JP2007509169A - 静脈内注入後のGly−Pro−Gluの神経保護効果 - Google Patents

静脈内注入後のGly−Pro−Gluの神経保護効果 Download PDF

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Abstract

Gly-Pro-Glu(GPE)は、in vivoで急速に代謝される。本発明者らは、試験した全ての脳領域でGPE注入が強力且つ持続的な神経保護を誘し、ある実施形態では、GPE注入の効果はボーラス注射後の注入(「負荷用量/注入」)による効果よりも高いことを見出した。GPEは海馬内のアポトーシスを軽減し、小膠細胞増殖を阻害し、星状細胞の損傷誘導性喪失を防止し、長期身体機能を改善した。注入後のGPEは広範な有効用量範囲(0.3〜30 mg/kg/h)を示し、治療有効期間を驚く程延長し、神経損傷1時間後〜少なくとも24時間後でも使用可能である。本発明者らは、急性GPE投与の神経保護効果が延長されることにより、神経損傷後に投与した場合でさえも種々の神経変性病態の有効な治療に使用することができることを見出した。従ってGPEは有効な神経保護剤であり、単独で又は他の神経保護剤、抗炎症薬又はペプチダーゼもしくはプロテアーゼインヒビターとの同時投与で使用され得る。GPE並びにプロテアーゼ及び/又はペプチドインヒビターの組成物を提供する。

Description

急性虚血性損傷は、成年期における死亡および長期的な身体障害の主な原因の1つである。現在、脳卒中発症から3時間以内に患者が診療所に到着できる場合、脳灌流を強化するための血栓溶解(thrombus)によって治療することができる。急性虚血性脳損傷を治療するための神経保護は別の機構であると考えられている(Lutsep and Clark,1999)。脳卒中または開心術に関連する神経系の合併症などの虚血性損傷に続く数時間後、場合によっては数日で大部分のニューロンは死滅することがよく実証されている(Coimbra et al.1996;Beilharz et al.1995;Gallyas et al.1992;Hsu et al.1994;Jeon et al.1995)。プログラム細胞死経路の開始のため、このような細胞消失の発展が進行し、治療介入のための治療機会(a windows of opportunity)が与えられる。
インスリン様成長因子−1(IGF−1)は、中枢神経系(CNS)に天然に存在し(Baskin et al.1988)、CNS発生で重要な役割を果たし、また、ニューロン細胞およびグリア細胞の両方のための生存因子および分化因子として作用する(Aberg et al.2000;O’Donnell et al.2002)。IGF−1は、成熟した脳(Gluckman et al.1992;Guan et al.1996;Guan et al.1993)および発達中の脳(Johnston et al.1996;Galli et al.1995)の両方においていくつかの形態虚血性損傷からニューロンの死滅を防止することができることはよく実証されている。IGF−1の抗アポトーシスの役割も、in vitroでよく実証されている(Yin et al.1994)。しかし、IGF−1の臨床適用は、IGF−1の血液脳関門(BBB)を通過する能力が限られていることおよびIGF−1の有糸分裂促進作用および代謝作用の可能性のため、問題を含んでいる。
Saraら(1989)は、酸性プロテアーゼによって媒介される過程において、IGF−1が自然にdes−N(1−3)−IGF−1(des−IGF−1)とN末端トリペプチであるグリシン−プロリン−グルタミン酸(「Gly−Pro−Glu」;「GPE」とも呼ばれる)とに切断できることを最初に示唆した(Yamamoto and Murphy,1994;Sara et al.1989;Yamamoto and Murphy,1995)。GPEは、IGF−1受容体と相互作用することなく、in vitroでドーパミンおよびアセチルコリンの放出を刺激することができることが証明されている(Nilsson−Hakansson et al.1993)。本発明者らは、GPEの脳室内投与が、特に脳皮質および海馬のCA1−2亜領域での低酸素性虚血性(HI)脳損傷後、ニューロンを保護できることを以前に証明している(Guan et al.1999)。静脈内(i.v.)投与製剤を使用して患者を治療することは脳室への投与と比較してはるかに容易であろうことから、有効なi.v.治療の開発は非常に望ましい。GPEは、分子サイズが小さいため、虚血性損傷後に障害が起きた血液脳関門(BBB)を通過することができる。したがって、本発明の1つの目的は、ニューロンの変性または死滅を軽減する有効なi.v.治療を開発することである。
(発明の概要)
近年のGPEの免疫アッセイの開発に伴い、本発明者らは、動物の循環系においてGPEが急速に分解されることを発見した。しかし、その急速な分解にもかかわらず、GPEの静脈内(i.v.)投与は、直接的な脳室内投与後に認められた神経保護効果に類似する神経保護効果を示す。本発明のある実施形態では、GPEを動物の循環系に直接注射して神経細胞死を減少または防止することができる。他の実施形態では、GPEのi.v.ボーラスを、それに続くいかなる注入も行うことなく、投与することができる。さらなる実施形態では、i.v.ボーラスに続いてGPEの持続的静脈内注入を行うことができる。さらに他の実施形態では、持続的静脈内注入を、事前のいかなるボーラス注射を行うことなく使用することができる。本発明者らは、事前にボーラス注射を行わずに投与した場合、GPEの持続的i.v.投与がより顕著な神経保護効果を示すことができることを予想外に見出した。
本発明者らはまた、ニューロンの死滅または変性に至る損傷後に投与した場合でさえ、GPEは、死滅または変性からニューロンを保護できることを予想外に見出した。いくつかの実施形態では、GPEを、損傷から24時間後までに投与することができる。
本発明者らはまた、短期間のGPE投与で長期間の治療的利益を得ることができ、ニューロン損傷後に典型的に起こる神経変性の進行を少なくとも部分的に逆行させることができることを予想外に見出した。いくつかの実施形態では、GPEの短期間投与は、損傷および治療から30日間持続する神経保護効果を示し得る。これらの所見は、GPEの短い半減期またはいかなる先行技術に基づいても完全に予想外である。
さらなる態様では、ペプチダーゼインヒビターおよび/またはプロテアーゼインヒビターを使用して血漿中でのGPEの分解を減少させ、よってGPEの効果を増大または延長させることができる。
さらなる態様では、GPEおよびプロテアーゼインヒビターを含む組成物を提供する。
(発明の詳細な説明)
ある態様では、本発明は、動物の循環系におけるGPEの量を決定する方法を含む。GPE測定のための放射免疫アッセイ手順は、PCT国際出願番号PCT/US02/08195号、2002年3月14日にGregory Brian Thomas,Bernhard Hermann Heinrich Breier and David Charles Batchelor,inventorsによって提出された発明の名称が“Anti-GPE Antibodies, Their Uses and Analytical Methods for GPE”の米国特許出願番号10/100,515号明細書(代理人整理番号:NRNZ 1016US1 DBB)、および発明者:Gregory Brian Thomas,Bernhard Hermann Heinrich Breier and David Charles Batchelorによって同時提出された発明の名称が“Anti-GPE Antibodies, Their Uses, and Assays for Weakly Immunogenic Molecules,”の通常の特許出願明細書(代理人整理番号:NRNZ 1016 US2 DBB)に記載されている。上記の各出願明細書は、参照により本明細書に含まれるものとする。
〔GPEはin Vivoの血漿中で短い半減期を有する〕
上述のようなアッセイを使用して、本発明者らは、GPEが約1〜2分間の半減期で循環系から除去されることを見出した。この除去機構は明らかではないが、循環系に存在することが知られているプロテアーゼおよびペプチダーゼは、GPEの分解を担い得る。その除去機構とは無関係に、静脈内治療が有意義であることが示唆される。
第1に、循環系からの急速な除去のため、神経保護量のGPEは本発明の薬剤の循環系への注入によって維持することができる。他の実施形態では、比較的少量のGPEボーラス後に持続的注入を行って、ボーラス単独によって得られる神経保護効果よりも一層高い神経保護効果を得ることができる。さらに他の実施形態では、驚くべきことに、最初のボーラスなしにGPEの持続的注入を行うことにより、ボーラスに続いて持続的注入を行って得られる神経保護効果よりも一層高い神経保護効果を得ることができる。
本発明者らのデータにより、HI損傷ラットにおいてのみi.v.注入から4時間後のCSF中のGPEの有意な上昇が見出されるので、GPEの中枢浸透が実証された。血液脳関門の虚血性損傷誘導性破壊は、内皮のタイトジャンクションの喪失のため、早ければ損傷から2〜4時間後であり得る。GPEがCSFに侵入することができる機構は、明白には知られていない。しかし、1つの仮説によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性化も内皮基底膜を破壊し得る(Fujimura et al.1999;Planas et al.2001)。GPEの小さな分子サイズおよび親水性により、問題の脳へアクセスすることができる。したがって、虚血性損傷後の基底膜の破壊(Fujimura et al.1999)は、脳へのGPEの取り込みと関連し得る。
