JP2007525162A - テロメアにより開始される細胞シグナル伝達の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2003年4月11日に出願された国際出願番号PCT/US03/11393の一部係属出願であり、全文を本明細書に引用として援用する。
(1.技術分野)
本発明は、シグナル伝達経路の制御に関する。より詳しくは、本発明は、テロメア開始配列、アポトーシス、日焼けおよびDNA損傷反応の制御に関する。
人口が老齢化するに伴って、先進国世界では、ヒトの癌の頻度が増加している。癌のあるタイプと診断における症状の段階において、集中的な研究にもかかわらず近年の罹患率と死亡率は、十分に改善していない。癌の進行中、正常細胞とその組織特異性環境との相互作用の方法が制御される重要な態様である老化現象耐性およびアポトーシスを含む負調節対照に、腫瘍細胞は、ますます独立している。
本発明は、3’テロメア突出配列のMre11媒介加水分解が、老化、日焼けおよびアポトーシス等のDNA損傷に対する細胞の保護反応に重要な信号伝達カスケードを開始するという発見に基づいている。理論に制約されず、本発明者らは、UV照射、DNAに対する酸化損傷等のDNA損傷、またはDNAに対する発癌性付加物の生成、または加齢に関連するテロメアの短縮が、TTAGGGの反復を有する3’突出配列を露出するテロメアループを不安定化すると信じている。次いでテロメア関連タンパク質が配列依存の方法で突出と会合し、Mre11/p95/Rad50複合体に対する「アンカー」として作用する。Mre11は、次に3’末端からテロメア突出を加水分解し始め、Rad50ATPアーゼの活性化を引き起こす。Rad50の活性化は、リン酸化によるタンキラーゼの活性化、ある種の空間配置の変化、または他の気候をもたらし、次いでATMおよび多分ATR等の他のキナーゼを活性化する。ATMは、次にp95、およびp53等の他のDNA損傷反応エフェクターをリン酸化し、最終的に細胞周期停止の生物的終点、遺伝子誘導、アポトーシスおよび/または老化をもたらす。
本明細書で用いる用語「アクチベーター」とは、タンパク質を活性化する、またはタンパク質の活性を増加する任意の物質を意味する。
本発明は、Mre11活性の調節因子に関する。調節因子は、Mre11活性を誘導または増加し得る。調節因子はまた、Mre11活性を阻害または減少し得る。調節因子は、人工的に合成された化合物、または天然起源化合物であってよい。調節因子は、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはペプチド、またはそのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体またはその誘導体であってよい。
本発明はまた、タンキラーゼ活性調節因子に関する。この調節因子は、タンキラーゼ活性を誘導する。この調節因子はまた、タンキラーゼ活性を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然起源の化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドまたはペプチド、またはそのアナログ、ホモログ、改変体または誘導体であってもよい。
本発明はまた、DNA損傷経路の調節因子に関する。調節因子は、DNA損傷経路を誘発し得る。この調節因子は、また、DNA損傷経路を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然起源の化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドまたはペプチド、またはそのアナログ、ホモログ、改変体または誘導体であってもよい。
本発明はまた、MRN複合体形成の調節因子に関する。調節因子は、MRN複合体の形成を誘発し得る。この調節因子はまた、MRN複合体の形成を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然起源の化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドまたはペプチド、またはそのアナログ、ホモログ、改変体または誘導体であってもよい。
本発明はまた、上記のような調節因子を有する組成物に関する。この組成物は、Mre11アクチベーターを含み得る。組成物はまた、タンキラーゼアクチベーターを含み得る。組成物はまた、Mre11のインヒビターを含み得る。組成物はまた、タンキラーゼのインヒビターを含み得る。組成物はまた、少なくとも1種の本発明の調節因子を含み得る。組成物はまた。別な治療薬と共に少なくとも1種の調節因子を含み得る。
本発明の組成物は、通常の方法で配合された錠剤または糖錠である。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤を含むがそれに限定されない通常の賦形剤を含み得る。結合剤には、シロップ、アカシアガム、ゼラチン、ソルビトール、タラガカンスガム、澱粉糊およびポリビニルピロリドンが含まれるが、それに限定されない。充填剤には、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシ澱粉、燐酸カルシウムおよびソルビトールが含まれるが、それに限定されない。潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが含まれるが、それに限定されない。崩壊剤には、澱粉およびナトリウム澱粉グリコレートが含まれるが、それに限定されない。湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、それに限定されない。
(a.Mre11アクチベーター、タンキラーゼアクチベーター、DNA損傷経路アクチベーターまたはMRN複合体形成アクチベーター)
