CN108699604A - 用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的myo1a以及myo1a用于治疗疼痛的用途 - Google Patents

用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的myo1a以及myo1a用于治疗疼痛的用途 Download PDF

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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

本发明涉及将Myo1a鉴定为急性疼痛转变为慢性疼痛的生物标志物，并鉴定为治疗靶标。本发明特别涉及用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的产品和方法，并且特别适用于哺乳动物，优选人类受试者。本发明更具体地涉及优选使用MYO1A基因作为生物标志物来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。在本文中发明人提供了对MYO1A具有特异性的结合试剂，含有所述试剂的组合物、装置、试剂盒，以及动物模型，并进一步描述了它们用于评估受试者罹患慢性疼痛的倾向的用途。本发明还涉及用于诊断、预防、管控或治疗慢性疼痛的产品和方法。

Description

用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的MYO1A以及MYO1A用于治 疗疼痛的用途
技术领域
本发明涉及将Myo1a鉴定为急性疼痛转变为慢性疼痛的生物标志物，并鉴定为治疗靶标。本发明特别涉及用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的产品和方法，并且特别适用于哺乳动物，优选人类受试者。本发明更具体地涉及优选使用MYO1A基因作为生物标志物来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。在本文中本发明人提供对MYO1A具有特异性的结合试剂，含有所述试剂的组合物、装置、试剂盒，以及动物模型，并进一步描述了它们用于评估受试者罹患慢性疼痛的倾向的用途。本发明还涉及用于诊断、预防、管控或治疗慢性疼痛的产品和方法。
背景技术
疼痛通常分为急性和慢性疼痛。急性疼痛持续时间短，并且对于维持我们的身体完整性是必需的，而慢性疼痛在正常愈合时间后持续并对我们的健康产生不利影响。慢性炎性或神经性疼痛导致高度衰弱和持久的感觉异常，如痛觉过敏、异常性疼痛和自发性疼痛(Munro等人,2009)。这些症状由外周和中枢神经系统中疼痛路径的异常延长的敏化引起，从而导致疼痛传递回路中的促进增加或抑制减弱。(Sandkuhler,2009；Zeilhofer等人,2012)。在发炎和神经损伤的情况下通过各种机制发生减少的脊髓抑制。这些包括前列腺素E2介导的对抑制性甘氨酸受体的抑制(Ahmadi等人,2002；Harvey等人,2004；Muller等人,2003；Zeilhofer等人,2012)和来源于脑的神经营养因子(BDNF)介导的氯化钾输出物KCC2下调，这扰乱了氯化物稳态，从而改变了GABA能和甘氨酸能抑制功能(Coull等人,2005；Coull等人,2003；Zeilhofer等人,2012)。最近的研究解密了数种微回路，所述微回路涉及参与控制急性和损伤诱导的持续疼痛的脊髓(SC)兴奋性和抑制性中间神经元的不同子集(Bourane等人,2015a；Bourane等人,2015b；Duan等人,2014；Foster等人,2015；Peirs等人,2015；Petitjean等人,2015)。这些数据一起展示我们对如下分子和细胞机制有很多了解，这些机制是控制损伤诱导的急性疼痛发作的外周和中枢敏化的基础。然而，我们对触发急性疼痛向慢性疼痛转变的分子和细胞事件的了解仍然有限。例如，已确定在常见的外科程序如胸外科、腿截肢和冠状动脉旁路后，约10％至50％的个体会在急性术后疼痛后出现持续疼痛(Gilron等人,2013；Kehlet等人,2006)。这些患者中仅一小部分如何以及为何产生慢性术后疼痛(CPSP)尚未知晓。在临床中，已经提出了数种预测CPSP产生的风险因素。这些因素包括年龄、性别和手术类型、患者对引起的疼痛刺激的反应的术前和术后评估以及他们对产生CPSP的遗传易感性(Kehlet等人,2006)。
鉴于缺乏关于慢性疼痛的产生、预防和治疗的信息，显然需要鉴定可适当管控慢性疼痛的新生物标记物以及可预防、减弱或治疗慢性疼痛的新治疗化合物。
发明内容
令人惊讶地，发明人在本文中首次展示，Myo1a的缺失或其表达的改变与受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向有关。
因此，本发明的第一目的涉及编码肌球蛋白IA(Myo1a)的DNA或mRNA、优选Myo1a基因或Myo1a蛋白的用途，其用作生物标志物来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。
本发明还涉及一种评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的体外方法，其中所述方法包含对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸序列进行分析、通常是测序的步骤，检测到在与以SEQ ID NO：1鉴定的Myo1a野生型核酸序列比较时受试者的Myo1a的核酸序列改变，则指示受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛，而不存在改变则指示受试者没有产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。
本发明的其它目的涉及编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或Myo1a蛋白(“肌球蛋白IA”)的激动剂，其用于预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛；涉及包含Myo1a蛋白的激动剂以及药学上可接受的载体或承载体的组合物；并且涉及其用于预防或治疗受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的用途。
本文还描述了一种Myo1a调节剂的体外或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达和/或生物学功能的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂(活化剂)，并可能鉴定为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂(抑制剂)。
发明人在本文中揭示了Myo1a KO(Myo1a-/-)动物模型用于筛选Myo1a调节剂和/或筛选用于预防、减少或抑制疼痛的药物的潜在用途。
本发明还涉及适用于实施上述方法的试剂盒和装置，例如包含固定在承载体上的至少一种互补核酸的装置，所述互补核酸结合Myo1a基因或Myo1a基因座的全部或部分，通常是用于对Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸，或用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，所述试剂盒包含用于对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸。
在一个特定方面，本发明涉及包含固定在承载体上的至少一种互补核酸的装置用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的用途，所述互补核酸结合Myo1a基因或Myo1a基因座的全部或部分。
在另一个特定方面，本发明涉及试剂盒用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的用途，其中所述试剂盒包含用于对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸。
在本发明的上下文中，所述受试者是任何哺乳动物受试者，特别是人类受试者。
具体实施方式
疼痛是与实际或潜在组织损害相关的令人不快的感觉体验。因此，疼痛是各种损伤和疾病的最常见症状。存在不同的疼痛分类，例如伤害性疼痛通常区别于炎性疼痛和病理性疼痛，病理性疼痛是由损害神经系统(即神经性疼痛)或其异常功能(功能障碍性疼痛，如在纤维肌痛、肠易激综合征、紧张型头痛等中)引起的疾病状态。
疼痛通常是短暂的，只持续到有害刺激被去除或潜在的损害或病理已经治愈为止，但是一些疼痛病状，如类风湿性关节炎、外周神经病、癌症和特发性疼痛(在创伤或病理已经治愈后持续或没有任何明显原因产生的疼痛)，可能会持续多年。持续长时间的疼痛被称为慢性疼痛，并且迅速消除的疼痛被称为急性疼痛。传统上，急性和慢性疼痛之间的区别依赖于距离发作的任意时间间隔；两种最常用的标志物是疼痛发作后3个月和6个月(Turk,Okifuji,疼痛的术语和疼痛的分类(Pain terms and taxonomies of pain)；Bonica,Loeser,Chapman,Turk,Butler,Bonica的疼痛管控(Bonica's management of pain).Hagerstwon:Lippincott Williams&Wilkins,2001)，但一些理论家和研究人员认为在12个月时急性疼痛转变为慢性疼痛(Spanswick,Main,疼痛管控：跨学科的方法(Painmanagement:an interdisciplinary approach).Edinburgh:Churchill Livingstone,2000)。其他人认为持续少于30天为急性疼痛，持续时间多于六个月为慢性疼痛，并且持续一至六个月为亚急性疼痛(Thienhaus,Cole,疼痛的分类(Classification of pain).Weiner,疼痛管控：临床实用指南(Pain management:a practical guide forclinicians).Boca Raton:CRC Press,2002)。慢性疼痛的不涉及任意固定持续时间的一个通俗替选定义为“超出预期的治愈期的疼痛”(Turk,Okifuji,2001,疼痛术语和分类(Painterms and taxonomies).Loeser,Butler,Chapman等人,Bonica的疼痛管控(Bonica'smanagement of pain),Lippincott Williams&Wilkins.ISBN 0-683-30462-3)。慢性疼痛可分为癌症疼痛或良性疼痛(Thienhaus,Cole,2002,疼痛的分类(Classification ofpain).Weiner,疼痛管控：临床实用指南(Pain management:A practical guide forclinicians),American Academy of Pain Management,ISBN 0-8493-0926-3)。
疼痛感通过感觉神经元传输到大脑，所述感觉神经元也被称为伤害感受器。伤害感受器被认为是多模式的，因为其可以响应多种形式的有害或强烈刺激，如热量(热/冷)、机械和化学刺激。伤害感受器的感觉传入纤维在许多方面是异质的。例如，感觉神经根据其直径和髓鞘化程度分为Aα、-β、-δ和C-纤维。接着，通过涉及脊髓内的兴奋性和抑制性中间神经元的复杂回路将来自外周的感觉输入加工并传输到更高的脑区(Basbaum等人,2009；Todd,2010)。刺激和抑制之间的平衡对于维持正常的感觉功能是至关重要的，并且这些回路的功能障碍导致疼痛如炎性和神经性疼痛的产生。
疼痛的治疗包括使用阻断神经元传输并影响感觉以及疼痛的局部麻醉剂，以及使用缓解疼痛并且还可以干扰发炎的化学介导物的活性的镇痛剂。急性疼痛通常用药物如镇痛药和麻醉剂来管控。然而，慢性疼痛的管控则困难得多。此外，疼痛的治疗不充分广泛存在于外科病房、重症监护室、事故现场和急诊部中，一般实践中，所有形式的慢性疼痛包括癌症疼痛管控中以及临终关怀中。这种忽视延伸到所有年龄段，从新生儿到体弱的老人。迄今为止，患者仍然非常需要改善的疼痛治疗，特别是在考虑无论所选的已知镇痛分子是何种治疗仍不完全的神经性、炎性和/或慢性疼痛时。
本发明的目的在于区分那些易于产生慢性疼痛的受试者，以帮助从业者优化对其的疼痛治疗。
在本发明的上下文中，患者或受试者是动物，优选是脊椎动物，通常是哺乳动物。在一个优选实施方式中，哺乳动物是人类，无论其年龄或性别如何。所述哺乳动物还可以是动物，特别是家畜或繁殖动物，特别是马、狗、猫等。
发明人在本文中展示，在Myo1a KO小鼠中，短暂持续且可逆的炎性、神经性和术后疼痛转变为不可逆的慢性疼痛，指示Myo1a的缺失使小鼠倾向于产生慢性疼痛而无论引发病变的病因如何。使用行为药理学，他们发现在发炎和神经损伤的情况下，Myo1a KO小鼠选择性地对GABAA-R激动剂蝇蕈醇的镇痛作用不敏感，从而展示了Myo1a的缺失损害了离子型GABA能信号传导。因此，SC切片上的电生理学记录展示，在炎性病状下，蝇蕈醇引起的板层II中间神经元的兴奋性谷氨酸能活性增加在Myo1a KO小鼠中被完全消除。发明人使用无偏RNA深度测序筛选揭示了DRG和SC神经元两者中GABAA-R(GABRA2)的α2亚基的选择性上调。同时，其数据将Myo1a基因鉴定为通过选择性改变离子型GABA能信号传导产生损伤诱导的慢性疼痛和发炎诱导的慢性热性疼痛的预测性遗传因子。
发明人现在在本文中描述编码肌球蛋白IA(Myo1a)的核酸序列、通常编码Myo1a的DNA或mRNA、优选Myo1a基因的用途，其用作生物标志物(或预测性遗传因子)来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。机械性或热性疼痛可以是机械性或热性异常性疼痛(由通常不令人疼痛的刺激引起的疼痛)或痛觉过敏(对通常令人疼痛的刺激的放大反应)。
损伤诱导的慢性机械性疼痛通常是炎性、神经性和/或术后慢性机械性疼痛。这三种典型不同种类的疼痛中的每一种都是由损伤触发的，即与组织损伤有关。更具体地，在本发明的上下文中：
-炎性慢性机械性疼痛与组织损伤和免疫细胞浸润有关；
-神经性慢性机械性疼痛由如下损伤触发，所述损伤影响神经系统并且可以涉及或不涉及对神经系统的实际损害，即神经可以被肿瘤浸润或压缩，被疤痕组织绞窄或因感染而发炎。疼痛经常具有灼烧、刺痛或触电的特性。持续异常性疼痛也是神经性疼痛的常见特征。疼痛可以在任何受损组织明显治愈后持续数月或数年。
神经性疼痛的实例包括疱疹后(或带状疱疹后)神经痛、反射性交感神经营养不良/灼痛(神经创伤)、癌症疼痛分量、幻肢痛、嵌压性神经病(例如腕管综合征)和外周神经病(广泛神经损害)。在外周神经病的多种原因中，糖尿病是最常见的，但这种病状也可能是由于长期使用酒精、暴露于其他毒素(包括多种化学疗法)、维生素缺乏以及多种其他医学病状引起，所述病状的原因未进行诊断的情况并不罕见；并且
-术后慢性机械性疼痛直接由手术期间发生的组织损害引起。
Myo1a基因编码肌球蛋白超家族的成员——肌球蛋白-1a(本文中也鉴定为“Myo1a”)。该蛋白质代表一种非常规肌球蛋白。其不应与常规骨骼肌肌球蛋白-1(MYH1)相混淆。非常规肌球蛋白含有常规肌球蛋白特征性基本(basic)域，并且通过其尾域进一步区别于类成员。它们作为基于肌动蛋白的分子马达起作用。已知肌球蛋白IA在脊髓神经元中[更具体地在来自成年腰背根神经节(DRG)的LTMR神经元中，所述成年腰背根神经节的LTMR神经元在本文中也被称作“腰LTMR”]和在肠的特定区域的神经元中表达。肌球蛋白IA还在三叉神经中表达(Tyska,M.J.等人)。
Myo1a基因已被鉴定为高度多态的。实际上观察到比预期多的变体(同义：预期153.1，观察到158，z＝-0.25。错义：预期363.9，观察到405，z＝-1.05)。
在本发明的典型实施方式中，当与表达功能性肌球蛋白Ia(Myo1a)的Myo1a纯合子(Myo1a+/+)参比受试者中观察到的表达比较时，受试者中肌球蛋白IA(Myo1a)的表达缺失、减少或不足或非功能性表达使受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
表达功能性肌球蛋白Ia的参比受试者是Myo1a纯合子(Myo1a+/+)受试者。参比受试者的Myo1a基因由SEQ ID NO：1或其功能性变体组成。SEQ ID NO：1的功能性Myo1a变体编码功能性肌球蛋白Ia(SEQ ID NO：2)。功能性Myo1a变体可以例如且不限于选自SEQ ID NO：1的直向同源物，如SEQ ID NO：3(狗)和SEQ ID NO：5(猫)。
肌球蛋白IA的非功能性表达通常与背根神经节(DRG)和脊髓中的GABA受体(GABA-R)的α2亚基的选择性上调有关，并且因此可由技术人员间接检测。同样，检测到受试者中GABA能信号传导改变应该是检验所述受试者中肌球蛋白IA的表达或对Myo1a进行测序的原因。
本领域技术人员可用于检测或定量蛋白质——通常是肌球蛋白Ia的方法是本领域技术人员公知的，并且在以下说明书中进一步鉴定。
评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的优选方法是一种体外方法，所述方法包含对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸序列进行分析、优选测序的步骤，检测到在与以SEQ ID NO：1鉴定的Myo1a野生型核酸序列比较时受试者的Myo1a的核酸序列改变，则指示受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛，而不存在改变则指示受试者没有产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。
核酸序列的改变引起当与表达功能性Myo1a的Myo1a纯合子(Myo1a+/+)参比受试者中观察到的表达比较时Myo1a核酸的异常表达，通常是减少、降低或不足的表达，或由核酸编码的蛋白质(Myo1a)的异常、通常是非功能性的表达或活性。
通常，核酸序列的改变可以在Myo1a基因、通常是DNA、cDNA或RNA的水平上确定。优选地，通过对基因座的全部或部分进行测序或通过选择性杂交或扩增基因座的全部或部分来进行检测。更优选地，在改变鉴定步骤之前进行基因座特异性扩增。
改变的核酸或基因座通常是在基因座的编码和/或非编码区中包含突变或突变组合的核酸或基因座序列。
突变通常是点突变，或两个或更多个残基(碱基)的缺失或插入。
点突变可以是将一个碱基与另一个碱基交换的替换，将额外的碱基插入核酸序列的新位置中的插入。点突变可以为：错义突变，其是一种点突变，其中单个核苷酸被改变以引起不同氨基酸的替换；或无义突变，例如移码突变，其在转录的mRNA和截短的或不完整的蛋白质产物中产生过早终止密码子或无义密码子。
缺失可以涵盖基因座的编码或非编码部分中的两个或更多个残基的任何区域，如两个残基至整个基因或基因座。典型的缺失影响较小的区域，如少于约50个连续碱基对的域(内含子)或重复序列或片段，但也可能发生较大的缺失。插入可以涵盖在基因座的编码或非编码部分中添加一个或数个残基。插入通常可以包含在基因座中添加1至50个碱基对。重排包括序列的反转。基因座改变可导致终止密码子的产生、移码突变、氨基酸替换、特定RNA剪接或加工、产物不稳定性、截短的多肽产生等。
