JP2007524573A

JP2007524573A - イディオタイプワクチン

Info

Publication number: JP2007524573A
Application number: JP2006501373A
Authority: JP
Inventors: ワード，ロビン，リン
Original assignee: セイントヴィンセンツホスピタルシドニーリミテッド
Priority date: 2003-02-21
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2007-08-30
Also published as: EP1594899A1; US20080241177A1; CA2515398A1; US20060159693A1; EP1594899A4; AU2003900767A0; WO2004074323A1

Abstract

本発明は、ｐ５３に対する免疫の誘導に使用するためのイディオタイプワクチン組成物に関する。好ましくは本発明は、薬学的に許容される担体、及び少なくとも１つのペプチドを含むワクチン組成物に関し、該少なくとも１つのペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＫＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択されるものである。

Description

本発明は、ｐ５３に対する免疫の誘導に使用するためのイディオタイプワクチン組成物に関する。

ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の変異は、ほぼ５０％のヒトの癌において起こっており、それには結腸癌（６５％）、肺癌（７０％）、胃癌（４５％）、乳癌（３０％）、及び頭頸部癌（６０％）が含まれる。ｐ５３は、３つの機能的ドメインを有する。すなわち転写因子に特徴的な酸性Ｎ末端ドメイン、調節Ｃ末端ドメイン、及び中央ＤＮＡ結合ドメインである。変異したｐ５３タンパク質は、細胞周期及びアポトーシスの調節におけるその正常な機能を失っている。変異したｐ５３は、適切に分解されず、従って細胞質及び核に蓄積する。

ｐ５３は、能動免疫療法のための優れた腫瘍関連抗原であるとみなされており、なぜなら、（１）ｐ５３の過剰発現は、ヒトＨＬＡクラスＩ分子と会合した、腫瘍細胞表面でのｐ５３ペプチドの高レベルでの提示をもたらす；（２）ｐ５３は最もよく特性が調べられた抗原の１つであり、その遺伝子配列は公知であり、且つ該タンパク質の主要領域の多くについての３次元構造が決定されており、それによりｐ５３上の、問題とされる独特な抗原部位の構造特定及びマッピングが可能になり、このことが、体液性及び細胞性免疫のための有用な標的を提供するものである、ためである。該分子を標的とすることの別の適当な理由は、１）ｐ５３ペプチドは正常細胞表面には提示されていないこと；２）ｐ５３特異的Ｔ細胞がヒトに存在することである。都合の悪いことに、多くの研究が、ｐ５３が特に有望な免疫原ではないことを示しており、それはおそらく該分子が自己タンパク質であるためである。ｐ５３に対する寛容を崩壊させうるならば、ワクチン接種が腫瘍の進行を遅らせるのに有効な強い自己免疫応答を引き起こすことが理論上可能になる。ｐ５３断片の使用に代わる選択肢は、抗原性擬態物（antigenic mimics）を用いることであり、この擬態物は免疫学的寛容を引き起こすようないかなる望ましくない性質も持たず、しかもなおｐ５３特異的免疫応答を誘発する能力を保持するものである。

本発明においては、本発明者らはｐ５３に対するヒト抗体のＣＤＲを含むイディオタイプワクチンを提供する。

イディオタイプネットワーク仮説は、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎにより１９７３年に初めて提唱され、Ｊｅｒｎｅは１９７４年に、免疫系を、抗体とリンパ球の相互作用のネットワークとして記述した。この仮説においては、抗体Ａｂ１を、Ａｂ１に対する一連の抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２と呼ぶ）を作り出すのに用いることができる。これらＡｂ２分子のうちの一部（Ａｂ２βと呼ぶ）は、Ａｂ１のパラトープに適合し、Ａｂ１により識別される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の３次元構造の機能的擬態物として機能しうる。Ａｂ２βは次に、特異的抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）及びＴ細胞（Ｔ３）を誘導し、これらはＡｂ１により識別される元の腫瘍関連抗原を認識する。

ワクチン接種戦略としての抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２β）の使用は、いくつかの主要な利点を有する。（１）抗腫瘍免疫を誘導するのに腫瘍由来の物質の使用を含まないため、使用するのが比較的安全である；（２）エピトープ構造が、イディオタイプ決定基へと変わり、異なる分子環境において発現されるので、自己腫瘍抗原に対する寛容を崩壊させる効果的な方法を示しうる；（３）抗イディオタイプ抗体は、元来の抗原よりも高い親和性でＨＬＡクラスＩ分子に結合することがある。このことは、抗イディオタイプをプロセシングする抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現を助け、且つＴ細胞活性化を助ける；（５）ヒト抗イディオタイプ抗体を用いたときには、それらはヒトの免疫エフェクター細胞及び特にＴ細胞をより効率よく刺激するという利点を有しうる。最近、いくつかの臨床試験が、抗イディオタイプ抗体が非常によく寛容されることを示した。

国際特許出願第ＷＯ００／５６７７０号において、本発明者らはｐ５３に対するヒト抗体を数多く開示した。さらにこれらの抗体のアミノ酸配列を、これらの抗体をコードするＤＮＡ配列とともに提供した。この出願の開示は、参照により本明細書に含められる。

発明の概要
第１の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含み、該少なくとも１つのペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧ−Ｙ_２及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択されるものである。

第２の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該組成物は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含み、該少なくとも１つのペプチドは、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択されるペプチドとｐ５３への結合について競合することを特徴とするものである。

第３の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該組成物は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含み、該少なくとも１つのペプチドは、該ペプチドに対して生起された抗体がＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドと反応することを特徴とするものである。

第４の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該ワクチンは、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、該ＤＮＡ分子は少なくとも１つのペプチドをコードする配列を含み、該少なくとも１つのペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択されるものである。

第５の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該組成物は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、該ＤＮＡ分子は少なくとも１つのペプチドをコードする配列を含み、該少なくとも１つのペプチドは、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択されるペプチドとｐ５３への結合について競合することを特徴とするものである。

第６の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該組成物は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、該ＤＮＡ分子は少なくとも１つのペプチドをコードする配列を含み、該少なくとも１つのペプチドは、該ペプチドに対して生起された抗体がＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドと反応することを特徴とするものである。

第７の態様において、本発明は、被験体において抗ｐ５３イディオタイプ応答を誘導する方法であり、該方法は本発明の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、又は第６の態様のいずれか１つに記載の組成物を被験体に投与することを含む。

第８の態様において、本発明は変異型ｐ５３の発現により引き起こされる疾患に対する免疫を誘導する方法を提供し、該方法は本発明の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、又は第６の態様のいずれか１つに記載の組成物を被験体に投与することを含む。

図面の簡単な説明
図１は、ワクチン接種スケジュールの日程にわたる、ＥＬＩＳＡにより測定された個々のワクチンペプチドに対する体液性応答である。個々のグラフは、１人の被験者についての結果を表している（被験者０１２−Ａ、Ｇ及びＩ；被験者０１４−Ｂ；被験者０１５−Ｃ、Ｅ及びＨ；及び被験者０１６−Ｄ、Ｆ及びＪ）。ペプチド２に対する血清反応性は図Ａ−Ｄ及びＩに、ペプチド５については図Ｅ、Ｆ及びＪに、ペプチド８については図Ｇ及びＨに表されている。個々のビオチン化ワクチンペプチド（５μｇ／ｍｌ）をストレプトアビジン被覆プレート（５μｇ／ｍｌ）に結合させ、血清結合抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ特異的二次アルカリホスファターゼ複合体（０．１２μｇ／ｍｌ）（Ａ−Ｈ）、又はマウス抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＭ特異的抗体パネル（０．２５μｇ／ｍｌ）と引き続くヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（０．１２μｇ／ｍｌ）（Ｉ及びＪ）のいずれかを用いて検出した。血清希釈は、Ａ、１：１００；Ｇ、１：２５；Ｈ、１：２５を除いて、１：５０とした。通院１−基準（ベースライン）；通院２−ワクチン接種１の１ヵ月後；通院３−ワクチン接種２の１ヵ月後；通院４−ワクチン接種３の１ヵ月後；通院５−ワクチン接種４の１ヵ月後；通院６−ワクチン接種４の２ヵ月後。三重検体の平均値±１標準偏差を示してある。

