JP2007527855A - ２−デヒドロ−３−デオキシ−ｄ−グルコネートからの２’−デオキシヌクレオシド及び２’−デオキシヌクレオシド前駆体の製造 - Google Patents

Abstract

この発明は、２’−デオキシヌクレオシド化合物又は２’−デオキシヌクレオシド前駆体を、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸(通常、ＫＤＧと略記)又はその塩を出発物質として利用して製造する方法に関係する。様々な２’−デオキシヌクレオシド及びそれらの類似体が、抗ウイルス剤、抗癌剤又はアンチセンス剤の製造における合成又は薬物配合のための出発物質として用いられる。

Description

この発明は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸(通常、ＫＤＧと略記)又はその塩を出発物質として利用する、２’−デオキシヌクレオシド化合物又は２’−デオキシヌクレオシド前駆体の製造方法に関するものである。様々な２’−デオキシヌクレオシド及びそれらの類似体が、抗ウイルス剤、抗癌剤又はアンチセンス薬剤の製造における合成又は薬物配合物のための出発物質として利用されている。

特に、この発明は、ＫＤＧ又はＫＤＧの誘導体を脱カルボキシル化工程にかけてＫＤＧの元のカルボキシル基を除去する方法に関係する。好適具体例において、この発明の方法において用いられるＫＤＧは、Ｄ−グルコネート又はＤ−グルコサミネートから酵素的に生成される。

２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む２’−デオキシヌクレオシド及び２’−デオキシヌクレオシド前駆体は、例えば、抗ウイルス剤及び抗癌剤の製造における合成又は薬物配合物のための出発物質として利用される。２’−デオキシヌクレオシド又はその誘導体及び２’−デオキシヌクレオシド前駆体は又、研究、診断及び治療用アンチセンス分子の合成のための試薬としても利用される。

一つの従来技術の方法において、デオキシヌクレオシドは、生物学的材料例えば精巣(ＷＯ９９／４９０７４)又は酵母又は魚精子からＤＮＡの酵素的開裂により生成される。しかしながら、この方法は、幾つかの不都合を、特に、出発物質を十分な量及び質で得ることの困難さに関して含んでいる。

２−デオキシ−Ｄ−リボースの主な製造方法は、現在、ＤＮＡの化学的加水分解にある。この場合、デオキシリボシル部分は、リボヌクレオチドレダクターゼ活性中に起源を持つ。２−デオキシ−Ｄ−リボースのＫＤＧからの合成は、未だ記載されたことはない。

殆どの生細胞において、デオキシリボヌクレオシドは、ヌクレオチド代謝の「サルベージ経路」から生じる。デオキシリボヌクレオシドのデオキシリボース部分は、リボシル部分の、リボヌクレオチドレダクターゼにより触媒される二又は三リン酸リボヌクレオチドへの還元から得られる。しかしながら、このデオキシリボース部分は、再利用されずに、下記の中心的代謝の反応により、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸及びアセトアルデヒドへと分解される：
- デオキシヌクレオシドは、チミジンホスホリラーゼ(ｄｅｏＡ)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ｄｅｏＤ)、ウリジンホスホリラーゼ(ｕｄｐ)又はキサントシンホスホリラーゼ(ｘａｐＡ)をコードする遺伝子の産物により媒介される加リン酸分解によって、デオキシリボース−１−リン酸及びヌクレオ塩基へと開裂される。
- デオキシリボース−１−リン酸は、デオキシリボースホスフェートムターゼ(ｄｅｏＢ)により触媒される反応によって、デオキシリボース−５−リン酸へと変換され、
- これは、更に、デオキシリボース−５−ホスフェートアルドラーゼ(ｄｅｏＣ)により触媒される反応によって、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸及びアセトアルデヒドへと分解される。

ｄｅｏ酵素は、イン・ビトロで、逆同化反応をも触媒するということが示されており：デオキシリボース−５−ホスフェートが、イン・ビトロで、アセトアルデヒド及びＤ−グリセルアルデヒド−３リン酸から出発して、精製した大腸菌又はラクトバチルス・プランタルムのデオキシリボースアルドラーゼの存在下で得られる(Rosen等、J.Biol.Chem., 240, (1964), 1517-1524；Pricer, J.Biol.Chem., 235, (1960), 1292-1298)。デオキシリボースは、アセトアルデヒドとグリセルアルデヒドを酵素基質として用いても得ることができるが、非常に低い収率でしか得られない(Barbas, J.Am.Chem.Soc. 112(1990), 2013-2014)。

特許出願ＷＯ０１／１４５６６は、デオキシリボース−１リン酸から出発する、ｄｅｏオペロンの３つの酵素即ち、デオキシリボースアルドラーゼ、デオキシリボムターゼ及びホスホリラーゼ(チミジン又はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ)の組み合わさった活性による、ワンポット反応における、デオキシヌクレオシドの、Ｄ−グリセルアルデヒド−３リン酸、アセトアルデヒド及びヌクレオ塩基を出発基質として利用する酵素的合成を記載している。Ｄ−グリセルアルデヒド−３リン酸は、フルクトース−１，６−二リン酸から酵素的工程によって得ることができる。

特許出願ＥＰ１１７９５９８は、デオキシリボース−一リン酸及びヌクレオ塩基から出発するデオキシヌクレオシドの酵素的生成を触媒するためのホスホリラーゼの利用を記載している。デオキシヌクレオシド合成の収率は、ホスフェートの沈殿によって改善される。

しかしながら、逆向きで働くｄｅｏオペロンの酵素を利用する方法は、それらの生物学的機能と比較して、低い収率を示し、これは、それらの利用に関する重大な欠点を示している。

現在でオキシヌクレオシド及びデオキシヌクレオシド前駆体の製造に適用されている方法の上記の非効率性の故に、デオキシヌクレオシド及びデオキシヌクレオシド前駆体を、あてにならない天然起源物に依存することなく、安価な市販されている化合物から出発して、生合成により製造する手段及び方法を提供することが、本発明の目的である。

特に、オキシヌクレオシド及びデオキシヌクレオシド前駆体の製造のための、デオキシリボヌクレオシドの効率的で経済的な合成を可能にする別法であって、従来法の欠点を排除する当該別法に対する要求がある。

本発明は、２’−デオキシヌクレオシド及びその前駆体の、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸(ＫＤＧ)又はその塩から出発して脱カルボキシル化工程を包含する製造方法に関係する。

特に、この方法は、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)並びに２’−デオキシヌクレオシド前駆体としてのＤＲＩの合成用途の広いエナミン誘導体の製造に有効である。

脱カルボキシル化工程は、ＫＤＧ又はその塩を直接反応させ、又はＫＤＧの誘導体を反応させて、通常ＫＤＧのＣ１−Ｃ２結合を開裂させることにより起きる。

この発明の一つの具体例において、ＫＤＧ又はその塩の一種は、２−デオキシ−Ｄ−リボン酸(ＤＲＮ)又はその塩へと導く(酸化的)脱カルボキシル化を受け、それ自体、更に、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)又は２−デオキシ−Ｄ−リビトール(ＤＲＬ)に変換される。

この発明の他の具体例において、脱カルボキシル化は、ＫＤＧ又はその塩をアミンと反応させて、エナミン誘導体へと誘導することによって起きる。この高エネルギーのエナミン誘導体は、更に、加水分解によってＤＲＩへと変換することができる。

この発明の他の具体例において、(酸化的)脱カルボキシル化を、３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸(ＤＧＮ)若しくはその塩及び／又は３−デオキシ−Ｄ−マンノン酸(ＤＭＮ)若しくはその塩(ＫＤＧ誘導体)について行なって、ＤＲＩへと導く。ＤＧＮとＤＭＮの混合物の製造は、ＫＤＧの還元によって起きる。脱カルボキシル化は、好ましくは、過酸化水素との反応により行なう。

この発明の他の具体例において、(酸化的)脱カルボキシル化を、３−デオキシ−Ｄ−グルコサミン酸(ＤＧＭ)若しくはその塩及び／又は３−デオキシ−Ｄ−マンノサミン酸(ＤＭＭ)若しくはその塩について行なって、ＤＲＩへと導く。ＤＧＭ及びＤＭＭの混合物の製造は、ＫＤＧから、還元的アミン化により起きる。

この発明の他の面は、上記の方法で利用するＫＤＧ又はその塩の製造のための便利で費用有効性の高い方法である。この方法は、Ｄ−グルコネートからか又はＤ−グルコサミネートから組換え酵素を利用して出発する。この発明は、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする新規なヌクレオチド配列及びＤ−グルコサミネートデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。

本発明の方法で利用する出発物質は、下記の式(Ｉ)で表されるＫＤＧ若しくはその塩の一種、又はその保護された誘導体であり、式中、４、５及び／又は６位のヒドロキシル基の一つ又は幾つかは、当分野で公知の保護基によって保護されている。

用語「２’−デオキシヌクレオシド」は、ここで用いる場合、Ｎ−グリコシドである２’−デオキシリボヌクレオシドと関連し、このヌクレオ塩基又はヌクレオ塩基類似体の塩基性Ｎ原子は、２−デオキシ−Ｄ−リボース又はその誘導体の一つの芳香族炭素原子に結合している。適当なヌクレオ塩基の例は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン、及びヒポキサンチンである。ヌクレオ塩基の類似体の例は、５−アザシトシン、２−クロロ−アデニン、５−ヨード−シトシン、８−アザ−グアニン、５−ヨード−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−エチル−ウラシル及び５−トリフルオロメチル−ウラシルである。

用語「２’−デオキシヌクレオシド前駆体」は、ここで用いる場合、従来技術において公知の方法を適用することによって２’−デオキシヌクレオシドに容易に変換されうる化合物に関係する。好適な２’−デオキシヌクレオシド前駆体は、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)又は２’−デオキシヌクレオシドの２−デオキシ−Ｄ−リボース部分に変換しうる炭水化物化合物例えば当分野で確立されたもの１−ホスホ−２−デオキシ−Ｄ−リボース、５−ホスホ−２−デオキシ−Ｄ−リボース及び本発明により確立されたもの２−デオキシ−Ｄ−リビトール、２−デオキシ−Ｄ−リボン酸、２−デオキシ−Ｄ−リボノ−１，４−ラクトン、１−Ｎ−モルホリノ−３，４，５−トリヒドロキシ−ペンタン−１、及びこれらの誘導体である。