非競合的NMDA受容体アンタゴニストのMK−801は小分子であり、動物での神経保護効果がよく実証されている。しかし、GPEの損傷関連CNS取り込みと異なり、虚血性脳損傷は末梢投与後の組織へのMK−801結合を減少させる(Wallace et al.1992)。CNSに非特異的にアクセスする物質と比較して、GPEの損傷媒介性中枢浸透は脳の損傷領域に本発明の薬剤をより特異的に標的化でき、非損傷領域との望ましくない相互作用を最小にすることができる。しかし、他の仮説はそのような所見を説明することができ、本発明者らは、本出願がいずれか特定の作用機構に制限されることを意図しない。
単回ボーラス注射後のGPEの神経保護効果の程度は有意であるが、いくらか変動し得る。この変動性は、HI損傷ラットへの単回ボーラス投与から2分後未満と評価された血漿中でのGPEの半減期の短さに起因し得る。GPEのボーラス静脈内注射後のその主な代謝産物であるグリシン、グルタミン酸およびプロリンへの急速な分解も正常なラットにおいて最近報告された(Batchelor et al.2003)。GPEは、内因性プロテアーゼ酵素によってIGF−1から切断され(Yamamoto and Murphy 1994)、GPEの短い半減期は、急速なタンパク質分解に対するその感受性に関連し得る。GPEの有効な血液レベルの維持、言い換えれば安定な中枢取り込みの保持が必要と仮定すると、連続的注入はGPE治療のための有効な投与経路であるようである。
〔GPEの静脈内投与は有効である〕
GPEの静脈内注入によって、試験した全ての脳領域において広範な有効用量範囲で一貫して強い神経保護が得られた。歯状回および大脳皮質の組織損傷は、最も有効な用量(3mg/kg/時間で4時間)のGPEでの治療後に完全に防止された。
本発明者らは、驚いたことに、いくつかの場合、持続的注入がボーラス注射後に同量の薬物注入するよりも神経保護効果が高いことを見出した。したがって、これらの場合、より低い用量のGPE後により高い神経保護効果が認められた。この結果は、先行技術に基づいた場合、完全に予想外であった。
急性損傷または疾患に対応した創薬および薬物の開発における別の実施上の問題は、適時での患者のリクルートメント(recruitment)及び治療への迅速なアクセスの提供である。例えば、急性虚血性脳卒中後の抗凝固薬の有効性が証明されているにもかかわらず、大部分の患者は3時間以内に入院しない(Famularo et al 1998;Fisher and Schaebitz 2000)。実験モデルで神経保護性を示すことが証明された大部分の化合物は、治療機会が非常に短い(Fisher and Schaebitz 2000)。「治療機会」は、その間に有効な治療法を開始することができる急性事象後の期間を意味する。損傷から6時間後より後に数種の化合物を投与することができるが、これらの化合物でさえ初期治療効果と比較して有効性が減少する(Mary et al.2001;Williams et al.2003)。しかし、本発明者らは、3〜7時間、7〜11時間後に開始した場合にGPE治療が有効であり得ることを予想外に見出した。実際、これらの期間中のGPEの投与は、より早い投与と比較して神経保護の程度が類似していた。さらに、HI損傷から24時間後のGPEの投与も顕著な神経保護効果が得られた。これらの所見に基づいて、本発明者らは、投与が24時間を超えて遅延した場合でさえもGPEの有益な効果を得ることができると考える。広範な有効用量およびGPEの治療機会の延長により、神経が損傷した動物をニューロンの死滅または変性の程度を減少させるためにGPEで有効に治療することができ、典型的に慢性ニューロン損傷に関連する機能喪失を減少させることができる。部分的神経保護効果でさえ、脳卒中、冠状動脈バイパス手術、外傷性神経損傷、または他の神経損傷の副作用を減少させるのに充分であり得る。したがって、特定の状況で最も有効なタイミングおよび投薬が実施されない場合でも、神経損傷を受けた患者にはささやかな程度(modest degree)の神経保護であっても非常に有利であり得る。
この治療機会の延長に関与する基礎をなす機構は明確に知られていないが、1つの仮説は、最初の損傷によってニューロンの死滅が遅延し得ることである。充分に理解されている損傷の第1週後の二次的ニューロン喪失に加えて、細胞死の遅延は、何ヵ月にもわたる進行性の「第3」段階に継続し得る(Coimbra et al.1996;Colbourne et al.1999;Gallyas et al.1992;Hsu et al.1994;Jeon et al.1995)。遅延した細胞死のこの経時変化は、現在の実験ラット系で以前に証明されている(Guan et al.2001b)。ほとんどの実証研究は、排他的に最初の損傷後24時間と1週間との間の組織学的終点を報告している。しかし、いくつかの化合物で認められた初期保護を、長期間維持することができない(Fisher and Schaebitz 2000;Gladsrone et al.2002)。したがって、短期間のニューロンの結果は、必ずしも全ての治療有効性を反映せず、急性研究のみに頼ることは、長期治療の利点の過小評価によって臨床的発展を誤った方向に導き得る。本実験は、損傷から1〜5時間後に開始したGPEのi.v.注入によってHI損傷から21日後に試験した長期ニューロンの結果が改善されたことを示した。おそらく脳の損傷および回復時に放出された内因性生成物の二相効果のために、特にこの動物モデルにおいて損傷から21日後に試験したニューロン損傷が進行することが以前に報告されている(Guan et al.2001;Sharp et al.2000)。
動物モデル由来の結果のヒトへの変換の失敗について充分に認識されている落とし穴の1つは、前臨床開発が典型的には組織学的結果に基づいて評価されるのに対し、臨床試験は長期挙動または臨床結果に基づいて評価されることである(Fisher and Schaebitz 2000;Gladsrone et al.2002)。
以前の報告では、HI損傷により、中大脳動脈の範囲内で片側性損傷を起こし(Ginsberg and Busto 1989)、その灌流領域は体性知覚機能に非常に関連する(Guan et al.2001)。 大脳皮質のこの特定の分布におけるニューロン損傷によって損傷した半球に対して対側で体性知覚機能が有意に喪失し、初期の時点(3日目および5日目)で最も顕著であった。HI損傷から10日後に自発的機能回復が認められ、これは種々の成長因子の内因性生成に関連していた(Yamaguchi et al.1991;Gasser et al.1986;Gomez et al.1992;Klempt et al.1992)。ビヒクル処置群における試験期間にわたり、体性知覚機能の有意な回復は認められなかった。他方では、パッチへの接触時間が遅延したラットは試験中のパッチの見逃し(missing)もしばしば認められ、このことは、線条体(striatum)中の複数の表現型ニューロンの喪失がHI損傷後に報告されていることから、運動神経の欠損を示唆し得る(Guan et al.1999)。IGF−1での治療(Guan et al.2001)と同様に、GPEでの処置によっても体性知覚機能の回復が改善され、比較可能な長期的なニューロン結果が得られた(図2AおよびB)。本発明者らは、IGF−1の機能回復が梗塞サイズの減少よりもむしろニューロン損傷の進行の防止に関連することを以前に報告している(Guan et al.2001)。本研究は、組織の空洞化および萎縮が少数のラットでも認められ(6匹のビヒクル処置ラットのうちの2匹)、これはおそらく本研究におけるより小さな損傷に起因することを示した。しかし、GPE処置群は組織学的損傷が最小であり、GPEは典型的にHIに関連する行動の欠陥を完全に防止した。
脳に対する急性低酸素性虚血性損傷は、複合的病因によりニューロンを損傷させる。いくつかの細胞は壊死(細胞膜の破裂によって開始されるより急速なニューロン死によって認識される形態)を示す一方で、他の細胞は核凝縮によって開始されるより進行した過程(例えば、アポトーシス)によって死滅させられる。ニューロン死の両形態は、損傷直後に起こらず、治療機会が得られる。TUNELおよびカスパーゼ−3陽性免疫染色は、アポトーシスを受けた細胞のマーカーとして広く使用されている(Snider et al.1999;Velier et al.1999)。現在使用されている組織損傷スコアがニューロンの壊死およびアポトーシスの両方を評価することを考えると、ビヒクル処置群における海馬のCA1−2、CA3、およびCA4亜領域で類似の程度のニューロン損傷が見出された。興味深いことに、TUNEL陽性細胞の増加は主に海馬のCA3亜領域で認められる一方で、大部分のカスパーゼ−3陽性細胞はビヒクル処置群のCA4亜領域で異なって存在した。TUNELおよびカスパーゼ−3陽性細胞は共にCA1−2亜領域で低かった。実施段階のプロテアーゼであるカスパーゼ−3の活性化(Yakovlev and Faden 2001)によってDNAが断片化し(Springer et al.2001)、その後にTUNELを陽性に標識することができる。