図２は、ＥＬＩＳＡにより測定された、プールされたワクチンを用いて免疫したヒツジ２頭のうち１頭における個々のワクチンペプチド（Ａ）及びｐ５３（Ｂ）に対する血清抗体応答である。Ａ．個々のビオチン化ワクチンペプチド（５μｇ／ｍｌ）をストレプトアビジン被覆プレート（５μｇ／ｍｌ）に結合させ、追加免疫の１０日後に存在した血清結合抗体は、アルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヒツジＩｇＧ特異的二次抗体（０．１２ｇ／ｍｌ）を用いて検出した。Ｂ．精製組換えｐ５３（１０μｇ／ｍｌ）をプレートに結合させ、免疫前（免疫前血清）及び後（免疫後血清）に存在した血清結合抗体を上記のように検出した。三重検体の平均値±１標準偏差を示してある。

図３は、ＥＬＩＳＡによりワクチン接種スケジュールの日程にわたって測定された被験者０１２におけるｐ５３に対する体液性応答である。精製組換えｐ５３（１０μｇ／ｍｌ）をプレートに結合させ、血清結合抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ特異的二次アルカリホスファターゼ複合体（０．１２μｇ／ｍｌ）（Ａ）、又はマウス抗ヒトアイソタイプ特異的抗体パネル（０．２５μｇ／ｍｌ）と引き続くヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（０．１２μｇ／ｍｌ）（Ｂ）のいずれかを用いて検出した。示したデータは１：１００に希釈した血清を用いたものであるが、１：４００希釈においてもなお反応性は検出された。相対血清濃度は、試験試料に対する４１０ｎｍにおける当量吸光度として与えられる２つの陽性対照血清のプールの濃度を、試験試料の濃度で除算することにより算出した。通院１−基準；通院２−ワクチン接種１の１ヵ月後；通院３−ワクチン接種２の１ヵ月後；通院４−ワクチン接種３の１ヵ月後；通院５−ワクチン接種４の１ヵ月後；通院６−ワクチン接種４の２ヵ月後。三重検体の平均値±１標準偏差を示してある。

図４は、ワクチン接種スケジュールの日程にわたって測定された被験者０１６におけるペプチド５に対する細胞媒介性応答である。患者ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのペプチド５を用いて刺激し、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて６日間インキュベートし、^３Ｈ−チミジンで１８時間パルス標識した後、増殖を^３Ｈ−チミジン取り込みによって評価した。通院１−基準；通院２−ワクチン接種１の１ヵ月後；通院３−ワクチン接種２の１ヵ月後；通院４−ワクチン接種３の１ヵ月後；通院５−ワクチン接種４の１ヵ月後；通院６−ワクチン接種４の２ヵ月後。

図５は、基準時点（Ａ及びＣ）及びワクチン接種３（Ｂ）若しくは４（Ｄ）の１ヵ月後に測定された２人の被験者０１６（Ａ及びＢ）及び０１７（Ｃ及びＤ）におけるワクチンに対する細胞媒介性応答である。ＣＦＳＥ−ＦＩＴＣで染色した被験者ＰＢＭＣを５０μｇ／ｍｌのプールされたワクチンを用いて刺激し、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて６日間インキュベートした。ＣＤ８、ＣＤ７１及びＣＤ３マーカーを、フルオレセイン結合抗体を用いて検出した。ワクチンを用いたｉｎｖｉｔｒｏ刺激に応答して特異的に増殖したＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ７１陽性細胞のパーセンテージを示してある。

詳細な説明
本発明者らは、ヒト抗ｐ５３抗体のＣＤＲに由来する特定のペプチドを用いた免疫がＡｂ２の産生をもたらすことを明らかにした。イディオタイプカスケードの一部として、Ａｂ２はＡｂ３、すなわちｐ５３に対する抗体の産生を引き起こしうる。同定され、選択された当該ＣＤＲは、Ａｂ２（ｐ５３構造擬態を表す抗体）の産生をもたらし、該Ａｂ２の産生が次に、腫瘍細胞の殺傷及び本発明の実施において有益なｐ５３の３次元構造上の領域に対する免疫応答（体液性及び細胞媒介性）を引き起こす点で独特である。ヒトモノクローナル抗体（Ａｂ１）に由来する他のＣＤＲによる認識によって規定されるｐ５３上の領域も存在し、それは免疫原性であるが、免疫応答（Ａｂ２）を引き起こしうるものの腫瘍殺傷活性をもたらすことができないと予想される。ｐ５３は、体内でのそのクリアランスの間の分子プロセシング（processing）によって多くのエピトープが露呈されるので、ヒトモノクローナル抗体（Ａｂ１）はｐ５３のほとんどいかなる領域についても作製することができるが、それらのエピトープはワクチンの形で免疫を標的化するためには免疫学的に適切ではない可能性がある。本発明の重要な点は、Ａｂ１（ヒトモノクローナル抗体）に関連したｐ５３配列領域の同定であり、これは、有意な抗イディオタイプカスケードがそれを標的としうるような部位を提供する。従って、本発明の重要な態様は、Ａｂ１上のＣＤＲ（それらが結合する特定のｐ５３配列によって規定される）の選択であり、これは次にＣＴＬによって認識されるように露呈された変異型ｐ５３分子の領域に対して、抗イディオタイプカスケードを介して、免疫を引き起こす。

容易に理解されるように、本明細書に記載された結果は特定の配列のペプチドを用いて達成されたものであるが、同様の結果が異なる配列のペプチドを用いて達成されうる。本発明はまた、本発明のペプチドの類似物にも適用範囲を広げるものである。重要な要素は、ペプチド抗原が少なくとも１つの特定されたペプチドと同様のＡｂ２応答を実質的に引き起こすことである。よって、該ペプチド抗原の必須の特性は、それが、特定されたペプチド抗原の少なくとも１つと反応する抗体を生起することである。

従って、第１の態様において、本発明はイディオタイプワクチン組成物を提供し、該ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含み、該少なくとも１つのペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧ−Ｙ_２及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択されるものである。

本発明の好ましい実施形態においては、
Ｘ_１は不在であるか、又はＡＶＹＹＣであり、
Ｘ_２は不在であるか、又はＬＥＷＶＧであり、
Ｘ_３は不在であるか、又はＧＶＹＹＣであり、
Ｙ_１は不在であるか、又はＷＧＱＧＴであり、
Ｙ_２は不在であるか、又はＲＶＴＩであり、
Ｙ_３は不在であるか、又はＦＧＥＧＴである。

さらなる好ましい実施形態においては、該組成物はＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む。

さらなる好ましい実施形態においては、該組成物はペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。

別の好ましい実施形態においては、該組成物はＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをさらに含む。

「競合する」とは、同濃度での該ペプチドの存在下において、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、又はＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴのｐ５３に対する結合が少なくとも５０％減少することを意味する。該ペプチドはｐ５３に対して、同等に、より強く、又は最高で２桁弱い親和性で結合する。

競合は当業者に周知の多くの方法のいずれかを用いて測定しうる。好ましくは競合のレベルは、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、又はＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴを標識し、試験ペプチドの存在下若しくは非存在下におけるｐ５３に対する結合のレベルを測定することにより測られる。

「反応する」とは、該ペプチドに対して生起された抗体がＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴより選択される少なくとも１つのペプチドに結合することを意味する。

本発明の第２及び第３の態様の好ましい実施形態においては、該ペプチドはＸ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択されるものである。

本発明の第２及び第３の態様のさらなる好ましい実施形態においては、
Ｘ_１は不在であるか、又はＡＶＹＹＣであり、
Ｘ_２は不在であるか、又はＬＥＷＶＧであり、
Ｘ_３は不在であるか、又はＧＶＹＹＣであり、
Ｙ_１は不在であるか、又はＷＧＱＧＴであり、
Ｙ_２は不在であるか、又はＲＶＴＩであり、
Ｙ_３は不在であるか、又はＦＧＥＧＴである。