この発明の方法は、脱カルボキシル化工程を直接ＫＤＧ若しくはその塩又はＫＤＧから誘導された化合物に対して行なう方法を包含する。好適なＫＤＧ誘導体は、３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸、３−デオキシ−Ｄ−マンノン酸、３−デオキシ−Ｄ−グルコサミン酸及び３−デオキシ−Ｄ−マンノサミン酸及びそれらのそれぞれの塩である。

その上、ＫＤＧ及びその塩又はこれらの保護形態{４、５及び／又は６位のヒドロキシル基の少なくとも一つが、その目的に関して当分野で公知の保護基で置換されている}は又、本発明の脱カルボキシル化反応の適当な出発物質でもある。別途記した場合を除いて、以下の明細書におけるＫＤＧへの如何なる言及も、ＫＤＧの保護形態を包含する(ちょうど、ＫＤＧ誘導体への言及が、これらの誘導体の保護形態を包含することを意図するように)。同様に、この発明の方法において得られる生成物への如何なる言及も、これらの生成物の保護形態を包含することを意図している。この発明の目的のための好適な保護基は、それぞれのヒドロキシル基をアセテートエステル、ベンゾエートエステル、アリルエーテル、ベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリル(ＴＢＤＭＳ)エーテル、イソプロピリデン又はベンジリデンアセタールによって置換するものである。

この発明の具体例に適した反応条件に依って、反応物として利用され又は生成物として得られた有機酸中のカルボキシル基は、プロトン化形態若しくはそれらの塩形態であってよく、又は平衡化して存在してよいということは理解されるべきである。これらの酸の典型的な塩は、対イオンとして金属又はアンモニウムイオン、特にアルカリ金属イオン例えばナトリウム及び／又はカリウムを有するものである。

本発明に記載された炭水化物化合物及びそれらの誘導体の殆どは、幾つかの環状形態で存在するが、簡単のために、開環鎖の式により表されてきた。本発明がこれらのすべての異性体又は互変体形態を包含することは理解される。

この発明の第一の具体例において、ＫＤＧ又はその塩を過酸化水素と反応させて、(酸化的)脱カルボキシル化を行なって、下記式(ＩＩ)の化合物２−デオキシ−Ｄ−リボン酸(ＤＲＮ)又はその塩とする。

この生成物を、更に、下記式(ＩＶ)により表される２−デオキシ−Ｄ−リビトール(ＤＲＬ)

又は下記式(ＩＩＩ)により表される２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)

に変換することができる。

ＤＲＮ、ＤＲＬ及び特にＤＲＩは、本発明の目的に適した２’−デオキシヌクレオシド前駆体の内にある。ＤＲＮのＤＲＩへの変換は、直接進行しうるし又は中間体としてのＤＲＬを介して進行することもできる。

好ましくは、ＤＲＮの製造は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウム又はカリウムの水溶液中での、実施例５に記載したような過酸化水素による室温での酸化的脱カルボキシル化によって行なう。２−ケトアルドン酸の酸化的脱カルボキシル化によるアルドン酸の製造のための一般的方法は、特許ＥＰ１０３８８６０Ａ１に記載されている。

好ましくは、ＤＲＬの製造は、２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンの水溶液中での、炭素上のロジウム触媒による、８０バールの圧力下での、１３０℃の温度での水素化によって実施例６に記載のようにして行なう。２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンは、２−デオキシ−Ｄ−リボネート(ＤＲＮ塩)を２−デオキシ−Ｄ−リボン酸に変換することによって容易に製造することができ、これは、水溶液中で、そのラクトン型と平衡にある(Han, Tetrahedron. 1993. 49, 349-362; Han, Tetrahedron Asymmetry. 1994. 5, 2535-62)。

好ましくは、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)製造は、２−デオキシ−Ｄ−リビトール(ＤＬＲ)の酸化(例えば、ピリジン中で酸化クロム使用)によって行なう。

この発明の他の具体例において、脱カルボキシル化は、(ＫＤＧ)又はその塩をアミノ基含有試薬Ｙ−Ｈと反応させることによって起き、下記式(Ｖ)の化合物

又はそのトランス異性体又はその保護形態を生じる(２’−デオキシヌクレオシド前駆体として)。Ｙ−Ｈは、アミノ基の窒素に結合した水素原子Ｈを有するアミンを表す。

この発明の好適具体例において、Ｙ−Ｈにより表されたアミノ基含有試薬は、直鎖又は環状の第二アミンであり；β−カルボニル基を有する第一アミン好ましくはα−ケト酸の脱カルボキシル化に有効であることが見出された３−アミノ−２−インドリノンである(Hanson, J.Chem.Education, 1987, 591-595)。これらの各々の場合に、式(Ｖ)中の−Ｙはこれらのアミノ基含有試薬に由来するそれぞれの窒素含有残基を表す。

好ましくは、式(Ｖ)の化合物は、直鎖又は環状第二アミン(Ｙ−Ｈ)の反応により生成されたエナミンを表している。

好適な環状第二アミンは、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、又はＮ−メチルピペラジンであり；好適な非環状アミンは、式Ｒ₁−ＮＨ−Ｒ₂(式中、Ｒ₁及びＲ₂は、独立に、１〜８好ましくは１〜４炭素原子の直鎖又は分枝鎖アルキル基を表す)のものである。非環状アミンとして特に好適なものは、ジエチルアミンである。
環状アミンとして特に好適なものは、モルホリンである。

式(Ｖ)の化合物又はそのトランス異性体又はこれらの保護形態を、更に、Ｚ−Ｈ(式中、Ｈは、水素原子を表し、Ｚは、脱離基を表す)と反応させて下記式(ＶＩ)の化合物

又はそのそれぞれのトランス異性体又はこれらの保護形態を、２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成することができる。Ｚ−Ｈは、好ましくは、水であり、その場合、式(ＶＩ)の化合物は、ＤＲＩ又はその保護形態(ケト−エノール互変異性)である。

好ましくは、式(Ｖ)の化合物の製造は、ベンゼン中でＫＤＧをアミン例えばモルホリンと、実施例７に記載の方法を利用して、還流下で反応させることによって行なって、１−Ｎ−モルホリノ−３，４，５−トリヒドロキシ−ペンテン−１へ導く。酸触媒された加水分解は、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)を生成する。

β−水素を有するα−オキソカルボン酸からエナミンを介してアルデヒドに至る一般的経路は、Stamos(Tetrahedron Lett. 23 (1982), 459-462)により記載されている。エナミンの製造及び加水分解のための他の方法は、他所に記載されている(Stock, J.Am.Chem.Soc. 85 (1963), 207-222; Stamhuis, J.Org.Chem. 30 (1965), 2156-2160)。

この発明の他の具体例において、ＫＤＧ又はその塩は、下記式(ＶＩＩ)により表される３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸(ＤＧＮ)及び／又は３−デオキシ−Ｄ−マンノン酸(ＤＭＮ)又はこれらの化合物の塩に変換される

この反応から生じた生成物を、好ましくは、過酸化水素を利用して、(酸化的)脱カルボキシル化にかけて、ＤＲＩを生成する。ＤＧＮ及びＤＭＮ又はそれらの塩の混合物の生成は、ＫＤＧ又はその塩から還元によって起きる。

好ましくは、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)の製造は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の水中での、水素化ホウ素ナトリウムによる、室温での、２−ケト−３−デオキシヘプトン酸につきWeissbach(J.Biol.Chem. 234 (1959), 705-709)により記載された方法を利用する非立体選択的還元と、その後の、例えば米国特許第３，３１２，６８３号；Richards J.Chem.Soc. (1954), 3638-3640; Sowden J.Am.Chem.Soc. 76 (1954), 3541-3542に記載されたような、３−デオキシ−Ｄ−グルコネート及び３−デオキシ−Ｄ−マンノネートの過酸化水素による酸化的脱カルボキシル化によって行なう。

他の好適具体例において、ＤＧＮ及びＤＭＮの混合物の製造は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートの水溶液中での、６％ラネーニッケル触媒又は酸化白金による室温で６バールの圧力下での水素化によって行なう。

この発明の他の具体例において、ＫＤＧ又はその塩は、３−デオキシ−Ｄ−グルコサミネート(ＤＧＭ)又は下記式(ＶＩＩＩ)により表される３−デオキシ−Ｄ−マンノサミネート(ＤＭＭ)又はこれらの化合物の塩に変換される

この反応から生じた生成物は、好ましくはニンヒドリンを利用する(酸化的)脱カルボキシル化を受けて、ＤＲＩを生じる。ＤＧＭとＤＭＭの混合物又はそれらの塩の製造は、ＫＤＧ又はその塩から還元的アミノ化によって起きる。

好ましくは、２−デオキシ−Ｄ−リボースの製造は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グコンサンナトリウム又はカリウムの水溶液中での、アンモニア又はシアノボロ水素化ナトリウムによる室温での非立体選択的な還元的アミノ化、及びその後の、３−デオキシ−Ｄ−２−グルコサミネート及び３−デオキシ−Ｄ−２−マンノサミネートの、ニンヒドリンによる酸化的脱カルボキシル化により、２−デオキシ−Ｄ−アロースの合成についてShelton (J.Am.Chem.Soc. 118(1996), 2117-2125；及びBorch, J.Am.Chem.Soc. 93(1971), 2897；Durrwachter, J.Am.Chem.Soc. 108(1986), 7812 これらの中で引用された文献)により記載された方法を利用して行なう。

その上、本発明は、式(III)の化合物(２−デオキシ−Ｄ−リボース)を、式(Ｉ)の化合物又はその塩の一種(ＫＤＧ)を単一ステップで変換することによって製造するための方法を提供する。好ましくは、この変換は、酵素的触媒により達成される。この変換は、好ましくは、ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される。好適なケト酸デカルボキシラーゼは、チアミンピロリン酸(ＴＰＰ)依存性ケト酸デカルボキシラーゼである。ＴＰＰ依存性ケト酸デカルボキシラーゼの例は、ピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．１)、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．７)、インドールピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．７４)、ホスホノピルベートデカルボキシラーゼ、スルホピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．７９)、オキサリルコエンザイムＡデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．８)、オキサログルタレートデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．７１)又はフェニルピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ ４．１．１．４３)である。ケト酸デカルボキシラーゼ例えば異なる生物に由来するピルベートデカルボキシラーゼ酵素が、ＫＤＧを２−デオキシ−Ｄ−リボースへ変換することができるということは示すことができた(実施例８〜１２参照)。原則として、如何なるケト酸デカルボキシラーゼでも、本発明と共に利用することができる。

