JP2007333479A - 蛍光トランスイルミネータ - Google Patents

Abstract

【課題】励起光として紫外光を用いず、且つ励起光を遮断するカットフィルタを用いることなく、泳動用ゲル内の検出試料を蛍光検出することが可能な蛍光トランスイルミネータを提供する。
【解決手段】励起光源１２は、例えば複数のＬＥＤからなり、蛍光トランスイルミネータ１０の筺体１１内、特に観察点から直接視認できない位置に配置されている。この励起光源１２は、励起光の光軸上に観察点が位置しないように、すなわち励起光が観察点に到達しないように、載置台１３の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向に励起光を照射する。この結果、泳動用ゲル中の蛍光標識された検出試料２０から発せられた蛍光のみが観察点に到達する。
【選択図】図１

Description

本発明は、例えば泳動用ゲル内で電気泳動によりサイズ分画された核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ等）やタンパク質等の蛍光修飾された状態の検出試料を蛍光検出する際に用いられる蛍光トランスイルミネータに関する。

従来より、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ等）やタンパク質等の検出試料を解析する手法として、ゲル電気泳動法が知られている。このゲル電気泳動法は、均一なふるい効果を示す泳動用ゲル内で検出試料を電気泳動すると、検出試料の泳動速度は検出試料のサイズ（分子量）と相関があるため、検出試料がサイズ分画されるという原理に基づく。

電気泳動によってサイズ分画された検出試料の泳動位置はそのままでは観察することができないため、電気泳動後の泳動用ゲルを検出試料に結合する蛍光物質の溶液で染色する。なお、このように泳動用ゲルを蛍光物質の溶液で染色する場合のほか、予め泳動用ゲルに蛍光物質を加えておく場合もあるが、何れの場合であっても、泳動用ゲル内の検出試料は蛍光修飾されることになる。本明細書では、この両者の場合を含めて、検出試料が「蛍光修飾された状態」であるという。その後、泳動用ゲルに励起光を照射すると、検出試料から蛍光が発せられるため、この蛍光を検出することで検出試料の泳動位置を知ることができる。このように泳動用ゲルに励起光を照射する際に、蛍光トランスイルミネータが用いられている。

従来の蛍光トランスイルミネータの概念構成を図３に示す。図３に示す蛍光トランスイルミネータ３０は、筺体３１と、この筺体３１内に配置された紫外光ランプからなる励起光源３２と、筺体３１の上面の一部を構成し、励起光源３２から発せられる光に含まれる可視光を遮断するための可視光カットフィルタ３３とを少なくとも備えている。この可視光カットフィルタ３３は、泳動用ゲルが載置される載置台としての役割も担っている。

この蛍光トランスイルミネータ３０を用いて検出試料を蛍光検出する際には、先ず可視光カットフィルタ３３上に電気泳動後の泳動用ゲルを載置し、続いて励起光源３２により、可視光カットフィルタ３３を介して泳動用ゲルに対して垂直方向（入射角度は略０度）に紫外光を照射する。この紫外光により泳動用ゲル中の検出試料４０から蛍光が発せられると、この蛍光及び紫外光が観察者による観察点（例えば観察者の目の位置）に到達することになる。なお、励起光源３２から発せられる光に含まれる可視光は、可視光カットフィルタ３３により遮断されるため、観察点まで到達することはない。

このような蛍光トランスイルミネータ３０によれば、検出試料４０から発せられた蛍光と励起用の紫外光とが混在して観察者の目に届いても、人間の目は紫外光を認識することができないため、観察者は検出試料４０から発せられた蛍光のみを認識することができる。

また、近年、高価な可視光カットフィルタを用いない蛍光トランスイルミネータも提案されている（特許文献１を参照）。この蛍光トランスイルミネータは、筺体の内底面が泳動用ゲルを載置するための載置台となっており、且つ低反射膜が形成されている。また、筺体の上面が紫外光ランプからなる面光源としての励起光源となっており、その中央には泳動用ゲルからの蛍光が通り抜ける開口部が設けられている。そして、励起光源により泳動用ゲルに対して紫外光が照射されると、この紫外光により泳動用ゲル中の検出試料から発せられた蛍光が開口部を通り抜けて観察点に到達する。

このような蛍光トランスイルミネータによれば、泳動用ゲルに対して観察点側から励起光を照射するため、可視光カットフィルタを用いる必要がなく、観察者は検出試料４０から発せられ、開口部を通り抜けた蛍光のみを認識することができる。

