JP2007524364A - グランザイムbプロテアーゼを使用した融合タンパク質の開裂 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グランザイムBプロテアーゼの使用による組み換え産生された融合タンパク質の酵素開裂により真正形態の興味のあるポリペプチドを調製する方法に関する。さらに、本発明は、グランザイムB開裂部位を含む融合タンパク質、およびヒトグランザイムB変種に関する。
高度に精製され、よく特徴づけられた形態における医薬タンパク質などの組み換えポリペプチドの製造および精製は、一般に蛋白質工学の分野、特に製薬業界における主な課題になっている。
このような組み換えポリペプチドの調製は、しばしば、融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質としてのポリペプチドの産生を含む技術に依存し、ここにおいて興味のあるタンパク質またはポリペプチドは担体または融合パートナー、例えばポリペプチドまたはタンパク質と融合する。
しかしながら、融合パートナーは、例えば興味のあるポリペプチドの生物学的活性または安定性に影響を及ぼし得、タンパク質が臨床的に使用されるならば、抗原性の問題を起こし得るので、このような融合タンパク質は通常最終生成物として好適でない。従って、融合タンパク質を開裂させて、興味のあるポリペプチドを放出する必要がある。
融合タンパク質を開裂するための生化学的方法は、プロテアーゼ(タンパク分解酵素)の使用に基づく。しかしながら、融合タンパク質の酵素開裂は、開裂部位に特異的なアミノ酸が同時に興味のあるポリペプチドそれ自体においても存在し得る点で限定されている。従って、興味のあるポリペプチドと融合パートナー間の開裂部位に加えて、興味のあるポリペプチド中に特定のアミノ酸配列が再度存在する可能性は、開裂配列の認識および開裂に必要なアミノ酸の数が大きくなるほど低くなるので、開裂させるために、1つのアミノ酸だけでなく、アミノ酸の配列を認識する酵素が特に好適である。
WO03/010204は、この文献によると、ユビキチンなどのタンパク質のC末端でアミノ酸配列RGGの隣に結合したペプチドを開裂する酵素であるユビキチン開裂酵素の使用により、興味のあるポリペプチドを融合タンパク質から分離するための方法に関する。
米国特許第6010883号は、血液凝固因子Xa(EC3.4.21.6;限定されたタンパク分解によりプロ酵素因子Xから形成されるS1セリンタイプペプチダーゼ)が融合タンパク質から融合パートナーを開裂するために使用される方法を開示している。このプロテアーゼはアミノ酸配列X−Y−Gly−Arg(ここにおいてXはIle、Leu、ProまたはAlaであり、YはGlu、Asp、GlnまたはAsnである)の後を切断する。Xa因子は好ましくは開裂配列Ile−Glu−Gly−Argの後を切断する。
しかしながら、融合タンパク質系においてタンパク分解開裂を用いる場合、いくつかの問題が生じる。1つの主な問題は、融合タンパク質の非特異性タンパク分解攻撃が起こり、その結果、いくつかの位置で開裂が起こり、その結果、生成物が失われ、汚染フラグメントが生じることである。また、融合タンパク質の非効率的または不完全な開裂に関する問題が現在公知の酵素に関してしばしば起こる。このような効率の悪い開裂は、収率を低下させ、精製されたタンパク質に不均一性を導入し、その結果、所望のタンパク質の小さなフラクションしか回収されない。
開裂後の興味のあるポリペプチド上に残存する異質アミノ酸に関する問題は、米国特許第4543329号において説明されており、この特許はコラゲナーゼの使用により融合タンパク質を選択的に開裂する方法を記載する。しかしながら、この酵素の使用により、そのN末端に異質アミノ酸配列Gly−Proを有する興味のあるポリペプチドが産生される。真正形態における興味のあるポリペプチドを得るためには、これらの異質アミノ酸(GlyおよびPro)はその後、1以上の異なるアミノペプチダーゼ(例えば、アミノアシルプロリンアミノペプチダーゼおよびプロリンアミノペプチダーゼ)の使用によりさらなる工程において除去されなければならない。
現在、融合タンパク質開裂に最も広く用いられているタンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼXa因子およびスロンビンである。しかしながら、どちらの酵素も融合タンパク質の非特異的開裂を行うことが知られている。加えて、Xa因子はウシ血清から単離されなければならず、その結果、これが治療用途のためにタンパク質を開裂するために用いられる場合、存在し得るウイルスおよびプリオンなどの病原性因子(例えば、プリオンは牛海綿状脳症を引き起こす)を検出するために高度の精製および分析がその後必要である。さらに、これらの酵素はかなり高価である。
前記の技術的問題は、融合タンパク質の酵素開裂にグランザイムBプロテアーゼ(EC3.4.21.79)を使用することにより克服できることが本発明者らにより見いだされた。かくして、グランザイムBプロテアーゼが、高度の開裂特異性を有するグランザイムBプロテアーゼ開裂部位を有する融合タンパク質の非常に効率のよい開裂を可能にすることが意外にも見いだされた。特に、グランザイムBプロテアーゼは、現行の、広く用いられているプロテアーゼXa因子よりもさらに特異的な融合タンパク質開裂を行うことが証明された。さらに、N末端融合パートナーと興味のあるC末端ポリペプチドの間に位置するグランザイムB認識配列を含有する融合タンパク質のグランザイムB開裂(ここにおいて、開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接している)の結果、開裂部位に由来する異質アミノ酸を有さない興味のあるポリペプチド、すなわち真正形態のポリペプチドが得られることも証明された。従って、天然のアミノ酸配列を有する興味のある組み換えタンパク質を、グランザイムBの融合タンパク質開裂の結果として得ることができる。また、グランザイムBプロテアーゼは組み換えにより産生することができるという利点を有する。最後に、ヒトグランザイムBにおいてシステインアミノ酸No.228(キモトリプシノゲンナンバリング)をフェニルアラニンで置換することにより、組み換えヒトグランザイムBを産生する際に、さらに高い最終タンパク質回収率を得ることができることが見いだされた。
従って、本発明は、第一の態様において、真正形態における興味のあるポリペプチドの調製法に関する。この方法は:(i)そのN末端からC末端までに、(a)融合パートナー、(b)グランザイムBプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムBプロテアーゼ認識部位、(c)興味のあるポリペプチド(前記開裂部位が興味のあるポリペプチドに隣接している)を含む融合タンパク質を提供する工程、および(ii)前記融合タンパク質をグランザイムBプロテアーゼ(EC3.4.21.79)と接触させて、これを前記開裂部位で開裂させて、真正形態の興味のある前記ポリペプチドを得る工程を含む。
システイン残基228番(キモトリプシノゲンナンバリング)がフェニルアラニンに突然変異しているヒトグランザイムBプロテアーゼ変種も提供される。
さらに別の態様において、このような融合タンパク質またはヒトグランザイムBプロテアーゼ変種をエンコードする単離された核酸配列、単離された核酸配列を含む組み換えベクター、かかるベクターで形質転換された宿主細胞、および融合タンパク質またはヒトグランザイムBプロテアーゼ変種の産生法であって、(i)プロモーターに操作可能に結合した、かかる組み換えベクターを提供する工程、(ii)前記組み換えベクターで宿主細胞を形質転換する方法、(iii)前記宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現する条件下で培養する工程、および(iv)所望により前記融合タンパク質またはヒトグランザイムBプロテアーゼ変種を単離する工程を含む方法が提供される。
一態様において、本発明は融合タンパク質の酵素開裂により真正形態の興味のあるポリペプチドを形成する方法に関する。従って、この方法は、前記のように、そのN末端からC末端までに、融合パートナー、グランザイムBプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムBプロテアーゼ認識部位および興味のあるポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する工程を含み、ここにおいて開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接した位置にある。融合タンパク質をその後グランザイムBプロテアーゼと接触させて、グランザイムBプロテアーゼ開裂部位で融合タンパク質を開裂させ、真正形態の興味のあるポリペプチドを得る。本明細書において用いられる場合「融合タンパク質」なる用語は、少なくとも2つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを意味する。
Asp、D:アスパラギン酸 Ile、I:イソロイシン
Thr、T:スレオニン Leu、L:ロイシン
Ser、S:セリン Tyr、Y:チロシン
Glu、E:グルタミン酸 Phe、F:フェニルアラニン
Pro、P:プロリン His、H:ヒスチジン
Gly、G:グリシン Lys、K:リシン
Ala、A:アラニン Arg、R:アルギニン
Cys、C:システイン Trp、W:トリプトファン
Val、V:バリン Gln、Q:グルタミン
Met、M:メチオニン Asn、N:アスパラギン
Nle、J:ノルロイシン Orn、O:オルニチン
Hcy、U:ホモシステイン Xxx、X:任意のL−アルファ−アミノ酸
本発明の融合タンパク質は、有用な実施形態においてはアフィニティータグである融合パートナーを含む。このようなアフィニティータグは、例えばアフィニティー樹脂上での融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティードメインである。アフィニティータグは、ヘキサヒスタグ、ポリアルギニンタグ、FLAG−タグ、Strep−タグ、c−myc−タグ、S−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンS−トランスフェラーゼタグ、またはマルトース結合タンパク質を包含するポリヒスチジンタグでもある。
本発明の方法は、有用な実施形態において、融合タンパク質の酵素開裂により形成される興味のあるポリペプチドを単離するためのその後の単離工程を含む。この単離工程は、イオン交換、サイズによる分画およびアフィニティー精製の使用を包含するタンパク質単離の分野において公知の任意の適当な手段により行うことができ、その選択は、興味のあるポリペプチドの性質に依存する。従って、興味のあるポリペプチドは、アフィニティー精製の目的で、例えば前記アフィニティータグシステムを用いて、結果として得られる興味のあるポリペプチドの単離に備えるためにC末端結合したアフィニティータグをさらに含むことができる。
(図面の記載)
図1は、以下の比色検定を用いて数日間追跡したGrB−H6のFXaとのインキュベーションの活性を示す:500μlの緩衝液(100mM NaCl、50mM Tris−HCl、pH8.0)、4μlの100mM Ac−IEPD−pNAおよび5μlのGrB−H6。100μlのGrB−H6(約10μg)と1μlのFXaとの混合物をインキュベーションの間4℃に維持し、活性を0時間、2時間、5時間、19時間、2日および5日後に測定した。
レーンA〜Nの説明:
A:分子量マーカー