本発明の第２及び第３の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該組成物は、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む。

本発明の第２及び第３の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該組成物は、ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。

本発明の第２及び第３の態様の別の好ましい実施形態においては、該組成物は、ＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをさらに含む。

本発明の第１、第２及び第３の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該組成物はアジュバントをさらに含む。

癌に対する理想的な免疫応答は、一般的には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＴｈ１ヘルパー応答の誘導を含むと考えられている。免疫応答をこの結果に向かわせることを促す薬剤の入手可能性は別として、癌ワクチンのためのアジュバントの選択は、適当なアジュバントの選択における通常の実験操作のレベルを要するのみである。

アジュバントに加えて、小ペプチド（一般的には３０アミノ酸未満）を、その免疫原性を改善させるためにより大きな分子（担体）に連結する場合が多い。好適な担体及びアジュバントの選択は、ヒトでの使用のための安全で許容できるワクチンの調製にとって重要な点である。

以下に述べられている試験においては、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をアジュバントとして用いている。このサイトカインは、抗原提示細胞を動員するその能力、そしてＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子のアップレギュレーションという点から有用であると考えられる。ペプチドワクチンに関しては、ＧＭ−ＣＳＦは混合型Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を誘導する傾向にある。ＩＬ−２及びＩＬ−１２のような他のサイトカインアジュバントも利用されうるが、これらは過度の副作用をも伴い、日常的な臨床用途でも用いられるワクチンには好適でない可能性がある。

他の一般的に利用されるアジュバントは、作用機構の大部分が不明であり、抗原提示の長期化や抗原局在化の増強のような物理的手段によって、純粋にその効果を発揮しているようである。これらは、種々の油エマルジョン技術、ＩＳＣＯＭＳ、ミョウバン（水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム）、及びリポソーム送達系を含む。いくつかのアジュバントは、病原体認識受容体（ＰＲＲ）を介して作用し、免疫応答に必要な種々の共刺激事象を誘発するようである。これらとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド（例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる））及びコレラ毒素のような細菌性毒素が挙げられる。最後の場合において、ペプチドを細菌性毒素に結合させることができ、この技術はＧ１７−ＤＴ、すなわちガストリンとジフテリア毒素の複合体を用いてヒトの胃腸悪性腫瘍において試験されたものである。これら全ての薬剤は、免疫応答の極性にある程度影響を及ぼす。

ジフテリア毒素及びコレラ毒素と同様に、ペプチドは、破傷風トキソイドのような他の細菌性毒素、又はＫＬＨ（Keyhole Limpet Haemocyanin：キーホールリンペットヘモシアニン）のようなタンパク質と結合させることができる。

効果的でありうるアジュバントの別の例としては、これに限定されるものではないが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、及びＲＩＢＩ（これは細菌から抽出した３つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含むものである）が挙げられる。

アジュバント及びその他の薬剤のさらなる例としては、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロピオノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium acnes））、ボルデテラ・ペルタシス（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマー又は他の合成アジュバントが挙げられる。そのようなアジュバントは、様々な供給元から市販されており、例えばメルクアジュバント６５（Merck and Company, Inc.、Rahway、N.J.）又はフロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント（Difco Laboratories、Detroit、Michigan）がある。ジフテリア毒素、百日咳毒素及び破傷風毒素、並びにオボアルブミンのような、ヘルパーＴ細胞応答を促進するアジュバントを含むことが特に好ましい。他の好ましいアジュバントには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が含まれ、これはＱｕｉｌＡのような界面活性剤の小ミセルである。本発明の免疫原は、該免疫原が細胞質に進入できるように、抗原提示細胞と融合しうるミセル中に存在していてもよい。

本発明のポリペプチド、特にペプチドは、例えばＷＯ９３／０２７０６号に記載されているように、脂肪酸との結合によって自己アジュバント性（self-adjuvanting）ペプチドとして調製されてもよい。

しかしながら現時点では、アジュバントがＧＭ−ＣＳＦであることが好ましい。

本発明の第４の態様の好ましい実施形態においては、
Ｘ_１は不在であるか、又はＡＶＹＹＣであり、
Ｘ_２は不在であるか、又はＬＥＷＶＧであり、
Ｘ_３は不在であるか、又はＧＶＹＹＣであり、
Ｙ_１は不在であるか、又はＷＧＱＧＴであり、
Ｙ_２は不在であるか、又はＲＶＴＩであり、
Ｙ_３は不在であるか、又はＦＧＥＧＴである。

本発明の第４の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該組成物は、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。

本発明の第４の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子は、ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つ、さらに好ましくは３つ全てをコードするものである。

本発明の第４の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子はＧＭ−ＣＳＦをコードするさらなる配列を含むものである。

本発明の第４の態様の別の好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子は、ＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをコードするさらなる配列を含むものである。

本発明の第５及び第６の態様の好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択されるものである。

本発明の第５及び第６の態様の好ましい実施形態においては、
Ｘ_１は不在であるか、又はＡＶＹＹＣであり、
Ｘ_２は不在であるか、又はＬＥＷＶＧであり、
Ｘ_３は不在であるか、又はＧＶＹＹＣであり、
Ｙ_１は不在であるか、又はＷＧＱＧＴであり、
Ｙ_２は不在であるか、又はＲＶＴＩであり、
Ｙ_３は不在であるか、又はＦＧＥＧＴである。

本発明の第５及び第６の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該組成物は、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。

本発明の第５及び第６の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子は、ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つ、さらに好ましくは３つ全てをコードするものである。

本発明の第５及び第６の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子はＧＭ−ＣＳＦをコードするさらなる配列を含むものである。

本発明の第５及び第６の態様のさらなる好ましい実施形態においては、該ＤＮＡ分子はＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをコードするさらなる配列を含むものである。

本発明の第４、第５及び第６の態様の組成物は、ＤＮＡワクチン接種における使用のためのものであることが理解されよう。

実験モデル及び前臨床モデルにおいて、ウイルスタンパク質をコードする非複製性プラスミドＤＮＡを直接注入して防御性免疫応答を生起することが可能であるため、ＤＮＡ免疫付与に対する関心が増大している。ＤＮＡワクチン接種に関する有用な総説は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１）の中で提供されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

ＤＮＡワクチン接種は、被験体組織の細胞における抗原の発現を目的とした、被験体組織への、抗原をコードするＤＮＡのｉｎｖｉｖｏ直接導入を含む。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，９３９，４００号、同第６，１１０，８９８号、ＷＯ９５／２０６６０号、及びＷＯ９３／１９１８３号中に記載されており、その開示は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。直接注入された、抗原をコードするＤＮＡの防御性免疫応答を生起する能力は、多数の実験系において実証されてきた（例えば、Ｃｏｎｒｙら（２）、Ｃａｒｄｏｓｏら（３）、Ｃｏｘら（４）、Ｄａｖｉｓら（５）、Ｓｅｄｅｇａｈら（６）、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（７）、Ｕｌｍｅｒら（８）、Ｗａｎｇら（９）、Ｘｉａｎｇら（１０）、Ｙａｎｇら（１１）、Ｕｌｍｅｒら（１２）、Ｗｏｌｆｆら（１３）参照）。

今までのところ、哺乳動物系におけるほとんどのＤＮＡワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモーターに依存している。これらは、多くの哺乳動物種において、筋及び皮膚接種の両者で良好な効率を示している。ＤＮＡ免疫付与により引き起こされる免疫応答に影響を及ぼすことが知られている要因はＤＮＡ送達の方法であり、例えば非経口経路は低い割合での遺伝子導入しかもたらすことができず、遺伝子発現の顕著な多様性を引き起こす（１４）。遺伝子銃を用いたプラスミドの高速接種は、マウスの免疫応答を増強し（１５、１６）、それはおそらく、より高い効率でのＤＮＡトランスフェクション、及び樹状細胞によるより効果的な抗原提示によるものである。本発明の、核酸に基づくワクチンを含むベクターは、当該技術分野において公知の他の方法によって所望の宿主に導入することもでき、そのような方法としては例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微小注入、形質導入（transduction）、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、又はＤＮＡベクタートランスポーターがある。