しかしながら、上述した２種類の蛍光トランスイルミネータは、何れも励起光として紫外光を用いるものであるため、検出試料４０が核酸である場合には紫外光により核酸が損傷を受けてしまうことになる。したがって、上述した蛍光トランスイルミネータ３０では、特に紫外光を長時間照射した場合、泳動用ゲルから切り出した核酸を以降の実験に用いることができなくなるという問題があった。なお、特許文献１に記載されている蛍光トランスイルミネータでは、泳動用ゲルが載置される筺体の上面が励起光源となっているため、泳動用ゲルから所望の核酸を切り出す際にナイフ等が励起光を遮ってしまい、切り出すこと自体が困難である。

一方、近年になり、青色光により励起されて緑色の蛍光を発する蛍光物質が開発され、これに伴い、青色光を発する励起光源により検出試料を蛍光検出する蛍光トランスイルミネータも開発されるに至っている（非特許文献１，２を参照）。

このような蛍光トランスイルミネータの概念構成を図４に示す。図４に示す蛍光トランスイルミネータ５０は、筺体５１と、この筺体５１内に配置された複数の青色ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｏｄｅ）からなる励起光源５２と、筺体５１内に配置され、励起光源５１からの青色光を拡散するための拡散板５３と、筺体５１の上面の一部を構成し、泳動用ゲルが載置される載置台５４と、この載置台５４と観察者による観察点との間に配置され、励起光源５２から出射される青色光を遮断するためのカットフィルタ５５とを少なくとも備えている。

この蛍光トランスイルミネータ５０を用いて検出試料を蛍光検出する際には、先ず載置台５４上に電気泳動後の泳動用ゲルを載置し、続いて励起光源５２により、載置台５３を介して泳動用ゲルに対して垂直方向（入射角度は略０度）に青色光を照射する。この青色光により泳動用ゲル中の検出試料６０から蛍光が発せられるが、励起光源５２から出射される青色光はカットフィルタ５５により遮断されるため、この蛍光のみが観察点に到達することになる。
特開２００５−１２７７３６号公報 http://www.invitrogen.co.jp/products/molecularprobe/SafeImager.pdf http://www.bmbio.com/product/duak/index.htm

上述した蛍光トランスイルミネータ５０によれば、励起光源５２から出射される青色光がカットフィルタ５５により遮断されるため、観察者は検出試料６０から発せられた蛍光のみを認識することができる。さらに、励起光として青色光を用いているため、検出試料６０が核酸である場合であっても損傷を受けることはなく、必要に応じて所望の核酸を切り出し、以降の実験に用いることができる。

しかしながら、この蛍光トランスイルミネータ５０では、泳動用ゲル内の検出試料を蛍光検出する際にカットフィルタ５５としてのメガネ或いはプラスチック板が必要となるため、操作性が著しく低下するという問題があった。さらに、使用した蛍光物質の励起波長と蛍光波長とが近接している場合には、励起光のみを遮断する適当なカットフィルタを調達することが困難になる。

本発明は、上述した従来の実情に鑑みて提案されたものであり、励起光として紫外光を用いず、且つ励起光を遮断するカットフィルタを用いることなく、泳動用ゲル内の検出試料を蛍光検出することが可能な蛍光トランスイルミネータを提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため、本発明に係る蛍光トランスイルミネータは、泳動用ゲル内で電気泳動によりサイズ分画された、蛍光修飾された状態の検出試料を蛍光検出するために、泳動用ゲルに対して励起光を照射する蛍光トランスイルミネータであって、泳動用ゲルが載置される光学的に透明な載置台と、上記載置台に載置された泳動用ゲルに対して、該載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から該載置台を介して可視域の励起光を照射する励起光源とを備え、上記励起光源は、励起光の光軸上に観測点が位置しないように、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向から励起光を照射することを特徴とする。

本発明によれば、載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向に励起光が照射されるため、検出試料から発せられた蛍光のみが観察点に到達し、励起光を遮断するカットフィルタを用いることなく蛍光を検出することができる。また、励起光として可視域の光を用いているため、検出試料が核酸である場合であっても損傷を受けることはない。さらに、載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から載置台を介して励起光を照射しているため、泳動用ゲルから所望の核酸を切り出す際にナイフ等が励起光を遮ることもない。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

先ず、本実施の形態における蛍光トランスイルミネータの概念構成を図１に示す。図１に示すように、蛍光トランスイルミネータ１０は、筺体１１と、複数のＬＥＤからなり、可視域の励起光を出射可能な励起光源１２と、泳動用ゲルが載置される載置台１３とを少なくとも備えている。

励起光源１２は、観察点から直接視認できないように、筺体１１の内側面近傍に配置されている。この励起光源１２は、励起光の光軸上に観察点が位置しないように、すなわち励起光が観察点に到達しないように、載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向に励起光を照射する。泳動用ゲルへの入射角度は、６０〜８０度であることが好ましい。