HI損傷はカスパーゼ−3とTUNEL標識との間に空間的な相違を生じ、カスパーゼ−3経路が必ずしも陽性TUNEL標識につながらないことを示す。TUNELとカスパーゼ−3との間の免疫反応性のこの分離は、CNSの外側でも認められている(Donoghue et al.1999)。したがって、これらの空間的相違は、カスパーゼ−3依存性経路およびカスパーゼ−3独立性経路が共にHI損傷後の海馬中のニューロン損傷に関与することを示した。本発明者らのデータは、HI損傷から1〜5時間後のGPE処置が組織損傷ならびにTUNELおよびカスパーゼ−3陽性細胞を減少させることを明確に示し、GPE投与がニューロンの壊死およびアポトーシスの両方の阻害に関連することが示唆される。
神経の損傷および回復におけるグリア細胞の役割は報告されているが、議論の余地がある(Kraig,et al.1995)。本発明者らのデータは、GPEが小膠細胞増殖を強く抑制し、星状細胞のHI誘導性喪失を完全に防止することを示す。反応性星状細胞の生理学的役割は、血液脳関門(BBB)の完全性(integrity)、細胞間伝達、細胞内の鉄ホメオスタシス、ニューロンの柔軟性、および成長因子代謝の調節によるニューロンの神経栄養作用に関与することが示唆された(Kraig et al.1995)。生理学的条件下では、星状細胞からの興奮性アミノ酸の放出が受容体媒介性であるのに対して、星状細胞からの損傷誘導性興奮性アミノ酸漏出は星状細胞の膨潤に起因し(Kraig et al.1995)、この膨潤が、ホメオスタシスを損傷させてさらなるニューロン損傷に寄与し得る。虚血性損傷後の星状細胞の喪失が、組織梗塞発生の重要な部分であることも示唆されている(Matsui et al.2002;Tateishi et al.2002)。したがって、星状細胞の完全性の維持は、GPEの神経保護効果の一部であり得る。
小膠細胞は、一般に、脳炎症、自己免疫応答、およびニューロン変性で役割を果たすと考えられている(Kraig et al.1995)。IGF−1での治療(Cao et al.2003)と異なり、PCNA陽性細胞(細胞増殖のマーカー)もGPE処置によって減少するので、GPEでの処置はおそらく細胞増殖の阻害によってHI損傷誘導性イソレクチンB4陽性小膠細胞を減少させた。HI損傷後のGPEの神経保護に関与し得るTGFβ−1(McNeill et al.1994)などの抗炎症特性を有するいくつかの神経保護剤が同定されている。GPEと対照的に、IGF−1は、虚血性脳損傷後の星状細胞および小膠細胞の増殖を促進する(Cao et al.2003;O’Donnell et al.2002)。これにより、小膠細胞/ニューロン細胞相互作用におけるGPEとIGF−1との間の異なる作用機構が示唆され得る。
i.v.ボーラス、i.v.注入、またはi.v.ボーラスとi.v.注入の両方によるGPEの投与は、神経変性病態を有する患者の治療に特に適切であり得る。このような病態には、例示のみを目的として、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、脊髄性筋萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ痴呆、進行性核上麻痺、広汎性髄鞘中心障害(myelinopathia centralis diffusa)(消失性白質疾患(vanishing white matter disease))、慢性神経変性疾患、ダウン症候群、白質脳症、低酸素症、虚血、冠状動脈バイパス移植(CABG)手術およびシルダー病、神経芽細胞腫、頭部損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、再灌流障害、癲癇、毒素損傷(toxin damage)、放射線損傷、仮死、炎症状態、慢性または急性脳脊髄炎、脳炎、視神経炎、横断性脊髄炎、髄膜炎、汎脳炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、橋中心髄鞘崩壊症、および視神経脊髄炎が含まれる。
本明細書中に記載の投与経路はまた、他の神経保護剤の投与に適切である。このような薬剤には、例示のみを目的として、成長因子および関連誘導体(インスリン様成長因子I(IGF−1)、インスリン様成長因子II(IGF−II)、形質転換成長因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、IGF結合タンパク質(特に、IGFBP−3)、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF−3、FGF−4、FGF−6、角化細胞成長因子、アンドロゲン誘導性成長因子、int−2、線維芽細胞成長因子相同因子−1(FHF−1)、FHF−2、FHF−3、およびFHF−4、角化細胞成長因子2、グリア活性化因子、FGF−10、およびFGF−16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2(BMP−2)、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、TNF−α、クロメチアゾール;キヌレン酸、Semax、タクロリムス、L−スレオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール、アドレノコルチコトロピン−(4−9)アナログ(ORG 2766)、ジゾルシピン(dizolcipine)(MK−801)、セレギリン、グルタミン酸アンタゴニスト、AMPAアンタゴニスト、および抗炎症薬からなる群より選択される抗アポトーシス薬または神経保護剤が含まれる。
さらなる神経保護剤には、グルタミン酸アンタゴニスト(NPS1506、GV1505260、MK−801、およびGV150526が含まれる)、2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070、およびLY300164からなる群から選択されるAMPAアンタゴニスト、ならびに抗MAdCAM−1抗体およびインテグリンα4β1受容体およびインテグリンα4β7受容体に対する抗体からなる群より選択される抗炎症薬が含まれる。
GPEは血漿中で非常に急速に分解されるので、ペプチダーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターの使用により、GPEの効果を増強してその半減期を延長することができる。したがって、さらなる実施形態では、GPEを、1つまたは複数のペプチダーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターと共に投与することができる。本発明のいくつかの実施形態では、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、および/もしくはジペプチダーゼまたはメタロプロテイナーゼのインヒビターを使用することができる。ある実施形態では、効果を増強および/または延長するために、ペプスタチンA、ロイペプチン、ベスタチン、アプロチニン、AEBSF、メタロプロテイナーゼインヒビター、およびE−64からなる群から選択される1つまたは複数のインヒビターを、GPEと同時投与することができる。
さらに、本発明は、GPEおよび1つまたは複数のペプチダーゼインヒビターを含む新規の組成物を提供する。このようなインヒビターには、上記列挙のインヒビターおよび当該分野で公知の他のインヒビターが含まれる。さらに、必要とする被験体への投与に適切な治療用組成物を得るために、GPEおよび1つまたは複数のペプチダーゼインヒビターまたはプロテアーゼインヒビターを含む組成物中に賦形剤を含めることができる。
本発明者らは、GPEがHI脳損傷後のニューロン損傷の防止で強力且つ即効性のある効果を示すことを見出した。その損傷依存性中枢浸透および急速な血漿クリアランスに加えて、広い有効用量範囲、延長された治療機会、および長期機能回復により、GPEは急性虚血性脳損傷治療のために開発されるべき潜在的候補となる。星状細胞生存の促進および小膠細胞増殖の阻害は、ニューロンのアポトーシスおよび壊死の両方の防止においてGPEが重要であり得る。
(実施例1:動物および手術)
これらの研究は、Animal Ethics Committee of the University of Aucklandによって承認された。動物の苦痛を最小にし、且つ使用動物数減少させるように常に努力した。
成体雄Wistarラット(280〜310g)を、Animal Resources Unit colony,University of Aucklandから入手した。改変Levine調製物を使用して急性脳損傷を誘導し、これは前に記載されている(Guan et al.1993)。簡単に述べれば、右頸動脈結紮後の吸入低酸素症(inhalation hypoxia)によって片側脳損傷を誘導した。右頸動脈を、一般的な麻酔下で(3%ハロタン/酸素)二重結紮を行った。麻酔からの回復から1時間後、ラットを、湿度(90±5%)および温度(31±0.5℃)を制御したインキュベーターにさらに1時間入れた。次いで、ラットを、低酸素状態(6±0.2%酸素)に15分間曝露した。動物を低酸素状態後にインキュベーター中にさらに30分間維持し、その後保持室(holding room)に取り出した。