この発明による方法の好適な具体例において、ＫＤＧは、ピルベートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素の利用によって、２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換される。

ピルベートデカルボキシラーゼは、下記の反応を触媒する：
ピルベート ＋ Ｈ⁺ ――＞ アセトアルデヒド ＋ ＣＯ₂

幾つかのピルベートデカルボキシラーゼ(ＰＤＣ)並びに対応するｐｄｃ遺伝子が、特性決定されている。例えば、ジモモナス・モビリスのＰＤＣ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＡＤ１９７１１；Neale等、J.Bacteriol. 1987, 169:1024-1028)、サッカロミセス・セレビシエのＰＤＣ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＰ０１３１４５；Candy等、J.Gen.Microbiol. 1991, 137:2811-2815)、アセトバクター・パスツーリアヌスのＰＤＣ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＡＭ２１２０８；Raj等、Arch.Microbiol. 2001, 176:443-451)、ザイモバクター・パルメのＰＤＣ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＡＭ４９５６６；Raj等、Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68:2869-2876)、サルシナ・ベントリキュリのＰＤＣ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＡＬ１８５５７；Lowe等、J.Gen.Microbiol. 1992, 138:803-807)。多くの他のピルベートデカルボキシラーゼは、十分に確立されたｐｄｃ遺伝子との配列相同性を共有する遺伝子の存在により証明されるように、植物、カビ及び細菌に存在しているようである。かかる推定のピルベートデカルボキシラーゼの例は、次の通りである：

植物由来のＰＤＣ：
アラビドプシス・タリアナ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 Ｔ４８１５５)
エキノクロア・クラス−ガリ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＭ１８１１９)
オリザ・サティバ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ９２２０１４)
リゾプス・オリゼ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＭ７３５４０)
ロータス・コーニキュラタス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＯ７２５３３)
ゼア・メイズ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＢＡＡ０３３５４)
ピスム・サティバム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＡ９１４４５)
ガーデン・ピー(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 Ｓ６５４７０)
ニコチアナ・タバクム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＡ５７４４７)
ソラナム・ツベロスム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＢＡＣ２３０４３)
フラガリア・アナナッサ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＬ３７４９２)
ククミス・メロ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＬ３３５５３)
ビティス・ビニフェラ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＧ２２４８８)

カビ由来のＰＤＣ：
サッカルム・オフィシナルム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＢ６１７６３)
アスペルギルス・オリゼ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＤ１６１７８)
アスペルギルス・パラシティクス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 Ｐ５１８４４)
サッカロミセス・セレビシエ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ０１３１４５)
フラムリナ・ベルティペス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＲ００２３１)
サッカロミセス・クルイベリ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＰ７５８９９)
シゾサッカロミセス・ポンベ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＢ７５８７３)
カンジダ・グラブラタ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＮ７７２４３)
ニューロスポラ・クラッサ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＪＮ０７８２)
ピチア・スティピス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＣ０３１６４)
クイベロミセス・ラクティス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＡ６１１５５)
エメリセラ・ニデュランス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＢ６３０１２)

原核生物由来のＰＤＣ：
ミコバクテリウム・ボビス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＤ９３７３８)
ミコバクテリウム・レプラ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＣ３１１２２)
ミコバクテリウム・ツベルキュロシス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ２１５３６８)
ミコプラスマ・ペネトランス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ７５８０７７)
クロストリジウム・アセトブチリカム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ１４９１８９)
アセトバクター・パスツーリアヌス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＭ２１２０８)
ザイモバクター・パルメ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＭ４９５６６)
ザイモモナス・モビリス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＤ１９７１１)
サルシナ・ベントリキュリ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＬ１８５５７)
ノストック・パンクチフォーム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＺＰ００１１０８５０)

かかる酵素は、対応する遺伝子を過剰発現する組換え微生物によって容易に生成することができる。ＴＰＰ依存性ケト酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の例は、ザイモモナス・モビリスのｐｄｃ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＦ１２４３４９)、サッカロミセス・セレビシエのｐｄｃ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＣ００１１４４)、アセトバクター・パスツーリアヌスのｐｄｃ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＦ３６８４３５)、ザイモバクター・パルメのｐｄｃ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＦ４７４１４５)、サルシナ・ベントリキュリのｐｄｃ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＦ３５４２９７)である。他のｐｄｃ遺伝子は、推定のピルベートデカルボキシラーゼの上記のリストに対応してＧｅｎｂａｎｋにおいて見出すことができる。
好適具体例において、このピルベートデカルボキシラーゼは、真核生物起源であり、一層好ましくは酵母に由来し、最も好ましくはサッカロミセス・セレビシエに由来する。特に好適な具体例において、このピルベートデカルボキシラーゼは、SEQ ID NO:２１に示したアミノ酸配列を有するＳ．セレビシエに由来する推定のデカルボキシラーゼである(ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＮＰ０１３１４５も参照されたい)。

他の好適具体例において、推定のデカルボキシラーゼは、原核生物起源であり、一層好ましくはザイモモナス属の微生物に由来し、最も好ましくはザイモモナス・モビリスに由来する。特に好適な具体例において、推定のデカルボキシラーゼは、SEQ ID NO:１９に示したアミノ酸配列を有するＺ．モビリス由来のピルベートデカルボキシラーゼである(ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＡＤ１９７１１も参照されたい)。

他の好適具体例において、原核生物のピルベートデカルボキシラーゼは、アセトバクター属の微生物に由来し、一層好ましくはアセトバクター・パスツーリアヌス種に由来する。特に好適なピルベートデカルボキシラーゼは、SEQ ID NO:２５に与えたアミノ酸配列を示すＡ．パスツーリアヌスのものである(ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＡＭ２１２０８も参照されたい)。

更に好適な具体例において、ピルベートデカルボキシラーゼは、ザイモバクター属の微生物に由来し、一層好ましくはザイモバクター・パルメ種の微生物に由来する。特に好適なものは、SEQ ID NO:２９に与えたアミノ酸配列を示すＺ．パルメに由来するピルベートデカルボキシラーゼである(ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＡＭ４９５６６も参照)。

この発明の方法の他の好適な具体例において、ＫＤＧは、２−デオキシ−Ｄ−リボースに、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素の利用によって変換される。

ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼは、下記の反応を触媒する：
ベンゾイルホルメート ＋ Ｈ⁺ ――＞ ベンズアルデヒド ＋ ＣＯ₂

シュードモナス・プチダのベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ(ＢＤＣ)(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＡＣ１５５０２；Tsou等、Biochemistry 1990, 29:9856-9862)は、特性決定されており並びに対応する遺伝子ｍｄｌＣ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＹ１４３３３８)も特性決定されている。この酵素は、２−ケト−４，５−ジヒドロキシバレレートのＤ及びＬ異性体の両方を脱カルボキシル化して、３，４−ジヒドロキシブタナールのそれぞれの異性体とすることが示されている(Niu等、J.Am.Chem.Soc. 125(2003), 12998-12999)。多くの他のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼは、十分確立されたＢＤＣをコードする遺伝子と相同な配列を共有する遺伝子の存在により証明されたように、細菌及び古細菌中に生じるようである。かかる推定のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの例は、次の通りである：

細菌由来のＢＤＣ：
シュードモナス・アエルギノサ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿２５３５８８)
ロドシュードモナス・パルストリス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿９４６９５５)
ストレプトミセス・コエリカラー(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿６３１４８６)
クロモバクテリウム・ビオラセウム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿９０２７７１)
ブラジリゾビウム・ジャポニカム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿７７４２４３)

古細菌由来のＢＤＣ：
スルホロブス・ソルファタリカム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿３４３０７０)
サーモプラスマ・アシドフィルム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿３９３９７６)
サーモプラスマ・ボルカニウム(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ＿１１１７１６)

かかる酵素は、対応するｂｄｃ遺伝子を過剰発現する組換え微生物によって容易に生成することができる。かかる遺伝子は、推定のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの上記のリストに対応するＧｅｎｂａｎｋで見出すことができる。

この発明の方法で用いることのできるチアミン依存性デカルボキシラーゼの他の例は、ホスホノピルベートデカルボキシラーゼである。幾つかのホスホノピルベートデカルボキシラーゼ(ＰＰＤ)並びに対応する遺伝子、例えばバクテロイデス・フラジリス由来のＰＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＡＡＧ２６４６６；Zhang等、J.Biol.Chem. 2003, 278:41302-41308)、ストレプトミセス・ウェドモレンシス由来のＰＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＢＡＡ３２４９６；Nakashita等、J.Antibiot. 1997, 50:212-219)が、特性決定されている。多くの他のホスホノピルベートデカルボキシラーゼは、十分に確立されたＰＰＤをコードする遺伝子と相同な配列を共有する遺伝子の存在により証明されたように、細菌中に存在するようである。かかる推定のホスホノピルベートデカルボキシラーゼの例は、次の通りである：バクテロイデス・テタイオタオミクロンのＰＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＰ＿８１０６３２)、アミコラトプシス・オリエンタリスのＰＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＢ４５０２３)、クロストリジウム・テタニ Ｅ８８のＰＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＰ＿７８２２９７)、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスのＰＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＡ７４７２２)、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＢＡＡ０７０５５)、ストレプトミセス・コエリカラーＡ３(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＰ＿７３３７１５)、ストレプトミセス・リシリエンシス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＧ２９７９６)、ボーデテラ・ペルトゥシス(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＣＡＥ ４１２１４)。かかる酵素は、対応する遺伝子を過剰発現する組換え微生物によって、容易に生成することができる。

本発明の方法において利用することのできるチアミン依存性デカルボキシラーゼの更なる例は、スルホピルベートデカルボキシラーゼである。２つのサブユニットＣｏｍＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 Ｐ５８４１５)及びＣｏｍＥ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 Ｐ５８４１６)よりなるメタノコッカス・ジャナシのスルホピルベートデカルボキシラーゼ(ＳＰＤ)(Graupner等、J.Bacteriol. 2000, 182:4862-4867)並びに対応する遺伝子は、特性決定されてきた。多くの他のスルホピルベートデカルボキシラーゼは、よく確立されたＳＰＤをコードする遺伝子と配列相同性を共有する遺伝子の存在により証明されたように、古細菌及び細菌中に存在するようである。