在本发明的上下文中遇到的所有情况下，突变停止或降低了功能性蛋白质产物的产生或导致非功能性蛋白质产物。突变通常是功能丧失突变。
不影响肌球蛋白Ia的功能性表达的变异或多态性将不会被技术人员鉴定为核酸序列的改变。
在本发明的上下文中，“Myo1a基因座”表示细胞或生物体中的所有序列或产物，包括Myo1a编码序列、Myo1a非编码序列(例如内含子)、控制转录和/或翻译的Myo1a调节序列(例如启动子、增强子/沉默子区、终止子、5'UTR、3'UTR等)、所有相应的表达产物如Myo1aRNA(例如mRNA)；以及在Myo1a基因的起始密码子(侧接5'UTR区)上游20kb区域、优选15.3kb区域，在非翻译区(侧接3'UTR区)下游20kb区域、14.1kb区域的周围序列。在一个特定实施方式中，大多数改变不在启动子序列中。
在一个特定实施方式中，改变的Myo1a核酸是如下Myo1a野生型核酸，其包含至少一个点突变，优选单核苷酸多态性(SNP)，例如功能丧失SNP，即引起核酸编码的蛋白质的表达缺失或异常(非功能性)的SNP。Myo1a野生型核酸还可以包含数种单核苷酸多态性(SNP)。
在包含Myo1a的目的基因组区中鉴定出第一个SNP后，可以鉴定与这个第一SNP连锁不平衡的其他额外SNP。I实际上，与和慢性疼痛倾向表型相关的第一SNP连锁不平衡的任何SNP都与这种特性有关。因此，一旦证实给定的SNP与慢性疼痛倾向表型之间的关联，发现与这种特性有关的其它SNP就可以是非常有意义的，以增加这个特定区域中SNP的密度。与给定SNP连锁不平衡的其它SNP的鉴定涉及：(a)从来自多个个体的包含或包围第一SNP的基因组区扩增片段；(b)鉴定含有或包围所述第一SNP的基因组区中的第二SNP；(c)进行所述第一SNP与第二SNP之间的连锁不平衡分析；以及(d)选择与所述第一标志物连锁不平衡的所述第二SNP。还考虑包含步骤(b)和(c)的子组合。这些连锁不平衡的SNP还可以用于根据本发明的方法中，并且更具体地，用于根据本发明评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法中。
引起慢性疼痛倾向表型的基因座突变可以通过比较来自呈现慢性疼痛倾向表型的患者的基因座的序列和来自参比患者的基因座的序列(如上文所定义含有SEQ ID NO:1或其功能性变体的序列)来鉴定。基于鉴定的SNP或Myo1a基因的SNP的关联，可以针对突变扫描鉴定的基因座。在一个优选实施方式中，针对突变扫描基因座的功能区如外显子和剪接位点、启动子和其他调节区等。优选地，呈现慢性疼痛倾向表型的患者携带显示与慢性疼痛倾向表型相关的突变或突变等位基因，并且参比患者不携带与慢性疼痛倾向表型相关的突变或突变等位基因。用于检测这些突变的方法通常包含以下步骤：从来自呈现慢性疼痛倾向的患者和来自参比患者的基因座的DNA样品扩增包含与慢性疼痛倾向表型相关的SNP或SNP组的目的基因座区域；对扩增的区域进行测序；比较来自呈现慢性疼痛倾向表型的患者和来自呈现参比表型的患者的Myo1a基因的DNA序列；确定对呈现慢性疼痛倾向表型的患者具有特异性的突变。
在一个特定实施方式中，评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法是一种体外方法，所述方法包含以下步骤：(a)从受试者获得Myo1a DNA、cDNA或RNA、优选DNA的测试样品，(b)使测试样品与至少一种核酸探针接触，其中所述核酸与改变的目标Myo1a核酸序列互补并且特异性杂交而形成杂交样品，其中所述改变的目标Myo1a核酸序列优选包含至少一种突变，通常是点突变，例如单核苷酸多态性(SNP)，(c)在足以使目标核酸序列与核酸探针发生特异性杂交的条件下维持杂交样品，以及(d)检测是否存在改变的目标核酸序列与核酸探针的特异性杂交，这种特异性杂交揭示受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。
本文描述的评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的大多数优选方法是对从生物样品的细胞获得的核酸进行的，所述生物样品通常是受试者的血液样品、血浆样品或血清样品。
虽然不太优选，但也可以在肌球蛋白IA多肽(例如，前蛋白和成熟蛋白)的水平上确定改变。
在本说明书中详述了特定技术的实例，所述特定技术的目的在于确定特定核酸的异常(特别是低或缺失)表达，或相应肌球蛋白IA多肽或蛋白质的异常表达。
本领域技术人员可以使用本领域的方法容易地检测核酸中改变的存在，所述方法如限制性消化、测序、选择性杂交(例如与核苷酸阵列上存在的核酸探针)和/或选择性扩增，如下文进一步说明。
还可以通过确定改变的RNA表达的存在来检测基因的改变。改变的RNA表达包括存在改变的RNA序列、存在改变的RNA剪接或加工、存在改变的RNA量等。这些改变的RNA表达可以通过本领域已知的各种技术检测，包括例如通过对RNA的全部或部分进行测序或通过所述RNA的全部或部分的选择性杂交或选择性扩增。
可以特别地通过实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)使用设计用于在目标核酸序列内杂交的探针检测目标核酸如Myo1a的异常表达的存在(参见O'Driscoll L.等人,1993和Yajima T.等人,1998)。
在另一个变体中，该方法包含检测由目的基因编码的多肽或蛋白质的改变的表达的存在。改变的多肽表达包括存在改变的多肽序列、存在改变的多肽量、存在改变的组织分布等。这些改变的多肽表达可以通过本领域已知的各种技术检测，包括例如通过测序和/或与特异性配体(如抗体)结合。
在一个特定实施方式中，本领域技术人员可以通过测量编码正常蛋白质的mRNA的细胞水平来容易地进行异常蛋白质表达的检测，与对照或标准水平相比降低的水平与异常蛋白质表达相关。
测序可以使用本领域中众所周知的技术使用自动测序仪进行。测序可以对完整的基因座进行，或更优选地对其特定域进行，通常是已知或怀疑携带有害突变或其他改变的域。
扩增基于用于引发核酸再生的互补核酸序列之间的特异性杂交体的形成。扩增可以根据本领域已知的各种技术进行，如通过聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。这些技术可以使用市售试剂和方案进行。优选的技术使用等位基因特异性PCR或PCR-SSCP。扩增通常需要使用特异性核酸引物来引发反应。适用于从目的基因座扩增序列的核酸引物能够与基因座中侧接所述基因座的目标区域的一部分特异性杂交，在倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的受试者中所述目标区域发生改变。
本发明的另一个特定目的在于一种核酸引物，所述核酸引物适用于从Myo1a基因或包括周围区域的目的基因座扩增序列。这些引物优选与基因座中的核酸序列互补并特异性杂交。特定引物能够与基因座中侧接所述基因座的目标区域的一部分特异性杂交，在倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的受试者中所述目标区域发生改变。可用于扩增包含SNP的目标区域的引物可以基于所述目标区域的序列或基于Myo1a基因的基因组序列进行设计。
本发明还涉及一种核酸引物，所述引物与在倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的某些受试者中改变的Myo1a基因座编码序列(例如基因或RNA)的一部分互补并特异性杂交。在这方面，本发明的特定引物对Myo1a基因座或RNA中的改变序列具有特异性。通过使用这些引物，扩增产物的检出指示基因座中存在改变。相反，没有扩增产物指示在所考虑的样品中不存在特定改变。
本发明还涉及如上所述和如本文所鉴定的核酸引物或核酸引物对在评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法中的用途。
杂交检测方法基于用于检测核酸序列改变的互补核酸序列之间特异性杂交体的形成。特定的检测技术涉及使用对野生型(或其功能变体)或改变的基因或相应的RNA具有特异性的核酸探针，接着检测杂交体的存在。探针可以悬浮或固定在基质或承载体上(如在核酸阵列或芯片技术中)。通常对探针进行标记来便于检测杂交体。
在这方面，本发明的一个特定实施方式包含使来自受试者的样品与对改变的Myo1a基因座具有特异性的核酸探针接触，并评估杂交体的形成。
在一个特别优选的实施方式中，所述方法包含同时使样品与一组探针接触，所述探针分别对野生型Myo1a基因座和其各种改变形式具有特异性。在这个实施方式中，可以直接检测样品基因座中各种形式的改变的存在。此外，可以同时处理来自单个受试者或来自各种受试者的各种样品。
在本发明的上下文中，探针是指一种多核苷酸序列，其与Myo1a基因或RNA(的目标部分)互补并且能够特异性杂交，并且其适用于检测与倾向于损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的基因等位基因(“突变的等位基因”)有关的突变。
探针优选与特定Myo1a基因、RNA或其目标部分完全互补。探针通常包含长度为8至1000个、如10至800个、更优选15至700个、通常20至500个核苷酸的单链核酸。应了解，也可以使用较长的探针。本发明的优选探针是长度为8至500个核苷酸的单链核酸分子，其可以与携带改变的Myo1a基因座或RNA的区域特异性杂交。
本发明的方法使用对改变(例如突变)的Myo1a基因或RNA具有特异性的核酸探针，即与所述改变的Myo1a基因或RNA特异性杂交并且基本上不与缺乏所述改变的Myo1a基因或RNA杂交的核酸探针。
特异性表明与目标序列杂交产生特异性信号，所述信号可以不同于通过非特异性杂交产生的信号。优选将完全互补的序列用来设计根据本发明的探针。然而，应了解，只要特异性信号可以不同于非特异性杂交，就可以容忍某些错配。
本发明还涉及如上所述和如本文所鉴定的核酸探针在评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法中的用途。
如上所表明，还可以通过筛选表达目的蛋白质(肌球蛋白IA)的组织的样品中Myo1a多肽序列或表达水平的改变来检测Myo1a基因座中的改变。为了检测蛋白质，可以将免疫组织化学(例如在活组织检查中)、免疫印迹(特别是蛋白质印迹)、蛋白质组学或针对目的蛋白质(肌球蛋白IA)的基于抗体的生物传感器以及本领域技术人员已知的任何其他方法施用于来自目的受试者的含有肌球蛋白IA的生物样品。
还描述了使样品与对特定核酸序列编码的肌球蛋白IA具有特异性的配体接触和确定复合物的形成。
可以使用不同类型的配体，如特异性抗体。在一个特定实施方式中，使样品与对特定核酸编码的肌球蛋白IA具有特异性的抗体接触，并确定复合物的形成。可以使用用于检测这种复合物的各种方法，如ELISA、放射免疫分析(RIA)和免疫酶分析(IEMA)。
在本发明的上下文中，抗体表示多克隆抗体、单克隆抗体以及具有基本上相同抗原特异性的其片段或衍生物。片段包括Fab、Fab'2、CDR区等。衍生物包括单链抗体、人源化抗体、多功能抗体等。对由特定基因编码的多肽具有特异性的抗体表示选择性结合所述多肽的抗体，即针对所述多肽或其含表位片段而产生的抗体。尽管可能发生对其他抗原的非特异性结合，但是与目标多肽的结合以更高的亲和力发生，并且可以可靠地区别于非特异性结合。
优选在任何外科程序之前对受试者进行评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的根据本发明的方法。
还公开了评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，所述试剂盒包含用于在来自受试者的样品中检测以下各项中存在改变的产品和试剂：Myo1a基因座或相应多肽或蛋白质；Myo1a基因或相应多肽或蛋白质表达；和/或Myo1a基因活性。
这些试剂盒包含本发明中描述的任何核酸，通常任何引物、任何引物对和/或任何核酸探针(野生型和突变体)；任何配体，优选抗体；和/或包含固定在承载体上的这种(这些)核酸和/或配体的任何装置。本文描述的试剂盒还可以包含用于进行杂交、扩增或抗原-抗体免疫反应的试剂和/或方案。这些试剂盒还可以包含用于本文所述方法并通过定量PCR或多重技术读取的微阵列。特定装置包含固定在承载体上的至少一种互补核酸，优选数种互补核酸，所述互补核酸结合Myo1a基因或Myo1a基因座的全部或部分。
特定试剂盒，通常是用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，是如下试剂盒：
-用于对从受试者生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的试剂盒，其中所述试剂盒包含核酸序列，通常是寡核苷酸，例如引物或引物对；
-检测受试者的生物样品、通常是血液样品中受试者的Myo1a基因的异常/改变的表达的试剂盒，该试剂盒包含(i)至少一个引物对，(ii)至少一种标记/可检测的(例如荧光)探针，例如两种不同的探针，其允许定量检测Myo1a的表达，以及(iii)提供对应于对照群体中Myo1a的对照定量表达值的活页；以及
-检测受试者的生物样品、通常是血液样品中受试者的Myo1a基因的异常/改变的表达的试剂盒，该试剂盒包含(i)至少一个引物对，(ii)至少两种不同标记的探针，第一种探针识别野生型等位基因，并且第二种探针识别Myo1a的突变等位基因。
当受试者不表达或异常表达肌球蛋白Ia，即不充分表达肌球蛋白Ia或表达非功能性肌球蛋白IA时，发明人在本文中表明必须对受试者使用“适应性疼痛治疗”来预防或治疗疼痛。实际上，发明人已经发现，一旦在所述受试者中形成了损伤诱导的慢性疼痛，所述疼痛就不能用生物碱，特别是GABAA-R激动剂如蝇蕈醇逆转，并且变得不可逆。
在本发明的上下文中，术语“治疗”受试者的疼痛表示在使用或施用根据本发明的合适化合物或组合物后，延迟、稳定、治疗、治愈、减轻、缓解、改变、改进、改善、补救或影响如本文所述的受试者的任何形式的疼痛，或与疼痛有关的任何疾病或病状(特别是与疼痛有关的任何炎性或神经性病症)或这种疾病或病状的任何症状。术语“治疗”还指疼痛(可以与任何损伤、病理或病状有关)治疗成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，如减轻、缓解、减缓进展或严重程度、稳定、去除疼痛症状或使其更能被受试者耐受。术语“治疗”疼痛还包括提高疼痛耐受性和/或减少感知的疼痛。在特定的实施方式中，本发明的方法、化合物和组合物用于提高疼痛耐受性和/或用于减少感知的疼痛。如本文所用，术语“疼痛耐受性”是指受试者在情绪和/或身体上崩溃之前可以感知和承受的疼痛量。疼痛耐受性与疼痛阈值(产生疼痛所需的最小刺激)不同。如本文所用，“提高疼痛耐受性”通常是指如下情形，其中与先前状态相比，例如在向受试者施用合适化合物或组合物后，受试者可以产生更高的疼痛耐受性(即，感知的疼痛更少)。
在本发明的上下文中，与受试者的疼痛相关的“预防”是指在使用或施用根据本发明的合适化合物或组合物后，至少降低受试者获得任何类型疼痛的风险的可能性(或易感性)。例如，“预防”包括使疼痛、通常慢性疼痛的至少一种临床症状不在受试者中、通常鉴定为倾向于产生慢性疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛但尚未经历或呈现出疼痛症状的受试者中产生。
根据本发明的适应性疼痛治疗通常涉及外源性供应，例如向受试者施用编码Myo1a的核酸序列(通常是DNA或mRNA)和/或肌球蛋白1a蛋白的激动剂。施用可以是例如鞘内(i.t.)施用。
因此，本发明的一个目的涉及编码Myo1a的核酸序列(通常是DNA或mRNA)和/或肌球蛋白1a蛋白的激动剂，其中Myo1a是功能性Myo1a，所述核酸序列或激动剂用于预防或治疗本文所定义的受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
在本发明中，术语“肌球蛋白1a蛋白的激动剂”用于表示能够活化或刺激野生型肌球蛋白IA蛋白的生物学功能或恢复功能改变的肌球蛋白IA蛋白的功能的任何蛋白质。这种激动剂可以是天然或重组蛋白质或蛋白质片段，所述重组蛋白质或蛋白质片段展现相应野生型蛋白质的特性，特别是能够活化或刺激野生型肌球蛋白IA蛋白的生物学功能或恢复功能改变的肌球蛋白IA蛋白的功能。
本发明还涉及编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或肌球蛋白1a蛋白的激动剂的用途，其中Myo1a是功能性Myo1a，，所述DNA、mRNA或激动剂用于制备组合物，通常是药物组合物，用于预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
本发明还涉及一种包含编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或肌球蛋白1a蛋白的激动剂以及药学上可接受的载体或承载体的组合物，通常是用于预防或治疗受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的组合物。
可用于所有本发明的适当的赋形剂、稀释剂或载体可选自例如盐水、等渗、无菌或缓冲溶液等。它们还可以包含稳定剂、甜味剂和/或表面活性剂等。它们可以通过使用盖伦医学(galenic)本身已知的技术以安瓿、烧瓶、片剂或胶囊的形式配制。
本发明还涉及一种预防或治疗疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的方法，所述方法包含向有需要的受试者、通常是哺乳动物、特别是人类施用至少一种选自前述产品的化合物。
需要治疗或预防的受试者是已经根据上述方法测试并且鉴定为倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的受试者。
本发明还提供：
-一种用于筛选或选择能够预防受试者的急性疼痛转变为慢性疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛发生的化合物的体外、体内或离体方法，其中所述受试者被鉴定为倾向于产生这种疼痛，所述方法包含在测试化合物存在下评估特定细胞、组织或动物模型的Myo1a表达的步骤，其中与未暴露于测试化合物或未与测试化合物接触的对照细胞、组织或动物模型相比，特定细胞、组织或动物模型的功能性Myo1a的表达增加指示所述化合物具有预防受试者的急性疼痛转变为慢性疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛发生的能力，其中所述受试者被鉴定为倾向于产生这种疼痛；
-一种用于筛选可用于预防或治疗受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的化合物的体外、体内或离体方法，其中所述受试者具有改变的Myo1a核酸、改变的Myo1a核酸表达或相应肌球蛋白IA蛋白的改变/异常的表达或活性，所述方法包含体外、体内或离体确定测试化合物的下述能力：(i)恢复所述改变或异常的肌球蛋白IA蛋白的功能性表达、(ii)诱导或增加所述蛋白质的表达或活性或(iii)诱导或增加所述蛋白质的激动性配体的表达或活性；