Mre11、タンキラーゼ、DNA損傷経路またはMRN複合体形成を誘導または増加する本発明の調節因子を単独で、または他の処置と組み合わせて、成長停止、アポトーシスまたは増殖老化不全に関連する病状の処置に使用し得る。このような病状の代表例には、癌および例えば乾癬におけるケラチン細胞または繊維芽細胞肥大性廃痕およびケロイド、またはある種の自己免疫疾患の症例におけるリンパ球サブセット等の正常粋を超える細胞の良性成長等の過剰増殖疾患が含まれるが、それに限定されない。これらの方法で処置される癌の形式は、様々な形で現れ、例えば頚部癌、リンパ腫、骨肉腫、メラノーマ、および皮膚に生じる他の癌、および白血病等の体の様々な細胞型および器官に生じる。この処置が目指す癌細胞のタイプは、乳房、肝臓、前立腺、膵臓、卵巣、膀胱、子宮、結腸、脳、食道、胃および胸腺である。調節因子はまた日焼けの阻害、細胞分化の促進および免疫抑制に使用し得る。
Mre11、タンキラーゼ、DNA損傷経路またはMRN複合体複合体形成の活性を阻害または減少する本発明の調節因子は、単独または他の処置と組み合わせて使用し、成長停止、アポトーシスまたは増殖老化に関連する病状を処置し得る。このような病状の代表例にはUV光線への暴露、および正常組織に対する化学療法および放射線療法等の癌処置の副作用、または日光に暴露された正常皮膚における日焼け反応が含まれるが、それに制限されない。細胞分化を阻害するためにも調節因子を使用し得る。
本発明の組成物を経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、経吸入、経頬、またその組み合わせを含むがそれに限定されない任意の方法で投与し得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、腱鞘内、および骨関節内を含むがそれに限定されない。
治療に使用するに必要な組成物の治療有効量は、治療する病状、活性を必要とする時間の長さ、および患者の年齢と状態によって変化し、最終的には、担当医によって決定される。しかしながら、一般に成人の治療に用いられる投薬量は、典型的には、1日あたり0.001mg/kg〜200mg/kgの範囲である。投薬量は、1日当たり約1μg/kg〜約100μg/kgでもよい。通常は、所望の投薬量を1回で投薬されるか、適当な間隔で複数回の投薬、例えば1日あたり2回、3回、4回またはそれ以上である。複数回の投薬が望ましいか、必要である。
本発明はまた、Mre11活性の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。本発明はまた、タンキラーゼ活性の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。本発明は、さらにMRN複合体形成の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。さらに、本発明は、DNA損傷経路の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。スクリーニング法をインビトロ、細胞ベース、遺伝的およびインビボ分析を含むがそれに限定されないフォーマットで実行し得る。
(オリゴヌクレオチドがアポトーシスを誘発し得る)
テロメア突出反復配列(TTAGGG;配列番号1)に相同のオリゴヌクレオチド、配列(11mer−1:pGTTAGGGTTAG;配列番号2)のオリゴヌクレオチド、この配列に相補性のオリゴヌクレオチド(11mer−2:pCTAACCCTAAC;配列番号3)、およびテロメア配列に関係しないオリゴヌクレオチド(11mer−3:pGATCGATCGAT;配列番号4)を、テロメア破壊に応じてアポトーシスを行うと報告されているヒトT細胞株であるJurkat細胞の培養に添加した。対照細胞の25〜30%と比較して、48時間以内に40μMの配列番号5で処理した細胞の50%がS相に集積し(p<0.0003、ノンペアt−試験、図1A〜1D参照)、対照の2〜3%と比較して、72時間でこれらの細胞の13%がサブG0/G1含有率で測定してアポトーシス性であった(p<0.0007、ノンペアt−試験、図1E〜1H参照)。対照の3〜5%と比較して、96時間で11mer−1処理細胞の20±3%がアポトーシス性であった(p<0.0001、ノンペアt−試験)。その奇妙な効果の説明として11mer−1の優先的な取り込みを排除するため、Jurkat細胞を3’末端にフルオレセインホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドで処理し、次いで共焦点顕微鏡およびFACS分析に供した。細胞の蛍光強度は、4時間および24時間処理後で同じであった。ウェスタン分析は11mer−1添加後の24時間でp53の増加を示したが、11mer−2または11mer−3では増加せず、E2F1転写因子のレベルが同時に増加したが、この因子は、アポトーシスの誘導でp53と協力し、ヒト繊維芽細胞でp53に依存して老化表現型を誘導する他、S相チェックポイントを制御することが知られている。
(テロメア突出ホモログ11mer−1のホスホロチオエートバージョンは、アポトーシスを誘導しない)
Jurkatヒト細胞の培養を希釈液、11mer−1(配列番号1)またはホスホロチオエート11mer−1(11mer−1−S)のいずれかで96時間処理し、細胞を集めFACS分析用に処理した。0.4μM(図2A〜2C)および40μM(図2D〜2F)の2種類の濃度を試験した。0.4μMでは、オリゴヌクレオチドのいずれも予期されたJurkat細胞の対数的に成育する細胞周期グラフに影響しなかった。40μMでは、11mer−1は、サブG0/G1ピークで示される広範囲のアポトーシスを誘導したが、11mer−1−Sは、影響しなかった。
