JP2007525184A - 均一マルチプレックススクリーニングアッセイおよびキット - Google Patents
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Abstract
Description
本発明のアッセイは、スクリーニングに適した高マルチプレックス化アッセイである。「高マルチプレックス化(highly multiplexed)」は、アッセイが、少なくとも6個、好ましくは少なくとも10個、ある実施形態においては30〜60個、さらにはそれ以上の可能な標的配列を検出しうることを意味する。
本明細書中では、短波長発蛍光団は「ハーベスター」と称され、長波長発蛍光団は「エミッター」と称される。しかし、FRET消光から生じるバックグラウンドは、分子ビーコンプローブおよびイン・ヤン・プローブにおいて一般に使用される接触媒介性消光より相当に高いため(Tyagi ら, (1998), 前掲; Marras, S.A.E.ら, (2002), Efficiencies of Fluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-Mediated Quenching in Oligonucleotide Probes, Nucleic Acids Res. 30: e122)、FRET消光は本発明のスクリーニングアッセイには好ましくない。本発明のアッセイは、好ましくは、分子ビーコンプローブまたはイン・ヤン・プローブのような接触媒介性消光により消光されるプローブを使用する。本発明者にとって最も好ましいプローブは、非蛍光消光剤を含む分子ビーコンプローブである。これらのプローブが最も好ましいのは、それらの低いバックグラウンドシグナルのみならず、マルチプレックス系へのそれらの設計のし易さのためでもある(Bonnet, G.ら, (1998), Thermodynamic Basis of the Enhanced Specificity of Structured DNA Probes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6171-6176)。
図1は、プローブ当たり2色または3色および4〜8個の識別可能な発蛍光団を使用して得られる識別可能な組合せの数を示す表である。
図1は、本発明において有用な或る組合せコード形式を示す表である。該表の上部は、各プローブが4、5、6、7または8個の発蛍光団のパネルからの2つの異なる発蛍光団で異なって標識されることにより得られるコードの数を示す。該パネルが8個の発蛍光団を含む場合には、28個の可能なコードが存在する。該表の下部は、各プローブが5、6、7または8個の発蛍光団の同一パネルからの3つの異なる発蛍光団で標識されることにより得られるコードの数を示す。該パネルが8個の発蛍光団を含む場合には、56の可能性が存在する。本発明のアッセイは、各プローブの、2つ又は3つ(および時には4つ)の異なって標識された部分、および少なくとも6つの異なってコードされたプローブを許容するのに十分なサイズの発蛍光団のパネルを使用する。これは、例えば、該表の2つの部分を組合せることにより、すなわち、2色の両方のコードおよび3色のコードを使用することにより達成されうる。例えば、プローブを、5つの発蛍光団のパネルと共に使用するための3つの部分に細分して、10個までの異なってコードされたプローブを得ることが可能であり(該表の下部に大まかに示されているとおり)、追加的なプローブを、5つの発蛍光団のパネルと共に使用する2つの部分に細分して、10個までの追加的な異なってコードされたプローブを得ることが可能である(該表の上部に大まかに示されているとおり)。このようにして、20個もの異なってコードされたプローブを、同じアッセイ混合物中で組合せることが可能である。
本実施例においては、感染性細菌を含有する疑いのある通常は無菌の血液サンプルから単離したDNAに対してリアルタイムPCR増幅アッセイを行う。反応混合物中に存在するプライマーのセットは、血液サンプル中に恐らく存在すると疑われる細菌種のすべてに存在する16sリボソームRNA遺伝子の断片の増幅を可能にする。該アッセイにおいては、多数の分子ビーコンプローブが、疑われる細菌標的種のそれぞれに1つずつ存在する。それぞれの異なる分子ビーコンは、その3'末端に共有結合した汎用消光剤部分(ダブシル(dabcyl))を有する。それぞれの異なる種特異的分子ビーコンプローブを、3つの異なる色の発蛍光団の特有のセットで、本発明の組合せ様態で標識する。これらの発蛍光団を各オリゴヌクレオチドのそれぞれの5'末端に共有結合させる。アッセイ混合物中に存在するそれぞれの種特異的プローブについて、一緒になって種特異的プローブを構成する、3つの異なる色のオリゴヌクレオチドのそれぞれの存在量を、アッセイの実施前に調節して、そのプローブの3つの色のそれぞれの蛍光強度が、アッセイを行うために使用するアッセイ装置で測定した場合にほぼ同じになるようにする。図2は、このアッセイで得られる結果のプロットである。「x」軸は、蛍光の各測定を行う時点までに行った増幅サイクルの数を表す。この測定は、プローブを標識するために使用する異なる色の発蛍光団のそれぞれの蛍光強度の測定を可能にする様態で、アッセイ装置により自動で行う。「y」軸は個々の着色蛍光による蛍光強度を表す。各増幅サイクルのアニーリング段階中に測定を行う。増幅の経過の全体を通して、各増幅サイクル中にリアルタイムで測定を行う。プローブを標識するために使用した異なる色の発蛍光団のそれぞれの蛍光強度を、完了した増幅サイクルの数の関数としてプロットする。
