JP2007526895A - ペプチド結合サロゲートを組み入れた空間的に規定された大環状分子 - Google Patents

Abstract

ペプチド結合サロゲートを組み入れた空間的に規定された新規大環状化合物を開示する。次いで、これらの大環状分子のライブラリーを使用して、特定の生物学的標的との特異的相互作用を示す１種以上の大環状分子種を選択する。特に、本発明による化合物は、哺乳類モチリン受容体および哺乳類グレリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして開示される。

Description

本発明は、ペプチド結合サロゲートを組み入れた空間的に規定された新規大環状(macrocyclic)化合物に関する。本発明はまた、これらの大環状分子のライブラリーの作製に関する。次いで、これらのライブラリーを使用して、特定の生物学的標的との特異的な相互作用を示す１種以上の大環状分子種を選択する。

ペプチドは、固体支持体での合成が容易であること、関係する反応が再現性があり高収率であることおよび出発物質が容易に入手できることによりコンビナトリアルケミストリー技術開発の最先端にある。ペプチドは、数多くの酵素および受容体の内因性リガンドである。これらのペプチドの修飾は、これらの同じ受容体および酵素のさらに強力なアゴニストまたは阻害剤を開発するために実施することができる。また、コンビナトリアルペプチドライブラリーは、多種多様の酵素および受容体系のこれまで知られていなかった数多くの活性な配列を見出すために使用されている。しかし、多くは効力および選択性のためにヒトおよび動物用医薬に使用されるが、これらの新規物質は、医薬としてのペプチドの直接使用に関連する通常の限界が依然としてある。ペプチドは非常に強力で、選択性のある生物剤であるが、医薬品としてのそれらの使用は、
・低い水溶性
・特にプロテアーゼに対する代謝不安定性
・低い経口バイオアベイラビリティ
・不十分な膜透過性
・組織および器官の作用部位への輸送の困難さ
・抗原性の可能性
・短い薬物動態学的半減期が薬理作用期間を短くする
・生物の標的領域以外の他の領域におけるペプチド受容体の存在による副作用
・高い製造費
によって制限されている。

これらの欠点を回避する一方で、ペプチドの高い効力を保持するために、過去３０年にわたる有意義な研究がこれらのペプチドの模倣物すなわちペプチド模倣薬の研究に捧げられた。同様の構造的特徴を有するが、異なる代謝特性を有する官能基によるアミド結合１つ以上の置換が広範に追求されている。同様に、側鎖を空間的に明確に表示するために立体的に要求が厳しいかまたは構造的に制限されているアミノ酸を使用して得られた分子の立体配座の制限も追求されている。直鎖ペプチドの環化も従来から追求されている。

しかし、望ましい構造に近づくために、単環分子内の立体配座を制御するには長期間の実験を必要とすることが多い。同じ相互作用ペプチド側鎖官能基を有する多数の立体配座を調べるために、三次元配向を誘導し、支配できることは特に興味深いと思われる。この方法では、関心対象の生物標的の最適な1つを迅速に決定できると思われる。

最近、国際公開公報第０１／２５２５７号は、「テザー(tether)」と名づけられた特定の要素を使用して大環状ペプチド模倣薬の立体配座を制御することを記載している。しかし、今日まで、このようなテザー要素の使用とペプチド結合サロゲートを合わせる方法は記載されていない。

このような分子は、他のアナログを上回る独自で優れた特性を有すると思われる：
・合成の容易さ
・高い化学的安定性
・改善された代謝安定性
・副作用の発現頻度が低い良好な選択性
・より望ましい薬物動態
・良好な経口バイオアベイラビリティ
・高い水溶性

特に、これらのアナログは、改善された治療特性を有する薬剤としてそれらを望ましいものにしている利点を有する：
・追加の相互作用官能基
・調節された物理化学的特性
・主にアミド結合によって決定される環状ペプチドへと改変された立体配座

骨格鎖間環化（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｔｏ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用してペプチド分子の立体配座を制御することが記載されている。（Ｇｉｌｏｎ， Ｇ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９９１， ３１， ７４５）。しかし、この方法は、使用する骨格鎖の長さによる制御しか提供されないという制限がある。これは、生物系内で最適に相互作用するために必要である可能性のある全ての立体配座へのアクセスを不可能にする。にもかかわらず、この方法は、治療目的（国際公開公報第９８／０４５８３号、国際公開公報第９９／６５５０８号、米国特許第５７７０６８７号、米国特許第６０５１５５４号）または診断目的（国際公開公報第０２／０６２８１９号）に使用することができるソマトスタチンアナログ、ブラジキニンアナログ（米国特許第５８７４５２９号）を得ている。

一方、環状ペプチドは、対応する直鎖アナログと比較して、立体配座の運動の制限、規定されたトポロジー、タンパク質分解酵素に対する高い安定性および改良された極性を含む数多くの利点を提供している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０００ （ｐｕｂ． ２００２）， ５， ２８９−３０４）。

従って、環状構造は、ペプチドの薬理学的および薬物動態学的特性を大幅に改善することができる。実施例は、環状ペプチドが効力、選択性、安定性、バイオアベイラビリティおよび膜透過性を増強できることを実証している。環状構造の酵素分解に対する安定性は、ペプチダーゼの基質として認識されるために必要な長い立体配座をこのような分子が取りにくいことによる。環状ペプチドの超巨大混合物ライブラリー（１０⁸メンバー以上）が国際公開公報第９８／５４５７７号に記載されている。

最近まで、薬物発見に大環状ペプチド模倣薬を使用する報告の数はむしろ少なかった。小型ペプチドまたはペプチド模倣大環状分子によって示されている治療的に興味深い生物活性の最近の例には、プロテアーゼ阻害（ＨＩＶ、癌、炎症）−Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００１， ８， ８９３−９０７；インテグリン受容体アンタゴニスト（細胞接着阻害、炎症、糖尿病）− Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００１， ４４， ２５８６−２５９２；ヒストンデアセチラーゼ阻害（癌、抗−真菌）− Ｔｒ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｍｅｔａｂｏｌ． ２００１， １２， ２９４−３００； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．２００１， ８， ２１１−２３５；ウロテンシンＩＩアンタゴニスト（循環器系疾病）− Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００２， ４１， ２９４０−２９４４；ニューロキニン−２アンタゴニスト（喘息、過敏性大腸症候群）− Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ４５， ３４１８−３４２９；チロシン受容体キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）アンタゴニストおよびニューロトロフィン−３模倣物（アルツハイマー型、卒中、糖尿病性神経障害）− Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ． ２０００， ５７， ３８５−３９１； Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００４， ６９， ７０１−７１３；抗菌剤 − Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ４５， ３４３０−３４３９；およびＣ５ａ補体阻害剤（炎症性疾病）？ Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２８， １４６１−１４６６が挙げられる。

しかし、これらの事例のほとんどにおいて、環状構造の形成は長期最適化過程の単に一段階であった。識別の最初のヒットおよび薬物発見のための巨大な大環状分子ライブラリーの使用はあまりにも前例がない。ペプチドへの注目を開始したコンビナトリアルケミストリーにおける広範な努力ならびに今ではアクセスが可能である小型分子ライブラリーの数および種類のその後の急増を考えると、これは特に特筆すべきである。

ペプチド結合の考えられる変更のうち、デプシペプチドは当技術分野において公知である。所定のペプチドおよび対応するデプシペプチドの比較例を以下に示す。重要なことに、他のペプチド結合サロゲートと同様に、隣接残基の側鎖の相対的配列は影響されない。

気づくように、ペプチド中の−ＮＨ−の１つがデプシペプチドでは−Ｏ−で置換されている。

多数のデプシペプチドが特定の生物活性を示すことが知られている（Ｂａｌｌａｒｄ， Ｃ．Ｅ．； Ｙｕ， Ｈ．； Ｗａｎｇ， Ｂ． Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ４７１−４９８； Ｍｏｏｒｅ， Ｒ．Ｅ． Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９６， １６， １３４−１４３ および Ｓｈｅｍａｙａｋｉｎ， Ｍ．Ｍ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ １９６５， ５， ９６２−９７６参照）。例えば、バンコマイシン、バリノマイシン、アクチノマイシン、ディデムニン、ドルスタチン（ｄｏｌｓｔａｔｉｎ）は天然産物のデプシペプチドである。これらの化合物の治療的効用には、抗癌性、抗菌性、抗ウイルス性（カリペルチン、キノキサペプチン（ｑｕｉｎｏｘａｐｅｐｔｉｎ））、抗真菌性（ジャスパミド）、抗−炎症性（ニューロキニンアンタゴニスト）、抗−凝固性、抗アテローム発生性（ａｎｔｉａｎｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）（ミクロペプチン）および他の作用が挙げられる。

別のクラスのアミノ酸模倣物、ペプトイドには、ペプチド関連治療薬およびバイオマテリアルの設計および合成における広範な効用が見出されている（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９９９， ９， ５３０−５３５）。デプシペプチドとペプトイドの比較を以下に示す。

