JP2007295801A - 糖尿病治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
糖尿病治療薬のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007295801A JP2007295801A JP2004214815A JP2004214815A JP2007295801A JP 2007295801 A JP2007295801 A JP 2007295801A JP 2004214815 A JP2004214815 A JP 2004214815A JP 2004214815 A JP2004214815 A JP 2004214815A JP 2007295801 A JP2007295801 A JP 2007295801A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pdk4
- inhibitory activity
- substance
- activity against
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 26
- 101000600756 Homo sapiens 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101001117146 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102100024148 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 101000734338 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 3, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100034824 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 3, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 101001117143 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 2, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100024150 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 102000053067 Pyruvate Dehydrogenase Acetyl-Transferring Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 101710159466 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 5
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000009207 exercise therapy Methods 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims 1
- 101000734339 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 4, mitochondrial Proteins 0.000 abstract description 57
- 102100034825 [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 4, mitochondrial Human genes 0.000 abstract description 55
- 238000005352 clarification Methods 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 3
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 101500006448 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) Endonuclease PI-MboI Proteins 0.000 description 3
- 101150078768 Pdk4 gene Proteins 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 description 2
- 229940125708 antidiabetic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 102000048804 human PDK4 Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101710186643 Insulin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
Abstract
【課題】 PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択するという、PDK4の機能の解明に基づく新規な糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】 本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法は、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択することを特徴とするものであり、具体的な方法としては、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択する方法が挙げられる。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法は、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択することを特徴とするものであり、具体的な方法としては、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択する方法が挙げられる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関するものである。
糖尿病は、持続的高血糖状態を伴う疾患であり、多くの環境因子と遺伝的因子とが作用した結果に生じるとされている。体内における血糖の主要な調整因子はインスリンであり、高血糖は、インスリン欠乏、または、その作用を阻害する諸因子(例えば、遺伝的素因、運動不足、肥満、ストレスなど)が過剰となって生じる。糖尿病には主として2つの種類があり、自己免疫疾患などによる膵インスリン分泌機能の低下によって生じるインスリン依存性糖尿病(IDDM)と、持続的な高インスリン分泌に伴う膵疲弊による膵インスリン分泌機能の低下が原因であるインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)とに分類される。日本人の糖尿病患者の95%以上はNIDDMと言われており、今日、生活様式の変化に伴う患者数の増加が問題となっている。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(pyruvate dehydrogenase kinase:PDK)は、ピルビン酸をアセチルCoAに変換する酵素であるピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase:PDH)をリン酸化して不活性化する酵素であり、グルコースの代謝に関与していることから糖尿病とも関連していること、PDKには4種類のイソ酵素、PDK1〜PDK4が存在することが知られている(例えば下記の非特許文献1を参照)。PDKの機能によれば、この酵素を阻害することは糖尿病に有効に作用すると考えられるが、PDKの個々のイソ酵素の機能の解明は今だ必ずしも十分に行われていないことから、イソ酵素に対する特異的な阻害活性を有することが糖尿病にどのように有効に作用するかについては不明な部分も多い。
The Journal of Biological Chemistry, Vol.271, No.37, Issue of September 13, pp.22376-22382, 1996
The Journal of Biological Chemistry, Vol.271, No.37, Issue of September 13, pp.22376-22382, 1996
そこで本発明は、PDK4の機能の解明に基づく新規な糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
上記の点に鑑みてなされた本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法は、請求項1記載の通り、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択することを特徴とする。
また、請求項2記載のスクリーニング方法は、請求項1記載のスクリーニング方法において、運動療法を代替する糖尿病治療薬のスクリーニング方法であることを特徴とする。
また、請求項3記載のスクリーニング方法は、請求項1または2記載のスクリーニング方法において、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、標識ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択することを特徴とする。
また、請求項4記載のスクリーニング方法は、請求項1または2記載のスクリーニング方法において、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、リン酸化セリン残基を認識する標識抗体をさらに添加するか、または、リン酸化セリン残基を認識する抗体とその抗体を認識する標識抗体をさらに添加し、抗体を介して基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択することを特徴とする。
また、本発明の糖尿病治療薬としてのPDK4特異的阻害剤は、請求項5記載の通り、請求項1乃至4のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択されてなることを特徴とする。
また、請求項2記載のスクリーニング方法は、請求項1記載のスクリーニング方法において、運動療法を代替する糖尿病治療薬のスクリーニング方法であることを特徴とする。
また、請求項3記載のスクリーニング方法は、請求項1または2記載のスクリーニング方法において、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、標識ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択することを特徴とする。