連続的i.v.注入を行うために、いくつかのプロトコールにおけるラットを、以前に記載のように実験3日前に慢性的にカテーテルを挿入した(Thomas et al.1997)。ラットに留置頸静脈カテーテルを外科的に挿入し、代謝ケージに個別に収容した。3%ハロタン/酸素を使用した一般的な麻酔下で、右頸動脈を露出してポリエチレンカテーテルを挿入する手術を行った。カテーテルを露出し、保護用ステンレススチールバネを介してケージから外側に出し、流体密封スイベエル・ジョイントに接続した。これにより、動物はケージ内を自由に動き回れる。3日間の術後回復期間後、カテーテルを、GPEの注入を容易にするための蠕動注入ポンプに接続した。
(実験群)
実験群を以下の表1に示す。












Figure 2007509169
(薬物動態学的研究)
10匹のHI損傷ラットを使用して、HI損傷から2時間後に行った単回ボーラスi.v.注射後のGPEの半減期を証明した。血液サンプルを、3mg/kgのGPE(Bachem AG,Basal,Switzerland)のi.v.注射の10分前、注射時、1、2、4、8、16、および32分後に氷上のプロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma−Aldrich,Sydney,Australia)を含むヘパリン処理チューブに採取した。GPE放射免疫アッセイのために、血漿を−80℃で保存した。
2つのさらなる実験では、正常ラット(n=15)およびHI損傷ラット(n=15)の両方についてのGPEの中枢浸透を測定した。各動物群由来の9匹のラットに、3mg/kg/時間のGPEを4時間連続注入した。各群由来の残りの6匹のラットに、10mMコハク酸緩衝液(pH6.0)(GPE−ビヒクル)のコントロール注入を行った。HI損傷ラットでは、損傷から1〜5時間後にGPE処置を行った。4時間の注入終了後に、動物を麻酔し、29Gウルトラファインニードルおよびシリンジを使用して大槽からプロテアーゼインヒビターを含むチューブに脳脊髄液(CSF)を回収した。次いで、過剰量のペントバルビタールを使用して動物を屠殺した。CSFサンプルを、GPEアッセイのために−80℃で保存した。
(実施例2:治療研究)
実験1では、14匹のHI損傷ラットの2群に、HI損傷の2時間後に15mg/kg GPEの単回i.v.注射を行うか、GPEビヒクルを注射した。4日後、ラットを屠殺し、組織学的分析のために脳を採取した。
実験2では、16匹のラットに、HI損傷から1時間後に3mg/kg GPEの単回i.v.ボーラス注射を行い、その直後に4時間のGPEのi.v.注入(3mg/kg/時間)を行った。コントロールHI群(n=16)に、GPE−ビヒクルのみを投与した。
4日後、ラットを屠殺し、組織学的分析および免疫組織学的分析のために脳を採取した。
実験3では、HI損傷ラット群(n=7〜16)に、HI損傷の1時間後から開始する0.03、0.3、3、または30mg/kg/時間のGPEのいずれかの4時間の連続的i.v.注入を行った。コントロールHI損傷ラットに、GPE−ビヒクルのみを4時間注入した。ラットを屠殺し、HI損傷から4日後に組織学的分析のために脳を採取した。
実験4では、HI損傷ラット群(n=12〜16)に、HI損傷から3時間後または7時間後から開始する3mg/kg/時間のGPEの4時間の連続的i.v.注入を行った。コントロールHI損傷ラットに、実験の関連する治療機会(HI損傷から3〜7時間または7〜11時間)に対応する4時間のGPE−ビヒクルのみの注入を行った。ラットを屠殺し、HI損傷から4日後に組織学的分析のために脳を採取した。
実験5では、HI損傷後のニューロンの結果および機能回復の両方に対するGPEの長期的効果の試験のために24匹のラットを使用した。ラットを、正常コントロール、偽手術、GPEもしくはそのビヒクルで処置したHIの4つの群に無作為に分けた。全ラットを、HI損傷の3日前から両側触覚試験に慣れさせた。HI損傷から1〜5時間後に、GPE(3mg/kg/時間)またはビヒクルを注入した(i.v.)。両側触覚試験の手順は、以前に記載されている(Guan et al.2001b)。IGF−1およびビヒクルで処置したラットを、損傷から3、5、10、および20日後に試験し、正常コントロールおよび偽手術ラットを並行して試験した。各試験日に各ラットを4つの試験に供した。各試験では、右および左前肢の遠位放射状部分に接着ラベル(11mm2)を適用した。ラットを、透明な風防ガラス観察チャンバー(幅190mm×高さ210mm×長さ330mm)に入れた。ラットが各パッチに接触するために要した時間を測定した(分)。各試験日における各ラットの試験時間は5〜10分間であり、パッチの配置順序は疑似ランダムであり、左および右パッチをそれぞれ4回の試験のうち最初2回に配置した。ラットがパッチに接触することができなかった場合、試験を5分間で終了した。パッチへの接触時間を、ラットにおける損傷した(右)半球およびコントロール(左)半球の体性知覚−運動機能の指標と見なした。パッチへの接触で要した時間のL/R比を使用して、損傷した半球に対して対側の前肢(左、潜在的欠損)と同側の前肢(右、潜在的損傷なし)との間の性能の非対称を定量した。各試験日における各ラットについての比の平均を計算した。実験者には処置群が分からなくしてあった。組織学的分析のために、HI損傷から21日後にラットを屠殺した。
(実施例3:組織学)
組織学的手順は、以前に記載されている(Guan et al.1996;Guan et al.1993)。簡単に述べれば、HI損傷およびGPE処置から4日後に、ラットを通常の生理食塩水およびその後に10%ホルマリンを使用した深麻酔下で経心的に灌流した。脳を同一の固定液中に2時間保持し、その後パラフィン手順を使用して処理した。3つの冠状切片(6μm)を線条体、大脳皮質、および海馬から切断し、スライドガラス上に置き、チオニンおよび酸性フクシンで染色した。
死滅したニューロンを、好酸性(赤色)細胞質および収縮核を有する死滅ニューロンと同定した(Auer et al.1985;Brown and Brierley,1972)。選択的ニューロン死、細胞反応、および/または全壊死を示す脳組織を、損傷と見なした(Guan et al.2000;Markgraf et al.1993)。上記病変に加えて、組織損傷スコアは、HI損傷から21日後の長期組織学的試験のために使用した群で組織萎縮および空洞化も含んでいた。外側皮質中の脳損傷の重症度を、以下の3つのレベルを使用して評価し、海馬の歯状回ならびにCA1−2、3、および4亜領域を以下の2つのレベルを使用して評価し、線条体を以下の1つのレベルを使用して評価した:0=損傷なし、1=5%未満の組織損傷;2=50%未満の組織損傷;3=50%を超える組織損傷、および4=95%を超える組織損傷(Guan et al.2000;Lundgren,Smith,andSiesj6,1992。データ分析のために異なる脳領域の平均組織損傷スコアを使用した(Guan et al.2000)。試験終了前に死亡した任意の動物を、組織学的分析から排除した。処置群に対する各盲検によって組織学的性質を分析した。
(免疫組織化学)
グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、イソレクチンB4、カスパーゼ−3、および増殖細胞核抗原(PCNA)を使用して、反応性膠細胞ならびにアポトーシスおよび増殖を受けた細胞をマークした。
4匹の正常なコントロールラットと共に、パラフィン組織上のコントロールおよびGPE処置HIラット(実験2)における免疫組織化学染色を行った。一定レベルの海馬を含む冠状切片(6μm)を切断し、染色のためにクロム−ミョウバンコーティングスライド上に置いた。切片を、キシレン中で脱パラフィンし、一連のエタノールで脱水し、0.1Mリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中でインキュベートした。抗原のアンマスキングのために(カスパーゼ−3およびPCNA染色)、切片を10mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中、1分間高出力で加熱した。全切片を、1%H22を含む50%メタノールで30分間前処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させた。次いで、1.5%正常ウマ血清または2.5%正常ヒツジ血清を含むPBSを室温で1時間適用して、非特異的バックグラウンド染色をブロッキングした。次いで、切片を以下の一次抗体とインキュベートした:モノクローナルマウス抗GFAP抗体(Sigma,St.Louis,MO,U.S.A.、500倍希釈);ポリクローナルウサギ抗カスパーゼ3pl7抗体(切断カスパーゼ−3抗体、活性化カスパーゼ−3の巨大な17〜20kDaのフラグメントを検出する、Cell Signaling Technology,USA、1000倍希釈);マウス抗PCNA抗体(DAKA,A/S,Denmark、100倍希釈)。一次抗体との4℃で2日のインキュベーション後(一晩インキュベートしたPCNA染色以外)、切片をビオチン化ウマ抗マウス二次抗体またはヤギ抗ウサギ二次抗体(200倍、Sigma)と4℃で一晩インキュベートした。使用1時間前に調製したExtrAvidin(Sigma、200倍)を、室温で3時間適用し、0.05%3,3−ジアミノベンジジン(DAB)およびPBS中で反応させて褐色反応生成物を得た。切片を一連のアルコールおよびキシレン中で脱水し、封入剤を使用してカバースリップで覆う。コントロール切片を、インキュベーション溶液から一次抗体を省略すること以外は同一の方法で処理した。