(11mer−1のホスホロチオエートバージョンは、ホスフェート骨格11mer−1によるS−相停止の誘導を妨害する)
ケラチン細胞株の培養(SSC12F、100,000細胞/38cm2)を11mer−1(配列番号2)のみ、または濃度を増加させた11mer−1−Sの存在で、11mer−1により48時間処理した。実施例1で先に示したように、11mer−1は、FACS(Becton−Dickinson FacScan)で示されるS−相停止を誘導した。対照である希釈剤で処理した細胞と比較して、細胞の43%がS相であった。しかしながら、ホスホロチオエート11mer−1の濃度を増加してこれらの培養に加えると、停止した細胞の数は、より少なかった(図3A〜3D)。この停止の完全な阻害が11mer−1:11mer−1−Sの比が2:1である場合に見られた。11mer−1−S自体は、S−相停止を誘導しなかった。
(テロメアオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート型は、構成的UV誘導色素沈着を誘導し、メラニン生成を刺激しない)
S91mer−ウスメラニン細胞の培養(100,000細胞/cm2)を100μMのpTpTまたはホスホロチオエートpTpT(図4)、または40μMの11mer−1またはホスホロチオエート11mer−1(11mer−1−S)(図5)で6日間処理し、細胞を集め計数し、メラニン含有量を分析した。pTpTおよび11mer−1は、これらの細胞中でメラニン生成を刺激したが(それぞれ図4および図5)、pTspTおよび11mer−1−Sは、刺激しなかった(それぞれ図4および図5)。さらに、pTspT(図4)および11mer−1−S(図5)は、これらの細胞中の構成的色素沈着を減少し、テロメア修復/複製中にこの配列を慢性的に暴露するとメラニン生成に対する定常的な低い信号を提供し、この信号がpTspTおよび11mer−1−Sで妨害されることを示唆している。
(ホスホロチオエートpTspTは、UV誘発メラニン生成を阻害する)
S91細胞の2重の培養(100,000細胞/cm2)を偽照射、またはリサーチラジオメータ(モデルIL1700A、International Light、Nweburyport、MA)を用いる285±5nmで計測して、1kWキセノンアークソーラーシミュレーター(XMN1000−21、Oprical Radiation、Azuza、CA)からの5mJ/cm2の太陽シミュレーション光で照射した。2枚の偽照射プレートに100μMのpTspTを追加し、2種の照射培養も同様にpTspTで処理した。1週間後、細胞を集めて計数し、細胞ペレットを1NのNaOHに溶解し475nmの光学濃度を測定してメラニン含量を分析した。UV照射によりこれらの細胞中のメラニン含有量は、2倍になった。しかしながら、この反応は、pTspTを加えることにより妨害された(図6)。さらに、図4および5に示したデータと同様、これらの細胞の構成的メラニン生成がpTspTにより偽照射培養中で減少した。
(活性には、T−オリゴの加水分解が必要である)
配列番号2に基づくオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド1を完全にホスホロチオエート骨格で合成した。オリゴヌクレオチド2は、各末端に2個のホスホロチオエート骨格を有し、中央の他の結合は、ホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド3は、5’末端に2個のホスホロチオエート結合を有し(5’末端をブロック)、オリゴヌクレオチド4は、3’末端に2個のホスホロチオエート結合を有し(3’末端をブロック)、残りの結合は、ホスホジエステル結合であった。図7参照。
(Mre11タンパク質レベルのダウンレギュレーションは、T−オリゴの反応を妨害する)
正常ヒト新生児繊維芽細胞を10ピコモルのMre11siRNAまたは10ピコモルの対照(発現したヒト配列中に相同が見出されない)のいずれかで処理した。siRNA感染の日に培養皿は、約60%の密集であった。製造業者のプロトコールに従い、Lipofectamine2000(Invitrigen、Caelsbad、CA)を用いて感染を行った。感染混合物を細胞に5時間作用させ、次いで新鮮な培地のみに交換した。翌日、感染プロトコールを繰り返した。翌日、二重培養をT−オリゴまたは負対照としての希釈液のみで処理した。48時間後に細胞を集め、ホスホp95セリン343(Cell Signaling Technology、Beverly、MA)、Mre11(GnenTex、San Antonio、TX)、ホスホロp53セリン(Cell Signaling Technology、Beverly)およびトータルp53(Oncogene、San Diego、CA)特異性抗体を用いてタンパク質を分析した(図9)。Hela細胞溶解物をMre11に対する正の対照として用いた。10GyIRに暴露、または偽照射し、1時間後に集めた正常繊維芽細胞をp53およびp95/Nbs1リン酸化に対する正の対照とした。濃度計でオートラジオグラフィーを分析し、T−オリゴに対する値を希釈液処理試料に対する値として表した(図10および図11)。負荷に対して補正後、MRE11レベルが有意に減少した細胞では、T−オリゴに対するホスホp53反応が減少し、ホスホp95/Nbs1反応がないことが明らかである。
(p53およびpRb経路双方の不活性化がR2F繊維芽細胞でT−オリゴ誘導老化を逃れるために必要である)
(オリゴヌクレオチド)