また、請求項4記載のスクリーニング方法は、請求項1または2記載のスクリーニング方法において、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、リン酸化セリン残基を認識する標識抗体をさらに添加するか、または、リン酸化セリン残基を認識する抗体とその抗体を認識する標識抗体をさらに添加し、抗体を介して基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択することを特徴とする。
また、本発明の糖尿病治療薬としてのPDK4特異的阻害剤は、請求項5記載の通り、請求項1乃至4のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択されてなることを特徴とする。
本発明によれば、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択するという、PDK4の機能の解明に基づく新規な糖尿病治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明の糖尿病治療薬のスクリーニング方法は、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択することを特徴とするものである。
具体的な方法としては、例えば、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、33P-ATPなどの標識ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1(基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択する方法が挙げられる。
また、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質のリン酸化部位を検出できる試薬として、リン酸化セリン残基を認識する標識抗体をさらに添加するか、または、リン酸化セリン残基を認識する抗体とその抗体を認識する標識抗体をさらに添加し、抗体を介して基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1(抗体を介して基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択する方法が挙げられる。
ここで用いるPDK1〜PDK4とPDHはヒト由来のものであることが望ましい。PDHのフラグメントとしては、リン酸化部位となるセリン残基を含むPDH-E1サブユニットの内在配列ペプチド、例えば、2つのリン酸化部位を含むYHGHSMSDPGVSYR(左から5番目と12番目のSがリン酸化部位)がある。PDK4に対する特異的な阻害活性に基づく糖尿病治療薬は今だ存在しない。従って、本発明は、これまでにない作用機序に基づく糖尿病治療薬の開発に際して有用なものとなる。
具体的な方法としては、例えば、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、33P-ATPなどの標識ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1(基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択する方法が挙げられる。
また、酵素としてPDK4、基質としてPDHまたはそのフラグメントを用い、ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質のリン酸化部位を検出できる試薬として、リン酸化セリン残基を認識する標識抗体をさらに添加するか、または、リン酸化セリン残基を認識する抗体とその抗体を認識する標識抗体をさらに添加し、抗体を介して基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1(抗体を介して基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択する方法が挙げられる。
ここで用いるPDK1〜PDK4とPDHはヒト由来のものであることが望ましい。PDHのフラグメントとしては、リン酸化部位となるセリン残基を含むPDH-E1サブユニットの内在配列ペプチド、例えば、2つのリン酸化部位を含むYHGHSMSDPGVSYR(左から5番目と12番目のSがリン酸化部位)がある。PDK4に対する特異的な阻害活性に基づく糖尿病治療薬は今だ存在しない。従って、本発明は、これまでにない作用機序に基づく糖尿病治療薬の開発に際して有用なものとなる。
以下、本発明者らによって解明されたPDK4の機能を詳述する。
1)実験動物について
・運動負荷動物:メスKKAy2型糖尿病モデルマウス6週齢を購入し(日本クレア)、8週齢より運動負荷を開始した。運動負荷は、トレッドミル傾斜角0°、10m/min、1日1回30分間の条件で、土曜日と日曜日を除く毎日4週間連続して行った。最終日の運動負荷後に剖検した。
・インスリン投与動物:運動負荷の代わりに剖検30分前にインスリン2mg/kg wtを皮下投与した。
・無処置動物:運動負荷もインスリン投与も行わず剖検した。
運動負荷群、インスリン投与群、無処置群のそれぞれの骨格筋(ヒラメ筋と被覆筋)を採取した。
1)実験動物について
・運動負荷動物:メスKKAy2型糖尿病モデルマウス6週齢を購入し(日本クレア)、8週齢より運動負荷を開始した。運動負荷は、トレッドミル傾斜角0°、10m/min、1日1回30分間の条件で、土曜日と日曜日を除く毎日4週間連続して行った。最終日の運動負荷後に剖検した。
・インスリン投与動物:運動負荷の代わりに剖検30分前にインスリン2mg/kg wtを皮下投与した。