他の実施形態においては、ＤＮＡは人工ウイルス粒子（virosome）又はリポソームによって皮膚又は粘膜に送達されてもよい。複製欠損アデノウイルスのようなウイルスベクターを用いてもよく、且つ露出した皮膚に直接、非侵襲的（注射針を用いない）ワクチン接種によりそれらを送達してもよい（１７）。

ＤＮＡワクチンの利点の１つは、ベクターそれ自身が免疫学的アジュバントとして作用しうることである。第１に、抗原の細胞内発現は、主要組織適合性クラスＩ経路による提示、及びＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導をもたらす。第２に、非メチル化ＣｐＧモチーフ（例えばＧＴＣＧＴＴ）を高含有率で含む細菌性ＤＮＡの使用により、Ｔｈ１応答傾向が増強される（１８）。

第７の態様において、本発明は、被験体において抗ｐ５３イディオタイプ応答を誘導する方法であり、該方法は本発明の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、又は第６の態様のいずれか１つの組成物を被験体に投与することを含む。

第８の態様において、本発明は変異型ｐ５３の発現により引き起こされる疾患に対する免疫を誘導する方法を提供し、該方法は本発明の第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、又は第６の態様のいずれか１つの組成物を被験体に投与することを含む。

本明細書の全体にわたって、「含む（comprise）」という語、又はその変形、例えば「含む（comprises）」又は「含んでいる（comprising）」は、示されている要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の排除を意味するものではないと理解されるものである。

本明細書中に記載された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書に包含されている文書、行為、物質、装置、物品等についてのいかなる議論も、専ら本発明の説明を与えるためのものである。これらの事項のいずれか、若しくは全てが、本出願の各請求項についての優先日以前にオーストラリアにおいて存在したとして、先行技術を成すか又は本発明に関連する技術分野における共通一般知識であったと理解されることが是認されるものではない。

本発明の本質がより明確に理解されるように、その好ましい形態を、以下の非制限的な実施例に述べる。

材料及び方法
ペントリックス（Ｐｅｎｔｒｉｘ）の調製
ペプチド製造
非ＧＭＰ等級ペプチド（表１）の製造は、ＭｕｌｔｉｐｌｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｓｔｅｍｓ（ＭＰＳ）、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳＡにより行われた。ＭＰＳは日常業務として多数の臨床試験のためにペプチドを製造している専門的団体である。

表１：ペントリックス（Ｐｅｎｔｒｉｘ^ＴＭ）のペプチド配列。これらの配列は、アミノドメイン（Ｎ）及び中央ドメイン（Ｃ）特異性を有する２種類のヒト抗ｐ５３抗体の抗原結合領域に対応する。ＣＤＲ配列には下線を付している。それぞれのペプチドは、ＣＤＲの両側に位置するフレームワーク領域に由来する追加のアミノ酸を有している。ＣＤＲ＝相補性決定領域。

ペプチドは検出可能な量の内毒素を含まず（＜０．１Ｕ／ｍｇ）無菌であり、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びアミノ酸配列解析により検討した限りでは純粋であった。ワクチンはペプチド（それぞれ５００μｇ）とＧＭ−ＣＳＦ（１００μｇ；Schering-Plough、Baulkham Hills、Australia）を３１．２５％ＤＭＳＯ／３１．２５％生理食塩水／３７．５％ｄＨ_２Ｏ（８００μｌ）中にて混合することにより調製した。

被験者及び臨床プロトコル
転移性悪性腫瘍を有する１０人の被験者（乳腺癌１、結腸直腸癌５、非小細胞肺癌１、血管周囲細胞腫１、腎細胞癌１、前立腺癌１）、局所再発を有する１人の被験者（頭頸部扁平上皮細胞癌）、及び試験登録時において無病の完全に治療された進行悪性腫瘍を有する３人の被験者（食道癌１、腎癌１、及び非小細胞肺癌１）が試験に参加した（年齢中央値＝５２．５歳、年齢範囲３９〜７０歳、男性７人、女性７人）。聖ビンセント病院ヒト研究倫理委員会に従い、全ての患者から詳細なインフォームド・コンセントを得た。

適格な被験者は、米国東部癌治療共同研究グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態０（１１被験者）又は１（３被験者）、少なくとも６ヶ月の推定余命、原発腫瘍又は転移腫瘍いずれかにおけるｐ５３の過剰発現（ＤＯ７抗ｐ５３抗体（Dako、Botany、NSW）による、腫瘍細胞のうち少なくとも２０％の中程度〜強い染色によって示される）、及びリコール抗原に対する陽性反応（ＣＭＩマルチテスト（Pasteur Merieux、Lyon、France）により測定した場合）を有することが必要とされる。被験者は、化学療法、放射線療法若しくは手術を受けたか、又は６週間以内に免疫抑制療法を受けた場合には除外された。

被験者の第１群は、２００μｌずつ４ヶ所の注射として行われる単回皮内ワクチン接種を受けた。被験者の第２群のＣＭＩ試験の前に、破傷風追加免疫を行った。第２群はその後、第１群に対するものと同じ送達法により、１ヶ月間隔で４回のワクチン接種を受けた。免疫学的アッセイのための血液は、それぞれの免疫付与の前、並びに４回目のワクチン接種の１ヵ月後及び２ヵ月後に採取した。体温、血圧、心拍数、及び呼吸数を含む臨床所見を、注射時、並びに２４時間後及び４８時間後に記録した。ＮＣＩ共通毒性基準第２版に従い有害事象を類別した（１９）。４回全てのワクチン接種を完了した被験者を、ワクチン特異的免疫応答について評価した。全ての患者を、安全性及び毒性について評価した。腫瘍応答は本研究の一環としては行わなかった。

遅延型過敏反応（ＤＴＨ）試験は、最後のワクチン接種の１ヶ月後に行った。個々のワクチンペプチド（１００μｇ）、ヒトＨＩＶｇｐ４１特異的抗体の軽鎖ＣＤＲ２配列に由来する陰性対照ペプチド（Ｈ−ＰＫＬＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲ−ＯＨ）、及びビヒクルのみを、肩甲骨間領域に皮内注射した。注射４８時間後における１０ｍｍ^２以上の硬結を陽性とみなした。

ワクチンによるヒツジ及びウサギの免疫付与
ペプチドのそれぞれに特異的なポリクローナル血清は、ヒツジ２頭及びウサギ２羽を免疫することにより作製した。ヒツジを２００μｇのペプチド混合物（ＣｐＧＤＮＡアジュバント（ImmunEasy Adjuvant、Quiagen）中）で初回免疫し、６週間後に追加免疫し、初回免疫の日、及び追加免疫の１０日後に採血した。ペプチド３及び７に反応性のポリクローナル血清はヒツジでは生起されず、そのためウサギをペプチド３及び７の混合物（それぞれ３７５μｇ；ＱｕｉｌＡ／ＤＥＡＥデキストラン／モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５０Ｖアジュバント混合物（Bioquest、Sydney、Australia）中）で初回免疫し、６週間後に追加免疫した。