-一种Myo1a调节剂的体外、体内或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达和/或生物学功能的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂(活化剂)，并潜在地作为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂(抑制剂)；以及
-一种用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物的体外或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂，并作为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂。
在本发明的上下文中，可以使用利用本文所述的筛选方法之一鉴定的化合物来预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
在本文中，发明人还描述了第一动物模型，即Myo1a KO(Myo1a-/-)小鼠，其中功能丧失突变引起损伤后不可逆的疼痛病状。这种小鼠模型描述于Tyska等人(2005年)中。
因此本发明的一个目的涉及这种Myo1a KO(Myo1a-/-)动物模型用于筛选Myo1a调节剂和/或筛选用于预防、减少或抑制疼痛的药物的用途。
这种模型可用于设计适当的药理学疗法来预防慢性疼痛的发作和形成。
这种模型还可以用作实验室工具来用于研究中以深入了解触发急性疼痛向慢性疼痛转变的细胞和分子机制。
本发明的其他特征和优点在以下实验部分(参考图1-8和表1-4)中给出，所述实验部分应被视为说明性的而非限制本申请的范畴。
附图说明
图1.LTMR富含的Myo1a的缺失将损伤诱导的急性机械性疼痛转变为慢性疼痛。
(A-C)成年腰背根神经节(DRG)中表达Myo1a的神经元的表征。使用Myo1a反义探针(红色)进行ISH，然后用抗GINIP(蓝色)抗体和IB4(绿色)(A)或抗Ret抗体(蓝色)(C)双重免疫标记。(B)使用Myo1a(红色)和TrkB反义探针(绿色)进行双重ISH。比例尺：100μm。
(D-E)在E15和新生(P0)DRG和SC组织中通过ISH进行的Myo1a表达分析(红色)。比例尺：50μm(D)和100μm(E)。
(F)使用Myo1a探针(白色，左图)或不使用探针(右图)对成年SC组织进行的ISH。虚线区域界定SC的板层I-IIo。
(G)成年DRG和SC中Myo1a转录物的定量(相对于β-肌动蛋白)。数据代表3次独立实验的平均值±SEM。
(H-J)角叉菜胶诱导的发炎(对于WT，n＝11，并且对于KO，n＝13)(H)、CCI手术(对于WT，n＝9，并且对于KO，n＝10)(I)和爪切割手术(对于WT，n＝10，并且对于KO，n＝10)(J)后WT和KO小鼠的机械反应。对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。(还参见图5-7)。
图2.蝇蕈醇和地西泮介导的镇痛作用在Myo1a KO小鼠中减弱。
(A-D)SNI手术并且在指定时间点鞘内施用10nmol SNC80、0.2nmol DAMGO(A)、0.1μg巴氯芬、2μg TAFA4(每种基因型n＝6只小鼠)(B)、40μg牛磺酸、腹膜内施用3mg/kg普瑞巴林(每种基因型n＝8只小鼠)(C)和鞘内施用0.15μg蝇蕈醇(每种基因型n＝8只小鼠)(D)后的WT和KO小鼠的机械反应。
(E-G)酵母聚糖诱导的发炎(每种基因型n＝9只小鼠)(E)并且在指定时间点鞘内施用0.15μg蝇蕈醇、10nmol SNC80(每种基因型n＝9只小鼠)(F)和0.09mg/kg DZP(G)(每种基因型n＝7只小鼠)后的WT和KO小鼠的机械反应。对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns：不显著)。
图3.来自WT和Myo1a KO小鼠的DRG和SC组织的转录分析揭示Gabra2表达增加。
(A)呈现KO小鼠相对于WT的DRG(97个差异表达(DE)基因)和SC(31个DE基因)神经元中DE基因的数量(5％错误发现率)的Venn图。仅在DRG中差异表达的基因以红色呈现(84个基因)，仅在SC中差异表达的基因以蓝色呈现(18个基因)或在DRG和SC神经元两者中表达的基因以黄色呈现(13个基因)。
(B)DRG和SC神经元两者中的DE基因的热图表示，其中显示表达增加的基因以红色显示，而那些显示表达降低的基因以绿色显示。比例表示相对于WT的在KO小鼠中观察到的表达的Log2倍数变化。
(C)来自WT和KO小鼠的DRG和SC组织中Wdfy1、Gabra2和Nnt转录物的定量。数据表示KO相对于WT的平均倍数变化±SEM(n＝3次独立实验)。
(D)来自WT(左)和KO(右)小鼠的L5DRG(上图)和腰SC(下图)中通过ISH评估的Gabra2转录物表达(红色)。比例尺：100μm。
(E)显示来自WT(左)和KO(右)小鼠的腰SC的背角中的GABRA2蛋白表达(绿色)的免疫染色。比例尺：50μm。
(F)来自WT和KO小鼠的SC的板层I-III中GABRA2免疫荧光强度的定量。数据表示KO相对于WT的平均倍数变化±SEM(n＝3次独立实验)。
(G)显示WT(左)和KO(右)小鼠的腰SC背角中的GABRA1蛋白表达(红色)的免疫染色。比例尺：50μm。(还参见表1-4)。
图4：蝇蕈醇诱导的EPSC频率增加在酵母聚糖发炎后的Myo1aKO小鼠中丧失。
(A)在解离的C-LTMR中蝇蕈醇诱导的电流(Musc)的全细胞记录的代表性迹线。
(B)来自WT：Tafa4+/Venus和KO：Tafa4+/Venus小鼠的C-LTMR中记录的浴施指定剂量Musc后的电流幅度(平均值±SEM)。在直方图上指明记录的细胞数。
(C-F)原初的(C-D)和酵母聚糖发炎的WT和KO小鼠(E-F)中Musc施用后，板层II中间神经元中的自发EPSC的全细胞记录。
左图：在ACSF下(黑色迹线)、表面灌注5μM Musc之后(蓝色迹线)和洗涤期间(棕色迹线)获得的EPSC的代表性迹线。
中图：左图中显示的实验的EPSC间隔(秒)的累积分布。注意到Musc/蓝色曲线向左移动(C、D、E中图)，指示EPSC频率可逆增加。
右图：在ACSF下、表面灌注5μM Musc和洗涤期间的归一化EPSC频率(平均值±SEM)。注意到在来自酵母聚糖发炎小鼠的切片中Musc无效。右图中指明记录的细胞数(*p<0.05；**p<0.01；ns：不显著)。(还参见图8)。
图5：成年DRG神经元存活、规格、中枢和外周神经支配在MYO1A缺失时不受损害。
(A-B)来自WT和KO小鼠的成年腰L4 DRG切片上实现的总PGP9.5+(A)和指示的子集(B)的细胞计数。数据表示三次独立实验的平均绝对值(A)或PGP9.5神经元的平均值％(B)±SEM。基因型之间没有观察到统计学显著差异。
(C-E)Myo1a KO小鼠中保留了SC的感觉神经元神经支配。
用抗CGRP(红色，C)、GINIP(蓝色C-E)、IB4(绿色，D)和抗PKCγ(红色，E)对来自WT(上图)和KO(下图)小鼠的SC横向切片进行的免疫染色。比例尺：100μm。
(F-G)Myo1a KO小鼠中保留了毛皮的感觉神经元神经支配。
用抗PGP9.5(红色，F)和抗S100(红色，G)对来自WT(上图)和KO(下图)小鼠的毛皮切片进行的免疫染色。比例尺：PGP9.5和S100显示毛皮神经支配：50μm。PGP9.5显示表皮神经支配：15μm。(与图1相关)。
图6：在缺失MYO1A的情况下保留了C-LTMR和Aδ-LTMR电生理学特性。
(A-D)C-LTMR的电生理学特性。
(A-B)图表显示了WT和KO C-LTMR的电容和静息膜电位。
(C)说明WT和KO C-LTMR对去极化电流脉冲(50pA，1000ms)的反应的代表性迹线。
(D)该图表示通过对WT(黑色)和KO C-LTMR(灰色)进行具有增加幅度的去极化电流步骤(Δ10pA，1000ms)引起的动作电位(AP)的数值。
(E-I)Aδ-LTMR的电生理学特性。
WT和KO Aδ-LTMR的细胞电容(上图)和静息膜电位(下图)如E中所示。通过去极化(F-G上图)或超极化(F-G下图)电流注入(分别为1000ms，Δ0.1nA或Δ-0.1nA)引起AP。(F)该图显示了对于WT(黑色)和KO(红色)Aδ-LTMR获得的代表性迹线。(G)曲线分别表示在去极化电流注入期间(上图)或超极化电流注入之后(下图)AP发放随注入电流变化的概率。在超极化脉冲终止时观察到的AP回弹是Aδ-LTMR的特征。
(H)通过在-60mV的保持电位下对体细胞进行递增的机械刺激在WT(黑色)和KO(红色)Aδ-LTMR中引发代表性机械活化(MA)电流。
(I)将峰值幅度(I峰值)归一化，获得电流/探针位移曲线。曲线显示归一化的峰值电流(I峰值)随探针位移的变化。
WT和KO Aδ-LTMR之间的平均归一化幅度没有变化。
C-LTMR和Aδ-LTMR中的基因型之间没有观察到统计学显著差异。数据表示为平均值±SEM。(与图1相关)。
图7：原初Myo1a KO小鼠和Myo1a+/-小鼠的行为表征以及损伤后的热和机械超敏反应。
WT和KO在旷场(A)和旋转杆(B：时间和C：速度)测试中的行为。对爪冷却(D：丙酮测试)和有害热(E：热板测试)的热敏感性显示基因型之间没有差异。
(F)该图说明福尔马林测试中的WT和KO小鼠疼痛行为。直方图表示第1阶段和第2阶段期间的反应持续时间。注意到在这个测试中KO小鼠展现增加的反应持续时间(***p<0.001)。
(G-H)在Hargreaves测试中测定角叉菜胶诱导发炎(G)和爪切割手术(H)之后WT和KO小鼠的热超敏反应(***p<0.001，ns：不显著)。
(I)角叉菜胶诱导发炎后WT、Myo1a+/-和KO小鼠的机械反应(***p<0.001，Myo1a+/-相对于WT)。
(J)鞘内注射荷包牡丹碱(0.01μg，10μL)后WT和KO小鼠的机械反应(ns：不显著)。
对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现。(与图1相关)。
图8：Myo1a KO原初或发炎小鼠中SC板层II神经元被动、主动和突触特性的电生理学表征。
(A-F)这些图表示在原初情形下以及在角叉菜胶(Carra.)和酵母聚糖(Zymo.)诱导的发炎下，来自WT和KO小鼠的SC板层II中间神经元的平均膜电位(A)、膜电阻(B)、电容(C)、响应于-25pA超极化脉冲的垂跨(Sag)比(D)、响应于-25电流脉冲的回弹AP的数值(E)和响应于+25pA电流脉冲的AP的数值(F)。记录的细胞的数量：原初：16个WT和26个KO，Carra.：29个WT和23个KO，以及Zymo.：10个WT和12个KO。
(G)该图说明了在原初情形下以及在Carra.和Zymo诱导的发炎下WT和KO小鼠的SC板层II中间神经元中记录的成对脉冲比。记录的细胞的数量：原初：19个WT和33个KO，Carra.：9个WT和13个KO，以及Zymo.：9个WT和9个KO。
对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现。基因型之间没有观察到显著差异。(与图4相关)。
图1A、B、C、D、E、图3D、E、G和图5C、D、E、F、G各自显示两次(相同的图片显示具有不同对比度的颜色)。
实验部分
材料与方法
小鼠
将小鼠饲养在标准的居住条件(23℃，40％湿度，12h光照循环，并且自由获取食物和水)下。尽量使本研究中使用的小鼠的数量以及应激和痛苦达最小。所有方案均符合欧盟关于动物实验的建议。
Myo1a KO小鼠根据Tyska等人,2005(Tyska等人,2005)产生。室内培育对照野生型(WT)C57BL/6小鼠。分别通过将WT和Myo1a KO小鼠与Tafa4Venus/Venus(Delfini等人,2013)和Myo1a+/-：Tafa4+/Venus小鼠杂交产生WT：Tafa4+/Venus和Myo1a KO：Tafa4+/Venus小鼠。
组织学
为了获得用于原位杂交(ISH)和免疫染色的成年背根神经节(DRG)和脊髓(SC)样本，用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物深度麻醉小鼠，接着用冰冷的4％多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液中的溶液(4％PFA)经心灌注。将组织在冰冷的4％PFA中进一步固定24h。将新生P0小鼠牺牲，在冰冷的PBS中快速洗涤，取出内脏并在冰冷的4％PFA中固定24h。将E15胚胎收集在冰冷的PBS中并在冰冷的4％PFA中固定24h。切除成年背部毛皮并在冰冷的4％PFA中固定2h。对于GABRA1和GABRA2免疫染色，快速解剖腰SC(L1-L3)并在冰冷的4％PFA中固定30min。将样本转移到30％(w/v)蔗糖溶液中进行冷冻保护，接着在OCT封固介质中冷冻。使用标准低温恒温器(Leica)获得12μm冷冻切片(DRG)和18-20μm冷冻切片(SC、E15和P0)。
原位杂交
使用来自成年小鼠DRG的基因特异性PCR引物和cDNA模板合成地高辛(Digoxigenin)标记的Myo1a和Gabra2反义探针和荧光素标记的TrkB探针，并如(Reynders等人,2015)中所述进行原位杂交或双原位杂交。用于探针合成的引物如下所列：
Myo1a F1：GAAAATACTTCCGGTCAGGTG
Myo1a R1：CAAGGGTTCTTCATCTCTGAGT
Myo1a F2：TACCAGTGGAAGTGCAAGAAGT
Myo1a R2+T7：
TAATACGACTCACTATAGGGACACTACGAAGTTCTGCTCCAG
Gabra2 F1/F2：ACTTGGTTACTTTTGGGCTGT
Gabra2 R1：TGATTGAAGTGAGCTGAAAGGT
Gabra2 R2+T7：
TAATACGACTCACTATAGGGAACATCCTTTCATGGTGACTCA
TrkB-F1：CTGAGAGGGCCAGTCACTTC,
TrkB-R1：CATGGCAGGTCAACAAGCTA,
TrkB-F2：CAGTGGGTCTCAGCACAGAA,
TrkB-R2+T7：
TAATACGACTCACTATAGGGCTAGGACCAGGATGGCTCTG。
免疫染色
用以下试剂进行免疫染色：大鼠抗GINIP(1:500，Moqrich laboratory)、山羊抗Ret(1:500，R&D Systems)、兔抗TrkA(1:1000，来自University of California，Dr.L.Reichardt的慷慨赠予)、山羊抗TrkC(1:500，R&D Systems)、兔抗CGRP(1:1000，ImmunoStar)、兔抗PKCγ(1:500，Santa Cruz)、兔抗PGP9.5(1:200，Thermo Scientific)、兔抗S100(1:1000，Darko)、兔抗GABRA2(1:2000，Synaptic Systems)和豚鼠抗GABRA1(1:1000，Synaptic Systems)。用来自Invitrogen的Alexa Fluor 488结合的IB4进行IB4标记。用ImmuMount(Thermo Scientific)封固载玻片，接着在AxioImager Z1(Zeiss)荧光显微镜下观察。使用Photoshop软件调节对比度。
为了比较WT与Myo1a KO之间的Gabra2表达，使用相同的曝光参数获取图像，并且相同地调节对比度。
为进行SC和皮肤神经支配以及GABRA染色，使用LSM-780共焦显微镜(Zeiss)进行图像获取，并且在WT与Myo1a KO样本之间考虑相同的针孔孔径、激光强度以及增益参数。
细胞计数和统计分析
如在Gaillard等人,2014中所述，在来自成年WT和Myo1a KO小鼠的腰L4 DRG上计数DRG神经元的总数和子集。简言之，将L4 DRG的12μm连续切片分布在6个载玻片上，对所述载玻片使用不同的标志物，包括泛神经元标志物PGP9.5。这种方法允许我们将所有计数称为神经元(PGP9.5)的总数。对于每种基因型，进行三次独立实验。数据以平均值±平均标准误差(SEM)的形式呈现。
GABRA2荧光强度
使用ImageJ软件在WT和Myo1a KO SC切片的板层I-III中测定与GABRA2表达有关的每平方毫米荧光强度(目的区域中像素的平均荧光)。对于每种基因型，进行三次独立实验并分析5-10个SC切片，并计算Myo1a KO相对于WT样本的荧光强度的倍数变化。
药物
将SNC80(Tocris Bioscience)溶解于100mM HCl溶液中，将DAMGO(SigmaAldrich)溶解于盐水(0.9％NaCl)中，将巴氯芬(Baclofen)(Sigma Aldrich)溶解于H2O(pH7.6)中，将重组人类TAFA4(R&DSystems)溶解于盐水中，将地西泮(Diazepam)(DZP，Roche)溶解于10％二甲亚砜(DMSO)/90％盐水中，将蝇蕈醇(Tocris Bioscience)、牛磺酸(Taurine)(Sigma Aldrich)、荷包牡丹碱(Bicuculline)(Sigma Aldrich)和普瑞巴林(Pregabalin)(Sigma Aldrich)溶解于磷酸盐缓冲液(PB，50mM，pH7.4)中。
除普瑞巴林外，所有药物均通过鞘内(i.t)注射施用。剂量如图例所示。腹膜内注射普瑞巴林(i.p)。在药物施用后30min至6h记录对机械刺激的反应，如图例中所示。
行为测试和统计分析
对8-12周龄的Myo1a KO和WT雄性进行所有行为分析。所有实验均在室温(约22℃)下进行。在所有实验之前，使动物适应其测试环境一小时。实验者在测试期间不清楚小鼠的基因型。测试动物的数量如图例部分所示。所有误差线表示SEM。依序使用双向重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验进行所有统计分析。如Gaillard等人,2014(Gaillard等人,2014)中所述进行旷场、旋转杆、热板和福尔马林测试。
丙酮测试
使用丙酮液滴蒸发分析(Hulse等人,2012)来评估原初小鼠对无害皮肤冷却的敏感性。使用1ml注射器在左后爪上施加一滴丙酮。在丙酮施用后立即记录退缩/疼痛样行为的持续时间(秒)，总共持续2分钟。将测试重复两次并计算退缩/疼痛行为的平均持续时间。
热超敏反应
如Gaillard等人,2014所述，使用Hargreaves测试，在角叉菜胶发炎之前和之后以及在爪切割手术之后测定后爪热超敏反应。对于角叉菜胶炎性疼痛模型，在从发炎后一天开始直至60天的数个时间点(见图例)进行测试。对于爪切割疼痛模型，在从发炎后一天开始直至30天的数个时间点(见图例)进行测试。
机械阈值
如前述(Gaillard等人,2014)，在发炎、神经病和爪切割手术之前和之后的数个时间点，使用Von Frey线用上下方法(Chaplan等人,1994)确定足底表面的机械阈值。
损伤诱导的疼痛模型
角叉菜胶和酵母聚糖-A诱导的发炎
使用30G针式注射器将20μl含有1％角叉菜胶的H2O溶液(重量/体积，Sigma)或20μl含有0.06mg酵母聚糖-A在0.9％NaCl中的溶液(重量/体积，Sigma)皮下注射到左后爪足底侧。
对于角叉菜胶诱导的发炎，在发炎之前和从发炎后1小时开始直至60天的数个时间点(见图例)测定机械阈值。对于酵母聚糖发炎，在注射之前、在第1天和直至第60天的数个时间点(见图例)测量机械阈值。此外，在发炎之前，在药物施用之前和之后的第1天和第2天测量酵母聚糖模型中的机械阈值。
慢性压迫性损伤(CCI)