B:GrB−H6 C228F、インキュベーション前
C:4℃で1日インキュベートしたGrB−H6 C228F
D:4℃で3日インキュベートしたGrB−H6 C228F
E:4℃で6日インキュベートしたGrB−H6 C228F
F:4℃で15日インキュベートしたGrB−H6 C228F
G:23℃で1日インキュベートしたGrB−H6 C228F
H:23℃で3日インキュベートしたGrB−H6 C228F
I:23℃で6日インキュベートしたGrB−H6 C228F
J:23℃で15日インキュベートしたGrB−H6 C228F
K:37℃で1日インキュベートしたGrB−H6 C228F
L:37℃で3日インキュベートしたGrB−H6 C228F
M:37℃で6日インキュベートしたGrB−H6 C228F
N:37℃で15日インキュベートしたGrB−H6 C228F
レーンA〜Jの説明:
A:分子量マーカー
B:12時間インキュベーションした後のH6−TripUB IEPD↓SP単独
C:12時間インキュベーションした後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+1μlのGrB−H6
D:12時間インキュベーションした後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+10μlのGrB−H6
E:FXaと共にインキュベートしたH6−FX−TripUB
F:12時間インキュベーションした後のF6−IEPD−TN123単独
G:12時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−TN123+1μlのGrB−H6
H:12時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−TN123+10μlのGrB−H6
I:レーンDおよびHにおけるのと同じ濃度でのGrB−H6単独
J:FXaで開裂されたネズミH6−FX−TN123
図において(5)により示したのは、10μlのGrB−H6が添加されたサンプルにおいてと同じ濃度のGrB−H6の位置である。
レーンA〜Kの説明:
A:分子量マーカー
B:12時間インキュベーション後のH6−TripUB IEPD↓SP単独
C:12時間インキュベーション後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+1μlのGrB−H6
D:19時間インキュベーション後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+1μlのGrB−H6
E:24時間インキュベーション後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+1μlのGrB−H6
F:19時間インキュベーション後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+10μlのGrB−H6
G:24時間インキュベーション後の200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+10μlのGrB−H6
H:FおよびGにおけるように希釈されたGrB−H6単独
J:12時間インキュベーション後の200μlのH6−IEPD−TN123単独
J:12時間インキュベーション後の200μlのH6−IEPD−TN123+1μlのGrB−H6
K:12時間インキュベーション後の200μlのH6−IEPD−TN123+10μlのGrB−H6
図3におけるレーンI、J、およびKは、H6−IEPD−TN123+GrB−H6インキュベーションについての図2におけるレーンF、G、およびHと同じであるが、図3においては、より大きなサンプルをゲル上にかけた。バンドは従って図2よりもずっと明瞭である。(3)で示したバンドは、非開裂H6−IEPD−TN123であり、(4)、(5)、(6)および(7)で示されたバンドパターンを図12において説明する。
レーンA〜Kの説明(全ての温度について同じ):
B:非開裂H6−TripUB IEPD↓SP
C:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、添加無し
D:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、添加無し
E:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、添加無し
F:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、4.2mM Ni2+
G:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、4.2mM Ni2+
H:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、4.2mM Ni2+
I:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、4.2mM Ni2+および5mMのNTA
J:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、4.2mM Ni2+および5mMのNTA
K:200μlのH6−TripUB IEPD↓SP+5μlのGrB−H6、4.2mM Ni2+および5mMのNTA
4.2mMのNi2+で、37℃および42℃で観察されるタンパク質の沈殿のために、2時間インキュベーションした後の融合タンパク質のさらなる開裂はゲルにおいて見られなかった。従って、図6(37℃)および7(42℃)におけるレーンF〜H(2)においては、図5(23℃)におけるレーンF〜H(2)よりも少ないタンパク質が見られ、22時間インキュベーションした後、融合タンパク質の約50%が開裂して生成物になり、これはNi2+を添加しないで開裂したものより多い。
4.2mM のNi2++5mMのNTAをインキュベーションに添加すると、沈殿は観察されなかった。図5レーンI〜K(3)において、レーンC〜E(1)およびF〜H(2)よりも多くの生成物が見られ、従って、添加無しでわずか約40%、Ni2+単独で50%であるのに比較して、23℃で、Ni2+およびNTAの両方の存在下で22時間インキュベーションした後に、融合タンパク質の約60%が開裂した。
温度をさらに37℃(図6レーンI〜K(3))および42℃(図7レーンI〜K(3))まで上昇させることにより、開裂の速度においてさらに大きな増加が見られる。37℃で22時間インキュベーション後、ほとんど全ての融合タンパク質が開裂して正しい生成物になる。42℃では22時間後にほとんど開裂しない。
A:分子量マーカー
B:5時間インキュベーションした後のH6−IEPD−RAP単独
C:5時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−RAP+1μlのGrB−H6
D:5時間インキュベーションした後の200μ;のH6−IEPD−RAP+10μlのGrB−H6
E:23時間インキュベーションした後のH6−IEPD−RAP単独
F:23時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−RAP+1μlのGrB−H6
G:23時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−RAP+10μlのGrB−H6
H:FXaで部分的に切断されたH6−IEPD−RAP、精製
I:FXaでほぼ完全に切断されたH6−IEPD−RAP、精製
J:26時間インキュベーションした後のH6−IEPD−RAP単独
K:26時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−RAP+1μlのGrB−H6
L:26時間インキュベーションした後の200μlのH6−IEPD−RAP+10μlのGrB−H6
レーンHおよびIは、最終RAP生成物を得るために、FXaにより部分的(レーンH)または完全(レーンI)に開裂されたH6−IEGR−RAPの精製されたサンプルを示す。これらのレーンにおいて、FXaによる内部開裂から得られる分解生成物を精製により除去した。
A:分子量マーカー
B:H6−IEGR−RAP単独 27時間インキュベーション後
C:400μlのH6−IEGR−RAP+1μlのFXa 1/2時間インキュベーション後
D:400μlのH6−IEGR−RAP+1μlのFXa 1時間インキュベーション後
E:400μlのH6−IEGR−RAP+1μlのFXa 3時間インキュベーション後
F:400μlのH6−IEGR−RAP+1μlのFXa 5時間インキュベーション後
G:400μlのH6−IEGR−RAP+1μlのFXa 7時間インキュベーション後
H:400μlのH6−IEGR−RAP+1μlのFXa 27時間インキュベーション後
I:H6−IEPD−RAP単独 27時間インキュベーション後
J:400μlのH6−IEPD−RAP+2μlのFXa 1/2時間インキュベーション後
K:400μlのH6−IEPD−RAP+2μlのFXa 1時間インキュベーション後
L:400μlのH6−IEPD−RAP+2μlのFXa 3時間インキュベーション後
M:400μlのH6−IEPD−RAP+2μlのFXa 5時間インキュベーション後
N:400μlのH6−IEPD−RAP+2μlのFXa 7時間インキュベーション後
O:400μlのH6−IEPD−RAP+2μlのFXa 27時間インキュベーション後
A:分子量マーカー
B:H6Ubi−IEGR−ApoA1単独、0時間インキュベーション
C:400μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.4μg GrB−H6 C228、1時間インキュベーション
D:400μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.4μg GrB−H6 C228、3時間インキュベーション
E:400μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.4μg GrB−H6 C228、6時間インキュベーション
F:400μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.4μg GrB−H6 C228、24時間インキュベーション
G:400μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.4μg GrB−H6 C228、48時間インキュベーション
H:H6Ubi−IEGR−ApoA1単独、0時間インキュベーション
I:350μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.35μg GrB−H6 C228、1時間インキュベーション
J:350μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.35μg GrB−H6 C228、3時間インキュベーション
K:350μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.35μg GrB−H6 C228、6時間インキュベーション
L:350μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.35μg GrB−H6 C228、24時間インキュベーション
