JP2007531722A - 膵構造から誘導される糖ペプチド、抗体ならびに診断および治療におけるそれらの応用 - Google Patents
膵構造から誘導される糖ペプチド、抗体ならびに診断および治療におけるそれらの応用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
− またはそうでなければヒトまたは動物由来の生物学的液体から精製され、
− またはそうでなければ、組換え体であり、グリコシル化を引き起こすのに必要な酵素機構を含んでなる従来の宿主細胞における発現によって産生され、前記宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子ならびにグリコシルトランスフェラーゼから、ならびに特に、コア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GnTと略称される)、α(1−3)ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ3(FUT3と略称される)およびフコシルトランスフェラーゼ7(FUT7と略称される)から選択される1つもしくはそれ以上の酵素をコードする遺伝子を含んでなるように遺伝子改変されている。
− 上記のような少なくとも1つの糖ペプチド、および
− 抗原と前記生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出するための手段。
− 上記のような少なくとも1つの抗体、および
− 抗原と生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出するための手段。
BSDL(配列番号9)およびFAPP(配列番号13)の組換え糖ペプチドを、周知の細胞系統CHO−K1、番号CRL61でAmerican Type Culture Collection ATCCから入手することができる、線維芽細胞の形態を伴うチャイニーズハムスター卵巣腫瘍細胞系統から誘導される別々の株において発現させた(バック(Buck)ら、1958年、J.Exp.Med.,108:945−955頁)。
異なる糖ペプチド成分の発現を可能にするクローニングされたcDNAは、チルグウィン(Chirgwin)ら[1979年、Biochemistry,18:5294−5299頁]により記載の方法に従って、健康なヒト膵臓または例えば、ヒト膵腺癌由来の細胞系統SOJ−6[フジイ(Fujii)ら、1990年、Hum.Cell.,3:31−36頁]のようなヒト膵臓腫瘍細胞系統の組織サンプルから抽出されるメッセンジャーRNAのポリAテイルとハイブリダイズするポリdTポリヌクレオチドプローブ(18塩基)を用いて行われる逆転写によって得た。
ヒト胎児膵腺房タンパク質(FAPP)(配列番号10)をコードするcDNAの増幅物を、先に記載のヒト膵臓腫瘍系統SOJ−6から抽出される5μgの全RNAから逆転写(55℃で45分間、逆転写キット、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国)し、続いて、ヒトBSDL(配列番号6)をコードするcDNA配列から規定されるヌクレオチドプライマーC−ter/FAPP−BSDLおよびN−ter/FAPPを使用して、以下に記載の条件でPCRを行った。ポリメラーゼ連鎖反応は、特に、グアニンおよびシトシンリッチのヌクレオチド配列の増幅を可能にする「Advantage−GC cDNA PCR」キット(Clontech)で行った。以下のプログラムを用いた。Robocycler Gradient96サーモサイクラー(Stratagene)において、94℃で2分間の1サイクル、続いて、94℃(変性)で1分間、52℃(プライマーアニーリング)で1分間、および68℃(伸長)で4分間の35サイクル、続いて、68℃で10分間の1サイクル。
N−ter/FAPP(配列番号1):
5’−TTCGTaagcttGCGAAGCTGGGCGCCGTGTACAGAA−3’、
C−ter/FAPP−BSDL(配列番号2):
5’−TTTCGTgaattcACGCTAAAACCTAATGACTGCAGGCATCTG−3’。
正常な膵臓から抽出されたRNA由来のBSDL(ヌクレオチド1089:Phe364からヌクレオチド2169:終止コドンまで、配列番号8および9)のC末端部をコードするcDNAを、プライマーC−ter/FAPP−BSDL(プライマー配列番号2、調製1を参照のこと)およびN−ter−Ctを使用するPCRによって、増幅した。
N−ter−Ct(配列番号3):
5’−CGTCTAaagcttTTTGATGTCTACACCGAGTCC−3’。
プラスミドpSec−FAPPに存在するFAPP(ヌクレオチド1089:Phe364〜ヌクレオチド1839:終止コドンまで、配列番号12および13)のC末端部をコードするcDNAは、上記のヌクレオチドプライマーNo2(C−ter/FAPP−BSDL)およびNo3(N−ter−Ct)を使用するPCRによって、増幅した。
マウス心臓(Balb/cマウス)から抽出されるRNA由来のα(1−3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(ヌクレオチド−10からヌクレオチド+1122:終止コドンまで)をコードするcDNAを、マウスα(1−3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするcDNA配列から規定されるプライマーCter/αGalおよびNter/αGalを使用するPCRによって、増幅した。これらのプライマーは以下の配列を有する。