2種のオリゴヌクレオチドを使用したが。1つは、テロメア突出のホモログ(pCTAACCCTAAC;配列番号3)であり、もう1つは、負の対照として用いた、それに相補性(pCTAACCCTAAC;配列番号3)であった。これらのオリゴマーは、Midland Certified Reagent Company(Midland、Texas)により合成された。オリゴヌクレオチドを前記のように調製した(Ellerら、[2003]テロメア3’突出特異性DNAによるp95/Nbs−1媒介S相チェックポイント(Induction of a p95/Nbs−1−Mediated S−Phase Checkpoint by Telomere Specific DNA)、Faseb J17,152−162)。
R2F新生皮膚繊維芽細胞、および誘導されたp53DD、cdk4R24Cおよび53DD/cdkR24C被形質導入体( G.Rheinwaldからの寛大な贈り物)は、機能性p53経路、pRb経路および双方の経路がそれぞれ欠けている。
細胞を希釈液のみ、40μMのT−オリゴまたは40μMの相補性オリゴで1週間、液を取り替えないで処理した。次いで細胞を2%ホルムアルデヒド/2%グルタルアルデヒド中で3〜5分固定し、文献記載(Dimriら、[1995]インビボでの培養および老化皮膚中で老化ヒト細胞を同定するバイオマーカー(A Biomarker that Identifies Senescent Human Cells in Culture abd in Aging Skin in vivo)、Proc.NALT.Acad.Sci.USA、92,9363−9367)通りに37℃(大気中のCO2)で終夜、新鮮な老化関連β−Gal(SA−β−Gal)染色液でインキュベーションした。
以前に報告(Ellerら、[1996]DNA損傷がメラミン形成を促進する(DNA Damage Enhances Melanogenesis)、Proc.NALT.Acad.Sci.USA、93,1087−1092)されているようにウェスタンブロット分析を行った。以下の抗体を使用した:DO−1(Ab−6)抗p53(Oncogene Research Products、Cambridge、MA)、抗ホスホp53(ser15)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA)、抗ホスホpRb(ser795、ser807/811)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA)、抗cdk4(Cell Signaling Technology、Beverly、MA)および抗アクチン(Santa Cruz Biotechnology、CA)。
ヒト繊維芽細胞を希釈液のみ、40μMのT−オリゴまたは40μMの相補性オリゴで1週間処理し、トリプシン処理を行って計数した。300個の細胞を60mmの培養皿中に3重に接種し、完全倍地中で週に2回培地を交換して2週間インキュベーションした。次いで細胞を100%メタノール中で5分間固定した。メタノールを除去し、培養皿を水で短時間濯いだ。コロニーをPBS中の4%(w/v)メチレンブルー溶液中で染色し、再度水で1回洗浄し計数した。
Permanoxチャンバースライド上で培養したHT−1080線維肉腫細胞を希釈剤、40μMのT−オリゴおよび40μMの相補性オリゴで4日間培養し、製造業者が提供するプロトコールに従って5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)標識および検出キット(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)を用いてDNA合成を分析した。簡単に言えば、細胞をBrdUで1時間標識し、固定して抗BrdUモノクローン抗体でインキュベーションした。抗マウスIgアルカリホスファターゼとインキュベーション後、光学顕微鏡で発色反応を検出した。
HT−1080細胞を希釈剤、40μMのT−オリゴおよび40μMの相補性オリゴで4日間処理し、次いでDNeasy Tissue Kit(Qiagen、Valencia、CA)を用いてゲノムDNAを単離した。製造業者が提供するプロトコールに従い、Telo TTAGGG Telomere Length Assay(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)を用いてテロメア長を決定した。簡単に言えば、1μgの精製ゲノムDNAをHinf1/Rsa1で消化し、0.8%アガロースゲル上でDNAフラグメントを分離し、次いでサザンブロットのためにナイロン膜上に移し、テロメア反復に特異的なジゴキシゲニン(DIG)標識プローブとハイブリダイズし、抗DIGアルカリホスファターゼでインキュベーションした。末端制限フラグメント(TRF)を化学発光で検出した。露光したX−線フィルムを濃度計で走査して平均TRF長を計算し、先に報告(Harleyら、[1990]ヒト繊維芽細胞の老化中にテロメアが短縮する(Telomers Shorten during Aging of Human Fibroblast)、Nature、345,458−460)されたように計算した。
老化繊維芽細胞は、特徴的に大きく平坦な形態を示し、老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−Gal)活性が増加する。TRF2DNの異所発現は、テロメアループ構造を破壊し、p53およびpRb経路を活性化することにより老化を誘導する。TRF2DN誘導を阻止するためには、ヒト細胞中のp53およびpRb経路の双方を妨害することが必要である。
(p53およびpRb経路双方の不活性化は、HT−1080細胞中のT−オリゴ誘導老化を逃れるために必要である)