・無処置動物:運動負荷もインスリン投与も行わず剖検した。
運動負荷群、インスリン投与群、無処置群のそれぞれの骨格筋(ヒラメ筋と被覆筋)を採取した。
2)Bodymap法による遺伝子発現頻度表作成
上記の採取した骨格筋(ヒラメ筋と被覆筋)を用い、無処置群、運動負荷群、インスリン投与群の各動物群の骨格筋における遺伝子発現頻度表をBodymap法により作成した。Bodymap法は大久保らの方法(必要であればDNA Seq 2:137,1991やNat Genet 2:173,1992を参照のこと)に若干の修正を加えて実施した。即ち、まず、筋肉からTRIZOL(GIBCO BRL)を用いてtotalRNAを抽出し、それぞれをRneasy kit(QIAGEN)により精製した。精製totalRNA2μgとPolyT付加、damメチラーゼ処理を施されたpUC19由来のベクタープライマー0.2μgを用いて2本鎖cDNA合成を行った後、制限酵素BamHI、MboIにより切断し、ライゲースにより自己環化させ、3'断片ライブラリーを作製した。作製したライブラリーを、大腸菌にトランスフォーム後、アンピシリンプレートに播き、生育したコロニーをランダムにピックアップした。ピックアップした大腸菌をボイルにより溶菌し、pUC19由来のプライマーを用いてPCR反応を行い、そのPCR産物をABI377により配列決定した。
得られた配列から、2回以上MboIサイトを持つもの、35bp以下のもの、ベクター、リボゾームRNA、ミトコンドリア由来のものを取り除いた後、ホモロジー解析ソフトであるFASTAにより、同じ配列をカウントした。同じ配列であると見なした条件は、2つの配列を見比べ、配列スタート位置のずれが5bp以内のもの、相同領域が短い方の長さの94%以上かつ相同性が92%以上あるものとした。
カウントは遺伝子毎に纏め、無処置群、運動負荷群、インスリン投与群の各動物群の骨格筋における遺伝子発現頻度表を作成した。
その結果、無処置群3607、運動負荷群3535、インスリン投与群3912クローンの有効データを得た。各々有効データ中、PDK4遺伝子の発現回数は無処置群で4回、運動負荷群で0回、インスリン投与群で6回であった。
<PDK4遺伝子発現頻度>
無処置群 :4/3607
運動負荷群 :0/3535
インスリン投与群 :6/3912
上記の採取した骨格筋(ヒラメ筋と被覆筋)を用い、無処置群、運動負荷群、インスリン投与群の各動物群の骨格筋における遺伝子発現頻度表をBodymap法により作成した。Bodymap法は大久保らの方法(必要であればDNA Seq 2:137,1991やNat Genet 2:173,1992を参照のこと)に若干の修正を加えて実施した。即ち、まず、筋肉からTRIZOL(GIBCO BRL)を用いてtotalRNAを抽出し、それぞれをRneasy kit(QIAGEN)により精製した。精製totalRNA2μgとPolyT付加、damメチラーゼ処理を施されたpUC19由来のベクタープライマー0.2μgを用いて2本鎖cDNA合成を行った後、制限酵素BamHI、MboIにより切断し、ライゲースにより自己環化させ、3'断片ライブラリーを作製した。作製したライブラリーを、大腸菌にトランスフォーム後、アンピシリンプレートに播き、生育したコロニーをランダムにピックアップした。ピックアップした大腸菌をボイルにより溶菌し、pUC19由来のプライマーを用いてPCR反応を行い、そのPCR産物をABI377により配列決定した。
得られた配列から、2回以上MboIサイトを持つもの、35bp以下のもの、ベクター、リボゾームRNA、ミトコンドリア由来のものを取り除いた後、ホモロジー解析ソフトであるFASTAにより、同じ配列をカウントした。同じ配列であると見なした条件は、2つの配列を見比べ、配列スタート位置のずれが5bp以内のもの、相同領域が短い方の長さの94%以上かつ相同性が92%以上あるものとした。
カウントは遺伝子毎に纏め、無処置群、運動負荷群、インスリン投与群の各動物群の骨格筋における遺伝子発現頻度表を作成した。
その結果、無処置群3607、運動負荷群3535、インスリン投与群3912クローンの有効データを得た。各々有効データ中、PDK4遺伝子の発現回数は無処置群で4回、運動負荷群で0回、インスリン投与群で6回であった。
<PDK4遺伝子発現頻度>
無処置群 :4/3607
運動負荷群 :0/3535
インスリン投与群 :6/3912
3)ATAC-PCR法による遺伝子発現頻度情報確認
まず、2)のBodymap法で抽出した無処置群、運動負荷群、インスリン投与群の各動物群の骨格筋のtotalRNA3μgおよびビオチン化されたOligodT15pmolを用いて2本鎖cDNA合成を行い、制限酵素MboIにより消化し、DNA溶液を作製した(それぞれA、B、Cとする)。得られたDNA溶液と6種類の適当なアダプター(MA-1〜MA-6)を混合し、DNAライゲースにより結合させた後、ストレプトアビジンでコートしたマグネティックビーズにより、3'-MboI断片を回収した。なお、DNA溶液とアダプターは以下のように混合した。
・A+B+Cの等量混合物とMA-1
・AとMA-2
・A+B+Cの等量混合物とMA-3
・BとMA-4
・CとMA-5
・A+B+Cの等量混合物とMA-6
それぞれの3'-MboI断片溶液を、上から10:5:5:5:5:1の割合で混合後、蛍光標識したアダプタープライマーおよび配列特異的プライマーを用いてPCRによる増幅を実施した。得られた増幅物を377DNAシーケンサーで泳動し、GeneScan(Perkin Elmer)によるピーク検出を行った。得られたピークの面積比を計算し、A+B+Cの等量混合物による検量で正しい結果が得られたもののみを抽出し、ピーク面積比をmRNA発現量の面積比と見なした。