ワクチン及びｐ５３に対する体液性免疫応答
個々のワクチンペプチド、又は組換えｐ５３のいずれかに特異的な血清抗体を検出するためにＥＬＩＳＡを用いた。それぞれのビオチン化ペプチド（５μｇ／ｍｌ；Auspep、Melbourne、Australia）を、５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Sigma、St. Louis、MO）で被覆したプレート上に別々に捕捉し、精製組換えｐ５３（１０μｇ／ｍｌ）は既述のように直接プレートに被覆した（２０）。血清は３回ずつ試験し、且つ一定の範囲（１：２５〜１：８００）の希釈について試験した。結合している抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（０．１２μｇ／ｍｌ；Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）を用いて検出した。Ａｂｓ_{４１０ｎｍ}の平均変化（ペプチド存在下でのＡｂｓ_{４１０ｎｍ}−ペプチド不在下でのＡｂｓ_{４１０ｎｍ}）が０．３より大きいサンプルを陽性とみなした。陽性応答は、マウス抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭ特異的抗体パネル（０．２５μｇ／ｍｌ；Zymed、San Francisco、CA）と引き続くヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（０．１２μｇ／ｍｌ；Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）を用いた結合抗体の検出によりアイソタイプ分類した。ウサギ及びヒツジにおける抗ペプチド応答及び抗ｐ５３応答の検出は、上記のようにＥＬＩＳＡを用いて行ったが、血清結合抗体はアルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヒツジ又は抗ウサギＩｇＧ抗体（０．１２μｇ／ｍｌ；Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）を用いて検出した。５４人の癌対照（年齢中央値＝６６．３歳、年齢範囲＝４０．９〜８４．０歳、男性３６人、女性１８人）及び３０人の正常対照（年齢中央値＝３４．５歳、年齢範囲＝２２．７〜６１．６歳、男性１４人、女性１６人）から採取した血清も試験した。

ワクチン及びｐ５３に対する細胞媒介性応答
ワクチン（個々のペプチド若しくはワクチンプール）又はｐ５３による刺激に応答した増殖は、（^３Ｈ）−チミジン及びカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）増殖アッセイを用いて測定し、ＩＦＮ−γの分泌をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をチミジン増殖アッセイ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイのために１×１０^５細胞／ウェルの濃度で播種し、ＣＦＳＥ増殖アッセイのために１×１０^６細胞／ウェル（２４穴プレート）で播種した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートは、マウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Diaclone、France）で被覆し、ＣＦＳＥアッセイ用の細胞は５μＭＣＦＳＥ−ＦＩＴＣ（Molecular Probes、Eugene、OR）で染色した。全てのＰＢＭＣは、２ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％ヒトＡＢ血清（Australian Red Cross Blood Service）を添加したＲＰＭＩ中で用いた。

細胞を、プールしたワクチン（５０μｇ／ｍｌ）、個々のワクチンペプチド（１０μｇ／ｍｌ）、組換えｐ５３（５又は１０μｇ／ｍｌ）、陽性対照（フィトヘマグルチニン（０．５μｇ／ｍｌ；Murex、Dartford、UK）及びインターロイキン−２（１０Ｕ／ｍｌ；Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）を含む）、及びスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（１μｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich、St Louis、Missouri）を用いて刺激し、陰性対照ウェルは、培地のみ及び細胞のみを含有するものとした。リコール抗原ＣＭＶ溶解物（１／２０００希釈；BioWhittaker、Walkersville、MD）及び破傷風トキソイド（２．５Ｌｆｕ／ｍｌ；CSL）についても試験した。ＰＢＭＣは３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で２０時間（ＥＬＩＳｐｏｔ）又は６日間（増殖アッセイ）インキュベートした。

その後、ダイアクローンのプロトコル（Diaclone、France）に従ってＩＦＮ−γ分泌を検出し、スポットを自動化ＥＬＩＳｐｏｔプレート計数機（Autoimmun Diagnostika、Strassberg、Germany）を用いて計数した。抗原特異的Ｔ細胞の存在頻度は、抗原存在下において得られたスポットの平均数から、抗原非存在下において得られたスポットの平均数を減算することにより算出した。平均スポット数が５０／１０^６ＰＢＭＣ以上の場合、サンプルを陽性とみなした。

ＣＦＳＥ増殖アッセイにおいては、ＣＤ３、ＣＤ７１（BD Biosciences、San Jose、CA）及びＣＤ８（Beckman Coulter、Miami、Florida）に特異的なフルオレセイン結合モノクローナル抗体を用いて細胞を染色し、ＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーターを用いて解析した（２１）。ＣＤ７１陽性であり、且つ分裂していない集団から移動した細胞のパーセンテージが、刺激非存在下において観察されるものの少なくとも２倍であるときには、染色を陽性とみなした。

チミジン増殖アッセイにおいては、細胞を０．５μＣｉ／ウェルの［メチル−^３Ｈ］−チミジン（Amersham、Buckinghamshire、UK）を用いてパルス標識し、１８時間後に回収した。［^３Ｈ］−チミジン取り込みは、液体シンチレーション計数により測定した。４連のサンプルにおける各ウェルの刺激指数（２２）が、未刺激細胞の平均値を少なくとも標準偏差の３倍分上回っているとき、サンプルを陽性であるとみなした。

結果
臨床結果
合計１０２個体をこの研究への参加についてスクリーニングし、４２個体を病状に基づいて除外し、別の２６個体を、その腫瘍がｐ５３を過剰発現していないために除外した。２１人の被験者はＣＭＩ試験を受け、そのうち７人は破傷風トキソイドを含む共通リコール抗原に対する明らかなＣＭＩ応答がみられなかったため、除外した。４人の被験者は本研究の単回用量フェーズに参加し（被験者００２、００４、００６、及び００７）、１０人の被験者は複数用量フェーズに参加した（００９、０１０、０１１、０１２、０１４、０１５、０１６、０１７、０１８、及び０１９）。複数用量フェーズに参加した４人の被験者（００９、０１０、０１１、０１９）は、別の治療を必要とする疾患の進行により、全４回のワクチン接種を完了する前に試験を中断した。

４９回のワクチン接種にわたって、ワクチンはよく許容され、記録された有害事象のうち主要なものは基礎疾患に起因するものであると考えられた。予想されたように、局所応答が最も一般的な有害事象であった。２００μｌの皮内浸潤は、被験者の全てに小さな水疱を引き起こし、初期の被験者の多くは２４〜４８時間後に水膨れ及び潰瘍を形成した。この局所応答は、ＧＭ−ＣＳＦ及びペプチド混合物の急速な析出に起因するものであり、希釈剤を生理食塩水から水に換えること、及び各注射の合間に注射器を振とうすることにより改善した。複数回のワクチン接種を受けた被験者は、それぞれの接種の後に、後ワクチン接種硬結の面積が拡大し、これは局所ＤＴＨ応答を示唆するものである。

おそらくは、又はもしかするとワクチンに起因すると考えられる毒性は、重症度段階１若しくは２に限られ、関節痛（１０件）、吐き気（４件）及び発熱反応（１６件）を含むものであった。これらの影響は、全てＧＭ−ＣＳＦ単独の場合にも記載されているものである（２３）。段階３若しくは４の毒性は、黄疸（１件）、運動神経障害（２件）、嘔吐（１件）、腫瘍痛（３件）、神経因性疼痛（１件）及び非好中球減少性敗血症（１件）、並びに２つの重症有害事象（脊髄圧迫、及び肺炎による死亡）を含み、これらは疾患の進行によるものと考えられた。

ワクチンに対する体液性応答
６人の評価可能な被験者のうち４人（０１２、０１４、０１５、及び０１６）の血清は、ペプチド２に反応性であることが見出され、２人の被験者（０１２及び０１５）はペプチド８に反応性であり、２人の被験者（０１５及び０１６）はペプチド５に反応性であった（図１Ａ−Ｈ）。しかしながら、これらの応答の１つは基準時点において観察され（患者０１５、通院１）、ワクチン接種によって増大しなかった（図１Ｅ）。どの患者も、ペプチド１、３、４、６、又は７に対する応答を示さなかったが、ポリクローナルヒツジ血清（図２Ａ）又はウサギ血清（データ未掲載）を用いると、これらのペプチドそれぞれに対する陽性反応が観察された。ヒトにおいて見られるワクチン特異的体液性応答は、少なくとも２回のワクチン接種が行われた後でのみ観察された。ペプチド特異的血清抗体の力価は、ワクチン接種４の１ヶ月後に最大レベルに上昇し、次の月には再び下降した。ワクチンペプチドに対する体液性応答は、アイソタイプ特異的抗体を使用してさらに特徴が調べられた。それぞれ全ての被験者のワクチン特異的血清抗体は、ＩｇＧクラスのものが顕著であり、抗原刺激性二次免疫応答を示唆するものであった。ＩｇＧ抗体の血清力価は、ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭ応答を合計した場合と同様に、ワクチン接種の期間にわたって増大した。ペプチド２特異的血清抗体は、被験者０１２においてはＩｇＧ１サブクラスのものであり（図１Ｉ）、被験者０１４及び０１５においてはＩｇＧ１及びＩｇＧ３であり、被験者０１６においてはＩｇＧ４であった（データ未掲載）。ペプチド５特異的血清抗体は、被験者０１５（内在性応答）及び被験者０１６（図１Ｊ）においてはＩｇＧ３サブクラスのものであった。ペプチド８特異的血清抗原は、被験者０１２及び０１５（図１Ｇ及びＨ）において１：２５という比較的高い血清希釈でのみ検出され、アイソタイプ特異的抗体を用いたときには検出されなかった（データ未掲載）。