Nter/αGal(配列番号4):5’−AAAAAgaattcGGAGAAAATAATGAAT−3’。
Cter/αGal(配列番号5):5’−AAAAAgggcccACAAAGTCAGACATTAT−3’。
パニコット(Panicot)らGlycobiology、1999年、9:935−946頁により記載のグリコシルトランスフェラーゼのコア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするcDNAを、その3’末端でflagエピトープをコードする配列を含んでなるベクターpCDNA−3にクローニングした。flagエピトープの発現は、形質転換された細胞におけるC2GnT発現の検出を可能にする。
a)連結
異なるPCR産物を、1%アガロースゲル上で分析し、「Geneclean」キット(Bio101)を使用して精製し、次いで、シャトルベクターpCR2.1TOPOにサブクローニングし、ユニバーサルM13およびリバースM13プライマーにより、配列決定した(Euro Sequences Genes Service、Paris、仏国)。次いで、PCR産物を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIの作用によって、前記シャトルベクターから遊離させ、真核生物の発現および分泌プラスミドpSec−Tagにクローニングし、プラスミドpSec−FAPPおよびpSec−16R(16RはBSDLのC末端ドメインに対応)(配列番号8)を得た。PCRによって得られるFAPPのC末端部をコードする相補的DNAを、精製およびHindIII/EcoRI消化後にpSec−Tagプラスミドに直接クローニングし、プラスミドpSec−6R(6RはドメインFAPPのC末端に対応)(配列番号12)を得た。配列決定は、ユニバーサルT7プライマーおよびEuro Sequences Genes Serviceによりこの目的のために合成されたBGH逆方向プライマーで行った。
5μlアリコートの連結産物を、ハナハン(Hanahan)[ハナハン(Hanahan)、1983年、J.Mol.Biol.,166:557−580頁]により記載のプロトコルに従って、50μlのコンピテント細菌細胞(大腸菌(Escherichia coli)、株TOP10F’)と接触させた。2マイクロリットルの0.5Mβ−メルカプトエタノールを添加し、サンプルを氷上で30分間、保持し、次いで、42℃で30秒間、熱ショック処理し、直ちに氷上に戻した。2分間後、サンプルを450μlのSOC培地(Life Technologies)で希釈した。細菌懸濁液を、1時間、37℃で振盪しながらインキュベートした。次いで、ガラスビーズを使用して、細菌を、50μg/mlアンピシリンを補充したLuria−Bertagni寒天を含有するペトリディッシュ上に拡げた。
選択寒天培地(50μg/mlアンピシリン)上での18時間の培養後に出現した細菌コロニーを拾い出し、50μg/mlアンピシリンを含有する2mlのLuria−Bertagni液体培地に播種した。培養物を、8時間、37℃で振盪しながらインキュベートし、次いで、1.5mlの細菌懸濁液を、5,000gで5分間、遠心分離した。細菌ペレットを、100μlの細菌膜不安定化緩衝液(50mM Tris−HCl pH8、10mM EDTA、リボヌクレアーゼA100μg/ml)に採取した。細菌懸濁液を200μlのアルカリ溶解緩衝液(200mM NaOH、1%SDS)の添加によって溶解し、調製物のpHを150μlの3M酢酸カリウムpH5.5で中和した。アルカリ溶解および中和工程には、氷上での5分間のインキュベーションを必要とする。細胞破砕物、変性したタンパク質および染色体DNAは、10,000gで10分間、4℃での遠心分離によって排除した。次いで、上清を、100mM Tris−HClでpH8に安定化させたフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25/24/1V/V/V)における1:2希釈により、フェノール−クロロホルムで抽出した。10,000g、2分間、室温での遠心分離によって、水相と有機相を分離した。上部の水相を回収し、無水エタノール(−20℃)で1:3希釈した。プラスミドDNAを、12,000g、15分間、4℃での遠心分離によって沈殿させ、次いで、70%エタノールで2回洗浄した。次いで、プラスミドDNAを20μlの超純水に再懸濁し、−20℃で保存した。
調製6:細胞クローンCHO−C2および中間細胞のクローンの入手に関する一般的ポイント
CHO−K1細胞系統を、その3’末端でflagエピトープをコードする配列を含んでなるグリコシルトランスフェラーゼのコア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GnT)をコードするcDNAを含んでなるプラスミドpcDNA3−C2β6GnT−flagでトランスフェクトした。flagエピトープの発現は、形質転換された細胞におけるC2GnT発現の検出を可能にする。