以上の方法でPDK4mRNAの発現量を調べた結果、ピーク面積比は無処置群を1とした場合、運動負荷群で0.06倍、インスリン投与群で1.71倍であった。
<PDK4mRNA発現比>
無処置群 :1
運動負荷群 :0.06
インスリン投与群 :1.71
なお、2)のBodymap法で抽出した運動負荷群の骨格筋のtotalRNAと、同様にして抽出した正常マウスの主要臓器のtotalRNAを用い、以上の方法でPDK4mRNAの正常マウスの主要臓器における発現量を調べた結果を表1に示す。表1から明らかなように、ピーク面積比は運動負荷群の骨格筋を1とした場合、正常マウスの心臓では3.80倍、筋肉では1.81倍であり、その他の臓器に比較して特異的に高い発現頻度を示すことが確認できた。
まず、2)のBodymap法で抽出した無処置群、運動負荷群、インスリン投与群の各動物群の骨格筋のtotalRNA3μgおよびビオチン化されたOligodT15pmolを用いて2本鎖cDNA合成を行い、制限酵素MboIにより消化し、DNA溶液を作製した(それぞれA、B、Cとする)。得られたDNA溶液と6種類の適当なアダプター(MA-1〜MA-6)を混合し、DNAライゲースにより結合させた後、ストレプトアビジンでコートしたマグネティックビーズにより、3'-MboI断片を回収した。なお、DNA溶液とアダプターは以下のように混合した。
・A+B+Cの等量混合物とMA-1
・AとMA-2
・A+B+Cの等量混合物とMA-3
・BとMA-4
・CとMA-5
・A+B+Cの等量混合物とMA-6
それぞれの3'-MboI断片溶液を、上から10:5:5:5:5:1の割合で混合後、蛍光標識したアダプタープライマーおよび配列特異的プライマーを用いてPCRによる増幅を実施した。得られた増幅物を377DNAシーケンサーで泳動し、GeneScan(Perkin Elmer)によるピーク検出を行った。得られたピークの面積比を計算し、A+B+Cの等量混合物による検量で正しい結果が得られたもののみを抽出し、ピーク面積比をmRNA発現量の面積比と見なした。
以上の方法でPDK4mRNAの発現量を調べた結果、ピーク面積比は無処置群を1とした場合、運動負荷群で0.06倍、インスリン投与群で1.71倍であった。
<PDK4mRNA発現比>
無処置群 :1
運動負荷群 :0.06
インスリン投与群 :1.71
なお、2)のBodymap法で抽出した運動負荷群の骨格筋のtotalRNAと、同様にして抽出した正常マウスの主要臓器のtotalRNAを用い、以上の方法でPDK4mRNAの正常マウスの主要臓器における発現量を調べた結果を表1に示す。表1から明らかなように、ピーク面積比は運動負荷群の骨格筋を1とした場合、正常マウスの心臓では3.80倍、筋肉では1.81倍であり、その他の臓器に比較して特異的に高い発現頻度を示すことが確認できた。
4)機能解析試験
マウスC2C12多核筋管細胞を24穴プレートに播種し、翌日、PDK4遺伝子挿入プラスミド(ベクター:pCMV-Tag4A)または空ベクターをリポフェクトアミン2000を用いて細胞へ導入し、翌日、分化誘導した。分化誘導2日後に2deoxy-D-glucose(2-DG)取り込み試験を実施した。2-DG取り込み試験は、血清除去することで4時間starvationした後、(+)Hepes buffer(140mM NaCl, 5mM KCl, 2.5mM MgCl2, 1mM CaCl2, 20mM Hepes)に2-D[14C]-DG mix(final conc. 50μM)を添加し、37℃、1時間インキュベートしてから上清除去し、(+)Hepes buffer 2mlにて洗浄を3回した後、1%SDS300μlに溶解し、液体シンチレーターにてラベルカウントを測定することで行った。
その結果、PDK4遺伝子導入C2C12多核筋管細胞において、空ベクター導入細胞と比べ、2-D[14C]-DGの細胞への取り込みが約31%抑制された(N=4)。
マウスC2C12多核筋管細胞を24穴プレートに播種し、翌日、PDK4遺伝子挿入プラスミド(ベクター:pCMV-Tag4A)または空ベクターをリポフェクトアミン2000を用いて細胞へ導入し、翌日、分化誘導した。分化誘導2日後に2deoxy-D-glucose(2-DG)取り込み試験を実施した。2-DG取り込み試験は、血清除去することで4時間starvationした後、(+)Hepes buffer(140mM NaCl, 5mM KCl, 2.5mM MgCl2, 1mM CaCl2, 20mM Hepes)に2-D[14C]-DG mix(final conc. 50μM)を添加し、37℃、1時間インキュベートしてから上清除去し、(+)Hepes buffer 2mlにて洗浄を3回した後、1%SDS300μlに溶解し、液体シンチレーターにてラベルカウントを測定することで行った。
その結果、PDK4遺伝子導入C2C12多核筋管細胞において、空ベクター導入細胞と比べ、2-D[14C]-DGの細胞への取り込みが約31%抑制された(N=4)。
以上の実験から、PDK4は2型糖尿病モデル動物に対する運動負荷により、無処置の場合やインスリンを投与した場合に比較して遺伝子発現が低下すること、培養細胞へのPDK4の一過性発現により、細胞への糖の取り込みが抑制されることを確認することができた。従って、PDK4特異的阻害剤は、運動療法を代替する糖尿病治療薬となるので、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択すること、即ち、PDK4特異的阻害剤をスクリーニングすることは、糖尿病治療薬、とりわけ、運動療法を代替する糖尿病治療薬をスクリーニングすることとして有用であることがわかった。PDK4特異的阻害剤のスクリーニングは、好適には、例えば、以下に示す手順で行うことができる。