小膠細胞の特異的視覚化のために、グリフォニア・シンプリシフォリア・シーズ(Griffonia simplicifolia seeds)由来のイソレクチンB4(Sigma,St.Louis,MO,U.S.A.)をマーカーとして使用した。脱パラフィン後の内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させるために、切片を1%H22含む50%メタノールで30分間前処理した。次いで、これらの切片を、トリス緩衝化生理食塩水で希釈した(4倍)イソレクチン一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、その後DAB中で発色させた。
TdT媒介dATPニック末端標識(TUNEL)染色のために、切片をプロテイナーゼK(40μg/ml;Sigma Chemical,St.Louis,MO)で15分間前処理し、PBSで洗浄し、1%H22を含むメタノールと10分間保持して非特異的ペルオキシダーゼ活性を遮断した。次いで、切片を、PBSで再度洗浄し、TdT緩衝液(GIBCO−BRL,Life Technologies,Gaithersburg,MD)と5分間インキュベートした。DNAフラグメントを、TdTおよびビオチン−14−dATP(Gibco−BRL)にて37℃で1時間標識した。その後、切片をSSC緩衝液中で洗浄し、ABC試薬(Vector Laboratories)と2時間インキュベートした。洗浄後、切片をDAB基質で発色させた。切片をアルコールで段階的に脱水し、DPXを使用してマウントした。DNアーゼI(Sigma Biosciences)で前処理して、ポジティブコントロールとして使用する全DNAに切れ目を入れた。インキュベーション溶液からTdTを省略してネガティブコントロールスライドを得た。
海馬両側のCA1−2、CA3、およびCA4亜領域の錐体細胞層内のカスパーゼ−3、TUNEL、GFAP、PCNA、およびイソレクチンB−4陽性細胞を計数した。
(実施例4:放射免疫アッセイ)
血漿およびCSF中のGPE濃度を、新規且つ特異的な二重抗体放射免疫アッセイによって測定した(Batchelor et al.2003;2002年3月14日提出の米国特許出願番号10/100,515号;およびGregory Brian Thomas,Bernhard Hermann Heinrich Breier and David Charles Batchelor,inventorsによって同時提出された発明の名称が「抗GPE抗体、その使用、およびGPEの分析方法」の米国特許出願(代理人整理番号:NRNZ 1016US2 DBB)(それぞれ本明細書中で完全に援用される)。アッセイ前に抗体結合形態を標準化し、抗体認識を最大にするために、GPEサンプル、標準、およびトレーサーを、Bolton and Hunter試薬(Sigma−Aldrich,Sydney,Australia)を使用して誘導体化した。誘導体化GPE放射免疫アッセイは、ラット血漿を使用した完全な並行処理およびアッセイ前に添加した非標識GPEの回収率(83%)を示す(n=6)。ED50は195pg/チューブであり、検出限界は2pg/mlであった。アッセイ内CVは、0.5から25ng/mlの範囲で10%未満であった。検量線から読み取った任意のサンプルを再アッセイ前にさらに希釈した。
(実施例5:統計分析)
組織学的データおよび免疫組織化学的データを、従属因子(dependent factor)として処置した脳領域と共に多重比較のための二元配置ANOVAおよびその後のボンフェローニ事後検定を使用して分析した。CSFおよび血漿中のGPEレベルを、一元配置ANOVAを使用して分析した。データを、平均±SEMとして示す。
(実施例6:GPEの薬物動態学)
HI損傷ラットにおける3mg/kgのGPEの単回i.v.注射直後にGPEの血漿濃度がベースライン(8.1±4.1ng/ml)から236.6±50.0ng/mlまで増加した(図1A)。次いで、GPEレベルは、8分以内にベースライン値(9.8±1.33ng/ml)に急速に減少した。血漿中のGPEの半減期は、2分未満であると評価された。
ビヒクル処置HIコントロール群(0.72±0.36ng/ml、図1B)と比較して、HI損傷ラットのGPEの連続的I.V.注入後(3mg/kg/時間で4時間)のCSF中のGPEレベル(7.75±1.87ng/ml)は、有意に増加した(P<0.05)。非HI損傷ラットにおけるGPE処理群(1.94±0.36ng/ml)とビヒクル処理群(1.55±0.88ng/ml)との間のCSF中のGPEレベルの相違は認められなかった。
(実施例7:GPE処置研究)
HI脳損傷により、HI損傷から4日後の結紮右半球で重篤なニューロン損傷が認められた(表2)。海馬の全亜領域で大規模な神経喪失が認められた。選択的ニューロン喪失、組織全壊死、および細胞反応が大脳皮質、海馬の全亜領域、歯状回、および線条体で混在していた。左海馬ではニューロンの喪失は認められなかった。
Figure 2007509169
HI損傷から2時間後に15mg/kgの単回i.v.ボーラス用量のGPEを注射した動物では、ビヒクル処置群と比較して組織損傷スコアのわずかな減少が認められたが(全てP=0.047)、各脳領域群において相違は認められなかった(表2)。対照的に、HI損傷から1〜5時間後に3mg/kgボーラス注射、およびその後GPEの連続的3mg/kg/時間のi.v.注入(全用量は15mg/kg)を行った動物では、ビヒクル処置群と比較した場合、組織損傷スコアが非常に有意に減少した(全てP<0.0001)。事後分析は、GPE処置が試験した全脳領域の組織損傷を有意に減少させる(P<0.01)ことを示した。
GPEは、最初のボーラスiv注射を行うことなく損傷から1時間後に4時間のiv注入を開始した場合、0.3〜30mg/kg/時間の広い有効用量範囲を示した(以下の表3)。
Figure 2007509169
Figure 2007509169
0.03mg/kg/時間の用量ではGPEの神経保護効果は認められなかった(上記表3)。GPEはまた、治療機会を損傷から3〜7時間後または7〜11時間後に延長した場合に、損傷を軽減させた(上記表4)。
ビヒクル処置群では、HI損傷から21日後の重篤な脳障害を有するラットの同側半球内に組織の空洞化および萎縮が見出された。平均組織損傷スコアは、1.28±0.11(n=6)であった。GPE(0.01±0.01、n=6、P<0.0001、図2A)での処置により、組織損傷スコアが有意に減少し、GPEで処置した6匹のラットのうちの1匹で軽度の線条体損傷が認められた。
正常なコントロール群と比較した場合(1.05±0.06)、HI損傷では、パッチ接触に要する時間のL/R比が有意に増加した(全て2.45±0.51、P<0.0001、図2B)。以前の報告(Guan et al.2001a)と同様に、ビヒクル処置群では、行動の欠陥を生じ、3日後に最大になり、10日目に自発的に回復した。HI損傷から1〜5時間後の3mg/kg/時間のGPEでの処置により、パッチへの接触時間のL/R比は、ビヒクル処置群(2.45±0.51、P<0.01、図2B)と比較して、有意に減少した(1.08±0.07)。
(実施例8:免疫組織化学的分析)
海馬のコントロール側にはカスパーゼ−3陽性細胞はほとんど認められなかった(平均18.9±3.9細胞、データは示さなかった)。HI脳損傷により、海馬のコントロール側(18.9±3.9細胞)と比較して同側(右)海馬の全亜領域でカスパーゼ−3陽性細胞が増加した(160.5±83.4細胞、図3A)。カスパーゼ−3陽性細胞のこの増加は、CA4亜領域でより顕著であった(325.5±55.2細胞)。GPEでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、海馬(29.9±10.6細胞、全てP<0.01)、特に海馬のCA4亜領域(47.7±31.8細胞、P<0.01)でカスパーゼ−3陽性細胞数が有意に減少した(図3A)。海馬のコントロール側にTUNEL陽性細胞は認められなかった。同様に、HI損傷により、海馬のコントロール側と比較して、同側海馬(155.5±105.0細胞)、特にCA3亜領域(365.5±132.6細胞、図3B)で検出されたTUNEL陽性細胞数が増加した。GPEでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、海馬(10.6±0.7細胞)、特に海馬のCA3亜領域(11.7±11.7細胞)でTUNEL陽性細胞数が有意に減少した(P<0.01)(図3B)。
HI損傷に応答して、イソレクチンB−4陽性細胞が存在しないコントロール側と比較して、損傷海馬の全ての亜領域でのイソレクチンB−4陽性小膠細胞数が増加した(20.9±1.18細胞)。GPEでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、特にCA3およびCA4亜領域中(P<0.05)のイソレクチンB−4陽性細胞数が有意に減少した(29±0.4細胞、全てP<0.0001)(図4A)。PCNA陽性細胞数は、コントロール側(1.6±0.7細胞、データは示さなかった)と比較して、同側海馬で増加した(130.9±8.9細胞)。GPEでの処置により、ビヒクル処置群と比較して、同側海馬、特にCA1−2およびCA4亜領域中(P<0.05)のPCNA陽性細胞数(P<0.05)が有意に減少した(30.9±5.1細胞、P<0.0001)(図4B)。ビヒクル処置動物においてHI脳損傷により、非注射コントロール海馬と比較して、同側海馬、特にCA4亜領域中のGFAP陽性星状細胞数(P<0.05)が有意に減少した(図4Cおよび4D)。対照的に、GPE処置群における同側海馬と対側海馬との間でGFAP陽性細胞数の相違は認められなかった(図4Cおよび4D)。