さらに別の方法において、ウレタン部分が効果的なペプチド結合模倣物として機能することができる。それは、アミド結合と同様の硬直さを有する類似の規定の平面性および幾何学を有する。しかし、この部分は余分な原子を含有するので、アミドと等比体積でなく、導入によりサイズが大きい構造を生ずる。しかし、β−アミノ酸を含有するペプチドの独自の特性が証明するように、これは極めて有利であることを証明すると思われる（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ２００１， １０１， ３８９３−４０１１； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ８１１−８２２）。

以下は、ペプチド結合サロゲートとしてのウレタン部分の可能な利点として引用することができる：
・分子間および分子内相互作用のための余分なヘテロ原子によるＨ−結合特性の変更ならびに溶解度の改善
・ある程度の立体配座的制限の負荷
・骨格ＮＨおよびキラルＲ基は、生物特性および物理特性の調節のための置換および修飾の機会を提供する
・ペプチド結合と比較して、余分な炭素原子による親油性の大きい極性の改良
・プロテイナーゼに対する抵抗性
・薬物動態特性の変更

尿素ペプチド結合サロゲートも、新規構造を有する分子を構築するために他の等量式と合わせて調査されている。例えば、関節炎および癌を治療するためのマトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬としての直鎖トリペプチド模倣物の開発では、尿素およびスルホンアミドはアミド結合の代替物として標的とされている。尿素置換は、実際には、結合基が元のペプチドのアミノ酸側鎖と同じで、尿素−ペプトイドハイブリッドと考えることができる場合にＮ−置換基を含有する。

これらの例は、設計され、検討されている種々のペプチド結合サロゲートの代表的なサンプリングだけを強調している（Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ２， ４６３−４７３； Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ２， ４４７−４６２； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ２２０９−２２２９； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ２２４３−２２７０； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ９６３−９７８； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２００２， ６， ８７２−８７７； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １９９８， ２， ４４１−４５２； Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４， ３３， １６９９； Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ３６， ３０３９−３０４９； Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ． ２０００， ６５， ７６６７−７６７５）。具体的にペプチド結合と置換するまたは別の種類のペプチド残基を提供する追加の構造を図３に示す。この多様性により、化学者は天然のアミノ酸単独ではアクセス不可能なペプチド構造の数多くの修飾を探求することができた。しかし、しばしば、これは、予測可能な方法で実施されるのではなく、分子の構築後に判明する。従って、上記のテザー要素によって可能になる制御は、これらのペプチド結合サロゲートを含有する構造に関連して有用であると思われる。

さらに、今日まで、ペプチド結合サロゲートは、おそらくそれらの合成に関与するチャレンジにより、環状構造に関連してもライブラリーに関連しても広範に検討されていない。

従って、種々のペプチド結合サロゲートを組み入れた大環状構造の必要性が存在する。

本発明は、立体配座的に規定された環状分子に関連してペプチド結合サロゲートを使用する。従って、本発明は、ペプチド結合サロゲートを組み入れた式（Ｉ）

［式中、Ａ₃およびＡ₄は、必要に応じて、存在し、
Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＡ₄は、式Ｓ１〜Ｓ２１

（式中、ＲおよびＲ’は、天然アミノ酸の側鎖または非天然アミノ酸の側鎖から選択されるが、ただし、Ｒ’は水素でなく、
Ｒ’’は水素またはアルキルであり、
ｍは０、１または２であり、
ｎは０、１または２である）
からなる群から選択されるが、ただし、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃またはＡ₄の少なくとも１つは式：Ｓ２〜Ｓ２１からなる群から選択され、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＲ₁−（式中、Ｒ₁は、水素、アルキル、置換アルキル、アシルおよびスルホニルからなる群から選択される）であり、
Ｔは、式（ＩＩ）：
−Ｊ−（ＣＨ₂）_d−Ｋ−（ＣＨ₂）_e−Ｌ−（ＣＨ₂）_f− （ＩＩ）
（式中：
ＪはＸに結合しており、−ＣＨ₂−または−Ｃ（＝Ｏ）−から選択される二価の基であり、
ｄ、ｅおよびｆは、各々独立して、０、１、２、３、４または５から選択され、
Ｌは、必要に応じて、存在し、
ＫおよびＬは、独立して共有結合または：
−Ｏ−、−ＮＲ₂−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ₃−、−ＮＲ₃Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ₂ＮＲ₄−、−ＮＲ₄−ＳＯ₂−、−ＣＲ₅Ｒ₆−、−ＣＨ（ＯＲ₇）−、ＺまたはＥ配置の−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−および

からなる群から選択される二価の基であり、
式中、Ｒ₂は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ホルミル、アシル、カルボキシアルキル、カルボキシアリール、アミド、アミジノ、スルホニルおよびスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｒ₃およびＲ₄は、独立して、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルから選択され、
Ｒ₅およびＲ₆は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅またはＲ₆の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
Ｒ₇は、水素、アルキル、置換アルキル、ホルミルおよびアシルからなる群から選択され、
Ｇ₁およびＧ₂は、独立して、共有結合または：
−Ｏ−、−ＮＲ₈−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₉−、−ＮＲ₉−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ₂−ＮＲ₁₀−、−ＮＲ₁₀−ＳＯ₂−、−ＣＲ₁₁Ｒ₁₂−、ＺまたはＥ配値の−ＣＨ＝ＣＨ−および−Ｃ≡Ｃ−
（式中、Ｒ₈は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ホルミル、アシル、カルボキシアルキル、カルボキシアリール、アミド、アミジノ、ウレイド、スルホニルおよびスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｒ₉およびＲ₁₀は、独立して、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルから選択され、
Ｒ₁₁およびＲ₁₂は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノから選択されるが、ただしＲ₁₁またはＲ₁₂の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルである）からなる群から選択される二価の基であるが、ただしＧ₁はＪに最も近く、Ｇ₁またはＧ₂は、１，２または１，３または１，４の相対的配置で互いに結合していてもよい）の二価の基である］の大環状化合物に関する。

本発明の第二の態様において、式（ＩＩＩ）

［式中、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、Ａ₄およびＸは式（Ｉ）について規定するとおりであり、Ｔ₂は、

（式中、波線は（Ｒ）または（Ｓ）立体化学またはその混合を示し、
ｑ₁、ｑ₂、ｑ₃、ｑ₆、ｑ₇、ｑ₈、ｑ₉、ｑ₁₀、ｑ₁₁、ｑ₁₃、ｑ₁₅およびｑ₁₆は、各々独立して、１、２、３、４または５であり、
ｑ₄およびｑ₁₈は、独立して、１または２であり、
ｑ₅は２、３または５であり、
ｑ₁₂およびｑ₁₄は、各々独立して、０、１、２、３または４であり、
ｑ₁₇は０、１、２または３であり、
Ｐ₁、Ｐ₂、Ｐ₃、Ｐ₄およびＰ₅は、各々独立してＯ、ＳまたはＮＨであり、
Ｐ₆はＮまたはＣＨであり、
Ｐ₇はＯ または ＣＲ₅₂Ｒ₅₃であり、
Ｒ₃₆は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ベンジルまたはアシルであり、
Ｒ₅₀およびＲ₅₁は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅₀またはＲ₅₁の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
Ｒ₅₂およびＲ₅₃は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅₂またはＲ₅₃の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
Ｒ₅₄、Ｒ₅₅、Ｒ₅₆、Ｒ₅₇およびＲ₅₈は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、
Ｒ_AAは天然アミノ酸の側鎖であり、
（Ｘ）は、Ｔ₂がＸに結合する地点を示し、
（Ｗ）は、Ｔ₂がＡ₂、Ａ₃またはＡ₄ に結合する地点を示す）からなる群から選択される二価の基である］の化合物が提供される。

本発明はまた、これらの大環状分子のコンビナトリアルライブラリーも提供する。式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の化合物は、哺乳類のモチリン受容体および哺乳類のグレリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとしても開示されている。

本発明は、例示的な実施態様に関連して開示されているが、本発明の範囲をこのような実施態様に限定する意図のものではないことが理解されよう。それどころか、添付の特許請求の範囲によって規定されるものと同様に全ての代替物、改良物および等価物を含むことが意図されている。

本発明の独自の化合物は、これまで同時に調査されたことのない４つの主要な要素を兼ね備えている：
（１）アミノ酸および他の官能基化側鎖の認識の可能性
（２）大員環の立体構造の剛性および分解抵抗性
（３）生物活性物質において可能性があることが判明したペプチド結合サロゲートの改変された水素−結合および極性、改善された安定性ならびに調節された物理特性および認識可能性
（４）非ペプチドテザー成分による空間的制御