本実施例においては、実施例1に記載のアッセイと同様にして且つ同じ目的でアッセイを行う。この実験で得られる結果を図3に示す。2つの異なるシグナルが生じ、一方(色a、bおよびcよりなる)は反応の初期に出現し、もう一方(色d、eおよびfよりなる)は反応の後期に出現する。この結果が示すところによると、2つの異なる細菌種がサンプル中に存在し、一方(色a、bおよびcにより同定される)は比較的豊富であり、もう一方(色d、eおよびfにより同定される)は比較的少量であり、したがって、種特異的プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルがバックグランド蛍光を超えて認められるのに十分な増幅産物が得られるまでに更に多くの増幅サイクルを要する。2つのシグナルのそれぞれにおける特有のセットの色は、サンプル中に存在する2つの細菌種のそれぞれを明白に同定する。
本実施例においては、実施例1に記載のアッセイと同様にして且つ同じ目的でアッセイを行う。この実験で得られる結果を図4に示す。2つの異なるシグナルが生じ、一方(色a、bおよびcよりなる)は反応の初期に出現し、もう一方(色dおよびeよりなる)は反応の後期に出現する。また、色「c」の蛍光強度を示す曲線の傾きは、後者のシグナル(色dおよびeよりなる)が生じる閾値サイクルの後で増加している。この結果は、2つの異なる細菌種がサンプル中に存在し、一方(色a、bおよびcにより同定される)が比較的豊富であり、もう一方(色c、dおよびeにより同定される)は比較的少量であり、より後に出現することを示している。色「c」の蛍光強度を示す曲線の傾きの増加は、該豊富細菌種からのDNAの増幅断片に結合するプローブからの「c」蛍光に付加された、該少量細菌種からのDNAの増幅断片に結合するプローブからの「c」蛍光の寄与によるものである。サンプル中に存在する2つの細菌種のそれぞれに関する3色コードが1つの色を共通に有している場合であっても、サンプル中の異なる濃度でのそれらの2つの種の出現は、各種からのシグナルがお互いから識別されるのを可能にする。一般に、2つ(または更には3つ)の種が臨床サンプル中に同時に存在する場合には、それぞれは、異なる濃度で存在し、細菌種のそれぞれの存在によるコード化シグナルは、サンプル中のその他の種によるシグナルから識別されうる。
本実施例は、2つの異なる種がほぼ同じ濃度でサンプル中に存在する場合であっても、明白な結果が得られうることを示す。本実施例に記載されているアッセイは、実施例1に記載のアッセイと同様にして且つ同じ目的で行う。本実施例においては、アッセイ混合物中に存在するプローブは、10個の異なる細菌種(種0、1、2、3、4、5、6、7、8および9と称される)を検出するように設計する。5つの異なる色の発蛍光団(a、b、c、dおよびe)のパレットから、それらの10個のプローブのそれぞれを標識するために、3色コードを用いる。アッセイ混合物中に存在する各種特異的プローブについて、一緒になって種特異的プローブを構成する3つの異なる色のオリゴヌクレオチドのそれぞれの存在量を、アッセイの実施前に調節して、そのプローブの3つの色のそれぞれの蛍光強度が、アッセイを行うために使用するアッセイ装置で測定した場合にほぼ同じになるようにする。このアッセイにおいては以下のコード形式(本明細書中では、「第一3色コード表」と称される)を用いる。
種1に対するプローブ abd
種2に対するプローブ abe
種3に対するプローブ acd
種4に対するプローブ ace
種5に対するプローブ ade
種6に対するプローブ bcd
種7に対するプローブ bce
種8に対するプローブ bde
種9に対するプローブ cde。
本実施例は、2つの異なる種がほぼ同じ濃度でサンプル中に存在する場合に、明白な結果が時には得られうることを示す。本実施例に記載されているアッセイは、実施例4に記載のアッセイと同様にして且つ同じ目的で行う。このアッセイにおいて使用するプローブは第一3色コード表(実施例4に示されている)を利用する。
図7に示すような結果に固有の曖昧さは、別のコード形式によりコードされる同じプローブを使用するアッセイを繰返すことにより解消されうる。例えば、図8に示す結果を与えるアッセイを、図7に示す結果を得るために使用したのと同じサンプルに対して行う。ただし、この場合には、プローブは以下の別のコード形式(本明細書中では、「第二3色コード表」と称される)によりコードされる。