本研究は、HI脳損傷後の成体ラットにおける4時間の連続的i.v.注入後にGPEによって強力且つ即効性のある神経保護効果が得られることを証明した。対照的に、GPEの単回i.v.投与ではわずかで時折ばらつきのある効果しか得られなかった。i.v.注入後のGPEの神経保護効果は、0.3〜30mg/kg/時間と有用用量範囲が広く、且つ治療機会はHI損傷から7〜11時間後に延長された。GPE注入によって、長期神経保護が達成され、損傷から20日後の体性知覚−運動機能が改善された。海馬におけるGPEの神経保護効果は、カスパーゼ−3依存性および独立性ニューロンアポトーシスの阻害に関連した。GPEが虚血性損傷後の星状細胞の生存を促進し、小膠細胞の増殖を抑制するという証拠も存在した。
図5Aは、2つのGPE投与プロトコール(一方は、事前のボーラス注射後のGPE注入(i.v.)を含み、他方は事前のボーラス注射を行わないGPE注入を含む)を比較したグラフを示す。図5Aでは、ボーラス後のGPE投与(右のカラム)によってほぼ20の損傷スコア(GPE/ビヒクル比)が得られるのに対して、事前のボーラス注射を行わない注入として投与したGPE(左のカラム)によってより低いニューロン損傷スコア(GPE/ビヒクル比)が得られた。したがって、本発明者らは、注入のみのプロトコールにおけるGPEの全用量がボーラス+注入プロトコールを使用して送達された全用量よりも低い場合でさえも、典型的な「負荷用量+注入」プロトコールがGPE注入のみよりも神経保護効果が低いことを予想外に見出した。この所見は、GPEの用量関連効果を考慮した場合にさらにより驚くべきものであり、0.3mg/kg/時間〜30mg/kg/時間の範囲におよぶ用量の増加につれてGPE効果の増加を示す。
図5Bは、ボーラスを使用しないか(各対の左のカラム)ボーラス後(各対の右のカラム)にビヒクルまたはGPEを注入した動物の脳損傷スコアのグラフを示す。
医薬産業では、一般に、虚血性脳損傷を治療するための神経保護化合物は依然として同定されていない(Fisher and Schaebitz,2000)(Gladsrone et al.2002)。いくつかの成長因子形態が、種々の虚血性脳損傷後に神経保護効果を示すことが報告されているにもかかわらず、その潜在的有糸分裂誘発効果およびBBB通過が困難であることは成長因子(IGF−1が含まれる)の臨床開発を制限していることが充分に認識されている。小ペプチドがCNSにより接近可能であることを考慮すると(Pardridge et al.2002)、薬物開発では現在小分子が注目されている。
(実施例9:薬物動態学研究のデザイン)
170gと240gとの間の成体雄Wistarラットを使用した。動物を、それぞれ群あたり6匹の動物からなる3つの処置群のうちの1つに割り当てた。静脈内ボーラス注射および採血を容易にするために、全ラットに、実験3日前にハロタン麻酔下で留置頸静脈カニューレを外科的に移植した。
動物に、30mg/kgと100mg/kgのGPEを含む0.1Mコハク酸緩衝液(pH6.5)の単回静脈内ボーラス注射を行った。血液サンプル(約220μl)を、0.1M PBS(pH=7)で9倍希釈した哺乳動物組織用の20μl Sigmaプロテアーゼインヒビターカクテルを含むヘパリン処理チューブに採取した。サンプルを、注射20、および10分前、注射時、1、2、4、8、16、32、および64分後に採取した。使用したプロテアーゼインヒビターカクテルは以下を含む:104mMのAEBSF、80μMのアプロチニン、2.1mMのロイペプチン、3.6mMのベスタチン、1.5mMのペプスタチンA、および1.4mMのE−64。サンプルを3000×gにて4℃で15分間遠心分離し、血漿を除去し、抽出およびアッセイまで−80℃で保存した。
静脈内ボーラス注射から有意な時間を経て、以下の式に従った一次反応の後にGPEが消失した:C=C0e -kt(式中、Cは特定の測定点におけるGPE濃度を示し、C0は時間(t)が0である場合の濃度であり、kは濃度/時間の単位で示される一次速度定数である)。kおよび半減期(t1/2)を、以下のように時間に対する血漿濃度の半対数プロットの消失期における線形回帰線の勾配から計算した:LogC=−kt/2.3+logC0。結果を、平均±標準誤差で示した。
〔結果〕
(放射免疫アッセイ)
特異的且つ感度の高いGPEのRIAの開発および立証後、GPEの薬物動態学的性質を、i.v.投与後にin vivoで決定した。GPEの血漿濃度は、i.v.ボーラス注射から1分以内に顕著に増加した(図6)。30mg/kg(図6A)および100mg/kg(図6B)のGPEの注射後、40±10.8および689±125μg/mlのピーク濃度が認められた。次いで、血漿濃度は、一次反応で急速に減少した。一次速度定数は、0.15±0.014(ng/ml/分、n=12)と計算され、半減期は4.95±0.43(分、n=12)と計算され、推定クリアランスは、137.5±12.3(ml/時間、n=12)である。本発明者らは、全身循環系からの非常に短い半減期を有するGPEのクリアランスは非常に急速であり、循環系における安定なGPE濃度を反復注射または継続的注入によって得ることができると結論づけた。
(HPLC分析)
薬物動態学的データは、ラット循環系からの非常に急速なGPEクリアランスを示した。したがって、本発明者らは、急速なクリアランスが最初の通過クリアランスであるのか、または代謝経路を介するのかどうかを調査した。HPLC溶離プロフィールは、GPEは約72分の保持時間で溶離することを示した(図7)。ピークは鋭く、コントロール血漿を超えて明確に検出可能である。「スパイクされていない(unspiked)」天然の血漿では、HPLCによってGPEは検出されなかった。
使用したHPLC法は、GPEの全ての潜在的な代謝産物(Gly−Pro、Pro−Glu)および各アミノ酸(グリシン、プロリン、およびグルタミン酸))を検出することができた。ベースラインでは、Glu、Gly、およびProのレベルは、それぞれ11、31、および31μg/mlであった。GPEおよびGly−Proは、このHPLC法の限界感度(300ng/ml)未満であった。30mg/kgのGPEのi.v.ボーラス注射の1分後、Glu、Gly、およびProのレベルは、それぞれ86、62、および80μg/mlに増加した(図7)。GPEレベルは33μg/mlであったが、ジペプチドGly−Proを、44μg/mlの広いピークとして同定することができた。8分後、全ての代謝産物およびGPEのレベルは、ベースラインレベルに戻った。Pro−Gluは、いかなるサンプルにおいても同定することができなかった。
したがって、本発明者らは、GPEの代謝分解は循環系内で起こり、反復注射、継続的注入、ボーラス注射と注入との組み合わせ、または徐放法のいずれかによってGPE濃度を安定にすることができることを見出した。
(結論)
本発明のある実施形態は、ラットにおけるGPEの薬物動態学的性質を決定するためのGPEアッセイの使用に関する。本発明者らが30および100mg/kgのGPEの単回i.v.ボーラス後の血漿GPE濃度を測定した実験では、GPEの投与により、血漿GPE濃度が有意であるが一過性に増加し、崩壊期間中に4.95分の平均半減期で消滅した。認められた血漿半減期は、GPEが多数の条件下での細胞分解または細胞死で有効であり得ることを示す先行技術の研究に基づいては全く予想外であった。本発明者らは、GPEの単回注射でさえも細胞分解および/または細胞死を減少させることができることを以前に証明していた。したがって、これらの条件下でのGPEの血漿半減期が約2〜約5分という所見は、GPEの治療効果が強力であることを示す。半減期は使用容量に影響を受けなかったが動物によってそれぞれ変動することを示す。ピーク用量の変動の大きさはまた、動物およびサンプルを得るのに必要な時間によるそれぞれのばらつきを反映する。
HPLC研究は、GPEのタンパク質分解はジペプチドGly−Proの形成を介するが、Pro−Gluはいかなるサンプル中でも検出されなかったことを示す。これにより、GPEの代謝は最初にC末端グルタミン酸の除去に関与し、その後に残存ジペプチドであるGly−Proのその構成アミノ酸への急速なタンパク質分解に関与することが示唆される。この所見はまた、カルボキシペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼ、およびアミノペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼ、ならびに他の血漿酵素がラットの血漿中のトリペプチドを分解することができることを示す。この所見はまた、ペプチダーゼインヒビターまたはプロテイナーゼインヒビターとのGPEの同時投与がGPEの能力の増大および/または動物中のGPEの半減期の延長の両方によってGPEの治療効果を改良することができることを示す。