本発明はまた、薬物発見のための既存の化合物およびライブラリーを上回る大きな利点も有する：
・テザー成分での立体配座の制御により生物活性型の知識が速やかに提供されるので、化合物ライブラリーの試験から得られる情報の劇的な改善；
・立体配座の制御により、リガンド−標的相互作用を最大にすることができると思われる三次元配向を達成するための認識要素のディスプレイにおいて異なるテザーを用いる規定のバリエーションが可能になる（テザー部分は、実際に、環状構想を１つの低エネルギー立体配座に制約する場合もある）；
・認識要素（Ａ_i）にアミノ酸側鎖を使用してタンパク質間、核酸とタンパク質との間またはペプチドとタンパク質との間の既存の分子認識過程を模倣することによる高い生物的関連性；
・タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用に関係するものなどの、小型分子医薬品を開発するためには、その多くがこれまで扱いにくいとされていた多種多様の標的および製薬学的に興味深い生物系への適用性；
・ゲノミクスおよびプロテオミクスにおける努力から生じた多数の新規標的を考えると特定の関連を有する、新規および既存のタンパク質、酵素および受容体標的のプローブとしての化合物の使用；
・観察される任意の活性を調節し、最適化するために容易に使用できる個々の基礎単位によって主に導入されるバリエーションを用いて、変化のない基礎化学アセンブリー方法による生物活性分子のヒットフォロー−アップおよびリード最適化における速度増加；
・生物活性の高い可能性を提供するように設計されている個々の基礎単位によって達成される大きな化学的多様性；
・これらの化合物を合成するための固相方法において、非環状化合物は固相支持体に結合したままであるので、樹脂からの切断−放出方法を使用することにより、高純度に近い状態で化合物が直接提供され、通常の長期にわたる精製工程を回避する；
・元の方法は標準的な液相工程として開発されたので、合成方法により合成の成功程度が高くなり（＞９５％）、大規模な物質量に直接スケールアップすることができる。

従って、本発明の化合物は、望ましい特性を有する新規生物活性物質の調査において高い可能性を有する新規構造である。

従って、本発明は、式（Ｉ）および（ＩＩ）

（式中、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、Ａ₄、Ｘ、ＴおよびＴ₂は先に規定するとおりである）
の大環状化合物を提供する。

式（Ｉ）の大環状化合物の好ましい実施態様において、Ｔは：

［式中、波線は、Ｅ、ＺまたはＥおよびＺの混合の二重結合の立体配置を示し、
Ｍ₁、Ｍ₂、Ｍ₃、Ｍ₄およびＭ₅は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ₁₈（式中、Ｒ₁₈は、水素、アルキル、置換アルキル、ホルミル、アシルおよびスルホニルからなる群から選択される）から選択され、
ｆ₁、ｆ₂、ｆ4、ｆ₇およびｆ₁₀は、独立して、１、２、３または４から選択され、
ｆ₃およびｆ₈は、独立して、２または３から選択され、
ｆ₅、ｆ₁₁、ｆ₁₃、ｆ₁₄ およびｆ₁₅は、独立して、１または２から選択され、
ｆ₆は、０、１、２、３または４であり、
ｆ₉は、０、１または２であり、
（Ｘ）は、ＴがＸに結合する地点を示し、
（Ｗ）は、ＴがＡ₂、Ａ₃またはＡ₄ に結合する地点を示す］からなる群から選択される。

式（Ｉ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｔは：

からなる群から選択される。

式（ＩＩＩ）の大環状化合物の好ましい実施態様において、Ｔ₂は：

［式中、波線は（Ｒ）または（Ｓ）立体化学またはその混合を示し、
ｑ₁、ｑ₂、ｑ₃、ｑ₆、ｑ₇、ｑ₈、ｑ₉、ｑ₁₀、ｑ₁₁、ｑ₁₃、ｑ₁₅およびｑ₁₆は、各々独立して、１、２、３、４または５であり、
ｑ₄およびｑ₁₈は、独立して、１または２であり、
ｑ₁₂およびｑ₁₄は、各々独立して、０、１、２、３または４であり、
ｑ₁₇は０、１、２または３であり；
Ｐ₁、Ｐ₃、Ｐ₄およびＰ₅は、各々独立してＯ、ＳまたはＮＨであり、
Ｐ₆はＮまたはＣＨであり、
Ｐ₇はＯまたはＣＲ₅₂Ｒ₅₃であり、
Ｒ₃₆は水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ベンジルまたはアシルであり、
Ｒ₅₀およびＲ₅₁は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅₀またはＲ₅₁の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
Ｒ₅₂およびＲ₅₃は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅₂またはＲ₅₃の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
Ｒ₅₄、Ｒ₅₅、Ｒ₅₆、Ｒ₅₇およびＲ₅₈は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、
Ｒ_AAは天然アミノ酸の側鎖であり、
（Ｘ）は、ＴがＸに結合する地点を示し、
（Ｗ）は、ＴがＡ₂、Ａ₃またはＡ₄ に結合する地点を示す］からなる群から選択される。

式（ＩＩＩ）の化合物のさらに別の具体的な実施態様において、Ｔ₂は：

（式中、Ｙは水素、アルキル、ベンジルまたはアシルから選択される）からなる群から選択される。

本発明はまた、哺乳類のモチリン受容体および／または哺乳類のグレリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の化合物も提供する。

直鎖の２２アミノ酸ペプチドであるモチリンは、空腹時の胃腸運動活性を支配することによりＧＩ生理学系において重大な調節的役割を果たす。従って、このペプチドは、ヒトを含む哺乳類の空腹時の十二指腸粘膜から定期的に放出される。さらに正確には、モチリンは、胃腸管平滑筋を収縮させて、胃内容排出を刺激し、腸管通過時間を短縮し、小腸の第ＩＩＩ相進行性胃腸運動群を開始することによって胃の運動に対して強力な影響を発揮する。胃運動制御へのモチリンの重大で直接的な関与により、モチリン受容体において活性を低下する（運動低下）または増強する（運動過剰）薬剤は、これらの適応症の新規有効薬剤の探索においてさらなる調査の特に魅力的な分野である。モチリン受容体の大環状アンタゴニストは米国特許仮出願第６０／４７９，２２３号に開示されている。

同様に、グレリンは、成長ホルモン分泌、エネルギーバランスの維持、食欲および腸の運動を含む数多くの重要な生理的機能に関与する主要なペプチドホルモンである。従って、この受容体のアンタゴニストは肥満治療について研究されているが、グレリンアゴニストは、成長ホルモン欠損によって生ずる状態、消耗症候群および運動不全に関係するＧＩ障害を含む種々の疾病の治療に関与する。

表１Ａおよび１Ｂは、本発明による６９の化合物の構造を示す。表２は、これらの６９の化合物の質量スペクトル分析データを掲載する。

表１Ａ：式（Ｉ）の代表的な化合物

Ｘは、ＸがＮＭｅである化合物１６７およびＸがＮＡｃである化合物１６８を除いてＮＨである。

表１Ｂ：式（ＩＩＩ）の代表的な化合物

ＸはＮＨである

表２：本発明の代表的な化合物の質量スペクトル分析

注記
１．分子式および分子量（ＭＷ）は、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェア（ＩＤＢＳ， Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ， Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ）によって構造から、またはＭＷだけについては、フリーウェアプログラムＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ ｖ． ６．３２から自動的に算出する。
２．Ｍ＋ＨはＬＣ−ＭＳ分析から得られる。
３．全ての分析は分取精製後に物質に実施した。

合成方法
本発明の化合物を構築する基礎単位は、アミノ酸、ヒドロキシ酸、ペプチド結合サロゲートを組み入れる構造およびテザーを含む。アミノ酸およびヒドロキシル酸は市販品を購入するかまたは公知の手法により合成する。ペプチドサロゲートの適切な基礎単位を構築する方法も当技術分野において確立されている。（Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ２， ４６３−４７３； Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ２， ４４７−４６２； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ２２０９−２２２９； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ２２４３−２２７０； Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ９， ９６３−９７８； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２００２， ６， ８７２−８７７； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １９９８， ２， ４４１−４５２； Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４， ３３， １６９９； Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ３６， ３０３９−３０４９； Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ． ２０００， ６５， ７６６７−７６７５）。特定のテザー化合物の合成は国際公開公報第０１／２５２５７号および米国特許仮出願第６０／４９１，２４８号に記載されている。

種々の合成方法を使用して本発明の大環状化合物を入手でき、そのいくつかはすでに国際公開公報第０１／２５２５７号に開示されているか、または文献上公知である。

チオエステル方法を使用する本発明の化合物の固相合成の第一の好ましい方法の概略を図１に提供する。閉環メタセシス（ＲＣＭ）と呼ばれる第二の好ましい方法も図２に一般的に概略する。環化のための活性樹脂を使用するさらに別の方法を実施例３および４に提示する。

実施例１：ペプチドサロゲートＳ６を含有する式Ｉの大環状化合物の代表的な合成
合成スキームを図４（ａ）に示す（１−０）で示したリンカーを含有するポリスチレントリチル樹脂から出発して、リンカーの最初の標準的なＦｍｏｃ脱保護により１−１が得られた。次いで、標準条件下においてこれをＦｍｏｃ Ｎｖａ−ＯＨと結合させた。この段階において切断されたアリコートの定量分析に基づいて得られた樹脂のローディングは６２％であった。標準条件を使用したＦｍｏｃ切断、次いで実施した標準条件下におけるＦｍｏｃ−（Ｄ）Ｖａｌ−ＯＨとのカップリングにより、１−２が得られた。Ｆｍｏｃ基脱保護後、ステップ１−ｄに記載されているようにＦｍｏｃ−（Ｄ）Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＣＨＯ １−３による還元的アルキル化を実施した。