被験者の１人（０１２）はまた、血清抗ｐ５３抗体についても上昇した力価を示した（図３Ａ）。これらの抗体が基準時点において存在している限りは、それらがワクチンによるものなのか、又は疾患の進行に伴って抗原レベルが増加した結果なのかは明らかではない。ｐ５３特異的ＩｇＧ１血清抗体のレベルはワクチン接種の増加に伴って上昇したが、ＩｇＭ抗体のレベルはワクチン接種スケジュールの日程にわたって定常レベルに留まっていたことが、アイソタイプ特異的抗体により明らかになった（図３Ｂ）。

３０人の正常対照、及び５４人の癌対照に由来する血清のごく一部はワクチン中のペプチドに対する弱い反応性を示したが、いずれの場合も吸光度は被験患者に見られるよりも低かった（表２）。ペプチド１（３人の被験者）、ペプチド３（１人の被験者）、及びペプチド５（２人の被験者）に対する血清反応性は正常対照群においても検出され、一方でペプチド２（１人の被験者）、ペプチド５（３人の被験者）、及びペプチド７（１人の被験者）に対する応答は非被験癌対照群においても見られた（表２）。５４人の癌対照のうち６人、及び３０人の正常対照のうち１人は、ｐ５３に対する血清抗体を有していた（表２）。癌対照のｐ５３変異状態は不明である。

表２：ワクチンペプチド及びｐ５３に対して体液性応答を示した個体数。癌対照及び被験者由来の血清は１：２５希釈で試験した。被験者は、本明細書及び図１で示した濃度範囲で調べた。略号：ｅ−ペプチド５に対する内在性応答（被験者０１５）、ｅｎ−ｐ５３に対する内在性応答（被験者０１２）。＊被験者群中、いずれかの時点における検出可能な応答は陽性とみなした。

ペプチド２、４、５、６、及び８に対する反応性を有するポリクローナル血清は両方のヒツジから得たが、一方の動物はペプチド１に応答せず、どちらの動物もペプチド３及び７に応答しなかった（図２Ａ）。血清抗体力価はペプチド５及び８について同等であったが、ペプチド２、４、及び６に対する反応は、初めに免疫したヒツジにおいて平均して５０％高かった。免疫方法を考慮すれば、ヒツジにおける血清抗ペプチド力価が被験患者において観察されたものよりも有意に高いことは驚くべきことではない。例えば、ペプチド５に対するヒツジ血清反応は、血清希釈１：３２００においても検出可能であったが、被験者における最高血清力価は、ペプチド２に対する１：２００である（図２Ａ及び１Ａ）。興味深いことには、抗ペプチド抗体の最高力価を示したヒツジはまた、上昇した検出可能なレベルのワクチン誘導ｐ５３特異的抗体を有していた。ｐ５３特異的抗体は血清希釈１：５０及び１：１００において測定可能であったが、それより高い希釈においてはバックグラウンドレベルに低下した（図２Ｂ）。ペプチド３及び７に対するポリクローナル血清は、免疫したウサギから単離することに成功したが、いずれのウサギも抗ｐ５３抗体を産生しなかった。

ワクチンに対する細胞媒介性応答
ｉｎｖｉｖｏＤＴＨ試験を行った６人の被験患者全てが、それぞれのワクチンペプチドに対して応答することが示された（表３）。患者はそれぞれペプチドのうち２種、３種、又は４種に対して応答し、少なくとも１個体においてペプチド３及び６を除く全てのペプチドに対する応答が観察された。ペプチド５及び２は、ペプチド５特異的ＤＴＨ応答を有する６患者全て、及びペプチド２に反応した５人の患者において、Ｔ細胞に対する免疫原性が最も強かった。ペプチド８に対しては３人の患者が応答し、ペプチド１及び７に対しては２人の患者、ペプチド４に対しては１人の患者が応答した。

表３：４回のワクチン接種全てを完了させた評価対象の６人の患者についての、ＤＴＨ試験において見られた皮膚硬結の程度。硬結面積（ｍｍ^２）は、それぞれのワクチンペプチド（１０ｇ）、ＨＩＶ−Ｌ２ペプチド（１０ｇ）、及びビヒクルのみ（３１．２５％ジメチルスルホキシド（ｖ／ｖ）、０．０５ＭＮａＣｌ）の注射後４８時間において測定した。「Ｎｅｇ」は、硬結が（例えあったとしても）１０ｍｍ^２未満であったことを示している。

評価対象の６人の被験患者のうち２人（０１６及び０１７）は、増殖アッセイで測定した限りでは、ワクチンに対して特異的なＴ細胞を有していることが明らかになった。患者０１６はペプチド１（通院５；刺激指数＝１０．４；データ未掲載）及びペプチド５（通院３、４及び５；刺激指数＝それぞれ８．８８、６４．６及び２２．２；図４）に対して、チミジン増殖アッセイにおいて応答を示した。この患者はまた、ペプチド５特異的増殖応答を示し、この応答は通院３（ワクチン接種２の１ヵ月後）において初めて現れ、３回のワクチン接種が行われた後に最高レベルにまで増大した。

ワクチンプールに対する増殖応答は、被験者０１６においてＣＦＳＥ増殖アッセイによって確認され（通院４；循環ＣＤ３及びＣＤ４陽性細胞の８．９％；図５Ｂ）、ペプチド５に対する応答も同様に確認された（通院５；循環ＣＤ３及びＣＤ４陽性細胞の５．５％；データ未掲載）。他のペプチドは、細胞数が限られていたため、個々に試験は行わなかった。被験者０１７もまた、ＣＦＳＥ増殖アッセイにより測定されたワクチンペプチドプールに対する特異的増殖応答を有していた（通院５；循環ＣＤ３及びＣＤ４陽性細胞の３．９％；図５Ｄ）。これらのワクチン特異的増殖アッセイの結果は両者とも、基準時点においては存在しないものであったから、ワクチン接種の経過によるものであると考えられる（図４、図５Ａ及び図５Ｃ）。また、患者０１６及び０１７由来のＰＢＭＣは、ワクチンプール若しくはペプチド５による刺激が行われない場合には増殖しなかった（データ未掲載）。細胞数が限られていたために、他の２人の患者についてのみＣＦＳＥ増殖アッセイによる試験を行い（０１２及び０１５）、両者ともワクチン特異的増殖応答を示さなかった。

増殖アッセイとは対照的に、被験患者のいずれも、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定可能なワクチン特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を有することが示されなかった（データ未掲載）。患者のうち５人は、ＣＭＶ溶解物に対する応答について試験を行い、５人のうち４人はＣＭＶ溶解物に対する再現性のある特異的応答を表し、このことは、該細胞が、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ経路によってタンパク質抗原全体がプロセシングを受け、提示されるのに十分な時間にわたり３７℃においてインキュベートされたことを裏付けるものである。チミジン増殖アッセイ、ＣＦＳＥ増殖アッセイ（被験者０１２、０１５、０１６及び０１７のみが試験を受けた）、又はＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価する限りにおいては、どの被験体においても、ｐ５３に対する測定可能な細胞媒介性応答は示されなかった。