PDK4発現プラスミドとして、ヒトPDK4フラグメントをEcoRIおよびXhoIを用いて制限酵素消化し、pET44へサブクローニングしたものを用い、これを大腸菌(TUNER株)に導入し、IPTG添加LB培地にて22℃、一晩培養する。大腸菌回収後、BugBuster試薬(Novagen)で溶解し、同時にBenzonase Nuclease(Novagen)を添加する。発現ヒトPDK4の精製はTALONレジン(clontech)カラムを使用し、溶出は5mMイミダゾールで行う。精製後直ちにPD-10カラム(ファルマシア)により脱塩を行う。
このようにして発現させたPDK4に対する阻害活性評価は、フィルター法により行う。まず、酵素反応停止液としての120mMリン酸溶液100μlでMultiscreenプレート(MILLIPORE MAPH-NOB-50:PH)をプレウェットする。次に、96穴プレート(PP製)に、1)検体5μl、2)PDK4+N末をアセチル化したYHGHSMSDPGVSYR25μl、3)ATP(Cold ATP+33P-ATP)20μl、合計50μlを順に添加し混合する(Assay Buffer:20mM Tris-HCl pH7.4, 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM 2-ME)。室温で1時間反応した後、反応を停止するため、120mMリン酸を100μl添加し、5分間インキュベートする。反応混合物を上記のプレウェットしたPHプレートに移し、100mMリン酸200μlで4回洗浄する。その後、PHプレートを乾燥し、underdrainを外して、top count用のホルダーに装着、MicroScintiOを20μl添加し、シールをしてtop countで放射活性を測定し、検体のPDK4に対する活性阻害評価を行う(基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)。
PDK1〜PDK3に対する阻害活性評価は、上記のPDK4に対する阻害活性評価に準じて行えばよい。
このようにして発現させたPDK4に対する阻害活性評価は、フィルター法により行う。まず、酵素反応停止液としての120mMリン酸溶液100μlでMultiscreenプレート(MILLIPORE MAPH-NOB-50:PH)をプレウェットする。次に、96穴プレート(PP製)に、1)検体5μl、2)PDK4+N末をアセチル化したYHGHSMSDPGVSYR25μl、3)ATP(Cold ATP+33P-ATP)20μl、合計50μlを順に添加し混合する(Assay Buffer:20mM Tris-HCl pH7.4, 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM 2-ME)。室温で1時間反応した後、反応を停止するため、120mMリン酸を100μl添加し、5分間インキュベートする。反応混合物を上記のプレウェットしたPHプレートに移し、100mMリン酸200μlで4回洗浄する。その後、PHプレートを乾燥し、underdrainを外して、top count用のホルダーに装着、MicroScintiOを20μl添加し、シールをしてtop countで放射活性を測定し、検体のPDK4に対する活性阻害評価を行う(基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)。
PDK1〜PDK3に対する阻害活性評価は、上記のPDK4に対する阻害活性評価に準じて行えばよい。
また、上記のようにして発現させたPDK4に対する阻害活性評価は、次のようにして行うこともできる。まず、96穴プレート(PP製)に、1)検体5μl、2)PDK4 1μg、3)N末をビオチン化したYHGHSMSDPGVSYR0.5μM、4)ATP2μMを含む合計50μl(Assay Buffer:20mM Tris-HCl pH7.4, 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM 2-ME)を順に添加し混合する。室温で1時間反応した後、反応を停止するため、7.5mMのEDTAを50μl添加する。次いで、DELFIA assay buffer(Perkin Elmer)を100μl添加した後、反応混合物をストレプトアビジンコートプレートに移し、室温で1時間shakingする。その後、プレートを400μlのTBS-T(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% tween20)で2回洗浄してから、1次抗体としてウサギ抗セリンリン酸化抗体(Rabbit anti-phosphoserin antibody:ZYMED)を添加し、室温で1時間shakingする。次に、プレートを400μlのTBS-Tで2回洗浄してから、2次抗体としてユーロピウム標識抗ウサギIgG抗体(LANCE Eu-w1024 labeled anti-Rabbit-IgG:Perkin Elmer)を添加し、室温で1時間shakingする。プレートを400μlのTBS-Tで6回洗浄してから、Enhancement Solution(Perkin Elmer)を200μl/wellで添加し、室温で5分間shakingした後、蛍光活性を測定し、検体のPDK4に対する活性阻害評価を行う(抗体を介して基質に結合した標識を観察できれば阻害活性がなく観察できなければ阻害活性がある)。
PDK1〜PDK3に対する阻害活性評価は、上記のPDK4に対する阻害活性評価に準じて行えばよい。