ステップ１−ｄ：第一の基礎単位を組み入れる還元的アミノ化
以下のストック溶液を最初に調製した。
溶液Ａ：１％ＡｃＯＨのＴＭＯＦ（トリメチルオルトホルメート）溶液１００ｍＬ．
溶液Ｂ：１％ＡｃＯＨのＤＭＦ／ＴＭＯＦ／ＭｅＯＨ（１：１：１）溶液１００ｍＬ。
２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で１−２のＦｍｏｃ基を脱保護した後、２．０ ｇ （１．５ｍｍｏｌ）の樹脂を溶液Ａで６回洗浄して、乾燥し、Ｎ₂雰囲気下で１００ ｍＬの丸底フラスコに移した。次に、４．６ｇ（１０．５ ｍｍｏｌ，７．０ｅｑ）アルデヒド１−３（標準的な方法を使用してＬＡＨ還元によりＷｅｉｎｒｅｂアミドから製造）を２５ ｍＬの溶液Ｂに溶解して、樹脂に添加した。混合物を５０℃において４５分撹拌した。上記混合物に、１０ ｍＬの溶液Ｂに溶解した１．０ｇ（１５．８ ｍｍｏｌ，１０．５ｅｑ）のＮａＢＨ₃ＣＮを添加した。内容物を５０℃においてさらに２．５時間撹拌した。次いで、樹脂をＤＭＦ（５×）で洗浄し、次いで交互サイクルでＤＣＭ／ＭｅＯＨ（２×）、ＤＣＭ（５×）で洗浄し、真空下で乾燥した。

ステップ１−ｅ：Ｃｂｚ保護
上記の樹脂（１．５ｍｍｏｌ）に５０ ｍＬのＤＭＦ（ＤｒｉＳｏｌｖグレード）、次に４．０ ｍＬ（２３ｍｍｏｌ，１５ｅｑ）のＤＩＰＥＡおよび２．１ｍＬ（１５ｍｍｏｌ，１０ ｅｑ）のＣｂｚＣｌを添加した。混合物をオービタルシェーカーＯ／Ｎで撹拌した。次いで、樹脂をＤＭＦ（５×）、交互サイクルでＤＣＭ／ＭｅＯＨ（４×）、ＤＣＭ（５×）で洗浄し、真空下で乾燥した。

ステップ１−ｆ：還元アミノ化による部分的テザー成分の導入
標準的な条件を使用したＦｍｏｃ基の切断後、１．７３ ｇ（１．２ｍｍｏｌ）の樹脂１−４を１％ＡｃＯＨのＭｅＯＨ溶液で洗浄した（５×）。次いで、この樹脂に、ＭｅＯＨ（ＤｒｉＳｏｌｖ）１５ｍＬおよびＴＭＯＦ５ｍＬ中の１−５ ３００ｍｇ（１．８ ｍｍｏｌ，１．５ ｅｑ）の溶液を添加した。次に、０．２４ｍＬ（２．４ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ）のＮａＢＨ₃ＣＮ（またはＢＡＰ）を添加し、１−５は溶解度が低いので、反応をオービタルシェーカーで４０時間維持した。樹脂をＭｅＯＨ（１０×）、ＤＭＦ／ＭｅＯＨ交互サイクル（５×）、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ交互サイクル（３×）、ＴＨＦ（２×）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ交互サイクル（３×）、ＣＨＣｌ₃（２×）、ＤＣＭ（４×）で洗浄し、次いで真空乾燥した。

上記樹脂の１．７ｇ（１．２ｍｍｏｌ）に３０ｍＬのＤＭＦ（ＤｒｉＳｏｌｖ）、次に２．８ｍＬ（１６ｍｍｏｌ，１３ｅｑ）ＤＩＰＥＡおよび１．７ｍＬ（１２ｍｍｏｌ，１０ｅｑ）のＣｂｚＣｌを添加した。混合物をＯ／Ｎ撹拌した。樹脂をＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ交互サイクル（３×）およびＤＣＭ（５×）で洗浄し、次いで真空乾燥した（オイルポンプ）。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析は所望生成物１−６が形成されたことを示した。

ステップ１−ｇ：ＲＣＭによる大環状化
標準手法に従って１．２ｇ（０．８４ｍｍｏｌ）の１−６を用いてＲＣＭを実施した。所望の大環状分子（１−７）が、収率１０２ｍｇ（２４％）で得られ、これは、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＣＬＮＤ分析により測定した。

ステップ１−ｈ：Ｃｂｚおよび不飽和水素化
９４ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の１−７を５０ｍＬビーカーで１５ｍＬの氷酢酸に溶解し、１８８ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを添加した。脱気後、溶液を１０００ｐｓｉのＨ₂下で７時間撹拌した。次いで、反応混合物をＣｅｌｉｔｅでろ過し、Ｃｅｌｉｔｅを１０ｍＬの氷酢酸で洗浄した（２×）。次いで、ろ液を蒸発させて、化合物を真空乾燥した。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により生成物のアイデンティティーを確認した。

ステップ１−ｉ：ｔＢｕ基の脱保護
このステップは、標準的な方法により５０％ＴＦＡ：５０％ＤＣＭ：３％ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）を使用して２時間実施した。ＭＳ検出を使用する逆相分取ＨＰＬＣによって粗物質を精製して、生成物（１−８）の収集を始動した。

実施例２：ペプチドサロゲートＳ６を含有する式Ｉの大環状化合物の代表的な合成
合成スキームを図４（ｂ）に示す。Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨの固定およびその後のＦｍｏｃの脱保護は標準的な手法により実施した。標準的な方法を使用してＦｍｏｃ−（Ｄ）Ｖａｌ−ＯＨからアルデヒド２−２を収率６２％で製造した。ステップ１−ｄと同様に、還元的アミノ化を実施した。ステップ１−ｅに記載の条件下で得られた生成物のＣｂｚ保護（反復２×）により所望の生成物２−３が得られた。

Ｆｍｏｃ脱保護、Ｂｔｓ−（Ｄ）Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨとのカップリングおよび樹脂結合トリペプチドサロゲートと２−４とのＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応は全て標準条件下で実施して２−５を得た。標準的な手法でＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒を用いるＲＣＭによる大環状化で所望生成物、２−６を得た。ＣＬＮＤ収率：１６．１ｍｇ。Ｂｔｓ基の標準的な脱保護は、好ましくは、Ｃｂｚ基の脱保護の前に実施され、同時に二重結合を還元した。最終生成物２−７はｔＢｕ基の脱保護によって得られる。

ペプチドサロゲートＳ１６またはＳ１７
本明細書に提示する経路は、以下の一般的な大環状分子構造について例示するように、本発明の化合物の別の経路を提供する。図５は、ペプチドサロゲートＳ１６を含有する代表的な大環状分子に適用される反応順序を詳細に記載する。

ステップ３−ａ：アミノ酸を２−クロロトリチルクロライド樹脂にローディングする標準的な手法
５０ｍＬの固相反応器において、２−クロロトリチルクロライド樹脂（２ｇ，２ｍｍｏｌ／ｇ，４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）に懸濁させて、１５分撹拌した。ろ過後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１．７５ｍＬ，１０ｍｍｏｌ，２．５ｅｑ）のＤＣＭ（１５ｍＬ）溶液を反応器に添加し、２時間振とうした。樹脂をろ過し、ＤＭＦ（２×２５ｍＬ）で洗浄した。（必要に応じてであるが、好ましくは、２−クロロトリチルクロライド樹脂の任意の残りの活性部位を次いで以下のようにキャッピングする。）このようにして得られた樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ（８０：１５：５）の混合物（２５ｍＬ）で１５分処理し、次いでろ過した。この処理を１回反復し、樹脂を最後にＤＭＦ（３×２５ｍＬ）で洗浄して、標準的な方法で乾燥した。

ステップ３−ｂ：Ｆｍｏｃ保護基を脱保護する標準的な手法
ステップ３−ａの樹脂をピペリジンのＤＭＦ（２０％，ｖ／ｖ，２５ｍＬ）溶液で処理して、５分撹拌し、次いでろ過した。この過程を、２０分にした以外は同様にしてもう１回繰り返し、樹脂を最後にＤＭＦ（２×２５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×２５ｍＬ）、ＤＭＦ（２×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（２×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄した。

ステップ３−ｃ１：Ｆｍｏｃ−保護された、ｐ−ニトロフェニルカルボネートまたはｐ−ニトロフェニルカルバメート（ＢＢ₂）のカップリング
Ｆｍｏｃ−保護アミノアルコールまたはモノ−Ｆｍｏｃ−保護ジアミン誘導体（ＢＢ₂， ０．８４ｍｍｏｌ，４ｅｑ）およびＨＯＢｔ（１４１ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ，４．４ ｅｑ）を含有するＤＭＦ（４ｍｌ）溶液をステップＡ−２の樹脂（４１０ｍｇ，０．２１ ｍｍｏｌ）に添加した。この懸濁液にＤＩＰＥＡ（３６６μＬ，２．１ｍｍｏｌ，１０ｅｑ）を添加し、生じた混合物を１２時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）およびＤＭＦ（３×５ｍＬ）で連続的に洗浄し、次いで標準的な方法で乾燥した。