CHO−K1細胞を、BSDLのC末端ドメインをコードするcDNAがクローニングされた(調製2を参照のこと)プラスミドpSec−Tag(Invitrogen、Leek、蘭国)に対応するプラスミドpSec−16Rでトランスフェクトした。これは、調製6におけるクローンCHO−C2の調製について行われた。
調製6由来のクローンCHO−C2を、プラスミドpCDM7−FUT3およびハイグロマイシン耐性を付与するプラスミドpLSVHg(R&D Systems)でトランスフェクトし、細胞クローンCHO−C2−F3を得た。
これは、調製8におけるように得られたが、但し、プラスミドpCDM7−FUT3の代わりにプラスミドpCDM8−FUT7を使用した。
調製8由来のクローンCHO−C2−F3は、調製6および7について記載のとおりに、プラスミドpSec−6R(調製3を参照のこと)でトランスフェクトし、クローンCHO−C2−F3−6Rを得た。このクローンは、中でもモノクローナル抗体J28によって認識されるグリコシル化エピトープを有するペプチドを発現する。
調製10由来のクローンCHO−C2−F3−6Rを、先に記載のように、プラスミドpBK−αGT(調製4を参照のこと)でトランスフェクトし、モノクローナル抗体J28によって認識されるグリコシル化エピトープならびにヒト血液における天然の循環抗体によって認識されるグリコシル化エピトープαGalを有するクローンCHO−C2−F3−GT−6Rを得た。
組換え糖ペプチドは、適切な選択的抗生物質を補充した2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシンおよび0.1%フォンギゾン(fongizone)を含有するOpti−MEM培地(Invitrogen)における恒湿、5%CO2大気中16時間、37℃で細胞クローンCHO−16R(調製7)の日常的培養によって、産生される。細胞を、2×104細胞/cm2の密度で接種した。
実施例1に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンCHO−C2−16R(調製6)を培養した。
実施例1に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンCHO−F3−16R(調製6)を培養した。
実施例1に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンCHO−C2−F3−16R(調製8)を培養した。
実施例1に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンCHO−F7−16R(調製6)を培養した。
実施例1に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンCHO−C2−F7−16R(調製9)を培養した。
クローンCHO−K1(コントロール)、CHO−6R(Ex7)、CHO−C2−6R(Ex8)、CHO−F3−6R(Ex9)、CHO−C2−F3−6R(Ex10)、CHO−GT−6R(Ex11)、CHO−C2−GT−6R(Ex12)およびCHO−C2−F3−GT−6R(Ex13)により産生される組換えポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲルあるいはそうでなければ液体および/またはアフィニティークロマトグラフィー上で精製し、アボウアキル(Abouakil)ら、1988年、Biochim.Biophys.Acta、961:299−308頁により記載の抗体pAbL64、およびmAbJ28を使用する免疫検出によって分析した。FAPPの癌胎児性形態のO−グリコシル化から誘導されるフコシル化J28糖ペプチドに特異的なマウスモノクローナル抗体mAbJ28については、パニコット(Panicot)らGlycobiology、1999年、9:935−946頁に記載されている。
FAPPのC末端に対応するサイズおよび特徴を有する組換え抗糖ペプチド抗体を、以下の通りに調製した。
段階A−マウスの免疫化。
6週齢雄性Balb/cマウスを、以下のプロトコルに従って免疫した。
0日目:50:50エマルジョン(150μl NaCl/150μl完全フロイントアジュバント)における正常および病的ヒト膵液(以下にBSDL−FAPP 抗原と命名される)から精製されたFAPPおよびBSDLの25μgの混合物の腹腔内注入。
15日目:50:50エマルジョン(150μl NaCl/150μl不完全フロイントアジュバント)における25μgのBSDL−FAPP抗原での腹腔内チャレンジ
− 30日目:50:50エマルジョン(150μl NaCl/150μl不完全フロイントアジュバント)における25μgのBSDL−FAPP抗原での腹腔内チャレンジ
− 110日目:50:50エマルジョン(150μl NaCl/150μl不完全フロイントアジュバント)における20μgのBSDL−FAPP抗原での腹腔内チャレンジ
− 140日目:50:50エマルジョン(150μl NaCl/150μl不完全フロイントアジュバント)における20μgのBSDL−FAPP抗原での腹腔内チャレンジ
− 215日目:50:50エマルジョン(150μl NaCl/150μl不完全フロイントアジュバント)における20μgのBSDL−FAPP抗原での腹腔内チャレンジ
− 244日目:100μlの滅菌NaClにおける10μgのBSDL−FAPP抗原の静脈内注入。
− 247日目:細胞融合。