PDK1〜PDK3に対する阻害活性評価は、上記のPDK4に対する阻害活性評価に準じて行えばよい。
本発明は、PDK4に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択するという、PDK4の機能の解明に基づく新規な糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
Claims (5)
- ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素4(PDK4)に対する特異的な阻害活性の有無を指標にし、当該活性を有する物質を選択することを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- 運動療法を代替する糖尿病治療薬のスクリーニング方法であることを特徴とする請求項1記載のスクリーニング方法。
- 酵素としてPDK4、基質としてピルビン酸デヒドロゲナーゼまたはそのフラグメントを用い、標識ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択することを特徴とする請求項1または2記載のスクリーニング方法。
- 酵素としてPDK4、基質としてピルビン酸デヒドロゲナーゼまたはそのフラグメントを用い、ATPの存在下でPDK4による基質のリン酸化反応を行う際、評価対象物質を反応系内に添加して行った後、リン酸化セリン残基を認識する標識抗体をさらに添加するか、または、リン酸化セリン残基を認識する抗体とその抗体を認識する標識抗体をさらに添加し、抗体を介して基質に結合した標識を指標にして評価対象物質のPDK4に対する阻害活性を判定する工程1、続いて工程1で用いたPDK4の代わりにPDK1、PDK2、PDK3のそれぞれを用いて工程1と同様の判定を行い、評価対象物質のそれぞれの酵素に対する阻害活性を判定する工程2を少なくとも含んでなる工程を経て、PDK4に対する阻害活性を有し、PDK1、PDK2、PDK3に対する阻害活性を有しない物質を選択することを特徴とする請求項1または2記載のスクリーニング方法。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択されてなることを特徴とする糖尿病治療薬としてのPDK4特異的阻害剤。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004214815A JP2007295801A (ja) | 2004-07-22 | 2004-07-22 | 糖尿病治療薬のスクリーニング方法 |
PCT/JP2005/012596 WO2006008980A1 (ja) | 2004-07-22 | 2005-07-07 | 糖尿病治療薬のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004214815A JP2007295801A (ja) | 2004-07-22 | 2004-07-22 | 糖尿病治療薬のスクリーニング方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007295801A true JP2007295801A (ja) | 2007-11-15 |
Family
ID=35785098
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004214815A Withdrawn JP2007295801A (ja) | 2004-07-22 | 2004-07-22 | 糖尿病治療薬のスクリーニング方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2007295801A (ja) |
WO (1) | WO2006008980A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7995758B1 (en) | 2004-11-30 | 2011-08-09 | Adobe Systems Incorporated | Family of encryption keys |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR074797A1 (es) * | 2008-10-10 | 2011-02-16 | Japan Tobacco Inc | Compuesto de fluoreno , composiciones farmaceuticas , inhibidores de pdhk y pdhk2 , metodos de tratamiento , usos de los mismos y kit comercial |
-
2004
- 2004-07-22 JP JP2004214815A patent/JP2007295801A/ja not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-07-07 WO PCT/JP2005/012596 patent/WO2006008980A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7995758B1 (en) | 2004-11-30 | 2011-08-09 | Adobe Systems Incorporated | Family of encryption keys |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006008980A1 (ja) | 2006-01-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fu | The superfamily of arginine/serine-rich splicing factors. | |