GPEの静脈内ボーラス注射後に、12匹のラットから一次速度および血漿サンプルを得た。時間に対する血漿濃度の半対数プロットの消失期における線形回帰線の勾配から消失速度定数および半減期を決定した。しかし、本発明者らは、血漿中のペプチダーゼによるGPEの急速な分解によってゼロ時間におけるCmaxを正確に得ることができなかった。したがって、本発明者らが得ることができる最大濃度は、理論用量よりも低い1分の測定点でのものである。公知のように、半減期は、使用容量に影響をうけないが、各動物または他の要因の影響を受ける。速度定数に推定分布容量を掛けたものから推定クリアランスを計算した。別の所見は、腹腔内に投与した場合にGPEが神経保護を示すことであり、これはGPE吸収を示し、依然として調査されていない他の機構に影響をうけ得る(5)。
興味深いことに、絶食小型ラット(本研究の範囲外のコントロール群)の基底レベルは約2.5ng/mlであったが、給餌Wistarラットの基底レベルは約10ng/mlであり、低レベルのGPEが血漿中に存在することを示した。1つの潜在的な供給源は、脳および血清中のプロテアーゼによるIGF−1のdes1−3およびGPEへのタンパク質分解である。
本所見に基づいて、連続的静脈内注入は、治療的なGPEの血液レベルを達成および保持するための有用な薬物送達様式である。反復静脈内ボーラス投与法は、濃度を過度に変動させることなく所望の平均GPE血漿濃度を達成するためには非現実的に短い間隔がおそらく必要であろう。同様に、血漿中のタンパク質分解性代謝産物レベルにより、腹腔内注射または筋肉内注射によっても作用部位に到達し得る前にGPEが有意に喪失することが示唆される。連続的静脈内注入投与計画により、遭遇する原発性および続発性虚血事象の両方を治療することもできる。
安定な物質濃度を得るための当該分野で公知の他の方法を使用することもできる。例えば、移植可能な「ミニポンプ」(例えば、Alza Corporation)を使用して、所望の位置にGPEを連続的に注入することができる。別の実施形態では、徐放(show−release)組成物(カルボキシポリサッカリド/ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、およびポリリジンなど)を使用して、移植用およびマトリクス材の生分解のための組成物を製造することができ、GPEを遊離して治療効果を得ることができる。このようなデバイスおよび組成物を治療部位に局所的に配置することができ(例えば、脳、脊髄、末梢神経系)、それにより治療活性GPEを徐放することができる。
本発明者らは、これらの非抗原性小ペプチドまたは分子の分析のための有用で迅速且つ新規のアプローチを得るためのハプテンに対する感受性および特異性を増大させるための抗原を含むハプテンの合成で使用される誘導体化化学を活用した新規の管内サンプルの調製および分析方法を開発した。以前は、研究者は、アッセイ感度におけるヨード化の影響を最小にするためにBolton and Hunter試薬を使用していた。これは、本発明者らの知る限りでは、標的分子のアッセイ感度を増加させるために使用した最初である。次いで、本発明者らは、この方法を使用して最初にGPEのレベルおよびクリアランスを同定した。本発明者らのデータにより、臨床試験のためのその可能な投与経路が静脈内注入であることが示唆される。
(実施例10:GPEの遅延投与は有効である)
実施例1に記載のように、動物の研究および手術を行った。
(治療研究)
14〜16匹のHI損傷ラットおよび14〜16匹のコントロール(ビヒクル処置)動物を個別に研究した。一方の研究では、HI損傷は比較的軽度であり、他方の研究では、HI損傷は重篤であった。各動物に、HI損傷から24〜28時間後にビヒクルまたは12mg/kgのGPEのいずれかでの4時間の連続i.v.注入を行った。HI損傷から4日後にラットを屠殺し、組織学的分析のために脳を採取した。実施例3に明記するように、組織学的手順を行った。実施例5に記載のように統計的分析を行った。
(結果)
各研究では、HIによって実質的に神経が損傷し、重症低酸素症の動物(図9)の損傷スコアは約1.5と約2.5との間であった。他の研究では(図8)、神経損傷スコアは約1〜約5と軽度であった。
GPEは、各群でHIに起因するニューロン損傷を減少させた。軽症低酸素症動物では、GPEは、損傷スコアを実質的且つ統計的に有意に減少させた(図8)。図8は、HI損傷から24〜28時間後に投与したGPEの効果のグラフを示す。各カラム対について、左側は、ビヒクルの効果を示し、各対の右側はGPEの効果を反映する。研究した各脳領域について、時間内に注入したGPEにより、有意な神経保護が得られた。
重症低酸素症動物では、GPEは、研究した各脳領域の損傷スコアを再現可能に減少させた(図9)。しかし、本研究では、HI損傷の程度は、図8中の動物の程度より大きかった。図8と同様に、研究した各脳領域では、GPEは、ビヒクルコントロールと比較して神経保護を増加させた。したがって、図9中の神経保護の程度が図8で示された程度よりもいくらか低いにもかかわらず、これらの両研究は、損傷から24時間後に投与した場合でさえもGPEが神経保護効果を有し得ることを示した。
今までに動物モデルで試験された最も神経保護効果が高い薬剤は、3時間未満の治療機会しか持たず、最初の損傷から6時間後以内に投与した場合に依然として有効性を示し得る薬剤はほとんどなかった。GPEと対照的に、神経保護効果を有する他の薬物群は、初期投与によって悪化するので、治療機会の延長は制限される(例えば、血管内皮成長因子(VEGF))。本発明者らは、GPEの有効な治療機会は、損傷から少なくとも1〜24時間後であることを証明し、前損傷治療が脳損傷の減少に有効であることも見出された。これらの所見に基づいて、GPEの治療機会は、神経損傷治療で公知の治療機会で現在最も広範である。
他方では、脳損傷の程度によって治療機会が決定されるようであった。損傷がより軽度である場合、ニューロンはより段階的に死滅し、より延長された治療機会が得られるのに対して、ニューロン損傷がより重篤である場合、治療機会は短縮され得ることが公知である。一般に、前臨床開発で使用される動物モデルは、ヒト患者よりもより一層重篤であるので、より多数のヒト患者が軽度の脳損傷に相当し得る。
提供する実施例および説明は、本発明の態様を例示することを意図し、本発明を制限することを意図しない。当業者は他の特定の実施形態を得ることができ、これらは全て本発明の一部と見なされる。本明細書中で引用した全ての刊行物は、その全体が参照としてふくまれる。
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載する。本発明の他の態様および特長を、図面の概説から理解することができる。
(参考文献)
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成体ラットにおいてHIから2時間後に3mg/kg GPEの単回i.v.ボーラス注射を行った後のGPEの血漿濃度のグラフを示す。n=10動物。 正常なラットおよびHI損傷ラットにおける3mg/kg/時間のGPEのi.v.注入から4時間後のCSF中のビヒクルまたはGPEレベルを示す図である。HI損傷ラットを、損傷から1〜5時間後に処置した。データを、平均±SEMとして示す。n=6〜9動物/群。*HI損傷ビヒクルコントロール群と比較してP<0.05。 ラットの異なる脳領域における長期ニューロン生存に対するビヒクルまたはGPEの効果のグラフである。HI脳損傷から1〜5時間後に動物に3mg/kg/時間のGPE(n=6)またはビヒクル(n=6)を動物に注入した。HI損傷から21日後に長期の組織学的結果および挙動の結果を試験した。データを、平均±SEMとして示す。***ビヒクルコントロール群と比較してP<0.001。 図1Aにも示した動物中の身体機能(smatofunctional)の回復を示すグラフである。 カスパーゼ−3に対する抗体を使用して検出した損傷右海馬中のアポトーシス細胞に対するビヒクルまたはGPEの効果を示すグラフである。データを、平均±SEMとして示す。n=11〜16動物/群。HI脳損傷から1〜5時間後の動物に、3mg/kg/時間のGPEまたはビヒクルを注入し、4日後に屠殺した。ビヒクルコントロール群と比較して、**P<0.01、***P<0.001。 図3Aと同一の動物におけるTUNEL染色を使用して検出した損傷右海馬中のアポトーシス細胞に対するビヒクルまたはGPEの効果を示すグラフである。 ビヒクルまたはGPEで処置したラット海馬中の細胞数を示すグラフである。データを、平均±SEMとして示す。n=13〜14動物/群。HI脳損傷から1〜5時間後の動物に、3mg/kg/時間のGPEまたはビヒクルを注入し、4日後に屠殺した。ビヒクルコントロール群と比較して、*P<0.05、***P<0.001。#非注射左側と比較してP<0.05。図4Aは、イソレクチン−B4陽性小膠細胞に対するビヒクルまたはGPEの効果を示すグラフである。図4Bは、PCNA陽性細胞に対するビヒクルまたはGPEの効果を示すグラフである。図4Cおよび図4Dは、海馬中のGFAP陽性星状細胞に対するビヒクルまたはGPEの効果を示すグラフである。 事前のボーラス注射なし(左側のカラム)または3mg/kgのボーラス注射後に投与したGPEの神経保護効果を示すグラフである。 ビヒクル(各対の左側のカラム)またはGPE(各対の右側のカラム)のいずれかのボーラス注射(カラムの左の対)またはボーラス+注入(カラムの右の対)の効果を示すグラフである。 in vivoにおける血漿中のGPE(30mg/kgおよび100mg/kgのi.v.ボーラス)の薬物動態学を示す図である。0.01±0.002μg/mlのベースラインと比較して、30(40±10.8μg/ml)(図6A)および100(689±125μg/ml)(図6B)ボーラスi.v.注射直後(1分)に血漿中のGPEレベルの急激な増加が認められた。このレベルは、4.95±0.43分の半減期でベースラインに急速に減少した。(括弧内のデータは、6回の平均±6である)。 30mg/kg GPEのi.v.投与から1、2、および8分後の血漿中のGPE、Glu、Gly、Pro、およびGly−ProのレベルのHPLC分析を示す。GPEの保持時間は72分であり、ジペプチドGly−Proは約88分の保持時間で広範なピークとして検出された。グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、プロリン(Pro)は、それぞれ、17.7分、37.5分、および75.2分に溶離された。 軽度のHI損傷から24時間後にGPEに曝露した動物における神経保護効果を示すグラフである。 重度のHI損傷から24時間後にGPEに曝露した別の動物群における神経保護効果を示すグラフである。