M:350μg H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.35μg GrB−H6 C228、48時間インキュベーション
A:分子量マーカー
B:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6 5日のインキュベーション後
C:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6 5日のインキュベーション後、サンプルは還元された
D+E:H6−IEPD−TN123単独 5日のインキュベーション後
F:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6 5日のインキュベーション後
G:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6 5日のインキュベーション後
H:GrB−H6単独 CおよびGにおいてと同様に希釈
I:H6−IEPD−TN123単独 12時間インキュベーション後
J:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6 12時間インキュベーション後
K:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6 12時間インキュベーション後
L:H6−IEPD−TN123単独 12時間インキュベーション後、サンプルは還元された
M:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6 12時間インキュベーション後、サンプルは還元された
N:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6 12時間インキュベーション後、サンプルは還元された
A:分子量マーカー
B:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6および5mM CaCl2、サンプルは還元された
C:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6および5mM CaCl2、サンプルは還元された
D:H6−IEPD−TN123単独
E:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6および5mM CaCl2
F:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6およびCaCl2無し
G:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6および5mM CaCl2
H:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6およびCaCl2無し
I:GrB−H6単独 GおよびHにおいてと同様に希釈
J:200μl H6−IEPD−TN123+1μg GrB−H6およびCaCl2無し、2日インキュベーション後
K:200μl H6−IEPD−TN123+10μg GrB−H6およびCaCl2無し、2日インキュベーション後
レーンDは非開裂H6−IEPD−TN123を示す。レーンEおよびG(+5mM Ca2+)をレーンFおよびH(Ca2+無し)と比較すると、5mM Ca2+が存在すると2つのバンドしか出現しないが(1)、Ca2+が存在しないと、図2、3、10および12に関して記載したように4つのバンドが出現する(2)。10μlのGrB−H6とともに12時間インキュベーション後、Ca2+が存在する場合、融合タンパク質の約40%が正しく開裂するが(レーンG)、Ca2+が存在しない場合、2つの部位の開裂は少し速く起こる(レーンHは12時間後、Kは2日後)。レーンKにおいて、融合タンパク質のほとんど全ては2回開裂された(3)。レーンBおよびCにおけるサンプルは還元され、依然として2つのバンド;非開裂H6−IEPD−TN123およびH6が除去された正しく開裂された生成物しか出現しない(4)。
(5)および(6):正しいIEPD↓部位での開裂のみが起こる場合、(6)におけるバンドパターンが観察される。非開裂H6−IEPD−TN123の位置を(5)に示し、(6)における一番上のバンドは、残存する非開裂H6−IEPD−TN123である。一番下のバンドは、正しい部位で1回だけ開裂された融合タンパク質である。小さなN末端ペプチドは小さすぎてゲルにおいては見ることができない。
A:分子量マーカー
B:H6−TripUB IEPD↓SP単独 24時間インキュベーション後
C:200μl H6−TripUB IEPD↓SP+5μl GrB−H6 2時間インキュベーション後
D:200μl H6−TripUB IEPD↓SP+5μl GrB−H6 6時間インキュベーション後
E:200μl H6−TripUB IEPD↓SP+5μl GrB−H6 24時間インキュベーション後
F:200μl H6−TripUB IEPD↓SP+5μl GrB−H6 48時間インキュベーション後
G:H6−TripUB IQAD↓SP単独 24時間インキュベーション後
H:200μl H6−TripUB IQAD↓SP+5μl GrB−H6 2時間インキュベーション後
I:200μl H6−TripUB IQAD↓SP+5μl GrB−H6 6時間インキュベーション後
J:200μl H6−TripUB IQAD↓SP+5μl GrB−H6 24時間インキュベーション後
K:200μl H6−TripUB IQAD↓SP+5μl GrB−H6 48時間インキュベーション後
L:H6−TripUB IQAD↓SP単独 24時間インキュベーション後
M:200μl H6−TripUB IQAD↓SG+5μl GrB−H6 2時間インキュベーション後
N:200μl H6−TripUB IQAD↓SG+5μl GrB−H6 6時間インキュベーション後
O:200μl H6−TripUB IQAD↓SG+5μl GrB−H6 24時間インキュベーション後
P:200μl H6−TripUB IQAD↓SG+5μl GrB−H6 48時間インキュベーション後
A:H6−TripUB VGPD↓SP単独 24時間インキュベーション後
B:200μl H6−TripUB VGPD↓SP+5μl GrB−H6 2時間インキュベーション後
C:200μl H6−TripUB VGPD↓SP+5μl GrB−H6 6時間インキュベーション後
D:200μl H6−TripUB VGPD↓SP+5μl GrB−H6 24時間インキュベーション後
E:200μl H6−TripUB VGPD↓SP+5μl GrB−H6 48時間インキュベーション後
F:H6−TripUB VGPD↓FG単独 24時間インキュベーション後
G:200μl H6−TripUB VGPD↓FG+5μl GrB−H6 2時間インキュベーション後
H:200μl H6−TripUB VGPD↓FG+5μl GrB−H6 6時間インキュベーション後
I:200μl H6−TripUB VGPD↓FG+5μl GrB−H6 24時間インキュベーション後
J:200μl H6−TripUB VGPD↓FG+5μl GrB−H6 48時間インキュベーション後
K:分子量マーカー
レーンA〜Mの説明:
A:分子量マーカー
B:H6−TripUB IEPD↓SP、0時間インキュベーション
C:250μl H6−TripUB IEPD↓SP+1μl GrB−H6 C228F、4時間インキュベーション後
D:250μl H6−TripUB IEPD↓SP+1μl GrB−H6 C228F、24時間インキュベーション後
E:250μl H6−TripUB IEPD↓SP+1μl GrB−H6 C228F、96時間インキュベーション後
F:H6−TripUB IEPD↓TQ、0時間インキュベーション
G:250μl H6−TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB−H6 C228F、4時間インキュベーション後
H:250μl H6−TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB−H6 C228F、24時間インキュベーション後
I:250μl H6−TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB−H6 C228F、96時間インキュベーション後
J:H6−TripUB IEPD↓IV、0時間インキュベーション後
K:250μl H6−TripUB IEPD↓IV+1μl GrB−H6 C228F、4時間インキュベーション後
L:250μl H6−TripUB IEPD↓IV+1μl GrB−H6 C228F、24時間インキュベーション後
M:250μl H6−TripUB IEPD↓IV+1μl GrB−H6 C228F、96時間インキュベーション後
レーンA〜Oの説明:
A:分子量マーカー
B:H6−TripUB IEPD↓SP、0時間インキュベーション
C:24μg H6−TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB−H6、21℃、4時間
D:24μg H6−TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB−H6、21℃、24時間
E:24μg H6−TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB−H6、21℃、48時間
F:24μg H6−TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB−H6、37℃、4時間
G:24μg H6−TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB−H6、37℃、24時間
H:24μg H6−TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB−H6、37℃、48時間
I:H6−TripUB IEPD↓EP、0時間インキュベーション
J:36μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB−H6、21℃、4時間
K:36μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB−H6、21℃、24時間
L:36μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB−H6、21℃、48時間
M:36μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB−H6、37℃、4時間
N:36μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB−H6、37℃、24時間
O:36μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB−H6、37℃、48時間
レーンA〜Oの説明:
A:分子量マーカー
B:H6−TripUB IEPD↓EG、0時間インキュベーション
C:H6−TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB−H6 C228F、23℃、6時間