ステップ３−ｃ２：Ｆｍｏｃ保護法を使用する標準的なアミノ酸カップリング手法
他の実施態様では、アミノ酸はこの位置で存在することが望ましいと思われる。そのような例には、この手法を使用する。Ｆｍｏｃ（またはＤｄｚ）−保護アミノ酸（ＢＢ₂， ０．５３ｍｍｏｌ，２．５ｅｑ）およびＨＯＢｔ（１２１ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ，３．７５ｅｑ）を含有するＤＭＦ（２．３ｍｌ）溶液にＤＩＣ（９４μＬ，０．５８ｍｍｏｌ， ２．５０ｅｑ）を添加した。その後、ここで活性化されたアミノ酸を含有するこの溶液をステップＡ−２からの樹脂懸濁液（０．２１ｍｍｏｌ，２１０ｍｇ）に添加し、３時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で連続的に洗浄し、次いで標準的な方法で乾燥した。

ステップ３−ｄ：ＢＢ₂のＦｍｏｃ−保護基の除去
ステップ３−ｃ１に記載するようであるが、１／５のスケールで樹脂を処理した。

ステップ３−ｅ：Ｂｔｓ−アミノ酸（ＢＢ₁）のカップリング
Ｂｔｓ−アミノ酸（ＢＢ₁，０．４２ｍｍｏｌ，２ｅｑ）、ＴＢＴＵ（２０２ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ，３ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（２２０μＬ，１．２６ｍｍｏｌ，６ｅｑ）を含有するＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液をステップ３−ｄで得られた樹脂に添加し、３時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で連続的に洗浄し、その後、標準的な方法で乾燥した。

ステップ３−ｆ：Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応
Ｎ−保護テザーアルコール（０．８４ｍｍｏｌ，４ｅｑ）およびトリフェニルホスフィン（２２０ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ，４ｅｑ）を含有するトルエン（２ｍＬ）／テトラヒドロフラン（２ｍＬ）混合物の溶液をステップ３−ｅで得られた樹脂に添加した。最後に、ＤＩＡＤ（１６６μＬ，０．８４ｍｍｏｌ，４ｅｑ）を添加し、得られた混合物を１２時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＤＭＦ（２×５ｍＬ）、ｉＰｒＯＨ（２×５ｍＬ）、ＤＣＭ（４×５ｍＬ）で連続的に洗浄し、標準的な方法で乾燥した。

ステップ３−ｇ：保護された大環状分子前駆体を、２−クロロトリチルクロライド樹脂から切断する標準的な手法
ステップ３−ｆで得られた樹脂を、酢酸：トリフルオロエタノール：ＤＣＭ（１：１：８，ｖ／ｖ／ｖ，５ｍＬ）の混合物で２時間処理した。樹脂をろ過し、１：１：８混合物の調製直後の２．５ｍＬで１回洗浄した。トルエン（１５ｍＬ）をろ液に添加し、溶媒を減圧下留去した。このようにして、大環状分子前駆体として作用するアルキル化トリペプチドを通常は白色の固体として得た。切断前に量を確認するために、樹脂の正確な重量を得て、観察される重量増加と切断から生じる量とを比較した。

ステップ３−ｈ：活性化した樹脂に大環状分子前駆体をローディングする標準的な手法
アルキル化トリペプチド（０．０５ｍｍｏｌ）を含有するＤＣＭ（５ｍＬ）溶液を活性化した樹脂、例えば、ＴＦＰ樹脂（２１３）、ｏ−ニトロフェノール樹脂（２１４）またはｏ−クロロフェノール樹脂（２１５）（３００ｍｇ）に添加した。この場合には、後者を使用した。最後に、ＤＭＡＰ（１ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，０．２ｅｑ）およびＤＩＣ（２３μＬ，０．１５ｍｍｏｌ，３ｅｑ）を添加し、懸濁液を１２時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＤＣＭ（２×５ｍＬ）、ＴＨＦ（２×５ｍＬ）、ＤＣＭ（３×５ｍＬ）で連続的に洗浄し、次いで標準的な方法で乾燥した。

ステップ３−ｉ：活性化した樹脂での大環状化
ステップ３−ｈで得られた樹脂を、２％ＴＦＡ、３％ＴＥＳ（またはＴＩＰＳ）のＤＣＭ（ｖ／ｖ／ｖ，５ｍＬ）溶液で３０分間処理して、テザー要素からＮ−Ｄｄｚ保護基を脱離させた。樹脂をろ過し、ＤＣＭ（２×５ｍＬ）で洗浄した。Ｄｄｚ脱保護後、樹脂を２．５％ＤＩＰＥＡのＴＨＦ（５ｍＬ）溶液で１時間処理した。反応中溶液の塩基性を確認し（濡れたｐＨ試験紙）、適宜さらにＤＩＰＥＡを添加して塩基性を維持した。樹脂をろ過し、２．５％ＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液の調製直後の２．５ｍＬですすいだ。ろ液を合わせて減圧下に蒸発させた。残渣にＨ₂Ｏを添加することによって大環状分子の沈殿を誘発した。ろ過して大環状分子を回収し、Ｈ₂Ｏで洗浄して、残存する塩を全て除去した。または、樹脂をＨ₂Ｏで粉砕した。

ステップ３−ｊ：ステップ３−ｉで得られた大環状分子を連続的に標準的な脱保護条件に付して、最終の大環状分子を得た。

実施例４：ペプチドサロゲートＳ３を含有する式Ｉの大環状化合物の代表的な合成
この合成を図６に示す。プロトコールは、ペプトイド部分を導入するために以前に報告されている方法の別法を強調している。

ステップ４−ａ：５００ｍＬの固相合成反応器中で、２−クロロトリチルクロライド樹脂（１６．５ ｇ，ローディング２．０ ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＣＭ（３５０ｍＬ）に懸濁させた。生じたスラリーを３０分撹拌し、ろ過し、ＤＣＭ（２×３５０ｍＬ）で洗浄した。別に、Ｂｔｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１３．４ｇ，１．５ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１７．２ｍＬ，３．０ｅｑ）のＤＣＭ（３５０ｍＬ）溶液を調製して、Ｂｔｓ−Ｇｌｙ塩を形成した。このカルボキシレート塩溶液を樹脂混合物に添加し、さらに２．５時間撹拌した。反応混合物をろ過し、回収した樹脂を、ＤＭＦ（３×３５０ｍＬ）、２−プロパノール（３× ３５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×３５０ｍＬ）で逐次的に洗浄した。最後に、樹脂に残存する全ての活性部位は、１時間撹拌しながら、８５／１０／５ ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（３５０ｍＬ）溶液で処理して中和した。生じた樹脂をろ過して収集し、ＤＭＦ（３×３５０ｍＬ）、２−プロパノール（３×３５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×３５０ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下乾燥して、１８．７３ｇの４−１を得た。

ステップ４−ｂ：樹脂４−１（１．３ｇ）に、ベンジルアルコール（５３．８□ｌ，４．０ｅｑ）とトリフェニルホスフィン（１．４０ｇ，４．０ｅｑ）とを含むＴＨＦ１０ｍＬおよびトルエン１０ｍＬの溶液を添加した。樹脂混合物を１分撹拌し、次いでジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ，１．０２ｍＬ，４．０ｅｑ）を添加して、撹拌を１２時間継続した。樹脂をろ過して集め、ＤＭＦ（４×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（４×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下乾燥して４−２を得た。

ステップ４−ｃ：樹脂Ａ２に、メルカプトエタノール（４１０μＬ，１０ｅｑ）およびｎ−プロピルアミン（５００μＬ，１０ｅｑ）のＤＭＦ（９ｍＬ）溶液を添加し、生じたスラリーを３時間撹拌した。樹脂をろ過して集め、ＤＭＦ（３×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下で乾燥して４−３を得た。

ステップ４−ｄ：樹脂４−３にＢｔｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（６９５ｍｇ，１．５ｅｑ）およびＤＥＢＰＴ（７６３ｍｇ）の９．４ｍＬのＤＭＦ溶液を添加した。樹脂混合物を１分撹拌し、次いでＤＩＰＥＡ（６６６μＬ，２．５ｅｑ）を添加し、撹拌を３時間継続した。樹脂をろ過して収集し、ＤＭＦ（３×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下で乾燥して４−４を得た。

ステップ４−ｅ：樹脂４−４に、ｎ−ブタノール（３６６μＬ，４．０ｅｑ）およびトリフェニルホスフィン（１．０５ ｍｇ，４．０ｅｑ）を含むＴＨＦ１０ｍＬおよびトルエン１０ｍＬの溶液を添加した。樹脂混合物を１分撹拌し、次いでＤＩＡＤ（７８８μＬ，４．０ｅｑ）を添加し、撹拌を１２時間継続した。樹脂をろ過して収集し、ＤＭＦ（４×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（４×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下に乾燥して４−５を得た。