a)247日目に、選択したマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、グループ分けした。脾臓の細胞をRPMI1640培地で洗浄した。20%ウシ胎児血清(FCS)、1%グルタミン、1%非必須アミノ酸および1%ピルビン酸ナトリウムを含有するRPMI1640培地において予め増殖されたP3.X63.Ag8 653骨髄腫細胞もまた、同じ培地で洗浄した。
以下の段階Dに記載の方法によって選択される各ハイブリドーマは、10、5、2、1および0.5細胞が腹膜マクロファージを含有するマイクロウェルに統計的に分配される限界希釈技術によるクローニングから生じた。従って、行われた2つのサブクローニング、複製されている各クローンおよびサブクローンを、90%FCSおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO)中に凍結した。次いで、最後の作製由来のサブクローンを、インビボで拡大し、Balb/cマウスにおいて腹水を得、続いて、プロテインAカラム上での免疫グロブリン精製を行った。
選択は、培養上清を使用する液相ELISA方法によって、行った。100μlの炭酸緩衝液pH8.5中5マイクログラムのBSDL−FAPP抗原を、96ウェルELISAプレートのウェルに堆積させた。プレートを12時間、4℃で活性化し、300μlの1mg/mlウシアルブミンを2時間、飽和させた。次いで、プレートを洗浄し、BSDL−FAPP抗原に対して指向された抗体を潜在的に含有する100μlの細胞培養上清と共にインキュベートした。2時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ標識第二抗体と共に2時間、インキュベートした。インキュベーションの終了時に、プレートを再度洗浄し、パラ−ニトロフェニルリン酸(100μl、0.2M Tris/HCl緩衝液pH8.2および1mM CaCl2中1mg/ml)と共にインキュベートした。37℃で1時間後、プレートを、マイクロプレートリーダー上、410nmで読み取った。
実施例14〜19に記載のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを担持する膜糖ペプチドを、以下の様式で調製した。膵臓腫瘍細胞を、プラスチック製支持体上で培養し、次いで、それから非酵素的解離溶液(Sigma)で脱離させた。遠心分離(1000rpmで2分間)によって得られる細胞ペレットを、音波処理(2×15秒間)し、再度遠心分離した(20分間、14,000rpm、4℃)。リン酸緩衝液に懸濁されたペレットは、実施例14〜19に記載のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを担持する膜糖ペプチドに対応する。
以下の組成を有するワクチンを調製した。
− HaPT−1膵臓細胞から単離された実施例20由来の膜糖ペプチド、20μg
− ALU−gel−serアジュバント(Serva) 150μl
− 注射用水を含む賦形剤 150μl
実施例18由来の抗体(16D10)の0.5mg/ml注射用等張液を調製した。
実施例1に記載の方法を用いたが、但し、細胞クローンCHO−K1を培養した。
実験1:膵外分泌癌の細胞免疫療法におけるBSDLおよびFAPPの組換えC−末端糖ペプチドの使用
ハムスター(90〜100g)をいくらかの群に分け、30分間のUV曝露によって不活化したHaPT−1細胞を接種した。ハムスターに、実施例20由来の糖ペプチドおよび2週間の間週1回の腹腔内注入によってALU−gel−serアジュバントと混合された不活化細胞を接種した。最後の接種の2週間後、ハムスターにHaPT−1細胞の転移移植(皮下、横腹上)を行った。
腫瘍増殖曲線は、実施例20由来の糖ペプチド(BSDLおよび/またはFAPPのC末端ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体J28および16D10(実施例18)によって認識される構造によって、大きな部分において提示される抗原)で免疫されるハムスターでは、有意に遅かった。
操作プロトコル:
多様な膵臓および他の病状を患う患者由来の血清におけるELISA方法によって行われる一連の実験は、ELISAプレートを活性化するために抗原として使用されるBSDLが、I型糖尿病患者由来の血清の約80%に存在する抗体によって特異的に認識される一方、コントロール患者由来の血清で反応性であったのは10%未満であったことを示した。膵臓炎、膵臓癌またはグレーブス病のような他の病状の患者由来の血清は反応性ではなかった(パニコット(Panicot)ら1999年、Diabetes,48:2316−2323頁)。
BSDL、および特にそのC末端ドメインは、糖尿病患者由来の血清によって認識される一方、BSDLは、正常なコントロール患者由来の血清によって認識されなかった。
操作プロトコル:
ヒト膵臓腫瘍細胞系統SOJ−6およびBx−PC−3ならびにヒト非膵臓腫瘍細胞系統Caco−2およびHep−G2を、モノクローナル抗体J28、16D10(実施例18)、および8H8(実施例19)ならびにBSDLおよびFAPPのC末端ドメインに特異的なポリクローナル抗体(pAb)L64で処置した。それぞれの抗原−抗体複合体を、蛍光ウサギまたはマウスフルオレセイン結合N−イソチオシアネート抗IgG抗体の援助で検出した。FACS分析を使用して、それらの表面で、FAPPおよびBSDLのC末端ドメインと会合した抗原の存在を検出した。