KR102391812B1 (ko) | B형 간염 감염을 치료하기 위해 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 감소시키기 위한 핵산 분자 | |
Atwood et al. | Smoothened variants explain the majority of drug resistance in basal cell carcinoma | |
Novoyatleva et al. | Protein phosphatase 1 binds to the RNA recognition motif of several splicing factors and regulates alternative pre-mRNA processing | |
KR102620328B1 (ko) | 핵 유전자 산출량의 표적화 증강 | |
Swirnoff et al. | DNA-binding specificity of NGFI-A and related zinc finger transcription factors | |
Lopes et al. | The human RPS4 paralogue on Yq11. 223 encodes a structurally conserved ribosomal protein and is preferentially expressed during spermatogenesis | |
Good et al. | A Family of Human RNA-binding Proteins Related to theDrosophila Bruno Translational Regulator | |
RU2760851C2 (ru) | Варианты hsd17b13 и их применения | |
Dai et al. | Haspin: a mitotic histone kinase required for metaphase chromosome alignment | |
KR20180039631A (ko) | 염색체 상호작용 부위를 이용하는 검출 방법 | |
RU2768285C1 (ru) | Олигонуклеотиды для модуляции экспрессии тау-белка | |
CN106794125A (zh) | 用于治疗或预防核纤层蛋白病、老化和癌症的nat10调节剂 | |
MXPA06000514A (es) | Metodos de diagnostico y tratamiento del asma y otras enfermedades respiratorias basandose en la asociacion de haplotipos. | |
Sanz et al. | Molecular characterization of a novel transcription factor that controls stromelysin expression | |
CN111315882A (zh) | 癌症促进因子表达抑制剂、其有效成分的筛选方法、对该方法有用的表达盒、诊断药和诊断方法 | |
KR102584661B1 (ko) | 염증 촉진 인자 발현 억제제, 그 유효 성분의 스크리닝 방법, 그 방법에 유용한 발현 카세트, 진단약 및 진단 방법 | |
JP2007295801A (ja) | 糖尿病治療薬のスクリーニング方法 | |
ES2318910T3 (es) | Nuevo factor de transcripcion de genes mhc de clase ii; sustancias capaces de inhibir este nuevo factor de transcripcion y usos medicos de estas sustancias. | |
CN108699604A (zh) | 用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的myo1a以及myo1a用于治疗疼痛的用途 | |
US8541345B2 (en) | Compositions and methods for the identification and use of epigenetic markers useful in the study of normal and abnormal mammalian gametogenesis | |
TW201238973A (en) | MiRNAs in joint disease | |
Edgar | The gene structure and expression of human ABHD1: overlapping polyadenylation signal sequence with Sec12 | |
US6753413B1 (en) | P35NCK5A binding proteins | |
EP2128272A1 (en) | Gene/protein marker for prediction or diagnosis of pharmacological efficacy of aurora a inhibitor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20071106 |