ステップ４−ｆ：樹脂Ａ５に、メルカプトエタノール（６００μＬ，１０ｅｑ）、ｎ−プロピルアミン（５００μＬ，１０ｅｑ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液を添加して、生じたスラリーを３時間撹拌した。樹脂をろ過して収集し、ＤＭＦ（３×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下に乾燥して４−６を得た。

ステップ４−ｇ：樹脂４−６に、Ｂｔｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（６９５ｍｇ，１．５ｅｑ）およびＤＥＢＰＴ（７６３ｍｇ）のＤＭＦ９．４ｍＬの溶液を添加した。樹脂混合物を１分撹拌し、次いでＤＩＰＥＡ（６６６μＬ，２．５ｅｑ）を添加し、撹拌を３時間継続した。樹脂をろ過して収集し、ＤＭＦ（３×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下に乾燥して４−７を得た。

ステップ４−ｈ：樹脂４−７に、Ｄｄｚ−Ｔ１（１．３ｇ，４．０ｅｑ）およびトリフェニルホスフィン（１．０５ｇ，４．０ｅｑ）を含むＴＨＦ１０ｍＬおよびトルエン１０ｍＬの溶液を添加した。樹脂混合物を１分撹拌し、次いで、ＤＩＡＤ（７８８μＬ，４．０ｅｑ）を添加し、撹拌を１２時間継続した。樹脂をろ過して収集し、ＤＭＦ（４×２５ｍＬ）、２−プロパノール（３×２５ｍＬ）およびＤＣＭ（４×２５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、真空下に乾燥して４−８を得た。

ステップ４−ｉ：樹脂４−８に、ＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１／１／８）の溶液１０ ｍＬを添加し、２時間撹拌した。樹脂をろ過して、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を蒸発乾固し、残渣を高真空下でさらに乾燥した。残存する切断生成物を４ｍＬのＤＣＭに溶解し、２−クロロフェノール樹脂（４５０ｍｇ）、ＤＩＣ（１５０μＬ）およびＤＭＡＰ（１５ｍｇ）に添加し、終夜撹拌した。樹脂をＤＣＭ（３×）で洗浄し、次いで真空下に乾燥して４−９を得た。

ステップ４−ｊ：樹脂４−９に、３％ＴＦＡのＤＣＭ溶液５ｍＬを添加し、生じたスラリーを１５分撹拌した。樹脂をろ過し、この処理を１回繰り返し、次いで樹脂をＤＣＭ（３×５ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥した樹脂に２．５％ＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液５ｍＬを添加し、１時間撹拌した。樹脂をろ過し、ＴＨＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。ろ液を減圧下に蒸発させ、残渣を真空下に乾燥して、大環状分子４−１０を得た。

ステップ４−ｋ：標準的な条件を使用して、４−１０のＢｔｓ基を脱離させて、全て脱保護された最終的な大環状分子４−１１を得た。この化合物は標準的な方法によってさらに精製することができた。

本発明の化合物の生物的評価
それぞれ、方法Ｂ１およびＢ２に記載されている競合的放射性リガンド結合アッセイを使用して、ヒトモチリン受容体およびヒトグレリン受容体において相互作用する能力について、本発明の化合物を評価した。それぞれ、モチリンおよびグレリン受容体について方法Ｂ３およびＢ４に記載されている機能アッセイを使用して相互作用のさらなる特徴づけを実施することができる。これらの方法は全て、それが望ましい場合には、多数の化合物の同時評価を可能にする高スループット方法で実施することができる。

方法Ｂ１およびＢ２を使用する本発明の代表的な化合物の調査の結果を表３に示す。

実施例方法Ｂ１：競合的放射性リガンド結合アッセイ（モチリン受容体）
材料：
・膜は、ヒトモチリン受容体を安定に形質移入したＣＨＯ細胞から調製し、１．５μｇ／アッセイポイントの量で使用した。［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（商標） ＳｉｇｎａｌＳｃｒｅｅｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃６１１０５４４］
・［¹²⁵Ｉ］−モチリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃ＮＥＸ−３７８）；最終濃度：０．０４〜０．０６ｎＭ
・モチリン（Ｂａｃｈｅｍ（商標），＃Ｈ−４３８５）；最終濃度：１μＭ
・Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔプレート−ＧＦ／Ｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標），＃ＭＡＨＦＢ１Ｈ６０）
・ディープ−ウェルポリプロピレンタイタープレート（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標），＃２６７００６）
・ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６００５１８５）
・ボトムシール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＭＡＴＡＨ０Ｐ００）
・ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６０１３６１１）
・結合緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ

アッセイ容量：
・結合緩衝液で希釈した膜 １５０μＬ
・結合緩衝液で希釈した化合物 １０μＬ
・結合緩衝液で希釈した放射性リガンド（［¹²⁵Ｉ］−モチリン） １０μＬ

化合物の最終試験濃度（Ｎ＝１１）：
１０，５，２，１，０．５，０．２，０．１，０．０５，０．０２，０．０１，０．００５ μＭ。

化合物の取扱：
化合物は、１００％ ＤＭＳＯで希釈された１０ｍＭのストック濃度でドライアイスで凍結されて提供され、試験日まで−２０℃で保存した。試験日に、化合物を室温において解凍し、次いで望ましい試験濃度に従ってアッセイ緩衝液で希釈した。これらの条件下では、アッセイの最大最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。

アッセイプロトコール：
ディープ−ウェルプレートにおいて、希釈した細胞膜（１．５μｇ／ｍＬ）を、結合緩衝液（全結合、Ｎ＝５）、１ μＭのモチリン（非特異的結合、Ｎ＝３）または適当な濃度の試験化合物のいずれか１０μＬと合わせる。各ウェルに１０μｌの［¹²⁵Ｉ］−モチリン（最終濃度０．０４〜０．０６ｎＭ）を添加することによって反応を開始する。プレートをＴｏｐＳｅａｌ−Ａで密封し、ゆっくりボルテックスし、室温において２時間インキュベートする。Ｔｏｍｏｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用して、事前に浸漬しておいた（０．３％ポリエチレンイミン、２時間）Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔプレートで試料をろ過して反応を停止し、５００μＬの冷却した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）で９回洗浄し、次いでプレートを３０分間ドラフトで空気乾燥する。ボトムシールをプレートに適用してから、各ウェルに２５μＬのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−０を添加する。次いで、プレートをＴｏｐＳｅａｌ−Ａで密封し、ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションおよび発光カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でウェルあたり３０秒計数し、結果を１分あたりの計数（ｃｐｍ）として表す。
データは、変数勾配の非線形回帰分析を使用するＧｒａｐｈＰａｄ（商標） Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によって分析した。Ｋ_i値は、（予め膜特徴付け中に測定されている）［¹²⁵Ｉ］−モチリンの０．１６ｎＭのＫ_d値を使用して算出した。

式中、全および非特異的結合は、それぞれ、１μＭのモチリンの非存在下または存在下において得られるｃｐｍを表す。

実施例方法Ｂ２：競合的放射性リガンド結合アッセイ（グレリン受容体）
ヒト成長ホルモン分泌促進受容体（ｈＧＨＳ−Ｒ１ａ）における競合的結合アッセイを、文献に記載されているアッセイと同様に実施した。（Ｂｅｄｎａｒｅｋ ＭＡ ｅｔ ａｌ． （２０００）， 新規成長ホルモン−放出ペプチドグレリンの構造−機能研究：成長ホルモン分泌促進受容体１ａの活性化に必要なグレリンの最小配列（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｎｅｗ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｈｒｅｌｉｎ： ｍｉｎｉｍａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ａ）； Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４３：４３７０−４３７６． Ｐａｌｕｃｋｉ ＢＬ ｅｔ ａｌ． （２００１）， グレリン模倣物としてのスピロ（インドリン−３，４’−ピペリジン）成長ホルモン分泌促進薬（Ｓｐｉｒｏ（ｉｎｄｏｌｉｎｅ−３，４'−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ） ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ ａｓ ｇｈｒｅｌｉｎ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）； Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １１：１９５５−１９５７．）

材料
・膜（ＧＨＳ−Ｒ／ＨＥＫ ２９３）は、ヒトグレリン受容体（ｈＧＨＳ−Ｒ１ａ）を安定に形質移入したＨＥＫ−２９３細胞から調製した。これらの膜は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＢｉｏＳｉｇｎａｌ（＃ＲＢＨＧＨＳＭ，ｌｏｔ＃１８８７）によって提供され、０．７１μｇ／アッセイポイントの量で使用した。
・［¹²⁵Ｉ］−グレリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃ＮＥＸ−３８８）；最終濃度：０．００７０〜０．００８５ｎＭ
・グレリン（Ｂａｃｈｅｍ，＃Ｈ−４８６４）；最終濃度：１□Ｍ
・Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔプレート−ＧＦ／Ｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＭＡＨＦＣ１Ｈ６０）
・ディープ−ウェルポリプロピレンタイタープレート（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，＃２６７００６）
・ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６００５１８５）
・ボトムシール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＭＡＴＡＨ０Ｐ００）
・ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６０１３６１１）
・結合緩衝液：２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％ ＢＳＡ