D:40μg H6−TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB−H6 C228F、23℃、24時間
E:40μg H6−TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB−H6 C228F、23℃、50時間
F:40μg H6−TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB−H6 C228F、37℃、6時間
G:40μg H6−TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB−H6 C228F、37℃、24時間
H:40μg H6−TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB−H6 C228F、37℃、50時間
I:H6−TripUB IEPD↓EP、0時間インキュベーション
J:38μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB−H6 C228F、23℃、6時間
K:38μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB−H6 C228F、23℃、24時間
L:38μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB−H6 C228F、23℃、50時間
M:38μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB−H6 C228F、37℃、6時間
N:38μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB−H6 C228F、37℃、24時間
O:38μg H6−TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB−H6 C228F、37℃、50時間
レーンA〜Mの説明:
A:H6−TripUB IQAD↓SP+固定化GrB−H6 C228F、実験A
B:H6−TripUB IQAD↓SP+固定化GrB−H6 C228F、実験B
C:H6−TripUB IQAD↓SP+固定化GrB−H6 C228F、実験C
D:H6−TripUB IQAD↓SP+固定化GrB−H6 C228F、実験D
E:H6−TripUB IQAD↓SP+固定化GrB−H6 C228F、実験E
F:H6−TripUB IQAD↓SP+固定化GrB−H6 C228F、実験F
G:H6−TripUB IQAD↓SG+固定化GrB−H6 C228F、実験A
H:H6−TripUB IQAD↓SG+固定化GrB−H6 C228F、実験B
I:H6−TripUB IQAD↓SG+固定化GrB−H6 C228F、実験C
J:H6−TripUB IQAD↓SG+固定化GrB−H6 C228F、実験D
K:H6−TripUB IQAD↓SG+固定化GrB−H6 C228F、実験E
L:H6−TripUB IQAD↓SG+固定化GrB−H6 C228F、実験F
M:分子量マーカー
実施例1
ヒトグランザイムB発現ベクターの設計および構築
不活性プログランザイムB構築物を調製するために、活性化ヒトグランザイムB(E.C.3.4.21.79)をエンコードする配列、すなわちIle21(キモトリプシノゲンナンバリングにおけるIle16)からTyr246を、C末端にhexa−Hisタグ(H6)を含有するpT7クローニングベクター(pT7C−termH6)中にクローンし、その結果、発現ベクターpT7−IEGR−GrB−H6を得た。血激凝固因子Xa(FXa)認識配列IEGRを含有する配列MGSIEGRは従ってグランザイムBのIle21に対してN末端に位置し、Arg(R)とIle21の間にFXa開裂部位を提供する。結果として得られる、FXa認識配列およびC末端hexa−Hisタグを含有する融合タンパク質プログランザイムBは以下、pro−IEGR−GrB−H6と称し、配列番号1に示される。
オリゴヌクレオチドプライマーH6C−term fw(配列番号9)およびH6C−term rev(配列番号10)から調製されたDNAフラグメントをNcoIおよびEcoRI切断ベクター、pT7(Christensen JHら、1991)中に標準的手順を用いて結紮することによりクローニングベクターpT7C−termH6を構築した。
ヒトグランザイムBのpT7C−termH6クローニングベクター中へのクローニング
cDNAの混合物から増幅し、ヒト骨髄、ヒト白血球、ヒトリンパ節、およびリンパ腫(Raji)細胞(Clontech Laboratories,Inc カタログ番号7181−1、7181−2、7164−1、7167−1)(オリゴヌクレオチドプライマーGrBfw(配列番号11)およびGrBrevEcoRI(配列番号12))から単離されたBamHIおよびEcoRI制限DNAフラグメントGrBEcoRIをBamHIおよびEcoRI切断ベクター、pT7C−termH6中に標準的手順を用いて結紮することにより発現ベクターpT7−IEGR−GrB−H6を構築した。結果として得られるGrB EcoRIのヌクレオチド配列の概要を配列番号13に示す。
自己活性化プログランザイムBタンパク質をエンコードする発現ベクターpT7−IEPD−GrB−H6およびpT7−IEAD−GrB−H6を、製造業者のプロトコルに従ってQuikChange部位指向性突然変異誘発キット(STRATAGENE、カタログ番号200518)を用いることにより構築した。発現ベクターpT7−IEGR−GrB−H6をテンプレートとして使用した。オリゴヌクレオチドプライマーGrB GR−PDfwおよびGrB GR−PDrev(配列番号14および15)をpT7−IEPD−GrB−H6の構築に使用し、オリゴヌクレオチドプライマーGrB GR−AD fwおよびGrB GR−AD rev(配列番号16および17)をpT7−IEAD−GrB−H6の構築に使用した。
自己活性化pro−GrB−H6 C228X突然変異タンパク質をエンコードする発現ベクターpT7−IEPD−GrB−H6 C228XはすべてQuikChange部位指向性突然変異誘発キット(STRATAGENE、カタログ番号200518)を用い、製造業者のプロトコルに従って構築された。発現ベクターpT7−IEPD−GrB−H6をテンプレートとして使用した。変性オリゴヌクレオチドプライマーGrB SAT fwおよびGrB SAT rev(配列番号18および19)をpT7−IEPD−GrB−H6 C228S、pT7−IEPD−GrB−H6 C228A、およびpT7−IEPD−GrB−H6 C228Sの構築に使用し、ここにおいて、表1に示されるGrB SAT fwおよびGrB SAT revプライマー配列において、D=A、G、またはTであり、H=T、C、またはAである。変成オリゴヌクレオチドプライマーGrB VF fwおよびGrB VF rev(配列番号20および21)をpT7−IEPD−GrB−H6 C228VおよびpT7−IEPD−GrB−H6 C228Fの構築に使用し、ここにおいて、表1に示すGrB VF fw および GrB VF revプライマー配列において、K=GまたはTであり、M=AまたはCである。
自己活性化ヒトグランザイムBの発現およびリホールディング
FXa活性化可能な組み換えPro−IEGR−GrB−H6
Studier FWら(1990)により記載されているようにして中程度のスケール(3×1リットル)で、イー・コリBL21細胞において実施例1で調製された発現ベクターpT7−IEGR−GrB−H6を成長させ、発現することにより、FXa活性化可能な組み換えプログランザイムB融合タンパク質pro−IEGR−GrB−H6(配列番号1)を産生した。37℃で指数関数的に成長する培養物はOD600=0.8で約5の多重度でバクテリオファージλCE6に感染した。培養物を37℃成長させ、感染後50分に、0.1g/Lリファンピシン(メタノール中0.1g/mLとして溶解させる)を添加した。37℃でさらに3時間後、細胞を遠心分離により収穫した。細胞を浸透圧衝撃および音波処理により溶解させ、全細胞タンパク質をフェノール中に抽出した(Trisma塩基でpH8に調節)。2.5体積のエタノールを添加し、遠心分離することによりタンパク質をフェノール相から沈殿させた。タンパク質ペレットを、6Mグアニジウムクロリド、50mM Tris−HCl pH8、および100mMジチオトレイトールを含有する緩衝液中に溶解させた。Sephadex G−25Fine(Amersham Biosciences)上で8M尿素、0.5M NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および5mM 2−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、粗タンパク質調製物をNi2+活性化NTA−アガロースカラム(Ni2+−NTA−アガロース、Quiagen)上に適用した。
Thogersenら(国際特許出願番号WO9418227)に記載されているような環状リホールディング処理を用いて、pro−IEGR−GrB−H6融合タンパク質をNi2+−NTA−アガロースカラム上でリホールドさせた。勾配管理プロフィールを以下の表2に示し、0.5M NaCl、50mM Tris−HCl pH8、2mM還元グルタチオン、および0.2mM酸化グルタチオンを緩衝液Aとして、そして6M尿素、0.5M NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および3mM還元グルタチオンを緩衝液Bとして使用した。
Ni2+−NTA−アガロースカラムから溶出させた後、HClでpHを7に調節する前に、pro−IEGR−GrB−H6タンパク質を1体積の50mM Tris−HCl pH8.0で希釈した。タンパク質を次いでSPセファロースファーストフロー(Amersham Bioscience)イオン交換カラム上にかけた。タンパク質を250mM NaCl、50mM Tris−HCl pH7.0から1M NaCl,50mM Tris−HCl pH7.0の直線的勾配で10カラム体積で溶出した。溶出プロフィールからのサンプルはSDS−PAGE分析において1つの独立したバンドとして出現し、モノマーpro−IEGR−GrB−H6の予想分子量27.4kDaで移動した。
実施例1において調製されたベクターpT7−IEPD−GrB−H6およびpT7−IEAD−GrB−H6からの発現により自己活性化組み換えグランザイムB融合タンパク質pro−IEPD−GrB−H6(配列番号2)およびpro−IEAD−GrB−H6(配列番号3)を生成させた。ここにおいて、発現、リホールディング、および精製は、本質的に前記pro−IEGR−GrB−H68に関して記載されたのと同様にして行った。
2つの酵素、pro−IEPD−GrB−H6およびpro−IEAD−GrB−H6の自己活性化は次の実施例3において記載する通りである。
自己活性化pro−IEPD−GrB−H6 C228X突然変種
全てのpro−IEPD−GrB−H6 C228X突然変種(配列番号4、5、6、7および8)を、本質的に前記pro−IEGR−GrB−H6の発現に関して記載したのと同様にしてpT7−IEPD−GrB C228X発現ベクターから発現した。pro―IEPD−GrB−H6 C228X突然変種のリホールディングも、本質的には前記pro−IEGR−GrB−H6と同様に行い、カチオン交換カラム上での活性化は、pro−IEPD−GrB−H6およびpro−IEAD−GrB−H6に関して記載されているのと同様にして行った。