在氯胺酮/甲苯噻嗪(xylasin)麻醉的小鼠中，通过使用单丝(monocryl)可再吸收缝合线(6-0，Ethicon,Piscataway,NJ,USA)在总坐骨神经周围进行三个松散束缚的结扎(间距约1mm)(Bennett和Xie,1988)来诱导单侧外周单神经病。将神经压迫到仅仅可辨别的程度，以使得通过神经外膜脉管系统的循环不会中断。手术后，使动物在温暖的室内恢复，然后使它们返回其居住的笼。在CCI之前和在从手术后3天开始直至60天的数个时间点(见图例)测量机械阈值。
爪切割
如Brennan(1999)中所述进行爪切割疼痛模型。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，并且从与后跟的近端边缘相距2-5mm开始，对右后爪的足底面进行5mm纵向切割。然后用镊子小心地抬高足底肌肉并用刀片纵向切割，同时保持肌肉的起源完整。使用6.0丝单丝线(Ethicon,Piscataway,NJ,USA)用一种水平褥式缝合法闭合伤口，并用必妥碘(betadine)软膏覆盖伤口部位。手术后，使动物在温暖的室内恢复，然后使其返回其居住的笼。在手术之前和手术之后从损伤后6小时开始直至60天(见图例)测定机械阈值。
选择性神经损伤(SNI)
如(Shields等人,2003)所述进行选择性神经损伤手术。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，并在坐骨神经三根分叉部的水平上穿过皮肤和大腿肌肉切开。使用6.0丝线(Ethicon,Piscataway,NJ,USA)结扎总腓肠和腓骨神经并横切，同时保持胫神经完整。手术后，使动物在温暖的室内恢复，然后使它们返回其居住的笼。在手术后第7、9和14天，在药物施用之前和之后测定机械阈值。
RNA提取
用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物对小鼠进行深度麻醉，并用5-10mL RNA Later(Qiagen)经心灌注。快速解剖L3至L5DRG和SC，并根据制造商的说明使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)提取RNA。为了质量控制，将RNA负载到RNA NanoChip(Agilent)上并用2100生物分析系统(Agilent technology)加工。
高通量测序和分析
从来自2-3只小鼠中的每一只的实验重复样中提取WT和Myo1a KO DRG和SC RNA。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina)制备RNA-seq库。使用Agilent DNA 1000芯片验证所有库的浓度和片段大小。在HiSeq 2000(Illumina)上进行测序，使用RTA(Illumina)进行碱基调用，并使用FastQC(FASTQC，2010)和RSeQC进行质量控制(Wang等人,2012)。使用Subread(Liao等人,2013)(C版本1.4.6-p2)使用默认值将序列唯一地映射到mm10基因组。使用featureCounts(Liao等人,2014)(C版本1.4.6-p2)计数映射到基因外显子(GRCm38.p4基因组装)的读序。使用DESeq2 BioConductor R包(Love等人,2014)，使用5％错误发现率(FDR)截止值，使用来自生物学重复样的外显子计数进行差异基因表达。
qRT-PCR
使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)将从每个样品获得的RNA转变为cDNA。使用qPCR Sybr-Green主混合物(ThermoFisher)通过定量PCR(qPCR)评估基因表达。样品在StepOne qPCR仪器(Applied Biosystems)上运行40个循环。编码每个基因的转录物的相对量通过使用标准ΔCt或ΔΔCt方法归一化至β-肌动蛋白来确定。
所有实验一式三份地进行，并且数据表示Myo1a KO相对于WT的转录物表达水平的倍数变化(平均值±SEM)。用于qPCR的引物序列为：
Myo1a F：CTACGAGCAGCTTCCCATCT
Myo1a R：CCACATTTGCCAAAGCATAG
Gabra2 F：ACAAAAAGAGGATGGGCTTG
Gabra2 R：TCATGACGGAGCCTTTCTCT
Wfdy1 F：AAAGGCCGGACACTCCTC
Wdfy1 R：TGAGCTGCAGGTAGCACAGT
Nnt F：CCTGGTGGCACCTTCGTA
Nnt R：CTGAGCCCAGGTACATGATTT
DRG神经元分离和培养
将成年WT、Myo1a KO、WT：Tafa4+/Venus和Myo1a KO：Tafa4+/Venus小鼠深度麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪)，并快速解剖DRG，收集在冰冷的HBSS-glu(HBSS 1×(Gibco)、0.1M D-葡萄糖(Sigma)、50mM HEPES(Gibco)，ph7.4)中，并且使用2mg/ml 1型胶原酶(Gibco)和5mg/ml分散酶(均来自Gibco)在37℃下进行两次酶消化，每次20min。将DRG用HBSS-glu洗涤两次并再悬浮于NBc培养基(NBc:Neurobasal(Gibco)、1％(v/v)B27(Gibco)、1000U/ml青霉素(Invitrogen)、1000μg/ml链霉素(Invitrogen))中。通过穿过直径减小的3个针头(规格18、21、26)获得单细胞悬浮液。将细胞涂布在聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养皿上，并在37℃下保持1-2小时，然后添加10ng/ml神经营养蛋白4(NT4，Peprotech)和2ng/ml来源于神经胶质细胞系的神经营养因子(GDNF，Invitrogen)。通过活Venus荧光鉴定C-LTMR，并且由于其“玫瑰花结”样形态而鉴定出Ad-LTMR(Dubreuil等人,2004)。在涂布后18-30h进行膜片钳记录。
培养的DRG的电生理学
使用Axopatch 200B放大器进行电生理学记录。通过pCLAMP 10.5(MolecularDevices)分析数据。
C-LTMR和Aδ-LTMR的全细胞记录
用1至2MΩ移液管进行培养的C-LTMR的膜片钳记录，所述移液管填充有基于KCl的溶液，该溶液含有(以mM计)：134KCl、1MgCl2、4.8CaCl2、10HEPES、4Mg-ATP、0.4Na-GTP和10EGTA(pH 7.3)。用1至3MΩ移液管进行培养的Aδ-LTMR的膜片钳记录，所述移液管填充有基于KCl的溶液，该溶液含有(以mM计)：105天冬氨酸钾、10NaCl、27KCl、4Mg-ATP、0.4Na-GTP、5磷酸肌酸(钠盐)、1CaCl2、10EGTA、1MgCl2、10HEPES(用KOH调节到pH 7.2，≈329mOsm)。
使用含有以下(以mM计)的标准外部溶液以2-3ml/min的流速灌注神经元：140NaCl、4KCl、2MgCl2、2CaCl2、10HEPES和10葡萄糖(pH 7.4)。
在水中制备GABAA受体激动剂蝇蕈醇(Tocris Bioscience)的储备溶液，并以所要浓度溶解在外部溶液中。在浴槽中施用蝇蕈醇10s。
机械活化的电流
使用连接到压电致动器(Step Driver PZ-150M；Burleigh)的密封火抛光玻璃微量移液管实现机械刺激，该微量移液管与水平方向成45度角安置并用作机械探针。通过pClamp软件(Molecular Devices)驱动探针朝向细胞的向下移动。使用对于Aδ-LTMR的整个膜片钳记录相同的溶液，在-60mV的保持电位下记录电压钳制的机械活化电流。机械刺激的基线定义为诱导机械活化的电流的探针位移的距离(μm)减去0.5μm。
来自连有背根的脊髓切片的全细胞膜片钳记录
制备来自幼年(P24至P45)Myo1a KO和WT小鼠的连有背根的横向脊髓切片来进行全细胞记录。简言之，使用戊巴比妥(Pentobarbital)(200mg/kg)麻醉动物，用冰冷的含氧低钙人造脑脊液(ACSF；以mM计:NaCl 101；KCl 3.8；MgCl2 18.7,MgSO4 1.3；KH2PO4 1.2；HEPES 10；CaCl2 1；葡萄糖1)灌注，然后斩首。迅速去除脊柱和周围的肌肉并浸入冰冷的含氧ACSF中。椎板切除术后，轻轻地去除脊髓并将其腰部放入小的3％琼脂糖块中。使用LeicaVTS1000振动切片机切割脊髓切片(300μm厚)，并转移到用95％O2-5％CO2平衡至少1小时的温热(31℃)ACSF(以mM计：NaCl 130.5；KCl 2.4；CaCl2 2.4；NaHCO3 19.5；MgSO4 1.3；KH2PO4 1.2；HEPES 1.25；葡萄糖10；pH 7.4)中，接着开始膜片钳记录。将脊髓切片置于用温热(31℃)ACSF洗涤的记录室中。使用多钳2B(Molecular devices)在Olympus BX51显微镜的控制下进行电生理学测量。用基于C的移液管溶液(以mM计：甲烷磺酸铯120；CsCl 20；CaCl2 0.1；MgCl2 1.3；EGTA 1；HEPES 10；GTP 0.1；cAMP 0.2；亮抑酶肽0.1；Na2ATP 3；D-甘露醇77；pH 7.3)填充膜片移液管(7-11Ω)。使用连接到Master 8(A.M.P.InstrumentLtd)刺激器的玻璃抽吸电极刺激背根。通常，使用一对高持续时间(500μs)高强度刺激(350μA)来募集记录的切片中的大多数初级传入纤维。所有药物都购自Sigma。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估每个细胞的EPSC频率的统计学比较。
结果
损伤诱导的急性机械性疼痛在Myo1a KO小鼠中转变为慢性疼痛。
在最近的一项研究中，发明人鉴定在成年C-LTMR中富含大量Myo1a(Reynders等人,2015)。共表达分析显示，Myo1a确实在GINIP+/IB4-C-LTMR中表达(图1A)，但其表达也发生在由TrkB标记的AδLTMR和AβRet+LTMR的子集中(图1B和1C)，并且完全排除于肽能TrkA+和本体感受性TrkC+神经元(数据未显示)。在发育水平，Myo1a在E15的大DRG神经元的子集中表达(图1D)，并且其表达在出生时延伸至大多数DRG神经元(图1E)。通过原位杂交和q-RT-PCR证实，发育过程和成年的SC中的Myo1a的表达水平几乎检测不到(图1D-G)。
为了深入了解MYO1A在感觉生理学中的作用，发明人试图分析Myo1a KO小鼠(Tyska等人,2005)。这些小鼠是活的，可育的，并且大多数描述的波动与高度表达这种非典型肌球蛋白的肠道生物学有关(Kravtsov等人,2012；Mazzolini等人,2012)。然而，对于MYO1A在体感系统中的作用一无所知。
为了测试MYO1A的缺失是否改变DRG神经元的发育，发明人进行了一系列定量和定性分析。他们发现WT和Myo1a KO小鼠之间腰DRG神经元的总数或TrkA+、TrkB+、TrkC+、Ret+和TH+神经元的数量没有差异(图5A和5B)。在解剖学水平上，SC切片的双重和三重染色实验显示，肽能CGRP+和非肽能GINIP+传入物的子集在SC的背角中呈现其各自板层的正常中心投影(图5C-E)。在外周，PGP9.5和S100染色揭示了所有DRG神经元和支配毛囊的(hairfollicles-innervating)LTMR的正常外周目标神经支配(图5F和1G)。最后，为了测试MYO1A的缺失是否影响DRG神经元的神经元兴奋性，发明人对培养的C-LTMR和D-毛发Aδ机械感受器进行了膜片钳记录。通过将Myo1aKO小鼠与Tafa4Venus小鼠杂交来观察C-LTMR，并通过其玫瑰花结样形状鉴定D-毛发神经元。在两种类型的神经元中，两种基因型在被动和内在电特性方面没有差异(图6A-G)。此外，他们发现从WT和Myo1aKO小鼠培养的D-毛发神经元对压电驱动的机械刺激的敏感性没有差异(图6H和6I)。这些数据一起展示MYO1A对于DRG神经元的存活、分子成熟、解剖组织和电生理学特性是非必要的。
为了深入了解MYO1A在体感中的作用，发明人在急性和损伤病状下对Myo1a KO小鼠进行了大量的体感测试。Myo1a KO小鼠在旷场和旋转杆测试中具有正常行为(图7A-C)，它们在热板测试中感知有害热刺激的能力没有差异，并且对丙酮测试呈现正常反应(图7D和7E)。接着他们测试了他们的小鼠在急性和3种不同病理学病状下的机械敏感性：角叉菜胶诱导的发炎、慢性压迫性损伤模型(CCI)(Bennett和Xie,1988)和Brennan测试(Brennan,1999)。在基础条件下和损伤后的数个时间点使用上下方法测试机械敏感性(图1F-H)。在所有三种范例中，两种基因型之间在基线水平的机械阈值类似(图1F-H)。足底内注射角叉菜胶在发炎后1小时开始诱导两种基因型的机械阈值的大幅下降(图1F)。令人印象深刻的是，发炎后三天，WT小鼠恢复到基线水平，而在Myo1a KO小鼠中机械超敏反应延长到发炎后长达60天，展示急性和可逆性发炎诱导的机械性疼痛转变为持久且不可逆的慢性疼痛。在神经损伤和术后模型中观察到相同的行为反应。在WT小鼠中，CCI诱导的机械超敏反应的显著逆转在第30天开始并且在第40天左右恢复到基线水平，但是如在角叉菜胶诱导的发炎中一样，Myo1a KO小鼠的机械超敏反应持续长达CCI后60天(图1G)。最后，在Brenan测试中，切割诱导的机械超敏反应在Myo1a KO小鼠中是不可逆的，而它在WT小鼠中持续不到10天(图1H)。使用Hargreaves测试在角叉菜胶和Brenan范例中评估热超敏反应。在角叉菜胶模型中，Myo1a KO小鼠的热超敏反应延长，但在发炎后第60天恢复到基线水平(图7G)。然而，在Brenan模型中，WT与Myo1a KO小鼠的术后诱导的热超敏反应之间没有差异(图7H)。最后，Myo1a KO小鼠在两个阶段都展现福尔马林引起的疼痛反应行为的显著增强(图7F)。总之，这些数据展示Myo1a KO小鼠倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛，并且表明这些小鼠可以用作解密触发急性疼痛转变为慢性疼痛的机制的优秀模型系统。
MYO1A的缺失特异性改变了离子型GABA能信号传导
已确定损伤诱导的慢性疼痛是由SC中兴奋性和抑制性神经传递之间的不平衡引起的，并且同时放大的疼痛可以被多种化合物如阿片样物质、GABA和甘氨酸受体激动剂、钙通道拮抗剂以及发明人最近鉴定的TAFA4瞬时逆转。为了揭示这些信号传导路径中的哪些在Myo1a KO小鼠中功能失调，发明人使用选择性神经损伤(SNI)神经性疼痛模型(Decosterd和Woolf,2000)测试了这些化合物的镇痛作用。选择SNI模型是因为其具有高度可再现性，并且还诱导持久且不可逆的机械性疼痛。他们使用这种范例显示，鞘内(IT)施用δ和μ阿片样物质受体激动剂SNC80和DAMGO(图2A)、GABAB受体激动剂巴氯芬和TAFA4(图2B)、α2δ电压门控钙通道抑制剂普瑞巴林和甘氨酸受体激动剂牛磺酸(图3C)显著逆转了两种基因型中SNI诱导的机械超敏反应。然而，与WT小鼠相反，IT施用GABAA激动剂蝇蕈醇完全不能逆转Myo1a KO小鼠中SNI诱导的机械性疼痛(图2D)。在酵母多糖A诱导的炎性疼痛模型中也证实了Myo1a KO小鼠对蝇蕈醇镇痛作用的抵抗力(Witschi等人,2011)。发明人首先显示，酵母聚糖诱导的发炎也在Myo1a KO小鼠中引起延长且不可逆的机械超敏反应(图2E)。IT施用蝇蕈醇或GABAA-R阳性变构调节剂地西泮(DZP)强烈逆转了WT小鼠中酵母聚糖诱导的机械超敏反应，但对Myo1a KO小鼠没有影响(图2F和2G)。重要的是，注射SNC80强烈逆转了两种基因型的机械性疼痛(图2H)。这些数据一起展示Myo1a KO小鼠倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛是由于离子型GABA能抑制性神经传递的选择性损害。
MOY1A的缺失使DRG和SC神经元两者中GABRA2选择性上调
已确定，GABA能抑制的丧失可以通过外周和中枢神经系统两者中的数种方式改变。这些包括改变的GABAA-R的亚基组成、改变的GABA水平、GABA释放概率和其从突触间隙中去除的速度以及将GABA介导的抑制转变为兴奋的氯化物梯度的变化(Sandkuhler,2009)。为了揭示在Myo1a KO小鼠中这些机制中的哪些受到影响，我们使用了无偏RNA深度测序筛选。对从WT和Myo1a KO小鼠的DRG和SC神经元制备的polyA mRNA的生物学重复样进行具有非常高测序深度的高通量测序(平均每个重复样112×106个映射到外显子组的读序)，代表平均250×全外显子组覆盖(表1)。
表1：从WT和Myo1a KO小鼠的DRG和SC制备的polyA mRNA的RNA-seq的读序映射的总结
识别出Myo1a表达缺失后高度显著差异表达(DE)的基因(<5％FDR；<p 0.00025)，使得在DRG神经元中鉴定出98个DE基因(图3A和表2)，并且在SC神经元中鉴定出32个DE基因(图3A和表3)。
表2：Myo1a KO小鼠相对于WT小鼠的DRG中差异表达的基因
表3：Myo1a KO小鼠相对于WT小鼠的SC中差异表达的基因
虽然大多数DE基因是正常表达Myo1a的DRG神经元所独有并不令人惊讶(图1A-G)，但是有少数(14个)DE基因在DRG和SC神经元两者中是反常的，并且18个DE基因为SC神经元所独有(图3A和3B)。为了证实RNA seq数据，发明人使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)关注了在两种组织中差异表达的少数基因。在两种组织中，Nnt、Gabra2和Wdfy1在Myo1a KO小鼠中呈现出非常显著地增加(图3C)。然而，发明人未能证实下调基因的差异表达(数据未显示)。
通过本发明人的行为实验揭示的离子型GABA能神经传递的Myo1a KO小鼠选择性改变促使他们关注Gabra2基因。Gabra2是在Myo1a KO小鼠中呈现改变的表达的唯一GABA受体亚基(表4)。
表4：
为了补充qRT-PCR结果，他们使用原位杂交和免疫组织化学。使用原位杂交，他们发现与SC相比，在DRG中Gabra2上调非常明显，其中在大尺寸神经元中具有非常强的上调(图3D)。使用免疫组织化学，他们证实Gabra2上调伴随有SC背角中GABRA2蛋白的显著增加，其中初级传入神经末梢和局部中间神经元混合(图3E和3F)。重要的是，根据GABRA2的选择性上调(表4)，他们发现两种基因型之间GABRA1(α1亚基)的免疫反应性没有差异(图3G)。最后，为了测试GABRA2上调是否影响GABAA-R功能，他们对培养的WT和Myo1a KO的表达Venus的C-LTMR进行全细胞膜片钳记录。他们发现，浴施增加浓度的蝇蕈醇在两种基因型中触发类似的电流幅度(图4A和4B)，展示GABRA2上调不会改变GABAA-R对其选择性激动剂蝇蕈醇的反应。
蝇蕈醇引起的板层II中间神经元的兴奋性谷氨酸能活性的增加在发炎的Myo1aKO小鼠中严重受损。