アッセイ容量
競合実験はろ過アッセイフォーマット３００μＬで実施した。
・結合緩衝液で希釈した膜 ２２０μｌ
・結合緩衝液で希釈した化合物 ４０μｌ
・結合緩衝液で希釈した放射性リガンド（［¹²⁵Ｉ］−グレリン） ４０μｌ

本発明の化合物の最終試験濃度（Ｎ＝１）：
１０、１、０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、０．００１ μＭ。

化合物の取扱：
化合物は、１００％ ＤＭＳＯで希釈された１０ｍＭのストック濃度でドライアイスで凍結されて提供され、試験日まで−８０℃で保存した。試験日に、化合物を室温において終夜解凍し、次いで望ましい試験濃度に従ってアッセイ緩衝液で希釈した。これらの条件下では、アッセイの最大最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった

アッセイプロトコール：
ディープ−ウェルプレートにおいて、希釈した細胞膜（最終濃度：０．７１μｇ／ウェル）２２０μＬを、結合緩衝液（全結合、Ｎ＝５）、１μＭのグレリン（非特異的結合、Ｎ＝３）または適切な濃度の試験化合物（各試験濃度についてＮ＝２）のどれか４０μＬと合わせた。各ウェルに４０□Ｌの［¹²⁵Ｉ］−グレリン（最終濃度０．００７０〜０．００８５ｎＭ）を添加することによって反応を開始した。プレートをＴｏｐＳｅａｌ−Ａで密封し、ゆっくりボルテックスし、室温において３０分インキュベートした。Ｔｏｍｏｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用して、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｈａｒｖｅｓｔプレート（０．５％ポリエチレンイミンで事前に浸漬）で試料をろ過して反応を停止し、５００ □Ｌの冷却した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４，４℃）で９回洗浄し、次いでプレートを３０分間ドラフトで空気乾燥した。ボトムシールをプレートに適用してから、各ウェルに２５μＬのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−０を添加した。次いで、プレートをＴｏｐＳｅａｌ−Ａで密封し、ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションおよび発光カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、６０秒のカウント遅延を使用して、ウェルあたり３０秒計数した。結果は１分あたりの計数（ｃｐｍ）として表した。

データは、変数勾配の非線形回帰分析を使用するＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によって分析した。Ｋ_i値は、（予め膜特徴付け中に測定されている）［¹²⁵Ｉ］−グレリンの０．０１ｎＭのＫ_d値を使用して算出した。
Ｄ_max値は、以下の式を使用して算出した：

式中、全および非特異的結合は、それぞれ、１μＭのグレリンの非存在下または存在下において得られるｃｐｍを表す。

実施例方法Ｂ３：エクオリン機能アッセイ（モチリン受容体）
材料：
・膜は、ヒトモチリン受容体を発現するＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＥＵＲＯＳＣＲＥＥＮ，ベルギー）細胞系統（細胞系統ＥＳ−３８０−Ａ；受容体受託番号＃ＡＦ０３４６３２）を使用して調製した。この細胞系統は、Ｇα₁₆およびミトコンドリア標的エクオリン（Ｒｅｆ ＃ＥＳ−ＷＴ−Ａ５）を共発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にヒトモチリン受容体を形質移入することによって構築する。
・モチリン（Ｂａｃｈｅｍ， ＃Ｈ−４３８５）
・アッセイ緩衝液：１５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ ７．０）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２（ダルベッコ変法イーグル培地）
・セレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）， Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）

化合物の最終試験濃度（Ｎ＝５）：
１０、３．１６、１、０．３１６、０．１ μＭ。

化合物の取扱：
化合物は、フォーマット済みの９６−ウェルプレートで約１．２μｍｏｌの量の乾燥フィルムとして提供された。化合物は１００％ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度で溶解し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。０．１％ＢＳＡを添加した３０％ＤＭＳＯ中５００μＭの濃度でドータープレートを調製し、試験時まで−２０℃で保存した。試験日に、化合物を室温において解凍し、望ましい試験濃度に従ってアッセイ緩衝液で希釈した。これらの条件下では、アッセイの最大最終ＤＭＳＯ濃度は０．６％であった。

細胞調製：
５ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＣａ²⁺およびＭｇ²⁺−不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を培養プレートから採集し、１０００×ｇで２分間でペレット化し、アッセイ緩衝液（上記参照）で５×１０⁶細胞／ｍＬの密度で再懸濁させ、５ μＭのセレンテラジンの存在下において一晩インキュベートした。ローディング後、細胞をアッセイ緩衝液で５×１０⁵細胞／ｍＬの濃度に希釈した。

アッセイプロトコール：
アゴニスト試験では、９６−ウェルプレートにおいて５０μｌの細胞懸濁液を５０ μｌの適切な濃度の試験化合物またはモチリン（基準アゴニスト）と混合した（二重試料）。受容体活性化によって生じる発光を、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ６０００「ＦＤＳＳ ６０００」（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，日本）を使用して記録した。

アンタゴニスト試験では、アゴニスト試験の終了時から１５〜３０分経過時に、試験化合物を含有する細胞懸濁液に適当なＥＣ８０濃度のモチリン（すなわち、０．５ｎＭ；１００μＬ）を注入し（二重試料）、受容体活性化によって生じる発光を上記のパラグラフに記載するように測定した。

結果は相対的光線単位（ＲＬＵ）として表す。等式Ｅ＝Ｅ_max／（１＋ＥＣ₅₀／Ｃ）ｎ（式中、Ｅは所定のアゴニスト濃度（Ｃ）における測定されたＲＬＵ値であり、Ｅ_maxは最大応答であり、ＥＣ₅₀は５０％刺激を生ずる濃度であり、ｎは傾斜指数である）に基づいて非線形回帰分析（シグモイダル用量−応答）によって、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用して濃度応答曲線を分析した。アゴニスト試験では、各濃度の試験化合物の結果は、ＥＣ₈₀に等しい濃度（すなわち、０．５ｎＭ）のモチリンによって誘導される信号に対する活性の割合（％）として表した。アンタゴニスト試験では、各濃度の試験化合物の結果は、ＥＣ₈₀に等しい濃度（すなわち、０．５ｎＭ）のモチリンによって誘導される信号に対する阻害の割合（％）として表した。

実施例方法Ｂ４：エクオリン機能アッセイ（グレリン受容体）
材料
・膜は、ヒトグレリン受容体を発現するＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ（商標）（（ＥＵＲＯＳＣＲＥＥＮ，ベルギー）細胞系統（細胞系統ＥＳ−４１０−Ａ；受容体受託番号＃６０１７９）を使用して調製した。この細胞系統は、Ｇα₁₆およびミトコンドリア標的エクオリン（Ｒｅｆ ＃ＥＳ−ＷＴ−Ａ５）を共発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にヒトグレリン受容体を形質移入することによって構築する。
・グレリン（基準アゴニスト；Ｂａｃｈｅｍ， ＃Ｈ−４８６４）
・アッセイ緩衝液：０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン；ｐＨ７．０）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）
・セレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）

本発明の化合物の最終試験濃度（Ｎ＝８）：
１０、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１ μＭ。

化合物の取扱
化合物のストック溶液（１０ｍＭの１００％ ＤＭＳＯ溶液）は、ドライアイスで凍結されて提供され、使用時まで−２０℃で保存した。ストック溶液から、２６％ ＤＭＳＯで２０倍希釈することによって５００□Ｍ濃度のマザー溶液を作製した。次いで、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ培地で適切に希釈することによってアッセイプレートを作製した。これらの条件においては、アッセイの最大の最終ＤＭＳＯ濃度は＜０．６％であった。

細胞調製
５ ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＣａ²⁺およびＭｇ²⁺−不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ（商標）細胞を培養プレートから採集し、１０００×ｇで２分間でペレット化し、０．１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２で５×１０⁶細胞／ｍＬの密度で再懸濁させ、５□Ｍのセレンテラジンの存在下に室温において一晩インキュベートした。ローディング後、細胞をアッセイ緩衝液で５×１０⁵細胞／ｍＬの濃度に希釈した。

アッセイプロトコール
アゴニスト試験では、９６−ウェルプレートにおいて５０□Ｌの細胞懸濁液を５０□Ｌの適切な濃度の試験化合物またはグレリン（基準アゴニスト）と混合した（二重試料）。実験をバリデートするために、グレリン（基準アゴニスト）は、試験化合物と同時にいくつかの濃度において試験した。グレリンまたは試験化合物に応答した受容体活性化によって生じる発光を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ ６０００リーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，日本）を使用して記録した。

結果の分析および提示
結果は相対発光量（ＲＬＵ）として表した。等式Ｅ＝Ｅ_max／（１＋ＥＣ₅₀／Ｃ）ｎ（式中、Ｅは所定のアゴニスト濃度（Ｃ）における測定されたＲＬＵ値であり、Ｅ_maxは最大応答であり、ＥＣ₅₀は５０％刺激を生ずる濃度であり、ｎは傾斜指数である）に基づいて非線形回帰分析（シグモイダル用量−応答）によって、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用して濃度応答曲線を分析した。アゴニスト試験では、各濃度の試験化合物の結果は、ＥＣ₈₀に等しい濃度（すなわち、３．７ ｎＭ）のグレリンによって誘導される信号に対する活性の割合（％）として表す。ＥＣ₅₀ Ｈｉｌｌ傾斜および％Ｅ_max値を記録する。