励起光源１２に用いるＬＥＤは、検出試料を修飾する蛍光物質の種類に応じて、蛍光物質を励起可能な波長の光を出射するものを選択することができる。例えば、蛍光物質として核酸染色用のＳＹＢＡ Ｇｒｅｅｎ（励起極大波長４９４ｎｍ、蛍光極大波長５２１ｎｍ）、或いはＶｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ（励起極大波長４９５ｎｍ、蛍光極大波長５２０ｎｍ）を用いる場合には青色光（極大波長４７０ｎｍ付近）を出射する青色ＬＥＤを用いることが好ましく、核酸染色用のエチジウムブロマイド（励起極大波長５２６ｎｍ、蛍光極大波長６０５ｎｍ）、或いはタンパク質染色用のＳＹＰＲＯ Ｒｅｄ（励起極大波長５５０ｎｍ、蛍光極大波長６３０ｎｍ）を用いる場合には緑色光（極大波長５２５ｎｍ付近）を出射する緑色ＬＥＤを用いることが好ましい。なお、赤色光（極大波長６３０ｎｍ付近）を出射する赤色ＬＥＤは、励起後の蛍光波長が赤外域になるため目視観察には向かないが、蛍光を受光検出器等により検出する場合には使用可能である。

励起光源１２に用いるＬＥＤの数は、特に限定されないが、泳動用ゲルに対して励起光を略々均一に照射できるだけの数が存在することが好ましい。特にＬＥＤから出射される光は指向性が高いため、それぞれのＬＥＤ又はＬＥＤ群が泳動用ゲルの異なる領域に対して励起光を照射できるように、ＬＥＤの数、或いはそれぞれの出射方向を調整することが好ましい。一具体例としては、筺体１１の対向する内側面近傍にそれぞれ複数個のＬＥＤからなるＬＥＤ列を高さ方向に複数段ずつ設け、それぞれの段毎に出射方向を調整する。このようにＬＥＤ列を高さ方向に複数段設けることで、泳動用ゲルに対して励起光を略々均一に照射することができる。なお、ＬＥＤから出射される光は指向性が高いが、出射直後の所定距離（例えば数ｃｍ）に限って、筒状等の導光路（図示せず）を設けておくようにしてもよい。

載置台１３は、筺体１１の上面の一部を構成するように略中央部に設けられており、泳動用ゲルが載置される。この載置台１３は、少なくとも励起光源１２からの励起光が透過するように、ガラス等の光学的に透明な材料からなる。励起光源１２が筺体１１の長手方向に対向する内側面近傍に設けられているとした場合、載置台１３の長手方向の長さは、筺体１１の上面の長手方向の長さの１／３〜１／２であることが好ましい。

さらに、筺体１１の内底面の少なくとも載置台１３と対向する部分には、黒色領域１４が設けられる。このように黒色領域１４を設けておくことで、観察点から観察した際に泳動用ゲルの背後が暗くなり、蛍光を発しているバンドとそれ以外の部分とのコントラストを向上させることができる。また、この黒色領域１４により、散乱光や迷光を吸収することができる。黒色領域を形成する際には、黒色布を用いてもよく、ポリイミドのような樹脂に黒色顔料或いは黒色染料を分散させた樹脂系のブラックマトリクス材を用いてもよい。この黒色領域１４は、載置台１３と対向する部分のみでなく、例えば筺体１１の内面全体に設けるようにしても構わない。

蛍光トランスイルミネータ１０の一具体例としては、筺体１１は縦２４ｃｍ、横３３ｃｍ、高さ１０ｃｍとされ、載置台１３は縦８ｃｍ、横１３ｃｍとされる。また、励起光源１２としては、筺体１１の長手方向に対向する内側面近傍にそれぞれ４個、５個のＬＥＤからなるＬＥＤ列がそれぞれ底面から５．５ｃｍ、６．２ｃｍの高さに２段設けられる。各ＬＥＤ列から出射される励起光の泳動用ゲルへの入射角度は、何れも７５度である。

この蛍光トランスイルミネータ１０を用いて検出試料を蛍光検出する際には、先ず載置台１３上に電気泳動後の泳動用ゲルを載置し、続いて励起光源１２により、載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向に励起光を照射する。この励起光により泳動用ゲル中の検出試料２０から蛍光が発せられるが、励起光源１２から出射される励起光は上述のように観察点に到達することはないため、この蛍光のみが観察点に到達することになる。