本発明の方法において利用することのできるチアミン依存性デカルボキシラーゼの他の更なる例は、インドールピルベートデカルボキシラーゼである。幾つかのインドールピルベートデカルボキシラーゼ(ＩＰＤ)並びに対応する遺伝子{例えば、エンテロバクター・クロアカエに由来する本ＩＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＢＡＡ１４２４２；Scutz等、2003, Eur.J.Biochem. 270:2322-2331)、アゾスピリラム・ブラジレンスに由来するＩＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＣ３６８８６；Costacurta等、Mol.Gen.Genet. 1994, 243:463-472)、エルウィニア・ヘルビコラに由来するＩＰＤ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＡＡＢ０６５７１；Brandl等、Appl.Environ.Microbiol. 1996, 62:4121-4128)}が、特性決定されている。多くの他のインドールピルベートデカルボキシラーゼは、よく確立されたＩＰＤをコードする遺伝子と配列相同性を共有する遺伝子の存在により証明されたように、細菌中に存在するようである。

本発明の方法において利用することのできるチアミン依存性デカルボキシラーゼの尚更なる他の例は、フェニルピルベートデカルボキシラーゼである。酵母のフェニルピルベートデカルボキシラーゼ(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＰ０１０６６８；Vuralhan等、Appl.Environ.Microbiol.2003, 69:4534-41)並びにその対応する遺伝子ＡＲＯ１０(Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号 ＮＣ００１１３６)が、特性決定されている。

脱カルボキシル化工程が酵素反応により達成されるこの発明の方法の好適な具体例において、ｐＨ値は、酸の添加により、ｐＨ５〜９(好ましくは、ｐＨ６〜８)に調節される。原則として、任意の適当な酸をこの目的のために利用することができる。好適な酸は、ＨＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄、Ｄ−グルコン酸又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸である。

この発明の他の面は、Ｄ−グルコネート(ＧＣＮ)又はＤ−グルコサミネートからの組換え酵素の利用によるＫＤＧの製造のための便利で且つ費用有効性の高い方法である。

この発明の方法の好適具体例において、式(Ｉ)の化合物は、予備工程において、Ｄ−グルコン酸塩から、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ活性の利用により生成する。好適な塩は、Ｄ−グルコン酸カリウム又はナトリウムである。好ましくは、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼは、下記よりなる群から選択するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる：
(ａ)SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(ｂ)SEQ ID NO:１のコード配列を含むヌクレオチド配列；
(ｃ)(ａ)又は(ｂ)のヌクレオチド配列によりコードされる断片をコードするヌクレオチド配列；
(ｄ)(ａ)〜(ｃ)の何れか一つのヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
(ｅ)(ｄ)のヌクレオチド配列から、遺伝コードの縮重の結果として、偏向しているヌクレオチド配列。

ＫＤＧ又はその塩の、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼを利用する酵素的合成は、次の反応により進行する：Ｄ−グルコネートを、水分子一つの除去によって、ＫＤＧに変換する。Ｄ−グルコネートデヒドラターゼの活性は、種々の細菌種例えばアルカリゲネス(Kersters, Methods in Enzymology 42(1975), 301-304；クロストリジウム・パスツーリアヌム, (Gottschalk, Methods in Enzymology 90(1982), 283-287)；サーモプラスマ・アシドフィルム(Budgen, FEBS Letters 196(1986), 207-210)及びスルホロブス・ソルファタリクス(Nicolaus, Biotechnology Letter 8(7)(1986), 497-500)において特性決定されている。好適なＤ−グルコネートデヒドラターゼは、幾つかの収集株を、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ活性についてスクリーニングすることにより同定した。Ｄ−グルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子(ｇｃｎＤと称する)を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株のゲノムライブラリーから選択し、更に、発現に最適化させたマルチコピーベクターに挿入した。ｇｃｎＤ遺伝子を過剰発現する大腸菌細胞からの粗抽出物がＤ−グルコネートのＫＤＧへの全変換を触媒するということが示された(実施例２参照)。

この発明の方法の更なる好適具体例において、式(Ｉ)の化合物は、予備工程において、Ｄ−グルコサミネートから、Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼ活性の利用によって生成する。好ましくは、Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼは、下記よりなる群から選択するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる：
(ｆ)SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(ｇ)SEQ ID NO:３のコード配列を含むヌクレオチド配列；
(ｈ)(ａ)又は(ｂ)のヌクレオチド配列によりコードされる断片をコードするヌクレオチド配列；
(ｉ)(ａ)〜(ｃ)の何れか一つのヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
(ｊ)(ｄ)のヌクレオチド配列から、遺伝コードの縮重の結果として、偏向しているヌクレオチド配列。

ＫＤＧ又はその塩の、Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼを利用する酵素的合成は、次の反応により進行する：Ｄ−グルコサミネートは、一分子の水と一分子のアンモニアの除去によって、ＫＤＧに変換される。Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼの活性は、種々の細菌種例えばシュードモナス・フルオレセンス(Iwamoto, Agric.Biol.Chem. 53 (1989), 2563-2569)アグロバクテリウム・ラディオバクター(Iwamoto, FEBS Letters 104(1979), 131-134；Iwamoto, J.Biochem. 91(1982), 283-289)において特性決定されており、そのＭｎ²⁺イオン要求性が示された(Iwamoto, Biosci.Biotech.Biochem. 59(1995), 408-411)。

好適なＤ−グコサミネートデアミナーゼを、幾つかの収集株をＤ−グコサミネートデアミナーゼ活性についてスクリーニングすることによって同定した。Ｄ−グコサミネートデアミナーゼをコードする遺伝子(ｇｍａＡと称する)を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株から、推定のＤ−セリンデアミナーゼとして注釈付きの遺伝子をクローン化することにより単離した。このｇｍａＡ遺伝子を、更に、発現につき最適化したマルチコピーベクター中に挿入した。ｇｍａＡ遺伝子を過剰発現する大腸菌細胞からの粗抽出物が、Ｄ−グルコサミネートのＫＤＧへの変換を触媒するということが示された(実施例４参照)。

好適具体例において、本発明は、式ＩＩＩの化合物、特に２−デオキシ−Ｄ−リボースを、Ｄ−グルコネート又はＤ−グルコサミネートから出発して、第一工程において、上記のようにＤ−グルコネート又はＤ−グルコサミネートをＫＤＧに変換し、第二工程において、上記のようにＫＤＧを２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換する酵素反応により製造する方法と関係する。

こうして、Ｄ−グルコネートのＫＤＧへの酵素的変換は、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼの利用により達成することができる。Ｄ−グルコサミネートのＫＤＧへの酵素的変換は、Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼの利用により達成することができる。好適具体例につき、上記と同様にする。その結果生成したＫＤＧの２−デオキシ−Ｄ−リボースへの酵素的変換は、ケト酸デカルボキシラーゼの利用により達成することができる。好適具体例につき、上記と同様にする。

Ｄ−グルコネート又はＤ−グルコサミネートを、２−デオキシ−Ｄ−リボースへ、ＫＤＧを介して変換する酵素的な２工程の方法は、対応する酵素を発現する細胞の細胞抽出物の利用により又は精製し若しくは部分精製した酵素の利用により、イン・ビトロで実施することができる。これらの酵素は、生物において自然に発現される酵素であってよく、又はそれらは、組換えにより生成されたものであってよい。対応する(組換え)酵素を製造し及び単離する方法は、当業者に周知である。

好適具体例において、Ｄ−グルコネート又はＤ−グルコサミネートを、ＫＤＧを介して２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換する酵素的２工程方法は、イン・ビボで、即ち必要な酵素活性を発現する適当な生物を利用することにより実施することができる。この生物は、如何なる種類の生物であってもよく、好ましくは、それは、細胞例えば植物、動物、カビの細胞又は細菌の細胞である。最も好ましくは、カビ又は細菌の細胞が用いられる。好適なカビは、酵母例えばサッカロミセス・セレビシエであり；好適な細菌細胞は、例えば大腸菌、ザイモモナス・モビリス、ザイモバクター・パルメ、アセトバクター・パスツーリアヌス、アシネトバクター・カルコアセチクス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びバチルス・ズブチリスである。この生物は、酵素活性の一つ即ちＫＤＧ生成のためのＤ−グルコネートデヒドラターゼ若しくはＤ−グルコサミネートデアミナーゼ又はＫＤＧを２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換するためのケト酸デカルボキシラーゼを既に内在的に発現している生物であって、該生物においては、それぞれの他の酵素活性が、対応する酵素をコードする対応する外因性核酸分子の導入により発現される生物であってよい。或は、この生物は、Ｄ−グルコネート又はＤ−グルコサミネートのＫＤＧへの変換に必要な酵素活性及び更に２−デオキシ−Ｄ−リボースへの変換に必要な酵素活性を自然には発現しない生物であって、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ又はＤ−グルコサミネートデアミナーゼ及びケト酸デカルボキシラーゼをそれぞれコードする対応する外来核酸分子が導入された生物であってもよい。

特に好適な具体例において、この生物は、ＫＤＧキナーゼ(ｋｄｇＫ)活性を発現しない生物である。かかる酵素活性は、ＫＤＧのＫＤＰＧへのリン酸化へと導き、これは、更にアルドラーゼによって開裂されてピルベートとグリセルアルデヒドリン酸になり、それにより、ＫＤＧを異なる望ましくない代謝経路へと向ける。この発明の方法に、自然にはｋｄｇＫ遺伝子を発現しない生物を利用することは可能である。もし、用いる生物が自然にｋｄｇＫを発現するならば、かかる生物の対応するｋｄｇＤ遺伝子が不活性化された変異体を生成する手段及び方法は、当業者に周知である。

この発明に記載した方法をイン・ビボで、Ｄ−グルコネートのＫＤＧへの変換のためのＤ−グルコネートデヒドラターゼ及びＫＤＧの２−デオキシ−Ｄ−リボースへの変換のためのケト酸デカルボキシラーゼを発現する生物を利用することにより行なうならば、これは、その生物を培養するために用いる培養培地にＤ−グルコネートを基質として与えることができるという利点を有する。Ｄ−グルコネートは、この生物により取り込まれて、２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換される。