表３：本発明の代表的な化合物の生物活性

１．示す活性は以下の範囲で示した：
Ａ＝０．０１〜０．１０μＭ、Ｂ＝０．１〜１．０μＭ、Ｃ＝１．０〜１０．０μＭ
２．結合は実施例に記載する標準的な方法を使用して実施した。

本発明の好ましい実施態様が本明細書において詳細に記載され、添付の図面に例示されているが、本発明はこれらの正確な実施態様に限定されず、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、種々の変更および改良を実施できることが理解されるべきである。

本発明の化合物の固相合成の一方法を示す一般的なスキームである。 本発明の化合物の固相合成の第二の方法を示す一般的なスキームである。 代表的なペプチド結合サロゲートの構造およびペプチド残基の置換を示す。 本発明の代表的な化合物の合成スキームを示す。 本発明の代表的な化合物の合成スキームを示す。 本発明の代表的な化合物の合成スキームを示す。

Claims (12)

1. 式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   Ａ₃およびＡ₄は、必要に応じて、存在し、
   Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＡ₄は、式Ｓ１〜Ｓ２１
   

   

   （式中、
   ＲおよびＲ’は、天然アミノ酸の側鎖または非天然アミノ酸の側鎖から選択されるが、ただし、Ｒ’は水素でなく、
   Ｒ’’は水素またはアルキルであり、
   ｍは０、１または２であり、
   ｎは０、１または２である）からなる群から選択されるが、ただし、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃またはＡ₄の少なくとも１つは式Ｓ２〜Ｓ２１からなる群から選択され、
   Ｘは−Ｏ−または−ＮＲ₁−（式中、Ｒ₁は、水素、アルキル、置換アルキル、ホルミル、アシルおよびスルホニルからなる群から選択される）であり、
   Ｔは、式ＩＩ：
   −Ｊ−（ＣＨ₂）_d−Ｋ−（ＣＨ₂）_e−Ｌ−（ＣＨ₂）_f− （ＩＩ）
   （式中、
   ＪはＸに結合しており、−ＣＨ₂−または−Ｃ（＝Ｏ）−から選択される二価の基であり、
   ｄ、ｅおよびｆは、各々独立して、０、１、２、３、４または５から選択され、
   Ｌは、必要に応じて、存在し、
   ＫおよびＬは、独立して共有結合または：
   −Ｏ−、−ＮＲ₂−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ₃−、−ＮＲ₃Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ₂ＮＲ₄−、−ＮＲ₄−ＳＯ₂−、−ＣＲ₅Ｒ₆−、−ＣＨ（ＯＲ₇）−、ＺまたはＥ配置の−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−および
   

   

   からなる群から選択される二価の基であり、式中、
   Ｒ₂は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ホルミル、アシル、カルボキシアルキル、カルボキシアリール、アミド、アミジノ、ウレイド、スルホニルおよびスルホンアミドからなる群から選択され、
   Ｒ₃およびＲ₄は、独立して、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルから選択され、
   Ｒ₅およびＲ₆は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅またはＲ₆の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
   Ｒ₇は、水素、アルキル、置換アルキル、ホルミルおよびアシルからなる群から選択され、
   Ｇ₁およびＧ₂は、独立して、共有結合または：
   −Ｏ−、−ＮＲ₈−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₉−、−ＮＲ₉−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ₂−ＮＲ₁₀−、−ＮＲ₁₀−ＳＯ₂−、−ＣＲ₁₁Ｒ₁₂−、ＺまたはＥ配置の−ＣＨ＝ＣＨ−および−Ｃ≡Ｃ−
   （式中、
   Ｒ₈は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ホルミル、アシル、カルボキシアルキル、カルボキシアリール、アミド、アミジノ、ウレイド、スルホニルおよびスルホンアミドからなる群から選択され、
   Ｒ₉およびＲ₁₀は、独立して、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルから選択され、
   Ｒ₁₁およびＲ₁₂は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノから選択されるが、ただしＲ₁₁またはＲ₁₂の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルである）からなる群から選択される二価の基であるが、ただしＧ₁はＪに最も近く、Ｇ₁またはＧ₂は、１，２または１，３または１，４の相対的配置で互いに結合していてもよい）の二価の基である］の化合物。
2. Ｔが：
   

   

   ［式中、波線は、Ｅ、Ｚ、またはＥとＺの混合の二重結合配置を示し、
   Ｍ₁、Ｍ₂、Ｍ₃、Ｍ₄およびＭ₅は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ₁₈（式中、Ｒ₁₈は、水素、アルキル、置換アルキル、ホルミル、アシルおよびスルホニルからなる群から選択される）から選択され、
   ｆ₁、ｆ₂、ｆ₄、ｆ₇およびｆ₁₀は、独立して、１、２、３または４から選択され、
   ｆ₃およびｆ₈は、独立して、２または３から選択され、
   ｆ₅、ｆ₁₁、ｆ₁₃、ｆ₁₄ およびｆ₁₅は、独立して、１または２から選択され、
   ｆ₆は、０、１、２、３または４であり、
   ｆ₉は、０、１または２であり、
   （Ｘ）は、ＴがＸに結合する地点を示し、
   （Ｗ）は、ＴがＡ₂、Ａ₃またはＡ₄ に結合する地点を示す］からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
3. 式（ＩＩＩ）：
   

   

   ［式中、
   Ａ₃およびＡ₄は、必要に応じて存在し、
   Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＡ₄は、式Ｓ１〜Ｓ２１：
   

   

   （式中、
   ＲおよびＲ’は、天然アミノ酸の側鎖または非天然アミノ酸の側鎖から選択されるが、ただし、Ｒ’は水素でなく、
   Ｒ’’は水素またはアルキルであり、
   ｍは０、１または２であり、
   ｎは０、１または２である）からなる群から選択されるが、ただしＡ₁、Ａ₂、Ａ₃またはＡ₄の少なくとも１つは式Ｓ２〜Ｓ２１からなる群から選択され、
   Ｘは−Ｏ−または−ＮＲ₁−（式中、Ｒ₁は、水素、アルキル、置換アルキル、ホルミル、アシルおよびスルホニルからなる群から選択される）であり、
   Ｔ₂は
   

   

   （式中、波線は（Ｒ）または（Ｓ）立体化学またはその混合を示し、
   ｑ₁、ｑ₂、ｑ₃、ｑ₆、ｑ₇、ｑ₈、ｑ₉、ｑ₁₀、ｑ₁₁、ｑ₁₃、ｑ₁₅およびｑ₁₆は、各々独立して、１、２、３、４または５であり、
   ｑ₄およびｑ₁₈は、独立して、１または２であり、
   ｑ₅は２、３または５であり、
   ｑ₁₂およびｑ₁₄は、各々独立して、０、１、２、３または４であり、
   ｑ₁₇は０、１、２または３であり、
   Ｐ₁、Ｐ₂、Ｐ₃、Ｐ₄およびＰ₅は、各々独立してＯ、ＳまたはＮＨであり、
   Ｐ₆はＮまたはＣＨであり、
   Ｐ₇はＯまたはＣＲ₅₂Ｒ₅₃であり、
   Ｒ₃₆は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、ベンジルまたはアシルであり、
   Ｒ₅₀およびＲ₅₁は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅₀またはＲ₅₁の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
   Ｒ₅₂およびＲ₅₃は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択されるが、ただしＲ₅₂またはＲ₅₃の１つがヒドロキシ、アルコキシまたはアミノである場合には、他は水素またはアルキルであり、
   Ｒ₅₄、Ｒ₅₅、Ｒ₅₆、Ｒ₅₇およびＲ₅₈は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシおよびアミノからなる群から選択され、
   Ｒ_AAは天然アミノ酸の側鎖であり、
   （Ｘ）は、Ｔ₂がＸに結合する地点を示し、
   （Ｗ）は、Ｔ₂がＡ₂、Ａ₃またはＡ₄ に結合する地点を示す）からなる群から選択される二価の基である］の化合物。
4. Ｔが：
   

   

   

   からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
5. Ｔ２が：
   

   

   

   （式中、Ｙは水素、アルキル、ベンジルまたはアシルから選択される）からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
6. Ｘ、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＴが表１Ａに定義されているものである、請求項１に記載の化合物。
7. 

   からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
8. Ｘ、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＴ₂が表１Ｂに定義されているものである、請求項３に記載の化合物。
9. 請求項１に記載の構造を有する哺乳類モチリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト。
10. 請求項３に記載の構造を有する哺乳類モチリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト。
11. 請求項１に記載の構造を有する哺乳類グレリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト。
12. 請求項３に記載の構造を有する哺乳類グレリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト。

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