このような蛍光トランスイルミネータ１０によれば、励起光源１２により載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向に励起光が照射される結果、検出試料２０から発せられた蛍光のみが観察点に到達するため、観察者は励起光を遮断するカットフィルタを用いることなく蛍光を検出することができる。さらに、励起光として可視域の光を用いているため、検出試料２０が核酸である場合であっても損傷を受けることはなく、必要に応じて所望の核酸を切り出し、以降の実験に用いることができる。

続いて、この蛍光トランスイルミネータ１０を用いて実際に泳動用ゲルに対して励起光を照射し、蛍光を検出した結果を図２に示す。図２中、レーンＡは約２Ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡを１３０ｎｇ泳動したものであり、レーンＢ〜ＤはＢｉｏＲａｄ社製の分子量マーカ（２−ｌｏｇ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ， Ｎ３２００１）をそれぞれ０．２、０．６、１．０μｌ泳動したものである。この分子量マーカの量は、図２の上から６番目の一番太い３Ｋｂｐのバンドでそれぞれ約２４、７２、１２０ｎｇに相当する。泳動後、泳動用ゲルをＣａｍｂｒｅｘ社製の蛍光物質（ＳＹＢＡ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）の１００００倍希釈液で染色し、極大波長４７０ｎｍの青色光を照射して、蛍光を検出した。

図２から分かるように、蛍光トランスイルミネータ１０によれば、励起光を遮断するカットフィルタを用いることなく、検出試料及び分子量マーカが示す各バンドを高コントラストに観察することができる。

なお、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲で種々の変更が可能であることは勿論である。

例えば、上述した実施の形態では、泳動用ゲル内の検出試料から発せられる蛍光を観察点から目視観察するものとして説明したが、目視観察に限定されるものではなく、泳動用ゲルを観察点から写真記録しても構わない。また、観察点に受光検出器を設け、蛍光トランスイルミネータと共に蛍光測定装置を構成することも可能である。

また、上述した実施の形態では、励起光源としてＬＥＤを用いるものとして説明したが、これに限定されるものではなく、蛍光物質を励起できる波長の光を出射することができ、且つ、励起光が観察点に到達しないようにできるだけの指向性を有するものであれば利用可能である。

本実施の形態における蛍光トランスイルミネータの概念構成を示す図である。 同蛍光トランスイルミネータにより検出した電気泳動写真を示す図である。 従来の紫外光を用いた蛍光トランスイルミネータの概念構成を示す図である。 従来の青色光を用いた蛍光トランスイルミネータの概念構成を示す図である。

符号の説明

１０ 蛍光トランスイルミネータ
１１ 筺体
１２ 励起光源
１３ 載置台
１４ 黒色領域
２０ 検出試料

Claims (6)

1. 泳動用ゲル内で電気泳動によりサイズ分画された、蛍光修飾された状態の検出試料を蛍光検出するために、泳動用ゲルに対して励起光を照射する蛍光トランスイルミネータであって、
   泳動用ゲルが載置される光学的に透明な載置台と、
   上記載置台に載置された泳動用ゲルに対して、該載置台の泳動用ゲルが載置される面とは反対側の面から該載置台を介して可視域の励起光を照射する励起光源とを備え、
   上記励起光源は、励起光の光軸上に観測点が位置しないように、泳動用ゲルに対して所定の入射角度をもって斜め方向から励起光を照射する
   ことを特徴とする蛍光トランスイルミネータ。
2. 上記励起光源は、それぞれ励起光を出射可能な複数の光源からなり、該複数の光源は、上記載置台に載置された泳動用ゲルに対して励起光が略々均一に照射されるように、それぞれ出射方向が定められていることを特徴とする請求項１記載の蛍光トランスイルミネータ。
3. 上記励起光源は、複数のＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｏｄｅ）からなることを特徴とする請求項１又は２記載の蛍光トランスイルミネータ。
4. 泳動用ゲルに対する励起光の入射角度が６０〜８０度であることを特徴とする請求項１記載の蛍光トランスイルミネータ。
5. 上記載置台がその１つの面の一部をなし、且つ、上記励起光源がその内部の所定位置に配置される筺体を備え、
   上記励起光源は、それぞれ励起光を出射可能な複数の光源からなる光源列が上記筺体の対向する内側面近傍において上記載置台と垂直な方向に複数段設けられたものである
   ことを特徴とする請求項１記載の蛍光トランスイルミネータ。
6. 上記載置台がその１つの面の一部をなし、且つ、上記励起光源がその内部の所定位置に配置される筺体を備え、
   上記筺体内面の少なくとも上記載置台と対向する部分には黒色領域が設けられている
   ことを特徴とする請求項１記載の蛍光トランスイルミネータ。