3つの他の突然変種pro−IEPD−GrB−H6 C228A、pro−IEPD−GrB−H6 C228T、およびpro−IEPD−GrB−H6 C228Vのリホールディング効率は、pro−IEPD−GrB−H6と類似していた。
次の実施例において、本発明者らはC228F突然変種、pro−IEPD−GrB−H6 C228Fを比較のためにpro−IEGR−GrB−H6とあわせて重点的に取り組んだ。
精製ウシXa因子を用いたpro−IEGR−GrB−H6融合タンパク質の活性化ならびにpro−IEPD−GrB−H6およびpro−IEAD−GrB−H6の自己活性化
Xa因子によるpro−IEGR−GrB−H6の活性化
実施例2において記載されるようにして産生されたモノマー不活性pro−IEGR−GrB−H6のサンプルをSPセファロースイオン交換からの溶出液から直接採取した。50μgのFXa(1mg/mlを50μg)を添加することにより1mgのpro−IEGR−GrB−H6(約10ml)を活性化し、室温で数日間インキュベートした。GrB−H6が得られるpro−IEGR−GrB−H6のFXaによる開裂/活性化の程度をSDS PAGEにより評価した。
加えて、pro−IEGR−GrB−H6をFXaとともにインキュベーションする間のグランザイムB活性を、次の比色検定を用いて数日間追跡した:500μlの緩衝液(100mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8.0)、4μlの100mM Ac−IEPD−pNA、および5μlのインキュベーション混合物。100μlのpro−IEGR−GrB−H6(約10μg)を1μlのFXa(1mg/ml)と混合することによりインキュベーション混合物を調製し、インキュベーションの間4℃に保持した。結果を表3および図1にまとめる。
添加されたFXaが適切にインキュベーション混合物から除去されたかどうかを確認するために、GrB−H6およびFXa活性の両方を添加されたFXaの除去の前後で基質S2222(N−ベンゾイル−L−イソロイシル−L−グルタミル−グリシル−L−アルギニン−p−ニトロアニリン、Chromogenix(イタリア)、カタログ番号S2222)およびAc−IEPD−pNA(N−アセチル−L−イソロイシル−L−グルタミル−L−プロリル−L−アスパラチル−p−ニトロアニリン、Calbiochem(ラ・ホーヤ、アメリカ合衆国)、カタログ番号368067)での比色検定を用いて測定した。ここにおいて、吸光度は405nmで約3分間測定し、ΔOD405/分を計算した。次のミックスを用いてFXa活性を測定した:500μlの緩衝液、25μlの3mM S2222および5μlのFXa。GrB−H6活性を次のミックスを用いて測定した:500μlの緩衝液、2μlの100mM Ac−IEPD−pNA、および5μlのGrB−H6。
組み換え自己活性化ヒトグランザイムB誘導体IEPD−GrB−H6およびIEAD−GrB−H6を実施例2に記載されているようにして、実施例1において記載される発現ベクターpT7−IEPD−GrB−H6およびpT7−IEAD−GrB−H6を用いて産生した。IEAD−GrB−H6およびIEPD−GrB−H6タンパク質をSPセファロースカラムから溶出させ、4℃で2日間保存した後、比色検定を用いてそれぞれのトップフラクションの活性を測定した。この目的のために、次のものを混合した:500μlの緩衝液(100mM HEPES pH7.5)、2μlの100mM Ac−IEPD−pNA、および5μlのタンパク質溶液。吸光度における変化を次いで405nmで3分間測定した。さらに1日および2日間4℃でインキュベーションした後に活性をさらに測定した。結果を表5にまとめる。
小発色性ペプチド基質に関して測定されたグランザイムB活性
Ac−IEPD−pNA基質を用いて異なる緩衝液中で活性化され、精製されたGrB−H6の活性を測定した:500μlの緩衝液、2μlの100mM Ac−IEPD−pNA、および5μlのGrB−H6。特に記載しない限り、ΔOD405/分を最初の0.75分から計算した。
定常状態速度パラメーターKMおよびkcatを評価するために、検定キュベット中合計体積500μlで前記と同じ比色検定を用いた。検定緩衝液は100mM HEPES pH7.75であり、GrB−H6およびGrB−H6 C228Fのどちらも各測定において20nMの濃度で使用した。Lineweaver−Burkプロットを作成するために、次の基質濃度を使用した:5、40、150、300、および600μM。得られた結果を以下の表7に示す。
GrB−H6およびGrB−H6 C228Fの特異性およびGrB−H6 C228Fの安定性の評価
GrB−H6およびGrB−H6 C228Fの特異性
発色性基質Ac−LEED−pNA、Ac−VEID−pNA、Ac−YVAD−pNA、およびAc−DEVD−pNAを、実施例4において適用したAc−IEPD−pNA基質に加えて使用して、GrB−H6およびGrB−H6 C228Fプロテアーゼの両方の特異性を調べた。500μlの100mM HEPES pH7.75と400μMの濃度の基質中で活性検定を再び行った。各測定に関して、1μgのプロテアーゼを検定キュベットに添加した。測定は全て3回行い、得られた活性は、Ac−IEPD−pNAで測定された活性を100%に設定することにより標準化した。結果を図2に示す。GrB−H6プロテアーゼは少なくともGrB−H6 C228Fプロテアーゼと同程度に特異性であることがわかる。
GrB−H6 C228Fプロテアーゼの安定性を測定するために、GrB−H6 C228Fのサンプルを100mM HEPES pH7.4中で15日間4℃、23℃および37℃でインキュベートした。自己開裂および変性を調べるために100mM HEPES緩衝液を選択したが、SDS PAGEにより評価すると顕著な「カニバリズム」は観察されなかった(図3A参照)。発色性基質Ac−IEPD−pNAに対する加水分解活性もインキュベーション期間中に測定した。図3B参照。
GrB−H6 C228Fプロテアーゼは4℃および23℃で著しく安定である。活性は15日間23℃で約10%若干減少し、ゲルにおいて変性フラグメントはほとんど見られなかった。37℃でも、15日後に依然として約20%の活性があり、ゲルにおいてごくわずかしか変性フラグメントは出現しなかった。
10分の短期間スケールでGrB−H6 C228Fプロテアーゼは50℃まで安定であることが判明した(ここでは省略)。この実験において、プロテアーゼのサンプルを10分間所定の温度でインキュベートし、次いで23℃で10分インキュベートすることにより室温に戻した。Ac−IEPD−pNAに対する活性を次いで23℃で測定した。50℃のインキュベーション温度まで、室温(23℃)でインキュベーションした後、プロテアーゼはほとんど100%活性に戻すことができるが、50℃を越える温度に曝された後は、プロテアーゼはもはや活性形態に戻ることができず、ごくわずかの活性しか検出できない。
GrB−H6およびGrB−H6 C228Fにより開裂可能な認識配列を含有する融合タンパク質の発現ベクターの設計および構築
GrB−H6およびGrB−H6 C228Fの基質として適当な融合タンパク質を調製するために、FXa開裂可能な融合タンパク質H6−FX−TripBUB、H6−IEGR−RAP、H6Ubi−IEGR−ApoA1、およびH6−FX−TN123(それぞれpT7H6−FX−TripBUB、pT7H6−FX−RAP、pT7H6Ubi−FX−ApoA1、およびpT7H6−FX−TN123によりエンコードされる)におけるFXa認識配列を、IEGRまたはIQGRのいずれかからIEPDに変更し、H6−TripUB IEPD↓SP(配列番号22)、H6−IEPD−RAP(配列番号23)、H6Ubi−IEPD−ApoA1(配列番号24)、およびH6−IEPD−TN123(配列番号25)の構築物を得た。
次のH6−TripUB融合タンパク質(H6−TripUB変種と称する)の認識配列は、XXXX↓YY(ここにおいて、XXXXはhexa−His部分H6とTripUB部分の間のグランザイムB認識配列の一部であり、YY残基はTripUB部分の一部である)のようにその名前の最後の部分として表示される。
製造業者のプロトコルに従って、テンプレートとしてベクターpT7H6−FX−TripBUB(国際特許出願番号WO9856906)およびオリゴヌクレオチドプライマー:TripUB GrB fw(配列番号34)およびTripUB GrB rev(配列番号35)を用いて、QuikChange部位指向性突然変異キット(STRATAGENE、カタログ番号200518)を用いることにより発現ベクターpT7H6−TripUB IEPD↓SPを構築した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−FX−RAP(Nykjaerら、1992)およびオリゴヌクレオチドプライマー:RAP GrB fw(配列番号36)およびRAP GrB rev(配列番号37)を用いて、前記のような部位指向性突然変異誘発によりベクターpT7H6−IEPD−RAPを構築した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−FX−TN123(Holtetら、1997)およびオリゴヌクレオチドプライマー:TN GrB fw(配列番号40)および TN GrB rev(配列番号41)を用いて前記のような部位指向性突然変異誘発により、発現ベクターpT7H6−IEPD−TN123を構築した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−FX−TripBUB(WO9856906)およびオリゴヌクレオチドプライマー:PC7TripUB GR−AD fw(配列番号42)およびPC7TripUB GR−AD rev(配列番号43)を使用して、前記のような突然変異誘発により発現ベクターpT7H6−TripUB IQAD↓SPを構築した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−TripUB IEPD↓SPおよびオリゴヌクレオチドプライマー:DNATrip IE−VG fw(配列番号46)およびDNATrip IE−VG rev(配列番号47)を用いて、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターpT7H6−TripUB VGPD↓SPを構築した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−TripUB IEPD↓SPおよびオリゴヌクレオチドプライマー:Trip IEPD−TQ(配列番号50)およびUB3(配列番号52)を使用して、PCR反応により発現ベクターpT7H6−TripUB IEPD↓TQを構築した。得られたPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、BamHI−HindII切断pT7H6(GS)3ベクター(Christensen J.Hら、1991)中に結紮した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−TripUB IEPD↓SPおよびオリゴヌクレオチドプライマー:TripUB EP fw(配列番号53)およびTripUB EP rev(配列番号54)を使用して、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターpT7H6−TripUB IEPD↓EPを構築した。