TRF2DNは、ヒト線維肉腫HT−1080細胞で老化表現型を誘導すると報告されている。テロメア3’突出DNA(T−オリゴ)への暴露もこれらの細胞中で老化を誘導するか否かを決定するため、HT−1080細胞(American Type Cell Culture Collection;Manassas、VA)を希釈剤単独、T−オリゴまたは対照としての相補性オリゴで4日間処理し、SA−β−Gal活性を分析した。T−オリゴ処理細胞のみが広がった形態とSA−β−Gal活性の増加を示した(図13a)。T−オリゴ処理培養は、希釈剤または相補対照オリゴ処理培養より多いSA−β−Gal陽性細胞を含んでいた(それぞれ80±7%および6±3%、p<0.01;図13b)。また、BrdUの取り込みの顕著な現象で示されるように、希釈または対照オリゴ処理細胞でなく、T−オリゴ処理細胞のみが増殖しなかった(それぞれ7±2%、90±8%および85±10%、p<0.01;図13cおよび13d)。
(テロメアオリゴヌクレオチドがpRbのリン酸化を阻止する)
HT−180細胞は、機能性pRbを有することが知られているが、p53経路は、p16が欠失する結果としてそれが欠けている。本発明者らは、次に、HT−1080細胞におけるそのリン酸化を阻止することによりT−オリゴ処理がpRbを活性化するか否かを調べた。ウェスタンブロット分析により、T−オリゴに反応してセリン780、セリン790およびセリン807/811上でpRbリン酸化が著しく選択的に減少することが分かった(図13e)。興味あることに、p16が欠失する腫瘍中では、pRbは、無傷で起毛製であることが多い。これらの細胞中では、cdk4の脱制御は、pRb過剰リン酸化をもたらし、際限のない細胞成長と腫瘍形成が行われる。cdk2でなくCdk4の活性化がセリン780およびセリン795上でpRbをきわめて効果的にリン酸化する。この発見は、T−オリゴがp16のない場合に、多分他のINK4ファミリーメンバーの誘導によりcdk4活性を阻害することを示唆しており、pRb制御の複雑なネットワーク中でp16が必須の役割でないことを示し、またpRbが絶対的な下流エフェクターであると単純にみなすことができないことを示唆している。
(テロメアオリゴヌクレオチドの効果は、可逆的でない)
T−オリゴを除くことが線維肉腫の老化表現型を反転するか否かを試験するため、HT−1080細胞の平行培養を希釈剤または40μMのT−オリゴまたは40μMの相補対照オリゴで4日間処理した。次いでオリゴヌクレオチド処理をそれ以上行わず、細胞に新鮮な完全培地を与えた。1および2日後に、T−オリゴ前処理細胞は、大きくなった形態とSA−β−Gal活性の増加をまだ示し(図14a)、DNA合成を再開しなかった(図14b)。ウェスタン分析も、pRbタンパク質も活性を維持している、すなわちT−オリゴ前処理細胞における阻害状態であることを示していた(図14c)。
(テロメアオリゴヌクレオチドの平均テロメア長さに対する効果)
HT−1080細胞における平均テロメア長さ(MTL)に対する影響を決定するため、老化表現型が容易に観察される時間に相当する、T−オリゴで処理した4日後に細胞を分析した。希釈液処理(5.61kb)または相補オリゴ処理対照(5.51kb)と比較して、T−オリゴは、MTL(5.56kb)を変えなかった(図16)。計算されたMTLにおける100bp以下の差は、実験変動の範囲内であり、有意ではない。これは、TRF2DNによるテロメアの破壊後に見られたように、4週間までの繊維芽細胞のT−オリゴによる処理は、テロメア3’突出の分解をもたらさないという観察と一致している(データ示さず)。テロメアループの破壊は、MTLの急速な短縮と3’突出の消化を生じることが知られているので、T−オリゴがMTLに影響せず、または3’突出の消化を生じずに類似または同一の信号伝達を開始すると言う事実は、テロメアループ破壊がなくても、すなわちDNA損傷がなくても、T−オリゴが3’突出配列の露出を真似ることを示している。
(T−オリゴ反応にPARP活性が必要である)
T−オリゴに反応するPARPの役割を調べるため、40μMのT−オリゴまたは対照としての等量の希釈剤を加える前に、2種の異なったインヒビターである3−アミノベンズアミド(3AB、2.5mM)または1,5−ジヒドロキシキノリン(IQ、100μM)の一つで2時間、繊維芽細胞を前処理した。T−オリゴまたは希釈液(D)を添加後、各インヒビターの追加用量を細胞に与えた。繊維芽細胞を3ABおよびT−オリゴで処理し、次いで48時間後にウェスタンブロット用に細胞を集めた。p53セリン15の全p53、p21およびp53のリン酸化(p53活性を示す)のT−オリゴ誘発アップレギュレーションは、すべて、3ABの存在で減少した(図17A)。
(PARPインヒビターがp53活性化およびTRF2DNによる誘導を阻止する)
新生児繊維芽細胞をAdTRF2Dまたは負の対照としてのAdGFPで処理した。感染の2時間前に、細胞を希釈剤、3AB(2.5mM)またはIQ(100μM)で処理した。3日後、c−myc−タグTRF2DN(感染を確認するため)、p53セリン15リン酸化およびp21誘導に対するウェスタン分析のために細胞を集めた。図17Fのレーン2をレーン4および6と比較すると、3ABおよびIQの双方がTRF2DNに反応してp53リン酸化とp21とを減少させたことを示す。
(T−オリゴの効果は、テロメラーゼに依存しない)
Saos−2細胞は、多分、テロメラーゼ陰性であるがALT経路によりテロメアを維持する骨肉種細胞株である。Soas−2細胞株を希釈液または40μMの指定されたオリゴヌクレオチドで処理し、FACS分析のために48時間後に細胞を集めた。ホモログヌクレオチドのみが細胞のS相停止を生じた(図18a)。さらに、テロメア突出オリゴヌクレオチドは、IRによる他にp95/Nbs1のリン酸化を誘導した(図18b)この結果は、テロメア陰性細胞中のT−オリゴの効果がテロメア陽性悪性細胞株中の反応と同じであること示す。
(PARPタンキラーゼレベルのダウンレギュレーションがT−オリゴの反応を妨害する)