モノクローナル抗体J28および16D10(実施例18)、ならびにポリクローナル抗体(pAb)L64は、ヒト膵臓腫瘍細胞系統SOJ−6の表面を特異的に認識し、Bx−PC−3はCaco−2およびHep−G2細胞のような試験したヒト非膵臓腫瘍細胞系統の表面を認識しなかった。
A−ヒト膵臓組織切片に関する研究
操作プロトコル:
FAPPおよび/またはBSDLのC末端ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体によって認識されるグリコシル化エピトープの組織発現を、正常および癌ヒト膵臓組織切片に対する本発明の多様なモノクローナル抗体で行った免疫組織化学研究において、試験した。
最初の実験では、実施例18(16D10)由来のモノクローナル抗体は、4つの膵腫瘍組織サンプル由来の新生物細胞を特異的に認識した。
操作プロトコル:
癌胎児性糖型J28の形成に関与するグリコシルトランスフェラーゼを特徴付け、前記グリコトープを、遺伝子操作によって、エクスビボで再生した。それは、CHO細胞おいて、前記構造を組み立てるのに必要なFAPPの組換えC末端ペプチド(6反復配列よりなる)ならびに2つのグリコシルトランスフェラーゼ、α(1−3/4)フコシルトランスフェラーゼFUT3およびコア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから再構築した。J28糖型(実施例10)を担持するFAPPの組換えC末端糖ペプチドを、この細胞系統の培養上清に分泌させた。
1.ウェルの底部を、1:10、1:20、1:50、1:100に希釈された組換えJ28糖ペプチドを含有する濃縮された培養上清で被覆する。
2つの実験の結果を示す図2は、競合物として使用される上昇濃度のmAb16D10(実施例8)(4倍過剰量をも伴う)の存在下で、ウェルの底部で被覆されたそのグリコトープに対するmAbJ28の反応性の有意な消失が認められたことを示す。
操作プロトコル:
モノクローナル抗体mAbJ28およびmAb16D10は、ヒト膵臓腫瘍細胞系統SOJ−6、Bx−PC−3を特異的に認識し、試験したヒト非膵臓腫瘍細胞系統を認識しなかった。
1.ヒト膵臓腫瘍SOJ−6細胞を脱離させ、固定化し、4℃でBSAで飽和させた。
2.蛍光標識モノクローナル抗体mAbJ28を、サンプルあたり2ngで、1:100、1:40、1:20、1:20、1:10、1:4および1:2希釈でmAb16D10を含有する上昇濃度の腹水の存在下で添加した。
3.細胞をFACSで分析した。
結果を図3に示す。細胞のきわめて低い標識化(Alexa−488標識mAbJ28による最初の実験のため)にもかかわらず、競合物として使用される上昇濃度の抗体mAb16D10の存在下で、その糖型に対する抗体mAbJ28の反応性の有意な消失は、観察されなかった。
実験プロトコル:
6週齢ヌードマウス(NMRIマウス)の2群に、−1日目に、実施例18由来のモノクローナル抗体16D10を、150μlの0.5mg/mg等張抗体溶液の用量で、または等張プラセボ溶液のいずれかを腹腔内接種した。
実施例18由来のモノクローナル抗体で処置した動物における腫瘍増殖速度は、プラセボ処置動物より10倍低かった。
操作プロトコル:
ウエスタンブロット、液体クロマトグラフィーおよび質量分析特徴付けによって行われる一連の実験により、健康な患者の尿における無傷(intact)なBSDLの同定がもたらされた。これの所見に照らし合わせて、BSDL/FAPPのC末端ドメインによって行われ、膵腺癌において出現する異なるグリコシル化エピトープJ28、16D10はまた、この癌を患う患者の尿に存在し得るものであった。
予備ウエスタンブロット実験において得られる最初の結果を示す図4は、膵腺癌患者由来の尿サンプルにおけるBSDL/FAPPによって担持されるグリコシル化J28エピトープの存在、および健康な個体由来の尿サンプルにおけるその非存在を示す。
操作プロトコル:
予備の結果は、BSDL/FAPPによって担持されるグリコシル化J28エピトープが、現時点で試験した膵腺癌患者由来の尿サンプル中に存在する一方、それは、健康な個体由来の尿サンプルには存在しないことを示した。侵襲的方法を伴わずに大量に得ることができる尿における前記腫瘍マーカーの存在は、ラマナタン(Ramanathan)ら、Cancer Immunol Immunoth、2004年、54:254−64頁、オネイル(O’Neill)ら、Blood、2004年、104:2235−46頁、ブラド(Vlad)ら、J Exp Med、2002年、196:1435−46頁、シュミット(Schmidt)ら、Cancer Res、2003年、63:8962−67頁により記載のような異なる有効な免疫療法プロトコルを開発するために、抗原の供給源としての役割を果たすことができる。そのような手段の1つは、それらの膵臓腫瘍が切除されている患者由来の樹状細胞を使用して、(ヤマナカ(Yamanaka)ら、Br J Cancer、2003年、89:1172−9頁、スバネ(Svane)ら、Cancer Immunol Immunother、2004年、53:633−41頁、ユ(Yu)ら、Cancer Res、2004年、64:4973−9頁により記載のような)自家細胞免疫療法プロトコルを開発することである。次いで、患者の樹状細胞は、前記の同じ抗原を発現する残存腫瘍病巣に対して指向される免疫応答を誘導するために患者に再注入される前に、患者自体の抗原、即ち、尿から得られるJ28グリコトープ(およびおそらくまた、16D10グリコトープ)を担持するBSDL/FAPPのC末端糖ペプチドでエクスビボで充填される。