テンプレートとしてベクターpT7H6−TripUB IEPD↓EPおよびオリゴヌクレオチドプライマー:TripUB EG fw(配列番号55)およびTripUB EG rev(配列番号56)を使用して、前記のような部位指向性突然変異誘発により発現ベクターpT7H6−TripUB IEPD↓EGを構築した。
GrB−H6およびGrB−H6 C228Fにより開裂可能な認識配列を含有する融合タンパク質の発現、精製およびリホールディング
融合タンパク質の発現
キメラ融合タンパク質H6−TripUB IEPD↓SP、H6−IEPD−RAP、H6−IEGR−RAP、H6Ubi−IEPD−ApoA1、H6Ubi−IEGR−ApoA1、H6−IEPD−TN123およびH6−TripUB変種を調製するために、発現ベクターpT7H6−TripUB IEPD↓SP、pT7H6−IEPD−RAP、pT7H6−FX−RAP、pT7H6Ubi−IEPD−ApoA1、pT7H6Ubi−IEGR−ApoA1、pT7H6−IEPD−TN123、pT7H6−TripUB IQAD↓SP、pT7H6−TripUB IQAD↓SG、pT7H6−TripUB VGPD↓SP、pT7H6−TripUB VGPD↓FG、pT7H6−TripUB IEPD↓TQ、pT7H6−TripUB IEPD↓IV、pT7H6−TripUB IEPD↓EP、およびpT7H6−TripUB IEPD↓EG(最後の8つはH6−TripUB変種と称する)を、Studier FWら(1990)により記載されているようにして、イー・コリBL21細胞中中程度のスケールで成長させた(3リットル;2xTY培地、5mM MgSO4および0.1mg/mlアンピシリン)。37℃で指数関数的に成長する培養物をOD600=0.8でバクテリオファージλCE6で、約5の多重度で感染させた。培養物を37℃でさらに4時間成長させ、遠心分離により細胞を収穫した。細胞を100mlの750mM NaCl、100mM Tris−HCl pH8、および1mM EDTA pH8中に懸濁させた。フェノール(150ml、Trisoma塩基でpH8に調節)をそれぞれに添加し、混合物を音波処理して、全タンパク質を抽出した。遠心分離(10.000gで25分)により清澄化した後、2.5体積の96%エタノールを添加し、遠心分離することにより、粗タンパク質フラクションをフェノール相から沈殿させた。タンパク質ペレットを75mlの6Mグアニジウムクロリド、50mM Tris−HCl pH8、および100mMジチオトレイトール(DTT)中に溶解させた。
Sephadex G−25 Fine(Amersham Biosciences)上で、8M尿素、500mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および10mM 2−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、H6−IEPD−TripUBおよびH6−IEPD−RAP融合タンパク質の粗タンパク質調製物をバッチ吸着により、精製のために、Ni2+活性化NTA−アガロース(Ni2+−NTA−アガロース、Quiagen)カラム(通常50〜75mlカラム体積)にかけた(Hochuli Eら、1988)。カラムを次のもので洗浄した:
1.2xカラム体積の8M尿素、500mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および10mM 2−メルカプトエタノール
2.1xカラム体積の8M尿素、500mM NaCl、50mMリン酸ナトリウム pH6.3、および10mM 2−メルカプトエタノール
3.1xカラム体積の6Mグアニジウムクロリド、および50mM Tris−HCl pH8、および10mM 2−メルカプトエタノール
4.2xカラム体積の500M NaCl、および50mM Tris−HCl pH8
精製された融合タンパク質を次いで500mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および10mM EDTAで溶出した。
Sephadex G−25 Fine(Amersham Biosciences)上で8M尿素、500mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および10mM 2−メルカプトエタノール中にゲル濾過した後、H6−IEPD−TN123融合タンパク質の粗タンパク質調製物を、精製およびインビトロリホールディングのためにバッチ吸着によりNi2+活性化NTA−アガロース(Ni2+−NTA−アガロース、Quiagen)カラム(通常、50〜75mlカラム体積)にかけた。カラムを次のもので洗浄した:
1.2xカラム体積の8M尿素、500mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8、および10mM 2−メルカプトエタノール
2.1xカラム体積の8M尿素、500mM NaCl、50mMリン酸ナトリウム pH6.3、および10mM 2−メルカプトエタノール
3.1xカラム体積の6Mグアニジウムクロリド、50mM Tris−HCl pH8、および10mM 2−メルカプトエタノール
各融合タンパク質を次いで、Thogersenら(国際特許出願番号WO9418227)によりプラスミノーゲンクリングル4について記載されているような反復リホールディング処理に付した。リホールディング処理が完了した後、それぞれのリホールドされた融合タンパク質を次いで500mM NaCl、50mM Tris−HCl pH8、10mM EDTA中Ni2+−NTA−アガロースから溶出させた。
それぞれの正しくホールドされたタンパク質生成物の最終精製を次いで、25mM NaCl、10mM Tris−HCl pH 8、および1mM CaCl2中にゲル濾過し、続いて25mM NaCl、10mM Tris−HCl pH8、および1 mM CaCl2から500mM NaCl、10mM Tris−HCl pH8、および1mM CaCl2の塩勾配を使用して、Qセファロースファーストフロー(Amersham Biosciences、1.6(内径)×20センチメートルカラム)上イオン交換クロマトグラフィーにより行った。
GrB−H6、GrB−H6 C228FおよびFXaによる調製された融合タンパク質の開裂
GrB−H6によるH6−TripUB IEPD↓SPの開裂
Ni2+−NTA−アガロースカラムから溶出された融合タンパク質H6−TripUB IEPD↓SP(実施例7において記載するようにして調製)を100mM HEPES pH7.5中にゲル濾過し、トップフラクションの200μlのサンプルを室温で0、1または10μlのいずれかの活性化GrB−H6(約0、0.2および2μgのGrB−H6)と共にインキュベートした。
SDS PAGEのサンプルを12、19、および24時間のインキュベーション後に採取し、ゲルを図4および5に示す。
図4中レーンC〜Dおよび図5中レーンC〜Gにおいて正しく開裂された生成物のみが出現し、1および10μlのGrB−H6の両方の添加について、インキュベーション時間が長くなるほど、レーンにおいてより多くの開裂生成物が出現した。観察される簡単なバンドパターンを図6において説明する。IEPD配列後の正しい部位での開裂は図4中レーンEにおいて確認され、ここにおいて、GrB認識部位IEPDの代わりにFXa認識部位IQGRを含有する構築物H6−FX−TripUBをFXaにより開裂させて、GrB−H6開裂H6−TripUB IEPD↓SPと同じ大きさの生成物を得る。
各インキュベーションについて200μlのH6−TripUB IEPD↓SPおよび5μlのGrB−H6(約1μgのGrB−H6)を用いてH6−TripUB IEPD↓SP融合タンパク質を用いて、次の9種のインキュベーション(表9)を準備した。
Ni2+イオンは融合タンパク質のhexa−Hisテール(H6)のN末端に結合し、GrB−H6により認識される開裂部位への接近を促進すると考えられる。加えて、Ni2+イオンは、GrB−H6構築物のC末端hexa−Hisテールに結合する。Ni2+−NTAアガロースビーズ上と同様に溶液中のNTAのNi2+イオンをシールドするために、すなわち、Ni2+−NTAアガロースカラム上の状態を刺激するためにNTAの添加を行った。
図7は23℃、図8は37℃、図9は42℃でのインキュベーションを示す。Ni2+またはNTAが添加されない場合、H6−TripUB IEPD↓SP融合タンパク質は図4および5においてみられるのと同様に開裂したが、22時間後、37℃でのインキュベーションが試験された3種の温度のうち最適であるようである。
観察される沈殿の問題は、インキュベーションに5mMのNTAを添加することにより解消された。23℃で22時間インキュベーション後、Ni2+またはNTAを添加しないよりも多くの融合タンパク質が開裂し、したがってNi2+およびNTAの添加は開裂反応を促進するようである。さらに温度を37℃および42℃に上昇させることにより、開裂速度のさらなる増大が見られる。37℃で22時間インキュベーション後に、融合タンパク質のほとんど全てが開裂して正しい生成物になった。42℃で22時間後にはほとんど開裂しなかった。
図4および6において示される実験において当初推定される開裂速度を、ここで観察される開裂速度と比較すると、Ni2+およびNTAの添加ならびに37℃でのインキュベーションはGrB−H6によるH6−TripUB IEPD↓SPの特異的開裂を劇的に促進することは明らかである。
Ni2+−NTA−アガロースカラムから溶出される融合タンパク質H6−IEPD−RAP(実施例7に記載するようにして調製)を100mM HEPES pH7.4中にゲル濾過し、トップフラクションの200μlのサンプルを室温で、0、1または10μlのいずれかの活性化GrB−H6(約0、0.2および2μgのGrB−H6)と共に室温でインキュベートした。5、23および26時間インキュベーション後にSDS PAGE用サンプルを採取した。図10参照。
前記のような1または10μlのGrB−H6とわずか5時間インキュベーション後に、H6−IEPD−RAPの全部が開裂して、最終生成物を得た。RAPにおいて少なくとも1つの内部開裂部位が存在するが、この内部部位はIEPD配列よりもずっと遅く開裂することは明らかである。このIEPD配列でGrB−H6がH6を正しく開裂させたことは、生成物の大きさを、FXaにより部分的(レーンH)または完全(レーンI)に開裂されたH6−FX−RAPの精製されたサンプルと生成物のサイズを比較することによりわかる。これらのレーンにおいて、FXaによる任意の内部開裂から得られる変性生成物を精製により除去した。
GrB−H6によるH6−IEPD−RAPの開裂を、FXaによるH6−IEGR−RAPの開裂と比較した。H6−IEPD−RAPおよびH6−IEGR−RAPのどちらも100mM HEPES pH7.4中溶液であり、プロテアーゼ:融合タンパク質比1:1000、室温(23℃)で次のインキュベーションを準備した:
1.400μl(約500μg)H6−IEGR−RAP+0.5μl FXa(1mg/ml)(約0.5μg)
2.400μl(約400μg)H6−GrB−RAP+2μl GrB−H6(約0.4μg)
両融合タンパク質がそのそれぞれのプロテアーゼにより非常に迅速に開裂したことは明らかである。わずか1/2時間後にほとんど全ての融合タンパク質が開裂して、両インキュベーションについて正しい生成物が得られた。