ヒト繊維芽細胞のペア培養をタンキラーゼsiRNA、非特異性siRNAで1回処理するか、第2対照として模擬感染した。2日後、siRNA処理細胞中のタンキラーゼレベルが顕著に減少した時点で、培養に11mer−1(pGTTAGGGTTAG;並列番号2)または相補配列11mer−2を補充した。さらに24時間後、細胞を集め、セリン343でのp95リン酸化に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットのために加工し、活性化ATMキナーゼによるp95修飾を示した。フィルムを濃度測定に供し、各グループの細胞に対する希釈液対照を任意の単位で1.0とした(図19)。予期されたように、正常なタンキラーゼレベルを有する細胞では、T−オリゴ処理細胞は、リン酸化p95の量が2倍であったが、対照オリゴ処理または希釈液処理細胞中の増加は、わずか30〜40%であった。しかしながら、タンキラーゼノックダウン群では、11−mer−1処理細胞は、p95リン酸化の増加を示さなかった(レベル1.1対1.0、対照に対しては、1.3)。これらのデータは、テロメア会合PARPであるタンキラーゼが、ATM活性化とそれに続く修飾(リン酸化)を引き起こし、処理細胞のS相停止(Ellerら、FASEB J、2003)を生じるT−オリゴ信号を形質導入するために必要であることを示している。
(T−オリゴは、p53の非ATM媒介リン酸化を生じる)
正常新生児繊維芽細胞を希釈液または40μM(11mer−1)で4、6、8、19、24および24時間処理し、p53ホスホセリン37特異性抗体を用いるウェスタンブロットのために集めた。偽およびIR照射(10Gy)繊維芽細胞をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。p53セリン37に対応するバンド強度の増加が早くも8時間で検出され、48時間では、希釈液(D)処理試料と比較してT−オリゴ(T)処理資料中できわめて顕著であった。
Claims (83)
- Mre11の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)Mre11に対する核酸基質の存在下で、候補調節因子をMre11とインビトロで接触させる工程;および
(b)該基質の加水分解を測定し、それにより、対照と比較して該基質の加水分解を変化させることによって調節因子を同定する工程;
を包含する、方法。 - 前記核酸基質は、(TTAGGG)n(n=1〜20)と少なくとも50%のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸基質の加水分解を、UV吸収または放射性標識の放出により測定する、請求項1に記載の方法。
- Mre11に特異的に結合する薬剤をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)候補薬剤をMre11と接触させる工程;および
(b)候補薬剤はMre11と特異的に結合するか否かを決定する工程;
を包含する、方法。 - Mre11は、固体支持体に付着している、請求項4に記載の方法。
- Mre11の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)Mre11を発現する細胞を提供する工程;
(b)候補調節因子を、該調節因子が該細胞により取り込まれる条件下で該細胞と接触させる工程;および
(c)細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、SA−β−Gal活性およびp53リン酸化、p95リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることによって調節因子を同定する工程;
を含む、方法。 - 前記候補調節因子は、Mre11に特異的に結合する、請求項6に記載の方法。
- 前記Mre11は、Mre11フラグメント、Mre11ホモログ、Mre11アナログまたはMre11改変体である、請求項1〜7のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記Mre11のフラグメント、Mre11ホモログ、Mre11アナログまたはMre11改変体は、エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞増殖である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞の生存能力である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞形態である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、SA−β―Gal活性である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、p53のリン酸化またはp95のリン酸化である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞は、癌細胞である、請求項6〜7および9〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞は、癌細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項17に記載の方法。
- 前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項19に記載の方法。
- 前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項21に記載の方法。
- タンキラーゼの調節因子をスクリーニングする方法であって、該方法は、
(a)タンキラーゼに対する基質の存在下で、候補調節因子をタンキラーゼとインビトロで接触させる工程;および
(b)該基質のリボシル化を測定し、それによって、対照と比較して該基質のリボシル化を変化させることによって、調節因子を同定する工程;