他の特に好適な具体例において、この生物は、ＫＤＧアルドラーゼ(大腸菌において、ｅｄａ遺伝子によりコードされる)活性を発現しない生物である。かかる酵素活性は、ＫＤＧのピルベートとグリセルアルデヒドへの開裂へと導き、それにより、ＫＤＧを異なる望ましくない代謝経路へと向ける。この発明の方法に、自然にはｅｄａ遺伝子を発現しない生物を利用することは可能である。もし、用いる生物がｅｄａ遺伝子を発現するならば、かかる生物の対応するｅｄａ遺伝子が不活性化された変異体を生成する手段及び方法は、当業者に周知である。

更に他の特に好適な具体例において、この生物は、２−デオキシ−Ｄ−リボースアルドラーゼ(大腸菌において、ｄｅｏＣ遺伝子によりコードされる)活性を発現しない生物である。かかる酵素活性は、２−デオキシ−Ｄ−リボースのアセトアルデヒドとグリセルアルデヒドへの開裂へと導き、それにより、２−デオキシ−Ｄ−リボースの異なる望ましくない代謝経路へと向ける。この発明の方法に、自然にはｄｅｏＣ遺伝子を発現しない生物を利用することは可能である。もし、用いる生物がｄｅｏＣ遺伝子を発現するならば、かかる生物の対応するｄｅｏＣ遺伝子が不活性化された変異体を生成する手段及び方法は、当業者に周知である。例えば、大腸菌のｄｅｏＣ変異体(Valentin-Hansen, EMBO J. 1(1982), 317-322)並びに大腸菌のｄｅｏオペロンを欠失させる方法(Kaminski, J.Biol.Chem. 277 (2002), 14400-14407；Valentin-Hansen, Molec.Gen.Genet. 159(1978), 191-202)は、報告されている。

本発明は又、Ｄ−グルコネートをＤ−グルコネートデヒドラターゼの発現によりＫＤＧに酵素的に変換し及び／又はＤ−グルコサミネートをＤ−グルコサミネートデアミナーゼの発現によりＫＤＧに酵素的に変換することができ、更に、ＫＤＧを２−デオキシ−Ｄ−リボースに、ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱カルボキシル化反応によって酵素的に変換することのできる生物にも関係する。この生物は、原則として、任意の適当な生物であってよく、好ましくは、それは、細胞例えば植物細胞、動物細胞、カビ細胞又は細菌細胞である。一層好ましくは、それは、カビ又は細菌細胞である。好適なカビは、酵母例えばサッカロミセス・セレビシエである。好適な細菌は、大腸菌、ザイモモナス・モビリス、ザイモバクター・パルメ、アセトバクター・パスツーリアヌス、アシネトバクター・カルコアセチクス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びバチルス・ズブチリスである。一つの面において、この生物は、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ又はＤ−グルコサミネート・デアミナーゼを既に内因的に発現している生物であって、ＫＤＧの２−デオキシ−Ｄ−リボースへの脱カルボキシル化を触媒することのできるケト酸デカルボキシラーゼをコードする外来核酸分子が導入された生物である。ケト酸デカルボキシラーゼの好適具体例に関して、前記と同じことが適用される。

他の面において、この生物は、ＫＤＧを２−デオキシ−Ｄ−リボースに脱カルボキシル化反応によって変換することのできるケト酸デカルボキシラーゼを既に発現しているが、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ又はＤ−グルコサミネートデアミナーゼを自然には発現しない生物であって、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼをコードし及び／又はＤ−グルコサミネートデアミナーゼをコードする外来核酸を導入した生物である。即ち、この生物は、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ若しくはＤ−グルコサミネートデアミナーゼ又は両酵素を発現するように遺伝的に改変されていてよい。

更なる面において、この生物は、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ、Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼ及び、ＫＤＧを脱カルボキシル化により２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換するケト酸デカルボキシラーゼを自然には発現しない生物であって、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ若しくはＤ−グルコサミネートデアミナーゼ又は両酵素をコードする外来核酸分子及びＫＤＧを脱カルボキシル化により２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換することのできるケト酸デカルボキシラーゼをコードする核酸分子を導入した生物である。

この発明の生物において発現すべきＤ−グルコネートデヒドラターゼ、Ｄ−グルコサミンデアミナーゼ及びケト酸デカルボキシラーゼの好適具体例に関して、この発明の方法と共に前記したのと同様にする。

特に好適な具体例において、この発明の生物は、ＫＤＧキナーゼ(ｋｄｇＫ)活性を発現しない。それは、自然にはｋｄｇＫを発現しない生物であるか又は、自然にはｋｄｇＫを発現するが、例えば遺伝子破壊若しくは当業者に周知の他の適当な方法によって、対応する遺伝子が不活性化された生物である。

本発明は又、ＫＤＧを２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換する方法におけるケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素又はかかる酵素をコードするポリヌクレオチドの利用にも関係する。好適具体例に関して、本発明の方法と共に既に示したように適用される。

これら及び他の具体例は、本発明の記載及び実施例により開示され、包含されている。上記の及び下記の任意の参考文献の開示内容を、本願に援用する。本発明により採用されるべきこれらの方法、利用及び化合物の任意の一つに関係する更なる文献は、公共の図書館から例えば電子装置を利用して検索することができる。例えば、公共のデータベースの「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができ、それは、例えばインターネットで http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. で利用することができる。更なるデータベース及びアドレス例えば http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org/ が、当業者に知られており、例えば http://www.google.de. を利用して得ることもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概観及び後ろ向き検索及びカレントアウェアネスに有用な特許情報の適当な起源の概観は、Berks, TIBTECH 12(1994), 352-364に与えられている。
その上、用語「及び／又は」は、ここで出現する場合は、「及び」、「又は」及び「この用語により繋がれる要素のすべての又は他の組合せ」の意味を含んでいる。

実施例
実施例１：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株(ＣＩＰ１０４３３３)に由来するＤ−グルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子のクローニング
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株(ＣＩＰ１０４３３３)を、Institut Pasteur Collection (CIP, Paris, フランス国)から得た。染色体ＤＮＡを抽出して、Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ遺伝子を、下記のプライマーを使用して標準的プロトコールに従ってＰＣＲにより増幅した：
5'-CCCTTAATTAATGACGACATCTGATAATCTTC-3' (SEQ ID NO:５に描写)
5'-TTTGCGGCCGCTTAGTGGTTATCGCGCGGC-3' (SEQ ID NO:６に描写)
5'-CCCGGTACCATGACGACATCTGATAATCTTC-3' (SEQ ID NO:７に描写)
SEQ ID NO:５及びSEQ ID NO:６に描写した２つのプライマーを利用して増幅した第一のＤＮＡ断片を、予めＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＵＣ１８由来のベクター中に連結してプラスミドｐＶＤＭ８０を生成した。SEQ ID NO:６及びSEQ ID NO:７に描写した２つのプライマーを利用して増幅した第二のＤＮＡ断片を、予めＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＥＴ２９ａベクター(Novagen)中に連結してプラスミドｐＶＤＭ８２を生成した。このクローン化した遺伝子のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:１に描写してあり、この遺伝子によりコードされるポリペプチドの配列は、SEQ ID NO:２に描写してある。

実施例２：Ｄ−グルコネートデヒドラターゼ活性の大腸菌における発現及び２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートのＤ−グルコネートからの製造
大腸菌ＢＬ２１のコンピテント細胞を、実施例１に記載したように構築したｐＶＤ８２プラスミドでトランスフォームして、＋１２８９株を生成した。＋１２８９株を、３０℃で、３０ｍｇ／ｌ カナマイシンを含むルリア−ベルターニ(ＬＢ)培地(Difco)中で、ＯＤ(６００ｎｍ)が０．６の値に達するまで培養した。その後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を、終濃度０．５ｍＭまで加えた。更なる２時間と３０分の培養時間の後に、細胞を遠心分離により集めて、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．２)で一回洗った。細胞抽出物を、約５ｇの細胞を、１００００ユニットのリゾチーム(Ready-Lyse, ウィスコンシン、Madison在、Epicentre製)及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)緩衝液に懸濁させて、その懸濁液を３０℃で１５分間インキュベートすることによって調製した。次いで、１００００ｋユニットのデオキシリボヌクレアーゼＩ(ＤＮアーゼＩ、Sigma社製)並びに５ｍＭ ＭｇＣｌ₂をこの調製物に加え、それを、３０℃で更に１５分間インキュベートした。こうして得られた細胞抽出物を、使用するまで−２０℃で凍結保存した。

この細胞抽出物１．５ｍｌを、２Ｍ Ｄ−グルコン酸ナトリウム又はカリウムと混合した(総容積１０ｍｌ)。この調製物を、ｐＨを８．５に調整してから、３７℃でインキュベートした。２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート(ＫＤＧ)の合成の進行を、増大するインキュベーション時間の後に採取したアリコートを分析することによって追跡した。これらのアリコートの幾つかの希釈部分をシリカプレート上に付着させて、次の溶媒系でのクロマトグラフィーを行なった：イソプロパノール／水(９０／１０)。ＫＤＧの黄色のスポット(Ｒｆ〜０．４０)が、ｐ−アニスアルデヒドへの暴露後に検出された。ＫＤＧは又、Mac Gee (J.Biol.Chem. 1954, 210, 617-626)により記載されたように、セミカルバジド塩酸塩との反応に基づく分光測光アッセイを利用して定量もした。典型的には、３０時間のインキュベーションの後に、分光測光アッセイを利用して、ＫＤＧの濃度は、１．５〜２Ｍであった。

こうして得られた２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウム又はカリウム溶液を、更なる合成工程に利用することができた。２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸も又、かかる溶液から、公開されたプロトコール(Bender, Anal.Biochem. 1974, 61, 275-279)を適用して製造することができた。２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸とＫＣｌの混合物の粗調製物は又、１当量のＨＣｌを、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カリウム溶液に加えてから蒸発させることによっても得ることができた。