しかしながら、H6−IEGR−RAP+FXaインキュベーションについて、融合タンパク質の全ては分解して、27時間後に様々なより小さなフラグメントが得られ、正しく開裂された生成物は残っていなかった。
H6−IEPD−RAP+GrB−H6インキュベーションにおいて、分解フラグメントも見られるが、H6−IEGR−RAP+FXaインキュベーションにおけるほど多くない。19の可能な部位(RAP生成物における19Asp残基)のうちRAPにおけるGrB−感受性部位の1つだけしかないようであるが、いくつかのFXa感受性部位(26の可能な部位、26Arg残基)があるようである。これはGrB−H6によるH6−IEPD−RAPの分解を遅くし、これによりかなり多くの正しく開裂された生成物(約25%)がインキュベーションの27時間後にも依然として存在する。
まとめると、GrB−H6によるRAP融合タンパク質の正しい開裂はFXaによるのとちょうど同じくらい速いが、GrB−H6によるRAP融合タンパク質の分解は、FXaによる分解よりもずっと遅い。この実施例において、GrB−H6プロテアーゼは従ってFXaよりも優れ、GrB−H6は非常に特異的なプロテアーゼであることが示される。
H6Ubi−IEPD−ApoA1+GrB−H6 C228FおよびH6Ubi−IEGR−ApoA1+FXaの開裂反応のために、プロテアーゼ:基質比はここでも1:1000であり、23℃、100mM HEPES pH7.75中で行った:
1.250μl(約400μg)H6Ubi−IEPD−ApoA1+0.4μg GrB−H6 C228F
2.250μl(約350μg)H6Ubi−IEGR−ApoA1+0.35μg FXa
GrB基質、H6Ubi−IEPD−ApoA1は23℃でわずか6時間インキュベーション後に約100%が開裂するが、FXa基質、H6Ubi−IEGR−ApoA1は6時間後に小フラクションしか開裂しなかった。FXaは、FXa基質の開裂を完了するために48時間以上を必要とすることもわかる。
前記の2つおn実施例において、GrB−H6およびGrB−H6 C228Fプロテアーゼは、精製されたウシFXa(ここにおいて、Xは認識部位IEPDまたはIEGRを示す)より速く(H6Ubi−X−ApoA1の場合)またはより特異的に(H6−X−RAPの場合)開裂するので、どちらも上記のようにFXaよりも優れている。これらの2つの実施例で、GrB−H6およびGrB−H6 C228Fはどちらもhexa−Hisテール(H6−IEPD−RAPにおけるH6)のような短いN末端タグを開裂でき、かつ興味のあるポリペプチドに隣接するGrB開裂部位を含む短リンカー配列(ここにおいて、H6Ubi−IEPD−ApoA1におけるApoA1、リンカー配列GGSIEPDを有する、ここにおいて、IEPDはGrB認識部位である)により非常に近接して結合した2つのタンパク質ドメイン間を開裂できる。上記の場合のどちらにおいてもN末端シーケンシングによりGrB−H6およびGrB−H6 C228Fは正しく開裂された生成物を生成することが立証された。
Qセファロースから溶出される融合タンパク質H6−IEPD−TN123(実施例7に記載されるようにして調製)は最終精製後、100mM HEPES pH7.5中にゲル濾過され、トップフラクションの200μlのサンプルを室温で、0、1、または10μlのいずれかの活性化GrB−H6(約0、0.2および2μgのGrB−H6)と共にインキュベートした(どちらも5mM CaCl2の存在下および不在下で)。CaCl2が存在しないインキュベーションから12、19および24時間ならびに5日インキュベーション後にSDS PAGE用サンプルを採取した。図4、5および13参照。CaCl2の存在下および不在下の両方でのインキュベーションからのSDS PAGE用サンプルを約20および48時間インキュベーション後に採取した。図14参照。
図4、5および13においてみられるように、H6−IEPD−TN123がCa2+の不在下でGrB−H6で開裂された場合に、サンプルは独立したバンドパターンを示した。H6−IEPD−TN123はIEPD配列で正しく開裂されたが、配列AQPDの内部部位と同程度に迅速であった。バンドパターンを図15に示す。H6−IEPD−TN123が正しいIEPD↓部位で開裂されたことは図4のレーンJからわかり、ここにおいてネズミH6−FX−TN123はFXaにより開裂され、H6−IEPD−TN123のGrB−H6開裂からの生成物と同じ大きさの生成物が得られ、内部開裂はなく、すなわち、パターンにおいて4つのバンドの最低のバンドである。
図13のレーンB〜DおよびL〜Nにおけるようにサンプルが還元された場合、異なるバンドパターンが出現する。このパターンも図15において説明され、特異的内部開裂部位AQPDの概念を支持する。
図11はGrB−H6を用いたH6−IEPD−TN123のインキュベーションを示し、ここにおいて、5mM CaCl2をインキュベーションの一部に添加した。Ca2+が存在する場合、2つのバンドしか出現せず(レーンEおよびG)、一方、図4、5、13および15に示すように、Ca2+が存在しない場合、4つのバンドが出現する。これは、Ca2+をインキュベーションに添加することにより、テトラネクチン(TNq123)における内部開裂部位AQPDはGrB−H6に接近できなくなることを示す。これは、AQPD配列がループ内に位置するためであり、この場合、QおよびD残基はテトラネクチンにおけるCa2+−イオン結合に関与する。従って、融合タンパク質において特定のIEPD部位で正しい開裂のみが起こり、TN123における内部開裂部位はCa2+の添加により「停止」される。
Ni2+−NTA−アガロースカラムから溶出される融合タンパク質のそれぞれを100mM HEPES pH7.4中にゲル濾過し、5つの異なるH6−TripUB変種のほぼ同じ濃度のフラクションを使用した。5つの変種は、H6−TripUB IEPD↓SP、H6−TripUB IQAD↓SP、H6−TripUB IQAD↓SG、H6−TripUB VGPD↓SPおよびH6−TripUB VGPD↓FGであった。それぞれの融合タンパク質のうち、200μlを室温、23℃で、5μlの活性化GrB−H6(約1μgのGrB−H6)と共にインキュベートした。プロテアーゼ:融合タンパク質比は従って1:500であった。SDS PAGE用サンプルを2、6、24および48時間インキュベーション後に採取し、ゲルを図16および17に示す。
図18は、H6−TripUB IEPD↓SPと比較したH6−TripUB IEPD↓TQおよびH6−TripUB IEPD↓IVの開裂のサンプルを示す。H6−TripUB IEPD↓TQおよびH6−TripUB IEPD↓IVの2つの構築物は、H6−TripUB IEPD↓SPのTrip部分の欠失突然変種であり、この場合、H6−TripUB IEPD↓TQにおいて最初の7つの残基が欠失し、H6−TripUB IEPD↓IVにおいて最初の13の残基が欠失している。
図18において示されるゲルから、H6−TripUB IEPD↓TQおよびH6−TripUB IEPD↓IVのどちらの開裂もH6−TripUB IEPD↓SPについてよりずっと速いことは明かである。次の図19に示すように、これはH6−TripUB IEPD↓SPのP2’部位におけるProのためである。
図19、パネルAは、H6−TripUB IEPD↓SPおよびH6−TripUB IEPD↓EPの開裂を示し、パネルBはH6−TripUB IEPD↓EPおよびH6−TripUB IEPD↓EGの開裂を示す。ここでもプロテアーゼ:融合タンパク質比は1:500であり、開裂反応ミックスを23℃および37℃の両方でインキュベートした。パネルAにおけるゲルについて、SDS PAGE用サンプルを0、4、24および48時間後、パネルBにおけるゲルについては0、6、24および50時間後に採取した。
これらのゲルから、P2’部位におけるProはGrB−H6 C228Fによる開裂の速度について不利であることは明らかである。しかし驚くべきことに、GrB−H6 C228FはIEPD↓EP部位を含有する基質を開裂させることができる。これはこの部位をIEPD↓SP部位と同じ低効率で開裂させるが、P1’部位におけるGlu(E)などの酸性残基は、ほとんどのセリンプロテアーゼ、例えば精製されたウシFXaなどによる開裂を廃することで有名である。
これらの観察に加えて、48時間GrB−H6またはGrB−H6 C228Fと共にインキュベーションした後でさえも、H6−TripUB変種のいずれにおいても内部開裂は起こらず、このことは、TripUB配列が7の他のAsp(D)残基を含有していても、GrB−H6およびGrB−H6 C228Fが操作された認識部位で非常に特異的に開裂することを示す。
グランザイムBの固定化
開裂混合物からグランザイムBを容易に除去できるようにするために、以下に記載するような6つの実験においてゲルマトリックス上に固定化するために、GrB−H6 C228F変種を使用した。
固定化は、0.3M NaHCO3/NaOH、pH8.6中、Mini−Leak(Kem−En−Tec)と呼ばれるジビニルスルホン活性化マトリックスを使用して行われた。2レベルの活性化を使用した;1リットルの沈殿したビーズあたりそれぞれ2〜5ミリモルおよび10〜50ミリモルのビニル基、活性化の各レベルについて、異なるタンパク質濃度およびPEG20000の存在下または不在下で3回の実験を行った。6回の実験を表10にまとめる。固定化のために、0.3M NaHCO3/NaOH;pH8.6中GrB−H6 C228Fを、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用したBradford検定から推定すると4mg/mlのタンパク質濃度で使用した。GrB−H6 C228F溶液の酵素活性を、緩衝液0.3M NaHCO3/NaOH;pH8.6および30%PEG20000;0.3M NaHCO3を検定緩衝液として使用して、実施例4に記載するようにして測定した。固定化は、流出ゲル、タンパク質溶液、および緩衝液を混合することにより行い、表10に記載した体積および濃度を得、続いて室温で48時間混合した。
固定化GrB−H6 C228Fの尿素およびグアニジウムクロリド(GdmCl)に対する安定性を、高いタンパク質濃度での2つの固定化について決定した(実験CおよびF)。実験CおよびFからのゲルマトリックスをそれぞれ3つの小スピンカラム中アリコートに分け、8M尿素;0.5M NaCl;50mM Tris−HCl、pH8.0(尿素)と6Mグアニジウムクロリド;50mM Tris−HCl、pH8.0(GdmCl)、または100mM HEPES、pH7.75(HEPES)のいずれかと30分間室温でインキュベートした後、100mM HEPES、pH7.75中で洗浄し、平衡化した。固定化GrB−H6 C228Fの酵素活性を次いで前記のようにして測定した。
得られた酵素活性を以下の表11に示す。非変性HEPES緩衝液とともにインキュベーションした場合と比較してインキュベーション後に酵素活性は増大するので、尿素での変性は固定化GrB−H6 C228Fに好ましいようであるが、グアニジウムクロリドでの変性は酵素活性を若干減少させる効果を有するようである。
12の開裂実験の全てについて、融合タンパク質を開裂させて、これからH6融合タンパク質が開裂されるTripUbi部分に対応する1つの生成物を得る。予想されるように、若干多くの融合タンパク質が実験CおよびFからのゲルマトリックスにより開裂され、これは最高のカップリングレベルを有する。開裂効率は評価しなかった。
Christensen J.H.ら(1991)、FEBS Letters、281(1−2):181−184.