为了对Myo1a KO小鼠对蝇蕈醇的镇痛作用的不敏感提供合理的解释，发明人对SC切片使用全细胞膜片钳记录。首先，对急性病状下和发炎(角叉菜胶和酵母聚糖)后内部板层II神经元的大量电生理学特性的全面表征揭示WT和Myo1a KO小鼠之间没有差异(图8)。然后，他们研究了浴施蝇蕈醇对急性病状下和酵母聚糖发炎后WT和Myo1aKO小鼠中板层II神经元中的自发兴奋性突触后电流(sEPSC)的影响。在这些病状下，两种基因型之间的sEPSC的总体平均幅度类似(数据未显示)。在原初WT小鼠中，浴施5μM蝇蕈醇诱导sEPSC频率的显著增加，如sEPSC间隔累积分布曲线向左移动所示(图4C)。在用酵母聚糖发炎的WT小鼠的切片中，这种作用几乎加倍(图4E)。有趣的是，在来自Myo1a KO小鼠的原初切片中，蝇蕈醇诱导sEPSC频率急剧增加544％(图4D)。然而，这种作用在从酵母聚糖发炎的KO小鼠中获得的切片中完全丧失，因为浴施蝇蕈醇对sEPSC频率没有影响(图4F)，从而进一步支持发明人观察到的Myo1a KO小鼠在损伤后对蝇蕈醇的镇痛作用的不敏感(图2D和2F)。
结论
在这些实验中，发明人显示MYO1A的缺失将损伤诱导的急性且可逆疼痛转变为持久且不可逆的疼痛。这种疼痛慢性病对两种炎性疼痛模型，即一种神经性和一种术后疼痛模型的机械敏感性具有选择性，表明MYO1A的缺失使个体倾向于产生损伤诱导的慢性疼痛，并揭示这些小鼠是揭示触发急性疼痛向慢性疼痛转变的细胞和分子机制的理想动物模型。实际上，发明人发现MYO1A的缺失选择性地损害了离子型GABA能信号传导，因为Myo1a KO小鼠中损伤诱导的机械超敏反应可以被阿片样物质、巴氯芬、普瑞巴林、TAFA4和牛磺酸瞬时逆转，但不能被蝇蕈醇和地西泮逆转。他们还发现MYO1A的缺失导致GABAA-R的α2亚基的组成型上调，表明这种亚基的改变的表达可能参与损伤诱导的疼痛慢性病的过程。
慢性疼痛是一种严重且高度异质的医学问题，其患病率为世界人口的20％至30％(Bouhassira等人,2008；Breivik等人,2006)。鉴于只有一小部分个体产生慢性疼痛，因此假设遗传因素的作用(Belfer等人,2015；Devor,2004；Macrae,2008；Tegeder等人,2006；Voscopoulos和Lema,2010)。在本文中，发明人使用四种不同的疼痛范例显示Myo1a KO小鼠在损伤后产生不可逆的慢性疼痛，展示MYO1A的缺失与慢性疼痛产生之间的因果关系。非常重要的是，发明人发现Myo1a+/-小鼠中Myo1a基因的一个拷贝的缺失在炎症情形中诱导了持久且不可逆的机械性疼痛，进一步支持了Myo1a作为产生损伤诱导的慢性疼痛的倾向基因的作用(图7I)。
发明人使用行为药理学显示，Myo1a KO小鼠中损伤诱导的机械超敏反应不能被蝇蕈醇逆转。这种受损的离子型GABA能信号传导进一步通过其电生理学记录证实，其中发明人显示，在急性病状下，蝇蕈醇引起板层II中间神经元的兴奋性谷氨酸能活性急剧增加，而在发炎后，这种作用被完全消除。他们还显示，GABAA-R的选择性拮抗剂荷包牡丹碱在原初WT和Myo1a KO小鼠中引起类似的机械超敏反应(图7J)，展示GABAA-R在急性病状下在Myo1aKO小鼠中发挥功能。这些数据一起指示损伤使脊髓GABAA-R从活性状态转变为非活性状态，进一步使Myo1a KO小鼠中的离子型GABA能抑制性神经传递沉默，从而导致慢性疼痛的产生。对这种现象的一个合理的解释是，损伤诱导Myo1a KO小鼠中GABAA-R的大量内化。实际上，已经在实验诱导了危及生命的难治性惊厥性癫痫持续状态(SE)的动物中观察到由内吞作用增强引起的突触GABAA-R的减少(Naylor等人,2005；Terunuma等人,2008)。有趣的是，表面受体的这种减少主要靶向含有苯并二氮杂卓敏感性亚基的GABAA-R，这解释了SE患者对苯并二氮杂卓的药物耐药性和癫痫发作的非终止性质两者。值得注意的是，发明人展示，在损伤病状下，Myo1a KO小鼠对蝇蕈醇和DZP完全不敏感，并且在这些相同病状下，损伤诱导的机械超敏反应一旦形成后，其在这些小鼠中变得不可逆转。
对观察到的表型的另一种可能解释来自发明人的RNA深度测序数据。他们发现MYO1A的缺失伴随有稳态状态下DRG和SC神经元两者中Gabra2的大量且选择性上调，指示这种改变的表达可能参与观察到的损伤诱导的疼痛慢性病。虽然他们证实gabra2上调使GABRA2蛋白显着增加，但这种增加对Myo1a KO CLTMR中蝇蕈醇引起的电流的幅度没有影响。鉴于GABRA2是唯一在DRG和SC神经元中差异表达的GABAA-R亚基，发明人的数据表明GABRA2上调可能有助于将平衡移向更多含有α2亚基的GABAA-R。在这种情况下，在大尺寸初级传入神经元中，α2/α1比率将主要受到影响(参见图3D)，因为α2和α1是DRG中表达的主要亚基。
根据这一假设，最近的一项研究表明，难治性惊厥性癫痫持续状态和难治性癫痫患者具有显著更多的含α2 GABAA-R，而含α1受体较少(Loddenkemper等人,2014)。已批准探讨含α2的GABAA-R是否比含有其他α亚基的GABAA-R易于过度内化的未来研究。
总之，虽然未解密Myo1a KO小鼠中损伤病状下损害GABAA-R功能的确切机制，但发明人描述了第一小鼠模型，其中功能丧失突变导致损伤后不可逆的疼痛状态。他们还提供了如下的有力论据，Myo1a基因应该被认真考虑作为产生损伤诱导的慢性疼痛的预测遗传因子，并指出离子型GABA能系统是促进急性疼痛向慢性疼痛转变的主要机制。发明人的研究还提供了一种有力的临床前动物模型，该模型可用于(i)深入了解触发急性疼痛转变为慢性疼痛的分子和细胞机制，以及(ii)设计“定制(à la carte)”药物疗法以预防慢性疼痛的形成。
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序列表
<110> 艾克斯-马赛大学等
<120> 用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的MYO1A以及MYO1A用于治疗疼痛的用途
<130> B2197PC00
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22249
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
aatgcaaggg ggagttcaat gaaactggga catctataca catgtgaggt attattacta 60
atcactttaa tctttgggtc tctatgatag ggtctgattc atgggggaag ggaagtggag 120
aagaatttgg ggattttgtc tgcttagctc tccaagtaat ctcattaaca tcccctgact 180
cccgataaga taggaagagt aggtatgagg gaggtactgt ttttttgcta ggaagacact 240
ctttgtaaag acgtgtctcg ccatgttgcc taggctggtc tcgaactcct gggctcaagt 300
gatcctcccg ccttggcctc ccaaagtgct gggagtatag gcatgagcaa ccgcacttgg 360
ccctacctgt ccttgacaaa attcctgact tctctttggg aaatattttc cttggctata 420
aattccattc ttccagcttt catttccaaa tttgggagac aatggagcaa gaaccctcct 480
ttagttaagc ctctcagcta acgccagcca gatacccttt cctacctaga gggagcttga 540
gtgtctccct ctggggcttc aggcctgtga agggttaagt gagccacacc ctcagcagga 600
acagtctgga ctttgtgctg atcagccatc tccggcctct cctggtttga ctggcacagg 660
gagcctgggc tggaagaggc agcaaaaggg aaaatcagaa gagtggacac tggcaagagg 720
agggcagcct ttttcccagc ttccttgcac catggacagc tcccattaag ccacctctcc 780
atcctggggc caggactctt atgccccatt cctgtcaaat tgagatttca tccaccattc 840
tccaaggaca gtgaagttat accctagttc cagtgttggg tgagtcctgc cttgacctgt 900
cactgcttct ctttaacacc ttggggcgcc ccatctgggg cctcttgcct ttttcccttc 960
cccaccctca accagtcaca ttcccactcc cttcaaatcc aaatccaaag aagatgactg 1020
ctcccaaccc accttctgct tctcaccctt ccctgccaag ttagttaaaa gacttagctt 1080
tttgtaaaat ctagaaaata caaaaatagt atctacttca tggggatatt gtaagcacta 1140
aatgaattag tgtatgtaca gtgcttagag ccctgcccag ttcgtggtaa acgctgcatg 1200
attcctagag actgctatta ttgatattct tattgcttcc tcagttgtgt ccttctggta 1260
agtgacaagt gctctctttt cctagagctt ggggaaagcc aagtgaaggg agaaggaagc 1320
ctgtgcccct tcttgcccca cttccgttcc tccttcctcc gctcctccac ccgggttcag 1380
agatgcaata gcataggagg atgtgtctct ttcattcctg ttcaggagtg gccttgacca 1440
ttgtactaat aatcctgtcc tgtgcctggc cactctgcct actcagtctc acaggaaaga 1500
ctgaggaggg ccaggtttcc tccttaggga acacctgcca tgtgcctact gcatgggggc 1560
caagccccac caccctccct gtagttccaa ctgtgctcct ccttgcccac tcccgcaaga 1620
agctaggtgt gtccctctgg ggcaaagtcc atgccagaag tttacaggag tgggtgtaaa 1680
agctagagat ggaaaaatag agacagacat gtagcacatc cagaggtcct gacaactgcc 1740
tgtttgttgg ggaagcaaac cccactttca ttttctttgg gaaattccaa tctcttatgg 1800
aggaatcctg cctctatcct ctataattct gccttgtcaa gttcccattt taaaaatgaa 1860
gctcactgta gcaatgacag ggaaggagag acctttggaa gaacttctga aatggttatg 1920
ggtaggttgg gtgtctttaa taggggctgt gagaggtaag gtgttgagaa gaagcactgg 1980
gggtagatgg ggagtctgga ccctggccag ggcccattgt aggagagaga gggctttctg 2040
tacctggcgg cagcacaagt ctttgcttac actttcctcc tcagccctct ctccttcagt 2100
cacaactctg ctcccccagt tgtagcccac tgggtgcctg ccttcccctg gtggtcagag 2160
gaaggtgttc ctgttccacc cctgccccac ccccaccaac tgtaacccag gcagcagagg 2220
atctccccca cctcctgctg agagtttcag cctccctatt agcttgggct ggtccagagg 2280
cctctcctag gttgggggct ctctttaggg ccagggtagg aagagaggaa ggctcttttg 2340
gtccttctgc catcctcccc tcaaacagtt actggcccct aaagctgagt ggacatcagc 2400
aaactgtgcc tcttattccc aggatcagtg gcccctctgg acatgcctct cctggaaggt 2460
tctgtggggg tggaggatct tgtcctcctg gaacccttgg tggaggagtc actgctcaag 2520
aatcttcagc ttcgctatga aaacaaggag atttatgtga gtgtcatatg ggtgcctctg 2580
gctgtggata tgtggctgga gaggtcacag gctcccacct caccctcaag ctcattccct 2640
tcaccttctt cctggctcca gacctacatt gggaatgtgg tgatctcagt gaatccctat 2700
caacagcttc ccatctatgg gccagagttc attgccaaat atcaagacta tactttctat 2760
gagctgaagc cccatatgtg agtaggggga ccaagggaag gctgacaggg ccccagcttc 2820
ttgacactga gtcatcctaa tttcctttgt cccttcccct gaaggggctt ctccagctgc 2880
cccttccttc cctggccttc tggaggcccc ttccaaggcc tgtcacatct tgcccagtct 2940
gctccaagta gagagagtgg atgaacctgc gtgctggaga ttgagtgaaa gatggtgtct 3000
tgaactggtt tcacaatagt cattgcccac ttcctcccca caagctacgc attggcaaat 3060
gtggcgtacc agtcactgag ggacagggac cgagaccagt gtatcctcat cacaggcgag 3120
agtggatcag ggaagactgg tgaggcccct ggctggggga acacatggag tcacctctgg 3180
aactgcttcc ttgtctcttt gcaagccaga cctagacctg accctccacc ccacagaact 3240
tcctttccac tttttctgac tccaaggggt ggtgaggcac tggggtgaag caagttaagg 3300
aggtgggggg atgggctagt cctgggtggg gacccatgag agcgttttgc ctgcacagag 3360
gccagcaagc tggtgatgtc ttatgtggct gccgtctgtg ggaaaggaga gcaggtgaac 3420
tctgtgaagg agcagctgct acagtctaac ccagtgctgg agggtgagaa ttctgctctc 3480
tgccctctcc accctccatc taacccccag aatcactgag ccctagaccc tcttccccag 3540
tgctgcaaaa tcacctctct tgttcgaccc agaaaaatct gagattgtca tgaggactgg 3600
aagcccttcc tcctttccct tctctagagt ttcacttctc ccctcctcat ctctgtagct 3660
tttggcaatg ccaagaccat tcgcaacaac aattcctccc gatttgtgag taaatgtctc 3720
cccacctggg aagagaggat gtgggggctt aagagggagg aatgtggcac agaccccttc 3780
caggcagggt ggtgagaaga ggaagaagct aagtctctct ctctggtctc tctctgaagg 3840
gaaaatacat ggatattgaa tttgacttca agggatcccc cctcggtggt gtcatcacaa 3900
actgtacgtg tctccccaat tccactcacc tgtcttccac ctgcctccca tggccctttc 3960
tgctaatctg ttcctgtaga aaggcagaat gttagacgtc aaggagactt cccaaccact 4020
aggaatgccg gcgatggggg cattctccag tagggctgga gaagctacgg catctcccag 4080
gccctcagga tattattttt ctaattctct gccagatctg cttgagaaat cccgattagt 4140
gaagcagctc aaaggagaaa ggaacttcca catcttctat cagctgctgg ctggagcaga 4200
tgaacagctg ctgagtatgt gcctgcatgg ggaaagtgtc ctcatgagtg acacatggca 4260
aagtccccaa cctccattca gtcccagaac ccctgttccc tctgggcccc tacagccctc 4320
ttcccttgag cctcccagat tttccttgct gcatttccca ttctcagcct cacccactca 4380
ttgttgggaa caaattcctt tacccctgtg ttctcttcct tttctggggt tttattgcca 4440
gggatatgcc ttcttgcctc ttcactgttc tcgttcctct ttcctgcctg ggttctgctt 4500
tccctgagct ggcttcaaat ataaaacact tatatccatc tactttcctt cctaccttca 4560
acttaagggg atttaattaa agcagggaag caggcagaat gttgtaagtg ttcaggaact 4620
ttcagtgaac tctagttgaa gctgtcctgg gtctacatct gccttaccta ggaccctgtt 4680
cctgattttc ttttcattca ttcattcact cattcattta ttcattcatt caacatctct 4740
tgaacaccta tgatcaaata ttatgctagc ctctagggat acagagttga gtaagacatg 4800
accctgtcct cgaagaactt atagtcttct agggataaga ggtgtgtgag cagatccatt 4860
gtaatattgt gtgatcgggg ccatcaggcc tgtgcagctg gctataagag cagaagacct 4920