種1に対するプローブ bde
種2に対するプローブ bce
種3に対するプローブ bcd
種4に対するプローブ ade
種5に対するプローブ ace
種6に対するプローブ acd
種7に対するプローブ abe
種8に対するプローブ abd
種9に対するプローブ abc。
Claims (22)
- a)異なる核酸標的にそれぞれが特異的である少なくとも6個の組合せコードされている蛍光ハイブリダイゼーションプローブを含む蛍光ハイブリダイゼーションプローブのセットとサンプルとを接触させ、ここにおいて、
i)該セット中のプローブは、少なくとも4個のスペクトル的に識別可能な発蛍光団のパネルからの4個までの異なるエミッター発蛍光団で組合せコードされており、
ii)該セット中のプローブは、その部分を異なるエミッター発蛍光団で標識することによりコードされており、
iii)各プローブ部分のハイブリダイゼーションが、その標識を示す検出可能な蛍光シグナル変化を与え、
b)該サンプルと共に存在する発蛍光団を刺激し、
c)該核酸標的をお互いから空間的に分離することなく、該発蛍光団からの発光シグナルにおける変化を検出することを含んでなる、少なくとも6個の異なる核酸標的のいずれかの存在に関してサンプルをスクリーニングするための高マルチプレックス化均一in vitroアッセイ。 - 該核酸標的を指数関数的に増幅することを更に含む、請求項1記載のアッセイ。
- 発光シグナルにおける変化を、増幅中にリアルタイムで検出する、請求項2記載のアッセイ。
- 各プローブが2個、3個または4個の異なって標識された部分を含む、請求項3記載のアッセイ。
- 各プローブの部分の相対量をお互いに対して調節して、調整されたシグナル変化を得る、請求項1記載のアッセイ。
- プローブのセットが、比コードされている少なくとも1つのプローブを更に含む、請求項1記載のアッセイ。
- 組合せコードされたプローブが、それらの標的に対するハイブリダイゼーションにより蛍光が回復する消光されたプローブである、請求項1記載のアッセイ。
- 組合せコードされたプローブが、一方のアーム上に非蛍光消光剤を有し他方のアーム上にエミッター発蛍光団を有する分子ビーコンプローブである、請求項7記載のアッセイ。
- 各プローブの部分の蛍光強度がお互いに対して調整されている、請求項8記載のアッセイ。
- 該プローブの存在下で該核酸標的を指数関数的に増幅し、エミッター発蛍光団からの蛍光における増加をリアルタイムで検出することを更に含む、請求項8記載のアッセイ。
- 各プローブが、4〜8個の識別可能な発蛍光団のパネルからの2個、3個または4個の異なって標識された部分を含み、ここにおいて、各プローブの部分の相対量をお互いに対して調節して、調整された蛍光発光を得る、請求項10記載のアッセイ。
- 全プローブの全部分の相対量をお互いに対して調節して、調整された蛍光発光を得る、請求項11記載のアッセイ。
- 異なる核酸標的にそれぞれが特異的である少なくとも6個の組合せコードされている蛍光ハイブリダイゼーションプローブを含む蛍光ハイブリダイゼーションプローブのセットを含んでなり、それらの標的に対するそのハイブリダイゼーションが、それらの標識を示す蛍光シグナル変化により、該アッセイにおいて検出されることが可能であり、該セット中のプローブが、異なるエミッター発蛍光団で各プローブの部分を標識することにより、少なくとも4個のスペクトル的に識別可能な発蛍光団のパネルからの4個までの異なるエミッター発蛍光団で組合せコードされていることを特徴とする、少なくとも6個の異なる核酸標的のいずれかの存在に関してサンプルをスクリーニングするための高マルチプレックス化in vitroアッセイにおいて使用するための試薬のキット。
- 該核酸標的の指数関数的増幅のためのプライマーを更に含む、請求項13記載のキット。
- 該プライマーを使用して該核酸標的を増幅するための増幅試薬を更に含む、請求項14記載のキット。
- 比コードされている少なくとも1つのプローブを更に含む、請求項13記載のキット。
- 組合せコードされたプローブが、それらの標的に対するハイブリダイゼーションにより蛍光が回復する消光されたプローブである、請求項13記載のキット。
- 該プローブが、一方のアーム上に非蛍光消光剤を有し他方のアーム上にエミッター発蛍光団を有する分子ビーコンプローブである、請求項17記載のキット。
- 各プローブの部分の相対量をお互いに対して調節して、調整された蛍光発光を得る、請求項18記載のキット。
- 全プローブの全部分の相対量をお互いに対して調節して、調整された蛍光発光を得る、請求項19記載のキット。
- 該核酸標的の指数関数的増幅のためのプライマーを更に含む、請求項18記載のキット。
- 該プライマーを使用して該核酸標的を増幅するための増幅試薬を更に含む、請求項21記載のキット。
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