実施例３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株(ＣＩＰ１０４３３３)に由来するＤ−グルコサミネートデアミナーゼをコードする遺伝子のクローニング
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株 (ＣＩＰ１０４３３３)を、Institut Pasteur Collection (CIP, Paris, フランス)から得た。染色体ＤＮＡを抽出して、Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼ遺伝子を、下記のプライマーを利用する標準的プロトコールに従ってＰＣＲにより増幅した：
5'-CCCTTAATTAATGCAGTCTTCTTCAGCTCTTC-3' (SEQ ID NO:８に描写)；
5'-TTTGCGGCCGCCTAGTGAAAGAAGGTTGTGTAGAT-3' (SEQ ID NO:９に描写)；
5'-AAATCATGACTATGCAGTCTTCTTCAGCTCTTCG-3' (SEQ ID NO:１０に描写)；
5'-TATAGATCTCTAGTGAAAGAAGGTTGTGTAGAT-3' (SEQ ID NO:１１に描写)；

SEQ ID NO:８及びSEQ ID NO:９に描写した２つのプライマーを利用して増幅した第一のＤＮＡ断片を、ＰａｃＩ及びＮｏｔＩで予め消化したｐＵＣ１８由来のベクターに連結して、プラスミドｐＫＤＧｂ１を生成した。SEQ ID NO:１０及びSEQ ID NO:１１に描写した２つのプライマーを利用して増幅した第二のＤＮＡ断片を、ＢｓｐＨ１及びＢｇｌＩＩで予め消化したｐＱＥ６０ベクター(Qiagen)に連結して、プラスミドｐＥＰ１８を生成した。クローン化した遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:３に描写し、この遺伝子によりコードされるポリペプチドの配列をSEQ ID NO:４に描写してある。

実施例４：Ｄ−グルコサミネートデアミナーゼ活性の大腸菌における発現及び２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸のＤ−グルコサミネートからの製造
大腸菌ＭＧ１６５５のコンピテント細胞を、実施例１に記載したように構築したｐＥＰ１８プラスミド及びｐＲＥＰ４(Qiagen)でトランスフォームして、＋１０６８株を生成した。＋１０６８株を、３７℃で、３０ｍｇ／ｌ カナマイシン及び１００ｍｇ／ｌ アンピシリンを含むＬＢ培地中でＯＤ(６００ｎｍ)が０．６の値に達するまで培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭまで加えた。更なる２時間と３０分の培養期間の後に、細胞を遠心分離により集めて２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．２)で一回洗った。細胞抽出物を、実施例２に記載したプロトコールを利用して調製した。

この細胞抽出物２ｍｌを、１００ｍＭ Ｄ−グルコサミン酸ナトリウム又はカリウム及び０．１ｍＭ ピリドキサルリン酸と、総容積５ｍｌにて混合した。この調製物を、ｐＨを７．５に調節した後に、３７℃でインキュベートした。
この２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート(ＫＤＧ)の合成の進行を、実施例２に記載したプロトコールを利用して追跡した。典型的には、３０時間のインキュベーション期間後に、実施例２記載の分光測光アッセイを利用して、ＫＤＧ濃度は、５０〜１００ｍＭに及んだ。

実施例５：２−デオキシ−Ｄ−リボネートの２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの製造
３１％過酸化水素溶液０．５ｍｌを、１Ｍ ２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートカリウム(ＫＤＧ)溶液に２５℃で加えた。ＫＤＧの脱カルボキシル化の進行を、二酸化炭素の放出により生じた泡の観察及びＫＤＧ(実施例２に記載した薄層クロマトグラフィープロトコール使用)の消失の両方により追跡した。典型的には、３時間の反応の後に、残留ＫＤＧ濃度は、１０ｍＭ未満であった。

実施例６：２−デオキシ−Ｄ−リビトールの、２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンからの製造
ロジウム(炭素上、５％)触媒０．２ｇを、２−デオキシ−Ｌ−リボノラクトンの合成のためにDeriazにより記載された方法(J.Chem.Soc.(1949), 1879-1883)に従って製造された１ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンの水溶液に加えた。２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンの水素化を、１３０℃で、８０バールの圧力下で行なった。反応混合物の濾過後に得られた溶液を蒸発させた。残留ぶつを酢酸エチルに溶解させて、更に、シリカカラム上でのクロマトグラフィーにより精製した。溶剤を真空下で除去して、黄色い油を生じた(収率８５％)。こうして得られた化合物は、Rabow (J.Am.Chem.Soc. 122 (1999), 3196-3203)により記載された２−デオキシ−Ｄ−リボースの還元により得られた２−デオキシ−Ｄ−リビトールと同一物であった。

実施例７：１−Ｎ−モルホリノ−３，４，５−トリヒドロキシペンテン−１の、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの製造
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸２ｇを、ベンゼン１５０ｍｌに懸濁させた。モルホリン１．１ｍｌ及びｐ−トルエンスルホン酸１００ｍｇをこの懸濁液に加え、この反応混合物を３時間還流した。この反応で生じた水を、蒸留により除去した。ベンゼンをデカンテーションにより除去した。容器に付着した固形化合物を集め、アセトンで洗って乾燥した。この沈殿中に存在する主要化合物(収率４０％)を、更に、クロロフォルム中のメタノール勾配を利用するシリカ上でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。１−Ｎ−モルホリノ−３，４，５−トリヒドロキシペンテン−１を含む画分をプールして、溶媒を真空中で除去した。
¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ)：δ＝３．１５ｐｐｍ(４Ｈ，ｔ，モルホリン)、３．８ｐｐｍ(４Ｈ，ｔ，モルホリン)、３．４〜４ｐｐｍ、(４Ｈ，ｍ，５ａ−Ｈ，５ｂ−Ｈ，４−Ｈ，３−Ｈ)、６．３及び６．８ｐｐｍ(２Ｈ，２ｄ，１−Ｈ及び２Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ)。

実施例８：ザイモモナス・モビリスに由来するピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のクローニング
ザイモモナス・モビリスＢ−８０６株(ＣＩＰ １０２５３８Ｔ)を、インスティチュート・パスツール・コレクション(ＣＩＰ，パリ、フランス)から得た。染色体ＤＮＡを抽出して、ピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子を、下記のプライマーを利用する標準的プロトコールに従ったＰＣＲにより増幅した：
5'-GCGTTAATTAATGAGTTATACTGTCGGTACC-3' (SEQ ID NO:１２に描写)；
5'-TATGCGGCCGCTTAGAGGAGCTTGTTAACAGG-3' (SEQ ID NO:１３に描写)；

SEQ ID NO:１２及びSEQ ID NO:１３に描写した２つのプライマーを利用して増幅したＤＮＡを、予めＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＳＰ１００又はｐＥＶＬ５(それぞれ、後記のように、ｐＵＣ１８又はｐＱＥ７０に由来するベクター)中に連結して、それぞれ、プラスミドｐＥＶＬ１０７及びｐＥＶＬ４２０を生成した。このクローン化した遺伝子のヌクレオチド配列並びに対応するポリペプチドのコードされた配列は、ＧｅｎＢａｎｋにて見出すことができ(受入れ番号ＡＦ１２４３４９)、それぞれ、SEQ ID NO:１８及びSEQ ID NO:１９にて示してある。

プラスミドｐＳＰ１００を、リボソーム結合部位、ＰａｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を、標準的プロトコールを利用して、予めＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８ベクターに導入することにより得た。ｐＳＰ１００の完全なヌクレオチド配列をSEQ ID NO:１４に描写する。

プラスミドｐＥＶＬ５を、リボソーム結合部位、ＰａｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を、標準的プロトコールを利用して、予めＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＱＥベクター(Qiagen)導入することにより得た。ｐＥＶＬ５の完全なヌクレオチド配列を、SEQ ID NO:１５に描写する。

実施例９：サッカロミセス・セレビシエに由来するピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のクローニング
染色体ＤＮＡを、サッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株(ＡＴＣＣ ２０４５０８)から抽出して、ピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子を、下記のプライマーを利用する標準的プロトコールに従ってＰＣＲにより増幅した：
5'-ATATTTAATTAATGTCTGAAATTACTTTGG-3' (SEQ ID NO:１６に描写)；
5'-ATATGCGGCCGCTTATTGCTTAGCGTTGGT-3' (SEQ ID NO:１７に描写)；
SEQ ID NO:１６及びSEQ ID NO:１７に描写した２つのプライマーを利用して増幅したＤＮＡ断片を、予めＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＳＰ１００又はｐＥＶ５(それぞれ、実施例８に記載した通りのｐＵＣ１８由来のベクター又はｐＱＥ７０由来のベクター)中に連結して、それぞれ、プラスミドｐＶＤＭ６１及びプラスミドｐＥＶＬ４１９を生成した。このクローンかした遺伝子のヌクレオチド配列並びに対応するポリペプチドのコードされた配列は、ＧｅｎＢａｎｋにて見出すことができ(受入れ番号ＮＣ００１１４４)、それぞれ、SEQ ID NO:２０及びSEQ ID NO:２１に示してある。

実施例１０：ピルベートデカルボキシラーゼ活性の大腸菌における発現及び２−デオキシ−Ｄ−リボースの、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの酵素的合成
ピルベートデカルボキシラーゼの発現及び無細胞抽出物の調製
大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞を、ｐＥＶＬ１０７又はｐＶＤＭ６１(実施例８及び９に記載したように構築)でトランスフォームして、それぞれ、＋１７３５株及び＋８４４株を生成した。これらの株を、１００ｍｇ／ｌ アンピシリンを含むルリア−ベルターニ(ＬＢ)培地(Difco)中で、ＯＤ(６００ｎｍ)が１．５の値に達するまで３７℃で培養した。

ｐＲＥＰ４プラスミド(Qiagen)を有する大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞を、ｐＥＶＬ４２０又はｐＥＶＬ４１９(実施例８及び９に記載したように構築)でトランスフォームして、それぞれ、＋３１５０株及び＋３１４８株を生成した。これらの株を、１００ｍｇ／ｌ アンピシリン及び３０ｍｌ／ｌ カナマイシンを含むルリア−ベルターニ(ＬＢ)培地(Difco)中で、ＯＤ(６００ｎｍ)が０．６の値に達するまで３７℃で培養した。その後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を、終濃度０．５ｍＭまで加えた。２時間と３０分の更なる培養時間の後に、細胞を遠心分離により集めて、２０ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ７．２)で一回洗った。
各株につき、無細胞抽出物を、実施例２に記載したのと同じプロトコールを利用して調製した。その後、粗無細胞抽出物を、５０ｍＭ トリス酢酸緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラム(Amersham)を通過させて、−２０℃に保存した。