Nykjaer A.ら(1992)、Journal of Biological Chemistry,267(21):14543−14548.
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Hochuli E.ら(1988)、Biotechnology、1321−1325
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Sun J.ら(2001)、Journal of Biological Chemistry 276(18):15177−15184.
Claims (39)
- 真正形態における興味のあるポリペプチドの調製法であって:
(i)そのN末端からC末端までに、(a)融合パートナー、(b)グランザイムBプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムBプロテアーゼ認識部位、(c)興味のあるポリペプチド(前記開裂部位が興味のあるポリペプチドに隣接している)を含む融合タンパク質を提供する工程、および
(ii)前記融合タンパク質をグランザイムBプロテアーゼと接触させて、これを前記開裂部位で開裂させて、真正形態の興味のある前記ポリペプチドを得る工程を含む方法。 - グランザイムBプロテアーゼ認識部位が、一般式:
P4P3P2P1↓
(式中、
P4はアミノ酸IまたはVであり
P3はアミノ酸E、QまたはMであり
P2はX(ここにおいて、Xは任意のアミノ酸である)であり
P1はアミノ酸Dであり
↓は前記グランザイムBプロテアーゼの開裂部位である)
のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の方法。 - グランザイムBプロテアーゼ認識部位が、ICPD↓、IEAD↓、IEPD↓、IETD↓、IQAD↓、ISAD↓、ISSD↓、ITPD↓、VAPD↓、VATD↓、VCTD↓、VDPD↓、VDSD↓、VEKD↓、VEQD↓、VGPD↓、VEID↓、VRPD↓、VTPD↓、LEED↓、LEID↓、LGND↓、LGPD↓、AQPD↓からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここにおいて↓が前記グランザイムBプロテアーゼの開裂部位を表す、請求項1記載の方法。
- 一般式がさらに、アミノ酸P1’およびP2’を含み、その結果、一般式P4P3P2P1↓P1’P2’(式中、P1’はXであり、ここにおいてXは任意のアミノ酸を表し、P2’はGであり、ここにおいてP1’およびP2’は興味のあるポリペプチドの一部である)になる、請求項2記載の方法。
- 一般式がさらに、アミノ酸P1’、P2’、P3’およびP4’を含み、その結果、一般式P4P3P2P1↓P1’P2’ P3’P4’(式中、P4’はDまたはEであり、ここにおいてP1’、P2’、P3’およびP4’は興味のあるポリペプチドの一部である)になる、請求項2記載の方法。
- 興味のあるポリペプチドが、酵素、ポリペプチドホルモン、単鎖抗体可変領域フラグメント、およびアポリポタンパク質Aからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドホルモンが、ソマトトロフィン、グルカゴン、インシュリンおよびインターフェロンからなる群から選択される、請求項6記載の方法。
- 酵素がグランザイムBである、請求項6記載の方法。
- 融合パートナーがアフィニティータグである、請求項1記載の方法。
- アフィニティータグが、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、FLAG−タグ、Strepタグ、c−myc−タグ、S−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンS−トランスフェラーゼタグ、およびマルトース結合タンパク質からなる群から選択される、請求項9記載の方法。
- グランザイムBプロテアーゼが、ヒトグランザイムBプロテアーゼ、マウスグランザイムBプロテアーゼおよびラットグランザイムBプロテアーゼからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- グランザイムBプロテアーゼが、システイン残基228番(キモトリプシノゲンナンバリング)がフェニルアラニンに変異している、配列番号57に示されるヒトグランザイムBプロテアーゼ変種である、請求項11記載の方法。
- グランザイムBプロテアーゼが固定化形態である、請求項1記載の方法。
- グランザイムBプロテアーゼがC末端を介して固定化される、請求項13記載の方法。
- グランザイムBプロテアーゼがリシンアミノ酸残基により固定化される、請求項13記載の方法。
- アフィニティータグがポリヒスチジンタグであり、融合タンパク質がNi2+イオンおよびニトリロトリ酢酸(NTA)の存在下でグランザイムBプロテアーゼと接触する、請求項10記載の方法。
- Ni2+の濃度が1〜20mMの範囲であり、NTAの濃度が1〜20mMの範囲である、請求項15記載の方法。
- そのN末端からC末端までに、(a)融合パートナー、(b)グランザイムBプロテアーゼ開裂部位を含むグランザイムBプロテアーゼ認識部位、および(c)興味のあるポリペプチド(ここにおいて、前記開裂部位は興味のあるポリペプチドに隣接している)を含む、融合タンパク質。
- グランザイムBプロテアーゼ認識部位が、一般式:
P4P3P2P1↓
(式中
P4はアミノ酸IまたはVであり
P3はアミノ酸E、QまたはMであり
P2はXである(ここにおいて、Xは任意のアミノ酸である)
P1はアミノ酸Dであり
↓はグランザイムBプロテアーゼの開裂部位である)
のアミノ酸配列を有する、請求項18記載の融合タンパク質。 - グランザイムBプロテアーゼ認識部位が、ICPD↓、IEAD↓、IEPD↓、IETD↓、IQAD↓、ISAD↓、ISSD↓、ITPD↓、VAPD↓、VATD↓、VCTD↓、VDPD↓、VDSD↓、VEKD↓、VEQD↓、VGPD↓、VEID↓、VRPD↓、VTPD↓、LEED↓、LEID↓、LGND↓、LGPD↓、AQPD↓からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここにおいて↓は前記グランザイムBプロテアーゼの開裂部位である、請求項18記載の融合タンパク質。
- 一般式がさらに、アミノ酸P1’およびP2’を含み、その結果、一般式P4P3P2P1↓P1’P2’(式中、P1’はXであり、ここにおいてXは任意のアミノ酸を表し、P2’はGであり、ここにおいてP1’およびP2’は興味のあるポリペプチドの一部である)になる、請求項19記載の融合タンパク質。
- 一般式がさらに、アミノ酸P1’、P2’、P3’およびP4’を含み、その結果、一般式P4P3P2P1↓P1’P2’ P3’P4’(式中、P4’はDまたはEであり、ここにおいてP1’、P2’、P3’およびP4’は興味のあるポリペプチドの一部である)になる、請求項19記載の融合タンパク質。
- 興味のあるポリペプチドが、酵素、ポリペプチドホルモン、単鎖抗体可変領域フラグメント、およびアポリポタンパク質Aからなる群から選択される、請求項18記載の融合タンパク質。
- ポリペプチドホルモンが、ソマトトロフィン、グルカゴン、インシュリンおよびインターフェロンからなる群から選択される、請求項23記載の融合タンパク質。
- 酵素がグランザイムBである、請求項23記載の融合タンパク質。
- グランザイムBがC末端ポリヒスチジンタグを含む、請求項25記載の融合タンパク質。
- pro−IEPD−GrB−H6(配列番号2)およびpro−IEAD−GrB−H6(配列番号3)からなる群から選択される、請求項25記載の融合タンパク質。
- pro−IEPD−GrB−H6 C228A(配列番号5)、pro−IEPD−GrB−H6 C228T(配列番号6)、pro−IEPD−GrB−H6 C228V(配列番号7)、およびpro−IEPD−GrB−H6 C228F(配列番号8)からなる群から選択される、請求項25記載の融合タンパク質。
- 酵素グランザイムBが、システイン残基228番(キモトリプシノゲンナンバリング)がフェニルアラニンに変異している、ヒトグランザイムBプロテアーゼ変種である、請求項25記載の融合タンパク質。
- ヒトグランザイムBプロテアーゼ変種が配列番号57に示される通りである、請求項25記載の融合タンパク質。
- 融合パートナーがアフィニティータグである、請求項18記載の融合タンパク質。
- アフィニティータグが、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、FLAG−タグ、Strep−タグ、c−myc−タグ、S−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンS−トランスフェラーゼタグ、およびマルトース結合タンパク質からなる群から選択される、請求項31記載の融合タンパク質。
- システイン残基228番(キモトリプシノゲンナンバリング)がフェニルアラニンに変異しているヒトグランザイムBプロテアーゼ変種。
- 配列番号57に示される、請求項33記載のヒトグランザイムBプロテアーゼ変種。
- 請求項33または34に記載のヒトグランザイムBプロテアーゼ変種の使用。
- 請求項19〜32のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項33または34のいずれかに記載のヒトグランザイムBプロテアーゼ変種をコード化する単離された核酸配列。
- 請求項36に記載の単離された核酸配列を含む組換えベクター。
- 請求項37に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項18に記載の融合タンパク質または請求項33または34に記載のヒトグランザイムBプロテアーゼ変種の製造法であって:
(i)プロモーターに操作可能に結合した請求項36に記載の単離された核酸配列を含む組換えベクターを提供する工程、
(ii)前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
(iii)前記宿主細胞を前記融合タンパク質またはヒトグランザイムBプロテアーゼ変種を発現する条件下で培養する工程、および
(iv)所望により前記融合タンパク質またはヒトグランザイムBプロテアーゼ変種を単離する工程を含む方法。
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