を包含する、方法。 - 前記基質は、ペプチドまたはポリペプチドである、請求項23に記載の方法。
- 前記基質は、TRF1である、請求項24に記載の方法。
- 前記基質のリボシル化を、UV吸収または前記基質の標識化により測定する、請求項23に記載の方法。
- タンキラーゼに特異的に結合する薬剤をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)候補結合剤をタンキラーゼと接触させる工程;および
(b)候補薬剤がタンキラーゼに特異的に結合するか否かを決定する工程;
を包含する、方法。 - タンキラーゼは、固体支持体に付着している、請求項27に記載の方法。
- タンキラーゼの調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)タンキラーゼを発現する細胞を提供する工程;
(b)候補調節因子を、該調節因子が細胞により取り込まれる条件下で該細胞と接触させる工程;および
(c)細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、SA−β−Gal活性およびp53リン酸化、p95リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることにより調節因子を同定する工程;
を包含する、方法。 - 前記調節因子は、タンキラーゼに特異的に結合する、請求項29に記載の方法。
- 前記タンキラーゼは、リボシル化活性を有する、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体である、請求項23〜30のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体は、リボシル化活性を有する、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞増殖である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞生存能力である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞形態である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、SA−β−Gal活性である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、p53のリン酸化またはp95のリン酸化である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞は、癌細胞である、請求項29〜30および32〜37のうちのいずれかに記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項38に記載の方法。
- 前記細胞は、癌細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項40に記載の方法。
- 前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項42に記載の方法。
- 前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項44に記載の方法。
- MRN複合体形成の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)候補調節因子を、Mre11、Rad50およびNbs1とインビトロで接触させる工程;ならびに
(b)MRN複合体の形成を測定し、それによって、対照と比較して該MRN複合体の形成を変化させることにより調節因子を同定する工程
を包含する、方法。 - 核酸基質またはMre11インヒビターの存在下で、候補調節因子をMre11、Rad50およびNbs1と接触させる、請求項46に記載の方法。
- 前記核酸は、(TTAGGG)n(n=1〜20)と少なくとも50%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項47に記載の方法。
- MRN複合体の形成を、遠心分離、共沈殿または非変性電気泳動により測定する、請求項46に記載の方法。
- DNA損傷経路の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)Mre11とタンキラーゼとを発現する細胞を提供する工程;
(b)候補調節因子を、該調節因子が細胞に取り込まれる条件下で、オリゴヌクレオチドの存在下にて該細胞と接触させる工程;
(c)細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、SA−β−Gal活性およびp53リン酸化、p95リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることにより調節因子を同定する工程
を包含し、該オリゴヌクレオチドは、(TTAGGG)n(n=1〜20)と少なくとも50%の核酸配列同一性を有する、方法。 - 前記Mre11は、Mre11フラグメント、Mre11ホモログ、Mre11アナログまたはMre11改変体である、請求項50に記載の方法。
- 前記Mre11の前記Mre11フラグメント、Mre11ホモログ、Mre11アナログまたはMre11改変体は、エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項51に記載の方法。
- 前記タンキラーゼは、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体である、請求項50に記載の方法。