Claims (40)
- モノクローナル抗体16D10、そのフラグメントもしくは誘導体、およびモノクローナル抗体16D10と同じエピトープに本質的に結合する抗体から選択されるモノクローナル抗体。
- ヒト化されているか、キメラかまたはヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
- IgG型である、請求項1または2に記載の抗体。
- 一本鎖抗体である、請求項1または2に記載の抗体。
- インビボまたはインビトロで膵臓の病状を検出するために使用し得る診断組成物を調製するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 膵臓の病状が膵臓癌である、請求項5に記載の使用。
- 被験体由来の生物学的サンプルと請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体とを接触させ、前記抗体と前記生物学的サンプルとの間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することを含んでなる、膵臓の病状を患う被験体のインビトロでの検出方法。
- 前記生物学的サンプルが膵臓組織のサンプルである、請求項7に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、膵液、血清および尿の中から好適に選択される生物学的液体である、請求項7に記載の方法。
- 膵臓癌を患う被験体の検出を可能にする、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体、および場合により、生物学的サンプルと前記抗体との間の免疫反応から生じる免疫複合体を検出するための手段を含んでなる、膵臓の病状の診断のためのキット。
- 被験体の尿を回収し、前記尿と、配列番号14に記載され、コア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GnT)、α(1−3)およびα(1−4)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT3、またはα(1−3)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT7よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する1つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化されるペプチド配列の1〜40反復を含んでなる糖ペプチドを特異的に認識し得る抗体とを接触させ、前記抗体と前記尿との間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することを含んでなる、膵臓の病状を患う被験体のインビトロでの検出方法。
- 前記抗体が、抗体J28、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体が、抗体16D10、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である、請求項12に記載の方法。
- 膵臓癌を患う被験体の検出を可能にする、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号14に記載され、コア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GnT)、α(1−3)およびα(1−4)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT3、またはα(1−3)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT7よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する1つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化されるペプチド配列の1〜40反復を含んでなる糖ペプチドを含んでなる医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが、酵素C2GnTおよびFUT3によってグリコシル化される、請求項16に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが、酵素C2GnTおよびFUT7によってグリコシル化される、請求項16に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが、酵素C2GnT、FUT3およびFUT7によってグリコシル化される、請求項16に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが、α(1−3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