agagcccctt ggcttggcct ggggaagggt ccatcacagc ctggatgctg gactggcctg 4980
aagtggctct gggtgggcat cactggagtg tctggtggac tttaagccct actggagttt 5040
gcctcccaat ctcctctctg gctgtgagca ccgtgggtgt ctggccccta agaatgtctc 5100
tttggtttct ggtgattcta tgatagacct gtgctatctc cttttccact cttggagatc 5160
tctgtgatct tcaggaaccc ctgcagatct catgctcttt cctggcttaa tagttttggt 5220
tatgttcaac ttgtctgcat catgggcatt agtgtcttgt tctggttggt ctgtcatcta 5280
ttggtttaaa tcaactctag atgaggtctc ccaggtatca tcatccccag acattctgac 5340
tcattctccc tccagatacc ctccttagca ggcccttgtt tcaaactttg tgtgctgggg 5400
gagctgccat tagactatag tttgagggat actccctgat tctcagatca tttgcatacc 5460
agataattga catccctcaa actccatgat taaccgaatc cctcccatcc tagggaaaca 5520
gctttgatca ttcacttgat tcatttatta aaaagagaaa atttcctgca tgccagaaag 5580
gcacacagaa tatggagatg agaaacacag tcccaaccca caagttgctc atttatggga 5640
gagacagaaa aaaacaaaac ctagcccata tgatatgggc tgggatatag attcaccagt 5700
ggggaatgca agacagccat ttggctcagg ccctcagcat cagagaaaac ttttcagaag 5760
aggtgtcagg gtcagggaac atgctacctg ccactttatt ggtgtttggt gttcaaacaa 5820
tgaatgagca acccacgcca agagttgagg ctgggggcag gcaggagata tgcgcttacc 5880
cttctcccct taccttcacc gtccagaggc acctgcgtag gatggaaggg ttgcttgttt 5940
atttttattg tttagaaccc tgagggtagg gagaagagta aaatgagggt tttgtttcat 6000
aaaagttggg ggaaaaccca atcaatatga gcatcaaaac cctaaacact acttaaaagt 6060
atacttaaaa atttagtctg ttaggccgag tgactcatgc ctgtaatccc agcactttga 6120
gaggccgagg cgggtggatt gcttgagtgc aggagtcaag accagcctgg ccaacataga 6180
gaaaccccat ctctactaaa aataccaaaa ttagccaggc gtggtggcat gcacccatag 6240
tcccagctac acaggaggct gaggcatgag aatcacttga acctgggagg tggtgcttgc 6300
agtgagctga gatcgcacca ctgccctcca gcctgtgtga cagagtgaga ccctgtctca 6360
acaacaacaa aaattagtct atcatcacag gaattaatga tcccaaaaca aaggaggcag 6420
gggaagaacc caaaacaaaa atgactcctt tggataagtg aatgaatcca ttagggcaag 6480
ggctgtgagg tgtcaaggct ggagggctcc agagagcctg ggtactaacc atcttcccca 6540
acactggccc tcccagaggc cctgaagctt gagcgggata caactggcta tgcctatctg 6600
aatcatgaag tatccagagt ggatggcatg gacgacgcct ccagcttcag ggctgtacag 6660
gtgggtgccc agggtgaggc aggcttgggc ccttaggtca tcctctattc gcattggact 6720
ggcaccaaca gttcagcttt tgatttctgc tttctgccta agagtgcaat ggcagtgatt 6780
gggttctcgg aggaggagat tcgacaagtg ctagaggtga catccatggt gctaaagctg 6840
gggaacgtgt tggtggctga tgagttccag gccagtggga taccagcaag tggcatccgt 6900
gatgggagag gtctgcatcc cagcctgctg gagctcctac ccagaccctg aatttcctac 6960
tacaagtcgt gtccttctac catctctagc ataattgatc tcaccctgat gcagtcccac 7020
tcagcccact cctgagttct cccctaaaca gactcactga gaactcccga tgaagcatat 7080
tggaatgagc ttttgaaatt tgatatatct aggtctggaa attctctgag tctgagttga 7140
ttcttctgca gaatggggat aatcacacct aattcaggag attctcatat taaagtagat 7200
gatacatgca aaatgcccag atcccctttc ttctgtcccc caactccctg agattcctcc 7260
agggccatgt tctgggttgg ctgcaatgac ttctccagtg agaccccagg acaccagtgt 7320
ctcaggcagt ttcacttatc agattgcact ccctcccctg agagaaagct gcctctaagg 7380
acatgctgta ctttctcatt atcccaggtg ttcgggagat tggggagatg gtgggcttga 7440
attcagaaga agtagagaga gctttgtgct cgaggaccat ggaaacagcc aaggaaaagg 7500
tggtcactgc actgaatgtt atgcaggtaa ggagctcact ggagtggagg gggctgtttc 7560
gaccctgttc tgtgatgcca ccctaatcag ctgtgcctca cccacaggct cagtatgctc 7620
gggacgccct ggctaagaac atctacagcc gcctctttga ctggatagtg aatcgaatca 7680
atgagagcat caaggcaagt ggccgctctg ctttctccat gctctcctgt ctgcctcacc 7740
ttcctgccct gtcaccagcc ctatatcttg gtttctgaga tgagcagagt agggaggatg 7800
atggggaggg tacagttcct tctaacagtg tgttgtcatg gaaacatcac tggcttttga 7860
gttagacaat ctggatatat catctactta cttaattcaa agtcatgtgg actttcaatt 7920
aagtaaaaag tcatgtggac tttcaatttc acaaaggttc tgggcctcag tgtcctgatt 7980
tggaaatgcc cactaagaaa cactaatatg ctgggtgtgg tggtccatgc ctgtaatccc 8040
aggactttgg gaggctgagg tgggaggatc acttgagctc agtagttcaa gaccagtctg 8100
ggcaatatag tgagacccca actctatatt ttatgaaaaa aaataagtta aataaaaaac 8160
tatttaagaa acactaatgc attcctacct gcttcacagg gtttaataag gatcagataa 8220
attatgtaaa tagttaccat atgataccac aattcccact cctaggtata tacccaagag 8280
aactgaaatt agatgtcctc actaaaattt gtgcacaaat gttcacagaa gccttatttg 8340
taatagccaa aaagtagaaa cagcccaaat gtccatcaac tgatgaagag ataaacaaaa 8400
tgtggtatat ctgtacaaaa gaatgttatt tgtccataaa aagaatgaag tactgataca 8460
tgcttcaaga ttgatgagcc tggaaaacat tatgctgagt gaaagaaggt agtcacaaaa 8520
gaccacattt tgtttgattc cattcatatg aaatgtccac aataggcaaa ttcatagaga 8580
tgggaagtag atcaatgaat gccaagggct ggggggagag gggtatgggg agtgactaat 8640
aatgggtata ggatttcttt tgtggggtgg tgaaaatgtt ctgaaattag atagtggtga 8700
tggttgtaca accttttgaa tatactaaaa agccactgaa ttgtacatgg tatgtgaatt 8760
atattcagta aagctgttat taacaaatta tccacatgga agtgccatct atttagaagc 8820
tattactgaa aggtagtaga ataagaagga atttgagtct aggcttggta agtacctatc 8880
cttctgaaat ttgactttgt tatctgtaaa atgggaacaa taatacctta taaggttatg 8940
ataaataaag acatggaatc ttttgtaaaa tgctctacaa atataagaga tggttattgt 9000
cctgagaggt tttattgtct ttctacctgg taccatcgga gcaccatcct ggaatctatc 9060
tgtatcttcc ttttcctcct ttcctccctc tttgcttgtt ctctagtgtg tggaggaggg 9120
agagtaaaat cacaacaatt cctttccagt ttggcaaagc tcttgctagt tctgtttgcc 9180
ccctactcca accccatccg ctccagaagg acctggcctg gtgtgcagag ggggcctgtc 9240
ctcagattta tctttctctc ctcttcaggt gggcatcggg gaaaagaaga aggtaatggg 9300
agtccttgat atctacggtt ttgagatatt agaggtgaga gtgcctcacc tcagcaccct 9360
gctcccctag gattagaggt ggacaggctc acagggggga tgtgagggag gggaggtagg 9420
actgagacgg agaaacagtc ttggagtgag ctctctaacc tgtgctccct ctctcaggat 9480
aatagctttg agcaatttgt gatcaactac tgcaatgaga agctgcagca ggtgttcata 9540
gagatgaccc tgaaagaaga gcaagaggaa tataagagag aagtaaacca agtcttttct 9600
acttccccct cttaaacaac ttctaggcat atgccagagc ttcctttctc cttgatcaca 9660
atttcctcta catcgtcccc agatgtgaac acagaggaca aaatgtttcc cttgcatagt 9720
agatcattcc agcattacca agtagcccta atcctctgct ctccattctt catttccctg 9780
gcctcccagg gtacatgtgt ggaaagtcct gacaagaggg aagtgacagc tgtgcttggc 9840
ctatggcaga ctgtgagcca aatataaaaa ggacatttct tctgggtttg gcccaaccac 9900
atctctttct atgcccttct ctaacatctc agagtccttg gtctcccccg ggccctagct 9960
agagttgctg tcctttcttg taacaccatg atcccagact tcctcaccag aagtacccca 10020
tggctccaat ttctatggct aagtgttaga aaagctctct gattgagctc attaccttca 10080
aagtgtgaat ggctgagagt ctcactcatc aaaaccctcc cagggatgtt cccttgtgag 10140
ctctcaggaa taggttataa cagaatttca ggcaatgtgg tcacaatgtg tgaaaaagtt 10200
tttttagttg ttttgtatgt tttaatttta acgatttaaa tgatcagata cataatacat 10260
tcccatgctt caaaattcaa aaagcttaga aagtatataa ggaaagtttc cctcctactt 10320
ctgcccctag cctcctagtt ctcctcccca cccagaggca accaacatgg gcttccttcc 10380
agaagtcctt acgcatatgc aagcaaattt gtaaatatat ttccccacaa aatctataca 10440
aatggcagta aatacactct gttctgtacc ttattgtcat cacgtaacga gatctttcca 10500
tgtcagtatg taaggatgct tttttacagc aacacagtat tttaagaata tcataattcc 10560
tttaactggt tggggaaggt atttggggga tgaagtggga ggcaacttaa tttaattttg 10620
ttttctttaa agacctgtga tagagggagg aaagaaagac ctatgcttcc cagccatacc 10680
tgagaatgtc ccagcctgga gcgtctgacc cttgggtggg atcaggagct atcctgtctg 10740
taggcctgat gcccagcaag tccccaaagt agagaacgat tatctttggg tcttctgctt 10800
ttgtaccatt cttgcttttc aaaacattat atagtctcaa agtctcatgt agataaagtg 10860
gttcctaaag ggtagtcctg gaccagcagt atcaaaatca cctggaaaca tgttggaaat 10920
gcagattcca ggcccacatc ccagacctgt tgaatcagaa acttggggag tgggacccag 10980
aaatctgtat tttaacagcc ctccaggtgg ttgtgctgca cactcaaatt tgagaatcac 11040
tgatgtagat ctttgaagat gtatcaaatt agccttgttg tttgatgata aactctcacg 11100
tgctgtggtt ttatagagca cagagtagtg tggccgctgt tgcacatacg catggatcct 11160
tccccactcc cacacaggaa atctctatcc taatcttcac tcaacatgtt acacttccct 11220
ctccacccta caccacctac agggatctct gcattgtctc accctctctc acagctgctc 11280
caattccttc cgtgtgtctg tctacccacc ccacaaattc tccaccaacc ttggagggat 11340
ggggacataa atagaaatca taccaaggac ccctgtgaac tatggggctt tctgatgtcc 11400
tttgttgggt gggtgaaagg ctagatctgg tgaggtctct ggaggcttgt cttggacgtg 11460
ttccctgtaa tttgttgtct cccctgacca gggcataccg tggacaaagg tggactactt 11520
tgataatggc atcatttgta agctcattga gcatgtgagt tgtcattctc ttatctgtgg 11580
gacttcccct tccagactgc ctgaacatcc ttcccctgtc tctctccctg attccccact 11640
tggtagggac agtaaagagg gcagaagata agagtggaga aagggggcag caatgagaac 11700
gtggacatct cggaggacca gatttaggtt gggcttcttt tgttcccccg gcccagaatc 11760
agcgaggtat cctggccatg ttggatgagg agtgcctgcg gcctggggtg gtcagtgact 11820
ccactttcct agcaaagctg aaccagctct tctccaagca tggccactac gagagcaaag 11880
tcacccagaa tgcccagcgt cagtatgacc acaccatggg cctcagctgc ttccgcatct 11940
gccactatgc gggcaaggtg aaatggcagg gctggagggc agagattagg gctcaggccc 12000
agactgaagt caatggggga ggaacccggg gaaggtgaga gtctggaata cttcacaatg 12060