- 前記タンキラーゼは、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体は、リボシル化活性を有する、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞増殖である、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞生存能力である、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、細胞形態である、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、SA−β−Gal活性である、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、p53リン酸化またはp95リン酸化である、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞は、癌細胞である、請求項50〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはALT経路により維持される、請求項61に記載の方法。
- 前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
- 癌を処置するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - アポトーシスを誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 細胞老化を誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 日焼けを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、阻害法。 - 細胞分化を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 免疫抑制を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 前記アクチベーターは、(TTAGGG)nと少なくとも50%のヌクレオチド配列同一性を有するMre11のオリゴヌクレオチドアクチベーターであり、少なくとも最初のx個の3’−ヌクレオチド結合は、3’→5’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ここで、n=1〜20であり、xは、約1〜約10である、請求項63〜68のうちのいずれか1項に記載の方法。
- アポトーシスを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、阻害法。 - 細胞老化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 成長を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 日焼けを促進するための法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 細胞分化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 癌処置の副作用を低減するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Mre11アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、DNA損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはMRN複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 前記組成物を、化学療法またはイオン化放射線と組み合わせて与える、請求項75に記載の方法。
- 前記インヒビターは、(TTAGGG)nと少なくとも50%のヌクレオチド配列同一性を有するMre11のオリゴヌクレオチドインヒビターであり、少なくとも最初のx個の3’−ヌクレオチド結合は、3’→5’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、n=1〜20であり、xは、約0〜約10である、請求項70〜76に記載の方法。
- (TTAGGG)nと少なくとも50%のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドと、少なくとも1個の非加水分解性ヌクレオチド間結合とを有する組成物であって、少なくとも最初のx個の3’−ヌクレオチド結合は、3’→5’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、n=1〜20であり、xは、約0〜約10である、組成物。
- 前記3’→5’ヌクレアーゼは、Mre11である、請求項78に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、TTAGGGと少なくとも50%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項78に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、配列GTTAGGGTTAGを有する、請求項80に記載の組成物。
- 前記非加水分解性結合は、ホスホロチオエートである、請求項78に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、PNAである、請求項78に記載の組成物。
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