(GT)によってさらにグリコシル化される、請求項16〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが、1〜15の間の前記反復を含んでなる、請求項16〜20のいずれか1項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが組換え体である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが生物学的液体から精製される、請求項16〜22のいずれか1項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記生物学的液体が尿である、請求項23に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記尿は、膵臓の病状を患う被験体由来である、請求項24に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記尿が、膵臓癌を患う被験体由来である、請求項25に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記糖ペプチドが抗原提示細胞上に充填される、請求項16〜26のいずれか1項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項27に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
- 膵臓疾患の予防的または治療的処置を目的とする医薬品を調製するための請求項16〜28のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
- 膵臓疾患が膵臓癌である、請求項29に記載の使用。
- 配列番号14に記載され、コア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GnT)、α(1−3)およびα(1−4)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT3、またはα(1−3)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT7よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する1つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化されるペプチド配列の1〜40反復を含んでなる糖ペプチドを特異的に認識し得る抗体を含んでなる医薬組成物。
- 前記糖ペプチドが、酵素C2GnTおよびFUT3によってグリコシル化される、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記糖ペプチドが、酵素C2GnTおよびFUT7によってグリコシル化される、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記糖ペプチドが、酵素C2GnT、FUT3およびFUT7によってグリコシル化される、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記糖ペプチドが、1〜15の間の前記反復を含んでなる、請求項31〜34のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、抗体J28、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である、請求項31〜35のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、抗体16D10、そのフラグメントもしくは誘導体、または前者と同じエピトープまたは決定基に本質的に結合する抗体である、請求項31〜35のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 膵臓疾患の予防的または治療的処置を目的とする医薬品を調製するための請求項31〜37のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
- 膵臓疾患が膵臓癌である、請求項38に記載の使用。
- 配列番号14に記載され、コア2β(1−6)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GnT)、α(1−3)およびα(1−4)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT3、またはα(1−3)フコシルトランスフェラーゼ活性を有するフコシルトランスフェラーゼFUT7よりなる群において選択されるオース−トランスフェラーゼ活性を有する1つもしくはそれ以上の酵素によってグリコシル化されるペプチド配列の1〜40反復を含んでなる組換え体の、単離または精製された糖ペプチドであって、α(1−3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(GT)によってさらにグリコシル化される、糖ペプチド。
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