agactgggag ggccaagtgc tgggacaagg ttgtggggtc tccaaaccaa tagctgctcc 12120
tttacaggtg acatacaacg tgaccagctt tattgacaag aataatgacc tactcttccg 12180
agacctgttg caggccatgt ggaaggccca gcaccccctc cttcggtcct tgtttcctga 12240
gggcaatcct aagcaggcat ctctcaaacg ccccccgact gctggggccc agttcaagag 12300
ttctgtggcc atcctcatga agaatctgta ttccaagagc cccaactaca tcaggtgaca 12360
tgctggcatg caggggaaca tgctacatat gtgatggcac gtgcagggtc catgcgctgt 12420
agaacacgtc catgtggggg tgcttctgga ataaggatgt cagaggtcct ttcctcacag 12480
aaaacagtca gataaggagc tgagagtccc acagggggag agcatcagat tcgataggga 12540
atacatagaa gtgagtgaaa ctggggaggc cagtgtgtct actttctttg aaacttttca 12600
gtgaagtgca ccgtgtgcag cataggggaa tatgatgggt tacactggca atgatgtcag 12660
ctcctgaagg ctgtgcctta ccccacctcc caccaggtgc ataaagccca atgagcatca 12720
gcagcgaggt cagttctctt cagacctggt ggcaacccag gctcggtacc tgggactgct 12780
ggagaacgta cgggtgcgac gggcaggcta tgcccaccgc cagggttatg ggcccttcct 12840
ggaaaggtac cgattgctga gccggagcac ctggcctcac tggaatgggg gagaccggta 12900
agaccccatg gggagactgg gcatcaggaa agggcagtgc aggaaacatc tctgggggaa 12960
gagacctgga ggtgcagtgc acatctgctg aagctgggtg aatggatact ttgagaaatg 13020
aattgaatga tcacttcttg gaggctgaaa ggattagggg aaaggtggaa gaggactttc 13080
tcctgagata cccctctgca gctttctgtc atttgcttcc atagggaagg tgttgagaag 13140
gtcctggggg agctgagcat gtcctcgggg gagctggcct ttggcaagac aaagatcttc 13200
attagaagcc ccaagactgt gagttagaga gtgcattagc atttggtgag ggtagaaggt 13260
ggaagagccc acctgagaaa ggctggaggg ggagggagcg tgtataacct ggaatggatc 13320
actgtccagt ggatgggaag cttcctgtct gcaggaaccg tatccctggg aattgaactc 13380
ttgggttcct acactgccct gagcctgggg agcttggtgc tgcatggctc taagtgcctt 13440
tgcctgaggc agagcccttg agggttgggg tgatcaactt ctagcttact gcctgctaca 13500
aagttagagt taagtagata cttgtttact gaatgaataa atgagcaaac taagaagaca 13560
aaggaatgat caaataaggc ctggctggga agcctcagta ctgtggggta taggagagga 13620
cagcactgtt cccctgagcc agtctctctg tcaccccctt ccacctctcc acagcttttc 13680
tacctcgaag aacagaggcg cctgagactc cagcagctgg ccacactcat acagaagatt 13740
taccgaggct ggcgctgccg cacccactac caactgatgc gaaagagtca gatcctcatc 13800
tcctcttggt ttcggggaaa catggtacgg tcatccccaa agtcccactc tgttcactct 13860
aatagggaag atggaaggtg gctcaggagg tgccattttt ctaacaactc ctatgttttc 13920
tacagcaaaa gaaatgctat gggaagataa aggcatccgt gttattgatc caggcttttg 13980
tgagagggtg gaaggtaatg gagagtggaa gagaggtttc ctcacattgt ttctcctgga 14040
ttgtgtcacc tgctggctag agcagcagag agctagtcct gcctgcaccc aggccgcacc 14100
tctgtgtatc agccggtcca tgtgtgggtg ggtgtctggg agtgagaggc ctgtagggga 14160
gacctgtaga ggtgtctggg tgggtagatg cctaacttgg cagcagaact ttgccttctg 14220
ctctaagtgt cctcactgcc aacttgtctg attttacttc caacttccag ctacagtctc 14280
agctctttat cttactcagg tctttgcgtg gttgaaaaat agtacaacct cttctagaat 14340
ctgcctatct tcactttggc tcctttcttg tacttttctg ccaggcccga aagaattatc 14400
gcaaatattt ccggtcagag gctgccctca ccttggcaga tttcatctac aagagcatgg 14460
taagtggtag gggttagggt ggatgttagg gatggagcag ggaggcacag gtttgggaga 14520
ggggtttgag aagaggcaac ccaaagcttt cccccaagag tttcctcagt ctgcatgtac 14580
ttaagtccta ggagaagagg gcagctacct gcagggacca ggccccagtg ccttggactc 14640
gggggcagaa tcagatagca ttttggcatg agtggacaat ccaggcaacc ttgtggcagg 14700
aaggggtctc agcacaccca ccatctggtc tatggtcaaa tagccttgtg aagatcctgg 14760
ggctggatgt ttaacaactg ttgaagaggc taagcctcat tgaagagtag agtgatccac 14820
acattaacta gctcaacctc ccaagatcca ttttagggtt ggggtgagag taggcgaatt 14880
gtatcttcct tctacttcct ctgaaactat tgtcagcaag tcagaaagta aatctcagga 14940
aggacctatc ctaattctgg aggacgtggg tcaggctgga tgggaagacc cacctggaag 15000
gcctacatat tcaaacttac agacagctcc cagggggaga aaaacaggga cagagaagag 15060
taacttctgg agacttcagt cagatagcaa tagtgcttct gagaagtgtc agggaggaaa 15120
ccagggaggg agaagcactt ccaatgaaac cttgggaaag gccagagaga aggaggaaga 15180
gcatgggatc ttggacagag gctggagcaa attggtaatt gacctccgct gattgggttt 15240
ttgaccatag ttaggaccct gactgtgctc attcagacat aagacatgtt tgcttgcagc 15300
ccctctttgt tgtttgagag tctggatccc tcagctcaag agaggaatgg gggctctgaa 15360
gctctggacc tcttttttgc cttcctgagc cttcatttgc tcgtcctctt ccccttccca 15420
gggaagttcc atcttccagg tctcttcagt tgcctgatca cctcttgtgc tggtgccaga 15480
gtgtctgcct tcccaccata catgcttctt gctacacacc tgagacctgt aatctgattt 15540
tgctgttatc tcctgactgc ccttcttctt ccttttcttt catctgtgta ttgtcaggca 15600
gctactaatt gtcaacccag aagctgctgg gtttagacca gggtctcaat aaatcacacc 15660
cccacagaag cctgcgggca ctgggcactg attcccccag tgtttctgag tattccagtt 15720
tgccactgcc ttgactgtaa ctaatgctag tatccattct cattttttta atttttattt 15780
atttatttat ttattttttg agacagagtt tcactcttgt cacccaggct ggagtacaat 15840
ggcgcgatct cagctcactg caacctccgc ctcccaggtt caagtgatta tcctgcctca 15900
gcctcctgag ctgggattac aggcatgcgc caccatgccc agctaatttt tgtattttta 15960
gtagagacag agtttcacca tgttggccag gctggtcttg aactcctgac ctcaagtgac 16020
ccgcccatct cggcctccca aagtgctagg attacaggtg tgagccactg cgcccagcct 16080
atttcttttt tgagatggaa tcttgctctc tcgcccaggc tggaatgcag caagcatgat 16140
ctcggctcac tgcaacctcc atctcccggg ctcaagccat ccttcagcct cggccttccc 16200
agtagctgag accacaggca catgccacca cgcctggcta attttttata tttttggtaa 16260
agatgtggtt tcaccatgtt gcccaggctg gtctcaaact cctgagctca agtgattcac 16320
tcgccttggc ctcccaaagt gctaggatta caggtgtgag ccactgcacc cggccttacc 16380
cattatcttt tgaacatcta ctatgcatta agctctttac atgcattaac tctaatactt 16440
tcaataaccc tgtgaggtag gctcttttct ttctcccatt ttgtagttaa aaagccaagg 16500
ctcagagagg ttaaataact tgccgggggt tccacagctg taagtggtaa agctgggtta 16560
caaactattt gactctagag cttttaacca ctgcctaaga ctgcccctca tcaatagagg 16620
cttgggcaac ccatggccct aggcagacct gggggcagga gggctgcata ggaaagggca 16680
gaactttcta gttctagaac aaacaataaa aagaagaaag ccttcagagg ctccacatta 16740
attggaacaa aggggattat gacagatgct taggcatgtt tgttgaatta ttaataaata 16800
aaatcagact agggactggg gactccagtc ttggaggcct tcacaggccc agatcccaaa 16860
cccaccaaac ccactagacc tgcagtggaa gctacaatga gcttggatag ttcctgcagt 16920
taacagcaat atactatgta ttctgcctct ttctatttaa attttttaac ctgatatctt 16980
agtaaaactt tttcataaaa attccagaca tttggaagtg ccaaaaatca agtcattttt 17040
tatatcttca gtaattctgt gccataaaca aacaggttgc taggtgctct atgggatgta 17100
aaaccttggc caggcaaggt gactcactcc tgtaatccta gcactttggg aggctgaggc 17160
gggaatattg cttgagccca ggaatttgtg accagtctgg gcaacatagt gagacctaga 17220
ctctacaaaa aaaatttaaa aattaggtgg gtgtggtggc tcatacctgt agtcccagct 17280
acttggaagg ctgaggtggg aggatcgctt gagcccagga ggcgggcaag gctgcagtga 17340
gctgtgatgg tggcactgca ctccagcctg ggcgacagag caaaaccctg tctcaaaaaa 17400
agaggcaaaa acaaaaactt aagaatcctt gttctagatt ggggcagact aaagagtcag 17460
ttgccatgga tgaagcttga ttggatcctg gaaaaggaaa aataaagctt caaaggacat 17520
gtttagaagt ttataaagga catgtagaga aatctgagag tggatcgctg ttggattagt 17580
gatgttgatt ttcttaggtg tggtgatgga gttatgattg tgtaagagaa tgttccagtt 17640
cttgggagag gcatgctgac attttagggt aaaatgtcat gatatctata acctacttta 17700
ggatggtagg gtagcaagga tttgtgtaaa tgtgtatatg catgtattta tatgcacaca 17760
tatgtgtgtg tgtcagagca cacagatagt gcaaggtgtt aacattatca gttggtgcat 17820
ttagatgagg aacatacagt atacagatgt taattgtatc ttttttcaac ttttctgtaa 17880
gttaaaaaaa ctttcaaaat aataagctat attgaatttt taaaacatca tattatgcta 17940
ttcttctgta taaattctcc aatggtgttc catttcactc cttaccacag cctacaaggc 18000
ccatcatgat ctgccccgac ctactctctg atcctctctc ttcctgctca agtgattctg 18060
gccacccttt ttttttcttc ttttttagac agtcttgctc tgtcacccaa gctggagtgc 18120
agtggtgcga tcttggctca ctgcaacctc cacctcccgg gttcaagcga ttctcctgtc 18180
tcaacctcta gagtagctgg gattacaggc atgcgccacc atgcccagct aatttttgct 18240
caccctggct ttttaatgtc tctggaatat gctgccactc attcctgcct cagggtctac 18300
ttctttgcat cacagcagat gccattatct gacatcacac tatatattta tttgcttgtg 18360
tagttggtcc ccttctccac cctacagtag aatgtaagtc cagtgaaaat gaagactttg 18420
ttcactgtta tgtcccagta cctagaacag ttccaggcac taagtagaca ctcaataaat 18480
gttgactagt gaaaaaaaat gtgagacctg ggatcctgcc ttataaggac tcagtgtcta 18540
gaaaagggag ctgttttcca tgcaaataac tgtagtacaa agacgagtgt aggcaaattg 18600
ctatggggct tcaaagaaag gagaggcaat ccggggcttg gggaatcagg gagggctttg 18660
agctgatctc ccaggttggc agagttgagt caagagagca tcgagagcta aggcacacag 18720
tgatcatgca tgggctgggt aggggcatgg gaaagagtcc tgtccgggtg gtgtgcccag 18780
ggaatgcagg ggtcctgcga catgaggctg ggctcttaag tgtcagggag gaaacccagg 18840
agagaaaagc acttccagtg aaaccctggg aaaggccaga gagaaggagg aagagcatgg 18900
gatcttggac agaggctgga gcaaattgta actgacctcc gctgattgga tttttgaccg 18960
tggttaggac cctgactatt gctcattcag acatgagaca catttgctta cagcctctct 19020
ttgttgttcg agggtctgga tccctcagct taagagagga atgggggctc tgaagctctg 19080
ggcctcttca ttgtctccct gaattcattt gctctttctc ctttgctcct ttatttgctc 19140