Claims (28)

  1. ニューロン損傷に応答した変性からニューロン細胞を保護する方法であって、
    ニューロン細胞の保護を必要とする動物に、医薬上有効量のトリペプチドGly−Pro−Glu(GPE)を静脈内投与することを含む、前記方法。
  2. GPEを、事前のボーラス注射を行わずに、注入によって投与する、請求項1に記載の方法。
  3. GPEを、ボーラスに続いて注入によって投与する、請求項1に記載の方法。
  4. GPEをニューロン損傷から約1時間〜約24時間後に投与する、請求項1に記載の方法。
  5. ニューロン損傷に続く変性から動物の神経細胞を長期間保護する方法であって、
    静脈内投与を介して動物にGPEを投与し、前記投与がニューロン損傷から約1時間後〜約24時間後に開始されることを含む、前記方法。
  6. 選択的な手術により引き起こされる低酸素症/虚血に起因するニューロン損傷に続く神経細胞死または変性を減少させる方法であって、
    約1時間〜約4時間の持続時間にわたって静脈内注入としてGPEを投与し、前記注入が、前記選択的な手術から約1時間前〜約24時間後の時間で開始されることを含む、前記方法。
  7. 脳卒中により引き起こされる低酸素症/虚血に起因するニューロン損傷に続く神経細胞死または変性を減少させる方法であって、
    脳卒中発症とほぼ同時〜脳卒中後約24時間経過時に開始する静脈内注入としてGPEを投与することを含む、前記方法。
  8. 手術が冠状動脈バイパス手術である、請求項6に記載の方法。
  9. GPEを医薬上許容される剤形で投与する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. GPEを、約0.03mg/kg〜約30mg/kgの用量でボーラスとして投与する、請求項3に記載の方法。
  11. GPEを約0.03mg/kg/時間〜約30mg/kg/時間の速度で注入する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  12. GPEを、損傷の後または神経変性もしくはニューロン細胞死に至ってから、約1時間〜7時間後に投与する、請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の方法。
  13. GPEを、損傷の後または神経変性もしくはニューロン細胞死に至ってから、約1時間〜約11時間後に投与する、請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の方法。
  14. ボーラスで投与されるGPEの用量が約0.03mg/kg〜約30mg/kgであり、注入でのGPEを約0.03mg/kg/時間〜約30mg/kg/時間の速度で投与する、請求項3に記載の方法。
  15. ボーラスで投与されるGPEの用量が約3mg/kgであり、注入でのGPEを約3mg/kg/時間の速度で投与する、請求項3に記載の方法。
  16. GPEを約0.3mg/kg〜約3mg/kgの速度で注入する、請求項2に記載の方法。
  17. 損傷が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、脊髄性筋萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ痴呆、進行性核上麻痺、広汎性髄鞘中心障害(消失性白質疾患)、慢性神経変性疾患、ダウン症候群、白質脳症、低酸素症、虚血、冠状動脈バイパス移植(CABG)手術、シルダー病、神経芽細胞腫、頭部損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、再灌流障害、癲癇、毒素傷害、放射線傷害、仮死、炎症状態、慢性または急性の脳脊髄炎、脳炎、視神経炎、横断性脊髄炎、髄膜炎、汎脳炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、橋中心髄鞘崩壊症、鬱病、統合失調症、および視神経脊髄炎からなる群より選択される病態である、請求項1〜請求項16のいずれか1項に記載の方法。
  18. 付加的な神経保護剤を投与することをさらに含む、請求項1〜請求項17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 付加的な神経保護剤が抗アポトーシス薬または抗壊死薬である、請求項1〜請求項18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 付加的な神経保護剤が、成長因子および関連誘導体(インスリン様成長因子I(IGF−1)、インスリン様成長因子II(IGF−II)、形質転換成長因子−β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、IGF結合タンパク質(特に、IGFBP−3)、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF−3、FGF−4、FGF−6、角化細胞成長因子、アンドロゲン誘導性成長因子、int−2、線維芽細胞成長因子相同因子−1(FHF−1)、FHF−2、FHF−3、FHF−4、角化細胞成長因子2、グリア活性化因子、FGF−10、FGF−16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2(BMP−2)、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、TNF−α、クロメチアゾール;キヌレン酸、Semax、タクロリムス、L−スレオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール、アドレノコルチコトロピン−(4〜9)アナログ(ORG 2766)、ジゾルシピン(MK−801)、セレギリン、グルタミン酸アンタゴニスト(NPS1506、GV1505260、MK−801およびGV150526からなる群より選択される)、AMPAアンタゴニスト(2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070およびLY300164からなる群より選択される)、並びに抗炎症薬(抗MAdCAM−1抗体並びにインテグリンα4β1受容体およびインテグリンα4β7受容体に対する抗体からなる群より選択される)からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
  21. 投与を約1〜約4時間連続して行う、請求項5に記載の方法。
  22. 血漿中のGPE分解を阻害することができる酵素インヒビターを投与することをさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
  23. カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼまたはジペプチダーゼの1以上のインヒビターを投与することをさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
  24. アプロチニン、ペプスタチンA、ベスタチン、ロイペプチン、AEBSFおよびE−64からなる群より選択される1以上の酵素インヒビターを投与することをさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
  25. GPEと、少なくとも1のプロテアーゼインヒビターまたはペプチダーゼインヒビターとを含む、組成物。
  26. インヒビターが、セリンプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼおよび/またはペプチジルジペプチダーゼを阻害することができる、請求項25に記載の組成物。
  27. 少なくとも1のプロテアーゼインヒビターまたはペプチダーゼインヒビターが、アプロチニン、メタロプロテイナーゼインヒビター、ペプスタチンA、ベスタチン、ロイペプチン、AEBSFおよびE−64からなる群より選択される、請求項25に記載の組成物。
  28. 医薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項25〜27のいずれか1項に記載の組成物。
JP2006536851A 2003-10-23 2004-10-22 静脈内注入後のGly−Pro−Gluの神経保護効果 Abandoned JP2007509169A (ja)

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