癌対照のいずれも、チミジン増殖アッセイ（９人の被験者）、ＣＦＳＥ増殖アッセイ（４人の被験者）、又はＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（９人の被験者）によりアッセイされる、ワクチンペプチドに対する測定可能な細胞媒介性応答を示さなかった。同様に、正常対照のいずれも、チミジン増殖アッセイ（３人の被験者）、又はＣＦＳＥ増殖アッセイ（２人の被験者）によりアッセイされる、ｐ５３に対する測定可能な応答を示さなかった。

考察
本研究において、本発明者らは、ヒト抗ｐ５３抗体のＣＤＲ領域は、動物及び進行悪性腫瘍を有する個体において体液性、及び細胞性免疫を生起する能力があることを実証した。さらに、抗ｐ５３抗体がヒツジ及び１個体において観察され、このことは、ワクチン接種によってイディオタイプ免疫カスケードが誘起された可能性があることを示唆している。

自己タンパク質であるｐ５３に対する臨床的に有効な免疫応答は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の産生を要する。本発明者らは、Ａｂ１（抗ｐ５３抗体に由来するＣＤＲ領域）を用いた免疫を行い、それにより、ｐ５３の免疫学的擬態物である抗イディオタイプ抗体（抗ペプチド抗体、又はＡｂ２）の産生を誘導することで、そのような応答を生起しようと試みた。動物モデルにおいては、これら抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）がｐ５３抗原の代わりとなって、抗ｐ５３細胞傷害性Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏ産生につながりうることが示されている（２４、２５）。本発明者らの戦略は、免疫した動物から単離された抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）ではなく、Ａｂ１を用いて被験体にワクチン接種を行っている点で、先行するヒトイディオタイプ試験とは異なっている（２２、２６−２９）。

有効性を発揮するためには、ペプチドワクチンはまずＭＨＣクラスＩＩ経路によってＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して提示されなければならない。Ｔ細胞の助けを借りて、その後ペプチド特異的Ｂ細胞はアイソタイプスイッチングを経て、抗イディオタイプ（Ａｂ２）抗体パネルを産生する必要がある（３０）。明らかに、本研究の評価対象の６人の被験者のうち４人においてはこの過程が起こり、推測するにヘルパーＴ細胞応答はＴｈ２サブタイプのもののようである。この主張を支持する事実は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗ペプチド抗体が顕著に見られたこと、そしてＩＦＮ−γを分泌することができないワクチン特異的Ｔ細胞の同定である。興味深いことに、８種のペプチドのうち３種（２、５及び８）のみが、観察された体液性、及び細胞媒介性免疫応答に寄与した。残りのペプチドが免疫原性を持たないことの可能な説明は多数あり、ワクチン接種の方法及び時期、並びに本研究の被験者におけるそれらペプチドのＨＬＡ適合性が含まれる（３１−３３）。最も可能性の高い理由の１つは、ペプチドが完全にヒト免疫グロブリン配列に由来するものであるために、これらの自己配列の認識に寄与する特定のＴ細胞及びＢ細胞が、クローン選択において排除されたかもしれないことである（３４）。確かに、Ｒｕｉｚらは、マウス抗ｐ５３ＣＤＲの一部のサブセットのみがマウスモデルにおいて免疫原性であることを証明している（２４、２５）。

ワクチン接種された被験者が抗原特異的Ａｂ２を産生することができたことを考えると、これらＡｂ２分子の一部は抗ｐ５３（Ａｂ３）応答を引き起こしうると仮定される。実際、ｐ５３特異的抗体の力価の上昇により示されるように、２頭のワクチン接種されたヒツジのうちの１頭、及び患者の１人においては、このような状況であった。ヒツジに関しては、ｐ５３特異的応答は、免疫前血清においては検出されなかったものであるから、明らかにワクチンにより誘導されたものであり、ワクチン特異的抗体の高力価とよく相関する。他方、被験者における抗ｐ５３応答の重要性は不明である。この個体は基準において内在性のｐ５３特異的免疫応答を有しており、抗ｐ５３抗体の力価はワクチン接種の日程にわたって上昇したものの、この期間、全身腫瘍組織量も増加していた。

これらの知見に基づいて、現行のワクチン接種の戦略は、少なくともヒトにおいては、検出可能な抗ｐ５３免疫応答を誘発するには適当でないと結論付けるのが妥当であるように思われる。さらなる熟考に値するこの知見についての説明はいくつもある。まず、本研究で用いたｉｎｖｉｔｒｏアッセイが、ｐ５３に対する体液性及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を検出できなかったという可能性を考慮することは重要である。このことはありそうもないが、組換えｐ５３上の立体構造的エピトープに対する反応性が、ＥＬＩＳＡにおいて検出されなかったことは事実である。さらに、交差初回免疫を行わない場合においては、ｐ５３が外因的に加えられ、抗原提示細胞によりＭＨＣクラスＩＩと共に提示されるので、Ｔ細胞アッセイはＣＤ４＋応答のみを同定している可能性がある。ｐ５３に対するＣＤ８陽性応答の検出は、ｐ５３の長さにわたる短い重複ペプチド（９〜１３アミノ酸長）のｉｎｖｉｔｒｏ使用を要するのかもしれない（３５）。

これらの技術的な問題は別にして、抗ｐ５３抗体（Ａｂ３）を産生しうるＡｂ２の特性を確認することは重要である。これに関して、抗原提示に利用可能なＡｂ２の絶対量が、免疫原としてのその潜在的な役割に強く影響することが示唆される。Ａｂ２の最高力価は、ヒツジにおいて、抗ｐ５３抗体反応と共に観察された。２頭目のヒツジはより低いワクチン特異的抗体力価を有し、対応して検出可能なｐ５３特異的体液性免疫を示さなかった。被験患者のＡｂ２力価はどちらのヒツジのものよりも何倍も低かったが、最高のＡｂ２応答を示した患者は、検出可能な抗ｐ５３反応性を有していた個体であったことは注目に値すべきほど興味深い。

Ａｂ３の産生に影響を与えうる別の要因は、抗ペプチド若しくはＡｂ２応答を形成するのに要した時間であり、これは言い換えるとワクチン接種の継続時間に依存しうる要因である。評価対象の患者は３回目若しくは４回目のワクチン接種後までペプチド免疫を発生せず、ワクチン接種が中断されると抗体力価が下がった。従って、抗ｐ５３抗体は、長期間にわたる頻回ワクチン接種に引き続いてのみ生成されうる可能性がある。他のワクチン試験との比較は、ペプチドが週１回、４週間投与され、続いて何ヶ月にもわたって定期的な追加免疫が行われることが最良であることを示唆する（３６−３８）。実際、ｐ５３は自己タンパク質であるので、免疫応答がよい記憶力を有するとは考えにくく、従ってワクチン接種が無限に続けられる必要があるかもしれない。

抗ｐ５３抗体の誘導の失敗を説明しうる最後の可能性は、Ａｂ２上のエピトープが、免疫系によって認識されないｐ５３の領域を擬態している可能性があることである。イディオタイプネットワークは抗原エピトープの局所化学的（topochemical）コピーを作り出すために設計されたものであり（３９）、ワクチンは特異的ヒト抗ｐ５３抗体を有する個体に由来するので、この説明はあまりありそうにない。

関与する機構に関わりなく、ワクチン特異的抗体を十分なレベル産生させることにおいて遭遇する困難を避けるための他の選択肢は、ワクチン特異的抗体（Ａｂ２）を単離し、それを用いて免疫することであり、これによりイディオタイプカスケードの１つのステップが除かれる。この手法の別の利点は、抗ｐ５３抗体、より重要にはＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を即座に生起することができるワクチンの設計がこれにより可能になることである（４０、４１）。イディオタイプカスケードの全てのステップが完了するのに要しうる時間を考慮すると、Ａｂ１を用いたさらなる免疫付与は賢明ではないかも知れず、特に手術のすぐ後に続く抗腫瘍免疫の誘導が重要であるようなアジュバント設定においてはそうである。