２−デオキシ−Ｄ−リボースの、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの酵素的合成
１．０ｍｌの無細胞抽出物を、２０ｍＭ ２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウム、０．５ｍＭ チアミンピロリン酸及び５ｍＭ ＭｇＣｌ₂と、総容積１．５ｍｌの５０ｍＭ トリス酢酸緩衝液(ｐＨ６)中で混合した。２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)合成の進行を、３７℃でのインキュベーション期間を増大させた後に採取したアリコートを分析することにより追跡した。予め蒸発により５倍に濃縮した各１μｌのアリコートをシリカプレート上に付着させて、次の溶媒系にてクロマトグラフィー分析した：ブタノール／トリエチルアミン／水(１０／２／５)。６５時間のインキュベーション期間の後に＋３１５０株又は＋３１４８株の無細胞抽出物を利用した場合、オルシノールへの曝露後に、ＤＲＩの青いスポット(Ｒｆ〜０．５０)が検出された。ＤＲＩに相当するスポットを含む粗調製物を濃縮して、イソプロパノールで平衡化した１．５ｍｌのシリカカラムを通過させた。予想されるＤＲＩ化合物を含む画分をプールし、濃縮して、その結果の試料を質量スペクトル分析により分析した。かかる分析の結果は、単離された化合物のＤＲＩとの同一性、及びＤＲＩの、ザイモモナス・モビリス又はサッカロミセス・セレビシエに由来するピルベートデカルボキシラーゼにより触媒される、ＫＤＧからの生成を確認した。

実施例１１：アセトバクター・パスツーリアヌス由来のピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のクローニング、コードされたピルベートデカルボキシラーゼ活性の大腸菌における発現及び２−デオキシ−Ｄ−リボースの２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの酵素的合成
アセトバクター・パスツーリアヌスＮＣＩＢ８６１８株(ＤＳＭＺ２３４７)を、ＤＳＭＺコレクション(ドイツ、Braunschweig在、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から得た。染色体ＤＮＡをこれらの細胞から抽出して、ピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子を、標準的プロトコールに従って、下記のプライマーを利用するＰＣＲにより増幅した：
5'-TCTTTAATTAATGGGTTGTCCGTCATTCATATA-3' (SEQ ID NO:２２に描写)；
5'-CTAAAGCTTTTAGGCCAGAGTGGTCTTGCGCG-3' (SEQ ID NO:２３に描写)；
SEQ ID NO:２２及びSEQ ID NO:２３に描写した２つのプライマーを利用して増幅したＤＮＡ断片を、予めＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＳＰ１００又はｐＥＶＬ５(それぞれ、実施例８に記載のように、ｐＵＣ１８由来の又はｐＱＥ７０由来のベクター)中に連結して、それぞれ、プラスミドｐＥＶＬ５４１及びプラスミドｐＥＶＬ５６０を生成した。このクローン化遺伝子のヌクレオチド配列SEQ ID NO:２４並びに対応するポリペプチドのSEQ ID NO:２５のコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋにて見出すことができる(受入れ番号ＡＦ３６８４３５)。

大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞を、ｐＥＶＬ５４１によりトランスフォームして＋３５５９株を生成した。ｐＲＥＰ４プラスミド(Qiagen)を有する大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞を、ｐＥＶＬ５６０によりトランスフォームして＋３９２４株を生成した。これらの株を培養して、無細胞抽出物を実施例１０に記載のように調製した。無細胞抽出物をＫＤＧとインキュベートして、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)合成の進行を実施例１０に記載したように追跡した。ＤＲＩに相当するスポットが認められたが、これは、アセトバクター・パスツーリアヌス由来のピルベートデカルボキシラーゼがＫＤＧを脱カルボキシル化してＤＲＩとすることができたことを示している。

実施例１２：ザイモバクター・パルメ由来のピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のクローニング、コードされるピルベートデカルボキシラーゼ活性の大腸菌における発現及び２−デオキシ−Ｄ−リボースの２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの酵素的合成
ザイモバクター・パルメＴ１０９株(ＤＳＭＺ１０４９１)を、ＤＳＭＺコレクション(ドイツ、Braunschweig在、Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から得た。染色体ＤＮＡをこれらの細胞から抽出して、ピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子を、下記のプライマーを利用する標準的プロトコールに従って、ＰＣＲにより増幅した：
5'-ATCTTAATTAATGTATACCGTTGGTATGTACT-3' (SEQ ID NO:２６に描写)；
5'-TATGCGGCCGCTTACGCTTGTGGTTTGCGAGAGT-3' (SEQ ID NO:２７に描写)；
SEQ ID NO:２６及びSEQ ID NO:２７に描写した２つのプライマーを利用して増幅したＤＮＡ断片を、予めＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＳＰ１００又はｐＥＶＬ５(それぞれ、実施例８に記載したようなｐＵＣ１８由来のベクター又はｐＱＥ７０由来のベクター)中に連結して、それぞれ、プラスミドｐＥＶＬ５４６及びプラスミドｐＥＶＬ５６１を生成した。このクローン化遺伝子のヌクレオチド配列並びに対応するポリペプチドのコードされる配列をそれぞれSEQ ID NO:２８及び２９に示すが、これらは、ＧｅｎＢａｎｋにて見出すことができる(受入れ番号ＡＦ４７４１４５)。

大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞を、ｐＥＶＬ５４６によりトランスフォームして、＋３５６８株を生成した。ｐＲＥＰ４プラスミド(Qiagen)を有する大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞を、ｐＥＶＬ５６０によりトランスフォームして、＋３９２３株を生成した。これらの株を培養して、無細胞抽出物を、実施例１０に記載のように調製した。無細胞抽出物をＫＤＧとインキュベートして、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)合成の進行を、実施例１０に記載したように追跡した。ＤＲＩに相当するスポットが認められたが、これは、ザイモバクター・パルメに由来するピルベートデカルボキシラーゼが、ＫＤＧを脱カルボキシル化してＤＲＩとすることができたことを示している。

実施例１３：シュードモナス・プチダに由来するベンジルホルメートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のクローニング、コードされるベンジルホルメートデカルボキシラーゼ活性の大腸菌における発現及び２−デオキシ−Ｄ−リボースの２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートからの酵素的合成
シュードモナス・プチダＭｉｇｕｌａ株(ＤＳＭＺ２９１)を、ＤＳＭＺコレクション(ドイツ、Braunschweig在、Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から得た。染色体ＤＮＡを抽出して、ベンジルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を、下記のプライマーを利用する標準的プロトコールに従って、ＰＣＲにより増幅した：
5'-CTATTAATTAATGGCTTCGGTACACGGCACCA-3' (SEQ ID NO:３０に描写)；
5'-TATGCGGCCGCTTACTTCACCGGGCTTACGGTGC-3' (SEQ ID NO:３１に描写)；
SEQ ID NO:３０及びSEQ ID NO:３１に描写した２つのプライマーを利用して増幅したＤＮＡ断片を、予めＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＳＰ１００又はｐＥＶＬ５(それぞれ、実施例８に記載のようなｐＵＣ１８由来の又はｐＱＥ７０由来のベクター)中に連結して、それぞれプラスミドｐＥＶＬ６８１及びプラスミドｐＥＶＬ６７０を生成した。このクローン化した遺伝子のヌクレオチド配列SEQ ID NO:３２並びに対応するポリペプチドのコードされる配列SEQ ID NO:３３は、ＧｅｎＢａｎｋにて見出すことができる(受入れ番号ＡＹ１４３３３８)。

大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞をｐＥＶＬ６８１によりトランスフォームして、＋４０５０株を生成した。ｐＲＥＰ４プラスミド(Qiagen)を有する大腸菌ＭＧ１６５５株のコンピテント細胞をｐＥＶＬ６７０によりトランスフォームして、＋３９２７株を生成した。それらの株を培養して、無細胞抽出物を、実施例１０に記載したように調製した。無細胞抽出物をＫＤＧとインキュベートして、２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)合成の進行を実施例１０に記載したようにして追跡した。ＤＲＩに相当するスポットが認められたが、これは、シュードモナス・プチダに由来するベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼが、ＫＤＧを脱カルボキシル化してＤＲＩとすることができたことを示している。

２−デオキシ−Ｄ−リボースの調製用の酵素的合成
＋３９２７株に由来する無細胞抽出物１００μｌ(２．５ｍｇの細菌性タンパク質を含む)を、３００ｍＭ ２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウム、０．５ｍＭ チアミンピロリン酸及び５ｍＭ ＭｇＣｌ₂と、０．５ｍｌの総容積の８０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６)中で混合した。１６及び４０時間のインキュベーション期間後に、数μｌの２Ｎ ＨＣｌ溶液をこのインキュベーション混合物にｐＨが６に達するまで加えた。２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)合成の進行を、やはり、３７℃でのインキュベーションの増大する期間後に採取したアリコートを分析することにより追跡した。各１μｌのアリコートをシリカプレート上に付着させて、実施例１０に記載したようにしてクロマトグラフィー分析した。２−デオキシ−Ｄ−リボースの濃度は、標準溶液との比較により、約２００ｍＭであると見積もられた。粗混合物の１３Ｃ ＮＭＲ分析は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートから形成された化合物が２−デオキシ−Ｄ−リボースであること及び２−デオキシ−Ｄ−リボースの濃度が２５ｇ／ｌに近かったことを確認した。
他の調製用の酵素的合成を、酸の添加をインキュベーション期間に沿って行なわなかった点を除いて、同じ条件で行なった。それらの条件において、２−デオキシ−Ｄ−リボースの濃度は、１０ｇ／ｌに近かったが、これは、これは、ｐＨを制御して６とした先の実験で到達された濃度より遥かに低いものである。

