JP2007524103A5

JP2007524103A5 -

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Publication number: JP2007524103A5
Application number: JP2007500191A
Authority: JP
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2008-03-21
Anticipated expiration: 2025-02-28

Description

結果は、図１に与えられる：（Ａ）非同調（ＮＴ）細胞およびＧ１、Ｓ、Ｇ２（ダブル・チミジンブロック）およびＭ（ノコダゾール）に抑えられた同調ヒーラ細胞からの全細胞抽出物中のＣＡＦ−１ｐ１５０およびｐ６０のウエスタン・ブロット分析。各場合において、１０５個の細胞に相当する溶出液がロード（load）された。βアクチンがコーディングコントロールとして用いられる。対応するＦＡＣＳプロファイルが上側に示される。（Ｂ）ヒーラ細胞およびＭＣＦ７細胞における免疫蛍光法によって示されるＣＡＦ−１ｐ１５０およびｐ６０サブユニットの発現。ＭＣＦ７細胞は、未処理（ａ）、ＤＭＳＯ処理（ｂ）であるか、４８時間のＩＣＩ１８２７８０１０ｎＭ（ＤＭＳＯ中）によりＧ０にブロックされた（Ｇ０）。Ｓ期の割合（％Ｓ）およびＣＡＦ−１ｐ１５０およびｐ６０染色細胞の百分率（％Ｃ）が下に示される。バーは１０μｍである。（Ｃ）未処理（ａ）、ＤＭＳＯ処理（ｂ）またはＧ０にブロックされたＭＣＦ７細胞からの全細胞抽出物が、半定量ウエスタン・ブロットに用いられ、ＣＡＦ−１サブユニット（ｐ１５０、ｐ６０）およびＣＡＦ−１パートナー（ＡＳＦ−１、ＰＣＮＡ、ＨＰ１）の発現が分析された。簡単のため、複数の分析が類似のβアクチンレベル（内部対照）とともに並列されている。各場合において、１０５個の細胞に相当する溶出液がロードされた。（Ｄ）上側パネル：非同調増殖（ＡＳ）またはＧ０ブロックされた（Ｇ０）ＭＣＦ７細胞からのサイトゾルおよび核の各抽出物においてウエスタン・ブロットによって分析されたＨＩＲＡ、ＣＡＦ−１ｐ１５０およびｐ６０（抗ｐ６０ｐｏｌｙ）の発現。１０μｇのタンパク質が各場合においてロードされた。下側パネル：非同調増殖（ＡＳ）またはＧ０ブロック（Ｇ０）ＭＣＦ７細胞において免疫蛍光法によって分析されたＨＩＲＡおよびＣＡＦ−１ｐ６０（抗ｐ６０ｐｏｌｙ）の発現。バーは１０μｍである。

前記結果は、この調節が不死化された形質転換細胞系に特有ではなくて、より一般的な現象を示すことを追加的に示す。これは、ＣＡＦ−１活性とＤＮＡ複製の直接的な結び付きと整合する。静止細胞は複製しないので、それらは、この特定の機能を成し遂げるためにＣＡＦ−１を必要としない。しかしながら、ヒストンの再生は、依然として、長期活動休止細胞に必要とされ、このため、他の因子がヒストンの沈着を確実に行うべきである。

細胞学標本の免疫細胞化学染色からの予備的な結果は、少数の事例（１８）においてｐ６０およびＰＣＮＡ発現間に高い相関を示した（ｒ＝０．９５，ｐ＝０．０００１）。しかしながら、増殖マーカーとしてのＰＣＮＡの使用は、固定時間に対する抗原感度に起因する限界を有するので、さらなる実験が、大量のサンプルを用いて、確立された増殖マーカーＫｉ−６７（これは、癌診断および予後のために日常的に広く用いられる）と比較して行われた。ＣＡＦ−１ｐ６０およびＫｉ−６７の免疫細胞化学染色は、細胞学標本およびパラフィン包理組織について行われ、これは、ＣＡＦ−１ｐ６０抗体が種々のタイプの臨床材料について十分に用いられ得ることを示した（図５Ｂ、Ｃ）。さらに、ＣＡＦ−１ｐ６０に対する抗体は、良性の胸部病巣内の増殖細胞を検出することを可能にした（図５Ｂ、Ｃ）。それはまた、非腫瘍および腫瘍組織を明瞭に区別し、腫瘍組織は、強い陽性を示す（図５Ｄ）。正常な組織において、皮膚上皮の基底層および大腸陰窩の下３分の１中に見出される増殖細胞は、我々の抗体により陽性染色された（図５Ｅ）。

Claims

ヒトまたは非ヒトの生物学的サンプル中の細胞の増殖状態を評価する方法であって、
ｐ６０およびｐ１５０クロマチン構築因子（略してＣＡＦ−１）サブユニットを増殖マーカーとして検出する工程を包含する方法。
検出は、タンパク質レベルで行われる、請求項１に記載の方法。
前記サブユニットのリン酸化された誘導体を検出する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
全細胞フラクションまたは細胞核中のＣＡＦ−１サブユニットのクロマチン結合フラクションまたはそれらのリン酸化された誘導体を検出する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
検出は、免疫蛍光法、ウエスタン・ブロット、タンパク質チップおよび好ましくは、免疫細胞化学または免疫組織化学によって行われる、請求項２〜４のいずれか１つに記載の方法。
抗ＣＡＦ−１抗体または個々のＣＡＦ−１サブユニットまたはそれらのフラグメントを標的にする抗体を使用する工程を包含し、該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナ抗体である、請求項５に記載の方法。
前記ＣＡＦ−１サブユニットの検出は、ＲＮＡレベルで行われる、請求項１に記載の方法。
プライマー対：ｐ６０−フォワード，CGGACACTCCACCAAGTTCT；ｐ６０−リバース，CCAGGCGTCTCTGACTGAAT；ｐ１５０−フォワード， GGAGCAGGACAGTTGGAGTG；ｐ１５０−リバース，GACGAATGGCTGAGTACAGA
を使用する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
癌の診断または予後、または、治療中の腫瘍応答のモニタリングにおいて、ＣＡＦ−１を使用する工程と包含する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
Ｋｉ−６７またはＰＣＮＡまたはＭＣＭとともに、バイオマーカーとしてＣＡＦ−１を使用する工程を包含する、請求項９に記載の方法。
乳癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮内膜癌および頚部癌等の固形腫瘍の場合において細胞増殖を評価するための、請求項９または１０に記載の方法の使用。