最後に、本研究は、ヒト抗体ＣＤＲ領域を用いたワクチン接種が、ヒトＡｂ２を誘導する新規の方法に相当するものであり、次に、特にアジュバント設定においては、これらの抗体の単離が有用な免疫原をもたらしうることを示している。

広く記載している本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に示された本発明に対して多くの変更及び／又は修正が加えられうることは、当業者であれば理解できるであろう。本実施形態は、従って、あらゆる点で例示的なものであり、限定的なものではないとみなされるべきである。

参照文献

ワクチン接種スケジュールの日程にわたる、ＥＬＩＳＡにより測定された個々のワクチンペプチドに対する体液性応答である。ＥＬＩＳＡにより測定された、プールされたワクチンを用いて免疫したヒツジ２頭のうち１頭における個々のワクチンペプチド（Ａ）及びｐ５３（Ｂ）に対する血清抗体応答である。ＥＬＩＳＡによりワクチン接種スケジュールの日程にわたって測定された被験者０１２におけるｐ５３に対する体液性応答である。ワクチン接種スケジュールの日程にわたって測定された被験者０１６におけるペプチド５に対する細胞媒介性応答である。基準時点（Ａ及びＣ）及びワクチン接種３（Ｂ）又は４（Ｄ）の１ヵ月後に測定された２人の被験者０１６（Ａ及びＢ）及び０１７（Ｃ及びＤ）におけるワクチンに対する細胞媒介性応答である。

Claims

薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含むイディオタイプワクチン組成物であって、該少なくとも１つのペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＫＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択される、上記組成物。
Ｘ_１が不在であるか又はＡＶＹＹＣであり、Ｘ_２が不在であるか又はＬＥＷＶＧであり、Ｘ_３が不在であるか又はＧＶＹＹＣであり、Ｙ_１が不在であるか又はＷＧＱＧＴであり、Ｙ_２が不在であるか又はＲＶＴＩであり、Ｙ_３が不在であるか又はＦＧＥＧＴである、請求項１記載の組成物。
少なくとも１つのペプチドが、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される、請求項１又は２記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの３つ全てを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
ＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドが、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択されるペプチドの類似体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
アジュバントが、サイトカイン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リポ多糖、ムラミルジペプチド、細菌毒素（ジフテリア毒素、百日咳毒素、及び破傷風毒素など）、オボアルブミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＲＩＢＩ、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）、ボルデテラ・ペルタシス（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマー、若しくはメルクアジュバント６５を含む他の合成アジュバント、又はフロイント不完全アジュバント及び完全アジュバントからなる群より選択される、請求項８記載の組成物。
アジュバントが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項９記載の組成物。
薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含むイディオタイプワクチン組成物であって、該少なくとも１つのペプチドが、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択されるペプチドとｐ５３への結合について競合することを特徴とする、上記組成物。
薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのペプチドを含むイディオタイプワクチン組成物であって、該少なくとも１つのペプチドは、該ペプチドに対して生起された抗体がＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドと反応することを特徴とする、上記組成物。
ペプチドがヒト抗ｐ５３抗体の相補性決定領域に由来する、請求項１１又は１２記載の組成物。
少なくとも１つのペプチドが、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＫＫＧ−Ｙ_２及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
Ｘ_１が不在であるか又はＡＶＹＹＣであり、Ｘ_２が不在であるか又はＬＥＷＶＧであり、Ｘ_３が不在であるか又はＧＶＹＹＣであり、Ｙ_１が不在であるか又はＷＧＱＧＴであり、Ｙ_２が不在であるか又はＲＶＴＩであり、Ｙ_３が不在であるか又はＦＧＥＧＴである、請求項１４記載の組成物。
少なくとも１つのペプチドが、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つを含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの３つ全てを含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
ＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドが、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択されるペプチドの類似体である、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
アジュバントが、サイトカイン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リポ多糖、ムラミルジペプチド、細菌毒素（ジフテリア毒素、百日咳毒素、及び破傷風毒素など）、オボアルブミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＲＩＢＩ、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）、ボルデテラ・ペルタシス（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマー、若しくはメルクアジュバント６５を含む他の合成アジュバント、又はフロイント不完全アジュバント及び完全アジュバントからなる群より選択される、請求項２１記載の組成物。
アジュバントが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項２２記載の組成物
薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むイディオタイプワクチン組成物であって、該ＤＮＡ分子は少なくとも１つのペプチドをコードする配列を含み、該少なくとも１つのペプチドは、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＫＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択される、上記組成物。
Ｘ_１が不在であるか又はＡＶＹＹＣであり、Ｘ_２が不在であるか又はＬＥＷＶＧであり、Ｘ_３が不在であるか又はＧＶＹＹＣであり、Ｙ_１が不在であるか又はＷＧＱＧＴであり、Ｙ_２が不在であるか又はＲＶＴＩであり、Ｙ_３が不在であるか又はＦＧＥＧＴである、請求項２４記載の組成物。
ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む、請求項２４又は２５記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つを含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの３つ全てを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
ＤＮＡ分子がＧＭ−ＣＳＦをコードするさらなる配列を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
ＤＮＡ分子がＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲをコードするさらなる配列を含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
ＤＮＡワクチン接種に使用するための請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むイディオタイプワクチン組成物であって、該ＤＮＡ分子が少なくとも１つのペプチドをコードする配列を含み、該少なくとも１つのペプチドは、ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択されるペプチドとｐ５３への結合について競合することを特徴とする、上記組成物。
薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むイディオタイプワクチン組成物であって、該ＤＮＡ分子は少なくとも１つのペプチドをコードする配列を含み、該少なくとも１つのペプチドは、該ペプチドに対して生起された抗体がＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドと反応することを特徴とする、上記組成物。
ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドがヒト抗ｐ５３抗体の相補性決定領域に由来する、請求項３２又は３３記載の組成物。
ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドが、Ｘ_１−ＬＬＱＡＬＫＨ−Ｙ_１、Ｘ_２−ＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＫＫＧ−Ｙ_２、及びＸ_３−ＭＱＧＬＱＴＰＹＴ−Ｙ_３（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｙ_１、Ｙ_２及びＹ_３は独立して、不在であるか、又は特定のペプチドのためのフレームワークをもたらす好ましくは１０アミノ酸未満のアミノ酸配列である）からなる群より選択される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
Ｘ_１が不在であるか又はＡＶＹＹＣであり、Ｘ_２が不在であるか又はＬＥＷＶＧであり、Ｘ_３が不在であるか又はＧＶＹＹＣであり、Ｙ_１が不在であるか又はＷＧＱＧＴであり、Ｙ_２が不在であるか又はＲＶＴＩであり、Ｙ_３が不在であるか又はＦＧＥＧＴである、請求項３５記載の組成物。
ＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴからなる群より選択される少なくとも１つのペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの少なくとも２つを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
ペプチドＡＶＹＹＣＬＬＱＡＬＫＨＷＧＱＧＴ、ＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＡＡＴＡＹＡＡＳＭＫＧＲＶＴＩ、及びＧＶＹＹＣＭＱＧＬＱＴＰＹＴＦＧＥＧＴの３つ全てを含む、請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
ＤＮＡ分子がＧＭ−ＣＳＦをコードするさらなる配列を含む、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
ＤＮＡ分子が、ＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＮＹＡＰＫＦＫＧＲＬＴＭＳ、ＫＬＬＩＨＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲ、ＡＧＬＦＣＱＱＹＹＴＴＰＬＴＦＧＧＧＴ、ＹＦＣＳＲＶＫＡＧＧＰＤＹＷＧＱＧＴ、及びＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲをコードするさらなる配列を含む、請求項３２〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
ＤＮＡワクチン接種に使用するための請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体において抗ｐ５３イディオタイプ応答を誘導する方法。
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の組成物を被験体に投与することを含む、変異型ｐ５３の発現によって引き起こされる疾患に対する免疫を誘導する方法。