実施例１４：２−デオキシ−Ｄ−リボースのＤ−グルコネートからの酵素的合成
２−デオキシ−Ｄ−リボースのＤ−グルコネートからのワンポット酵素的合成を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのｇｃｎＤ遺伝子によりコードされるＤ−グルコネートデヒドラターゼ及びザイモモナス・モビリス由来のデカルボキシラーゼを利用して、次のように行なった：
それぞれ、実施例２及び実施例１０に記載したように調製した５０μｌの＋１２８９株からの無細胞抽出物(１．５ｍｇの細菌性タンパク質を含有)及び４００μｌの＋３１５０株からの無細胞抽出物(限外濾過による濃縮後に、１７ｍｇの細菌性タンパク質を含有)を、５０ｍＭ Ｄ−グルコン酸カリウム、０．５ｍＭ チアミンピロリン酸及び５ｍＭ ＭｇＣｌ₂と、総容積０．５ｍｌの５０ｍＭ Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ’−(２−エタンスルホン酸)(ＨＥＰＥＳ)緩衝液(ｐＨ７)中で混合した。２−デオキシ−Ｄ−リボース(ＤＲＩ)合成の進行を、３７℃での増大するインキュベーション期間の後に採取したアリコートを分析することによっても追跡した。１８時間のインキュベーション期間後に、約１μｌのインキュベーション混合物を、シリカプレート上に付着させて、実施例１０に記載のように、クロマトグラフィー分析を行なった。２−デオキシ−Ｄ−リボースの濃度は、標準溶液との比較により、約１ｇ／ｌであると見積もられた。

Claims (48)

1. ２’−デオキシヌクレオシド又は２’−デオキシヌクレオシド前駆体の、下記式(Ｉ)の化合物
   

   

   若しくはその塩又はそれらの保護形態からの、脱カルボキシル化工程を含む方法における製造方法。
2. 脱カルボキシル化工程が、式(Ｉ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態のＣ１−Ｃ２結合を開裂させる、請求項１に記載の方法。
3. 脱カルボキシル化工程を、式(Ｉ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態について直接行なう、請求項１又は２に記載の方法。
4. 脱カルボキシル化工程を、式(Ｉ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態を過酸化水素と反応させることにより起こして、式(ＩＩ)の化合物
   

   

   若しくはその塩又はそれらの保護形態を２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成する、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
5. 式(ＩＩ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態の、２’−デオキシヌクレオシド前駆体としての式(ＩＶ)の化合物
   

   

   又はその保護形態への変換を更に含む、請求項４に記載の方法。
6. 式(ＩＩ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態の、２’−デオキシヌクレオシド前駆体としての式(ＩＩＩ)の化合物
   

   

   又はその保護形態への変換を更に含む、請求項４に記載の方法。
7. 式(ＩＩ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態の、中間体としての式(ＩＶ)の化合物又はその保護形態への変換を含み、該中間体は、その後、式(ＩＩＩ)の化合物又はその保護形態に変換される、請求項６に記載の方法。
8. 脱カルボキシル化工程を、式(Ｉ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態を、アミンＹ−Ｈと反応させることにより起こして(式中、Ｈは、アミノ基の窒素原子と結合した水素原子を表す)、式(Ｖ)の化合物
   

   

   若しくはそのトランス異性体又はそれらの保護形態を２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成する、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
9. Ｙ−Ｈが、直鎖又は環式の第二アミンを表す、請求項８に記載の方法。
10. Ｙ−Ｈが、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペラジン又はジエチルアミンである、請求項８又は９に記載の方法。
11. 式(Ｖ)の化合物若しくはそのトランス異性体又はそれらの保護形態を、Ｚ−Ｈ(式中、Ｈは、水素原子を表し、Ｚは、脱離基を表す)と反応させて、式(ＶＩ)の化合物
    

    

    若しくはそのトランス異性体又はそれらの保護形態を２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成する工程を更に含む、請求項８〜１０の何れかに記載の方法。
12. Ｚ−Ｈが、水であり、式(ＩＩＩ)の化合物又はその保護形態を２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成する、請求項１１に記載の方法。
13. 式(Ｉ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態を、式(ＶＩＩ)の化合物
    

    

    若しくはその塩又はそれらの保護形態或はそれぞれのエピマーの混合物に変換し、次いで、それを脱カルボキシル化して、式(ＩＩＩ)の化合物又はその保護形態を２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成する、請求項１又は２に記載の方法。
14. (Ｉ)若しくはその塩又はそれらの保護形態の、(ＶＩＩ)又はその保護形態への変換を、ボロ水素化ナトリウムによる還元により又はラネーニッケル若しくは酸化白金触媒を利用する水素化によって起こす、請求項１３に記載の方法。
15. 脱カルボキシル化工程を、過酸化水素との反応により起こす、請求項１３〜１４に記載の方法。
16. 式(Ｉ)の化合物若しくはその塩又はそれらの保護形態を、式(ＶＩＩＩ)の化合物
    

    

    若しくはその塩又はそれらの保護形態或はそれぞれのエピマーの混合物に変換し、次いで、それを脱カルボキシル化して、式(ＩＩＩ)の化合物又はその保護形態を２’−デオキシヌクレオシド前駆体として生成する、請求項１又は２に記載の方法。
17. 式(ＶＩＩＩ)の化合物又はその保護形態或はそれぞれのエピマーの混合物をニンヒドリンと反応させ、それにより、化合物(ＩＩＩ)又はその保護形態へと導く、請求項１６に記載の方法。
18. (Ｉ)若しくはその塩又はそれらの保護形態の、(ＶＩＩＩ)又はその保護形態への変換が、アンモニア及びシアノボロ水素化ナトリウムによる還元的アミノ化により起きる、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 保護基を、独立に、酢酸エステル、安息香酸エステル、アリルエーテル、ベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリル(ＴＢＤＭＳ)エーテル、イソプロピリデン又はベンジリデンアセタールより選択する、請求項１〜１８の何れかに記載の方法。
20. 脱カルボキシル化工程が、単一工程を含む酵素反応により達成される、請求項１〜３の何れか一つに記載の方法。
21. 酵素反応が、ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により触媒される、請求項２０に記載の方法。
22. ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、チアミンピロリン酸(ＴＰＰ)依存性ケト酸デカルボキシラーゼである、請求項２１に記載の方法。
23. ＴＰＰ依存性ケト酸デカルボキシラーゼが、ピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．１)、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．７)、インドールピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．７４)、ホスホノピルベートデカルボキシラーゼ、スルホピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．７９)、オキサリル−コエンザイムＡデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．８)、オキソグルタレートデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．７１)又はフェニルピルベートデカルボキシラーゼ(ＥＣ４．１．１．４３)である、請求項２２に記載の方法。
24. ピルベートデカルボキシラーゼが、真核生物起源である、請求項２３に記載の方法。
25. 真核生物が、酵母である、請求項２４に記載の方法。
26. 酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項２５に記載の方法。
27. ピルベートデカルボキシラーゼが、原核生物起源である、請求項２３に記載の方法。
28. 原核生物が、ザイモモナス、ザイモバクター又はアセトバクター属のものである、請求項２７に記載の方法。
29. 生物が、ザイモモナス・モビリス、ザイモバクター・パルメ又はアセトバクター・パスツーリアヌス種のものである、請求項２８に記載の方法。
30. ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼが、原核生物起源である、請求項２３に記載の方法。
31. 原核生物が、シュードモナス属のものである、請求項３０に記載の方法。
32. 生物が、シュードモナス・プチダ種のものである、請求項３１に記載の方法。
33. ｐＨを、ｐＨ５〜９の酸の添加により調節する、請求項２０〜３２の何れか一つに記載の方法。
34. ｐＨ値を、ｐＨ６〜ｐＨ８の間に調節する、請求項３３に記載の方法。
35. 酸が、ＨＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄、Ｄ−グルコン酸又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸である、請求項３３又は３４に記載の方法。
36. 式(Ｉ)の化合物をＤ−グルコネート又はＤ−グルコネート塩からグルコネートデヒドラターゼ活性の利用により生成する予備工程を含む、請求項１〜３５の何れか一つに記載の方法。
37. Ｄ−グルコネート塩が、Ｄ−グルコン酸カリウム又はナトリウムである、請求項３６に記載の方法。
38. グルコネートデヒドラターゼが、下記よりなる群から選択するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項３６又は３７に記載の方法：
    (ａ)SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    (ｂ)SEQ ID NO:１のコード配列を含むヌクレオチド配列；
    (ｃ)(ａ)又は(ｂ)のヌクレオチド配列によりコードされる断片をコードするヌクレオチド配列；
    (ｄ)(ａ)〜(ｃ)の何れか一つのヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
    (ｅ)(ｄ)のヌクレオチド配列から、遺伝コードの縮重の結果として、偏向しているヌクレオチド配列。
39. 式(Ｉ)の化合物をＤ−グルコサミネートからグルコサミネートデアミナーゼ活性の利用により生成する予備工程を含む、請求項１〜３５の何れか一つに記載の方法。
40. グルコサミネートデアミナーゼが下記よりなる群から選択するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項３９に記載の方法：
    (ａ)SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    (ｂ)SEQ ID NO:３のコード配列を含むヌクレオチド配列；
    (ｃ)(ａ)又は(ｂ)のヌクレオチド配列によりコードされる断片をコードするヌクレオチド配列；
    (ｄ)(ａ)〜(ｃ)の何れか一つのヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
    (ｅ)(ｄ)のヌクレオチド配列から、遺伝コードの縮重の結果として、偏向しているヌクレオチド配列。
41. Ｄ−グルコネートをＤ−グルコネートデヒドラターゼの発現により２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートに酵素的に変換することができ及び／又はＤ−グルコサミネートをＤ−グルコサミネートデアミナーゼの発現により２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートに酵素的に変換することができ、そして２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートをケト酸デカルボキシラーゼの発現により脱カルボキシル化によって２−デオキシ−Ｄ−リボースに酵素的に変換することのできる生物。
42. ２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートキナーゼ活性を発現しない、請求項４１に記載の生物。
43. ２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ活性を発現しない、請求項４１又は４２に記載の生物。
44. ２−デオキシ−Ｄ−リボースアルドラーゼ活性を発現しない、請求項４１〜４３の何れか一つに記載の生物。
45. 請求項４１〜４４の何れか一つに記載の生物を利用して行なう、請求項２０〜４０の何れかに記載の方法。
46. 請求項３８に規定したポリヌクレオチド又はかかるポリヌクレオチドによりコードされるグルコネートデヒドラターゼの、請求項３６又は３７に記載の方法における利用。
47. 請求項４０に規定したポリヌクレオチド又はかかるポリヌクレオチドによりコードされるグルコサミネートデアミナーゼの、請求項３９に記載の方法における利用。
48. ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素又はかかる酵素をコードするポリヌクレオチドの、式(Ｉ)の化合物を２−デオキシ−Ｄ−リボースに変換する方法における利用。