cttcttcctt tgaatggagg ctgacatgtt tggacttgac tgatttgaga ggaggggaaa 19200
tttggtacct agccaacagc tgacacagac agtggctgcc acctgtaggc aattgtgaac 19260
agaaggaata gaaagctaca ggagcaaaac tttgagacca gctttcatat tggttcctct 19320
tacctcactg ccctgggtag caggtctttg gttggaacta atcgttctct ccctccagtc 19380
tcctattcat gctcttacct cccggcctca agcctgcacc tcttgctgaa aaagatccaa 19440
gaggtgactc ccttccatct cttcagctcc accccttgct tctcactgtg ggttaacttc 19500
ctcctttgaa gtggcaggat ctgggtgcca gtttgcctgt caggaagtgt ttcttatcac 19560
tccactccca atccccctgg tcccaaacta ggtacagaaa ttcctactgg ggctgaagaa 19620
caatttgcca tccacaaacg tcttagacaa gacatggcca gccgccccct acaagtgcct 19680
cagcacagca aatcaggagc tgcagcagct cttctaccag tggaaggcaa gtggagccca 19740
ggcacccctc ctctcatttc gtcttttttt tccctccccc tgattttcct cttttgcctc 19800
cctcttctat ttttttccca ttaaaaaaat tgtggtaaaa tatacataac atacaatcta 19860
ccattttaac ggtgtttaag tgtatagttc agtggcatga gcgacattca tgttgttctg 19920
cagccatcac tgccatccat ctccatatgc gtttttcatc accccaaact gaaactctgt 19980
acccattaag caataacccc ctattctccc attcccctag cccctgatat cttataatct 20040
actttctgtt tctatgaatt tcacttttcc aagtgcctca tataagtggg aatcatattt 20100
gtccttttgt gtctggctta tttcacttag cataaagtaa tttgttcttt tattcaggaa 20160
atgcttattg agcacctgtc tgggactaag ccttgccctg agagctgagc atagagccct 20220
cctggtgctt ttatttgatg gtgtccattc cctcccctag cctccctcag ttctcgcact 20280
cctcctcaat ggtcctccag ccccggcctc tccctgaggt gtctagtgcc tgtccttttt 20340
cctcagtctc tctcctctcc tagtgtcttc tagtcaatat ttctcacctc cctccccagc 20400
cctgccctcc cactctatga ttttagctcc tgtccctcct tcctcacagt gcaagaggtt 20460
ccgggatcag ctgtccccga agcaggtaga gatcctgagg gaaaagctct gtgccagtga 20520
actgttcaag ggcaagaagg cttcatatcc ccagaggtga gggcctccca gaccctgcac 20580
agccagttcc atcacgcagc agttctcaaa cttgagcgtg ccttagaatc acctggcagg 20640
attgtcaccc ccaggtgctg tgtccctcct cagagtctct gatccagcag gtcttggggt 20700
gaggaccaaa atttgccttt ctaacaactc cccaggtggt gctgatgtct tggtcctgga 20760
ctgtgctctg tggacactga cagaggatac gtggatgtgg gggaagggcc cgggaggact 20820
aggatgggaa ctctgggggt ggggaagagg cctctgggcc ttgtcgcgct gcacacctcc 20880
catgtgttct cagtgtcccc attccattct gtggtgacta cattgggctg caagggaacc 20940
ccaagctgca gaagctgaaa ggcggggagg aggggcctgt tctgatggca gaggccgtga 21000
agaaggtcaa tcgtggcaat ggcaaggtaa gggcctgcag gctgaactcc tcccgcagct 21060
agtgcagagc tgtgggctgg catctggaga gcagatggca ggctgtgttt gcgccctgcc 21120
aggtggagtg ggggcaatta atcctgcctt tcctcaccct tgcctgttcc gtccctagac 21180
ttcttctcgg attctcctcc tgaccaaggg ccatgtgatt ctcacagaca ccaagaagtc 21240
ccaggccaaa attgtcattg ggctagacaa tgtggctggg gtgtcagtca ccagcctcaa 21300
ggatgggctc tttagcttgc atctgagtga ggtatcagag ctgggtgggg caagccttgg 21360
actggagaag gtggtatgca tcccagggct ggggcaggct ggaggtgatg gggaccagac 21420
ctttcgctct gggcctttga tgtccctcag gtgctcctga agagaaaaaa tgaatccctt 21480
tcctgctatt tttccctctt cctaagatgt catcggtggg ctccaagggg gacttcctgc 21540
tggtcagcga gcatgtgatt gaactgctga ccaaaatgta ccgggctgtg ctggatgcca 21600
cgcagaggca gcttacagtc accgtgactg agaagtgagg ccatgaactg ggggtgaggg 21660
gcggcttacg gtagatggcc aggctgatgg tcatcgtgac caggatcaga aagcgaagca 21720
tgtagggcag tgcaggccgg ggcttggagg tgtttctcag gcccccaccc aggttctctg 21780
gggcctcaag tcctctgact cgcatgatgg gggggccatc atggaaatgc gggagtcggg 21840
gtgaggggat gggcactaga cttggttttc tgttccctct ccaggttctc agtgaggttc 21900
aaggagaaca gtgtggctgt caaggtcgtc cagggccctg caggtggtga caacagcaag 21960
ctacgctaca aaaaaaaggg gagtcattgc ttggaggtga ctgtgcagtg aggagggggc 22020
accatgcaga gatggcagtt gcttcctcct gaaccagcac taatccccct ctgccctcct 22080
gtgtgggagg atctctaacc cctctgatcg tggcgcatgg cttggggatt aaactaccct 22140
tgaagaggac ccttgtccca aacccttctt gttctctcct ccaaaagtag cttcctccaa 22200
cccgcagcct ctctgcacac taataaaaca tgtggcttgg aaaggttca 22249
<210> 2
<211> 1043
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Pro Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val Glu Asp Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Pro Leu Val Glu Glu Ser Leu Leu Lys Asn Leu Gln Leu Arg Tyr
20 25 30
Glu Asn Lys Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly Asn Val Val Ile Ser Val
35 40 45
Asn Pro Tyr Gln Gln Leu Pro Ile Tyr Gly Pro Glu Phe Ile Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Asp Tyr Thr Phe Tyr Glu Leu Lys Pro His Ile Tyr Ala Leu
65 70 75 80
Ala Asn Val Ala Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Gln Cys
85 90 95
Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ser Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys
100 105 110
Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val Cys Gly Lys Gly Glu Gln Val
115 120 125
Asn Ser Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala
130 135 140
Phe Gly Asn Ala Lys Thr Ile Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Met Asp Ile Glu Phe Asp Phe Lys Gly Ser Pro Leu Gly Gly
165 170 175
Val Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Val Lys Gln Leu
180 185 190
Lys Gly Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Asp Glu Gln Leu Leu Lys Ala Leu Lys Leu Glu Arg Asp Thr Thr Gly
210 215 220
Tyr Ala Tyr Leu Asn His Glu Val Ser Arg Val Asp Gly Met Asp Asp
225 230 235 240
Ala Ser Ser Phe Arg Ala Val Gln Ser Ala Met Ala Val Ile Gly Phe
245 250 255
Ser Glu Glu Glu Ile Arg Gln Val Leu Glu Val Thr Ser Met Val Leu
260 265 270
Lys Leu Gly Asn Val Leu Val Ala Asp Glu Phe Gln Ala Ser Gly Ile
275 280 285
Pro Ala Ser Gly Ile Arg Asp Gly Arg Gly Val Arg Glu Ile Gly Glu
290 295 300
Met Val Gly Leu Asn Ser Glu Glu Val Glu Arg Ala Leu Cys Ser Arg
305 310 315 320
Thr Met Glu Thr Ala Lys Glu Lys Val Val Thr Ala Leu Asn Val Met
325 330 335
Gln Ala Gln Tyr Ala Arg Asp Ala Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Ser Arg
340 345 350
Leu Phe Asp Trp Ile Val Asn Arg Ile Asn Glu Ser Ile Lys Val Gly
355 360 365
Ile Gly Glu Lys Lys Lys Val Met Gly Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe
370 375 380
Glu Ile Leu Glu Asp Asn Ser Phe Glu Gln Phe Val Ile Asn Tyr Cys
385 390 395 400
Asn Glu Lys Leu Gln Gln Val Phe Ile Glu Met Thr Leu Lys Glu Glu
405 410 415
Gln Glu Glu Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Pro Trp Thr Lys Val Asp Tyr
420 425 430
Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Lys Leu Ile Glu His Asn Gln Arg Gly
435 440 445
Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys Leu Arg Pro Gly Val Val Ser
450 455 460
Asp Ser Thr Phe Leu Ala Lys Leu Asn Gln Leu Phe Ser Lys His Gly
465 470 475 480
His Tyr Glu Ser Lys Val Thr Gln Asn Ala Gln Arg Gln Tyr Asp His
485 490 495
Thr Met Gly Leu Ser Cys Phe Arg Ile Cys His Tyr Ala Gly Lys Val
500 505 510
Thr Tyr Asn Val Thr Ser Phe Ile Asp Lys Asn Asn Asp Leu Leu Phe
515 520 525
Arg Asp Leu Leu Gln Ala Met Trp Lys Ala Gln His Pro Leu Leu Arg
530 535 540
Ser Leu Phe Pro Glu Gly Asn Pro Lys Gln Ala Ser Leu Lys Arg Pro
545 550 555 560
Pro Thr Ala Gly Ala Gln Phe Lys Ser Ser Val Ala Ile Leu Met Lys
565 570 575
Asn Leu Tyr Ser Lys Ser Pro Asn Tyr Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn
580 585 590
Glu His Gln Gln Arg Gly Gln Phe Ser Ser Asp Leu Val Ala Thr Gln
595 600 605
Ala Arg Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Arg Val Arg Arg Ala Gly
610 615 620
Tyr Ala His Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Arg Leu
625 630 635 640
Leu Ser Arg Ser Thr Trp Pro His Trp Asn Gly Gly Asp Arg Glu Gly
645 650 655
Val Glu Lys Val Leu Gly Glu Leu Ser Met Ser Ser Gly Glu Leu Ala
660 665 670
Phe Gly Lys Thr Lys Ile Phe Ile Arg Ser Pro Lys Thr Leu Phe Tyr
675 680 685
Leu Glu Glu Gln Arg Arg Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile
690 695 700
Gln Lys Ile Tyr Arg Gly Trp Arg Cys Arg Thr His Tyr Gln Leu Met
705 710 715 720
Arg Lys Ser Gln Ile Leu Ile Ser Ser Trp Phe Arg Gly Asn Met Gln
725 730 735
Lys Lys Cys Tyr Gly Lys Ile Lys Ala Ser Val Leu Leu Ile Gln Ala
740 745 750
Phe Val Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys Asn Tyr Arg Lys Tyr Phe Arg
755 760 765
Ser Glu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Asp Phe Ile Tyr Lys Ser Met Val
770 775 780
Gln Lys Phe Leu Leu Gly Leu Lys Asn Asn Leu Pro Ser Thr Asn Val
785 790 795 800
Leu Asp Lys Thr Trp Pro Ala Ala Pro Tyr Lys Cys Leu Ser Thr Ala
805 810 815
Asn Gln Glu Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Gln Trp Lys Cys Lys Arg Phe
820 825 830
Arg Asp Gln Leu Ser Pro Lys Gln Val Glu Ile Leu Arg Glu Lys Leu
835 840 845
Cys Ala Ser Glu Leu Phe Lys Gly Lys Lys Ala Ser Tyr Pro Gln Ser
850 855 860
Val Pro Ile Pro Phe Cys Gly Asp Tyr Ile Gly Leu Gln Gly Asn Pro
865 870 875 880
Lys Leu Gln Lys Leu Lys Gly Gly Glu Glu Gly Pro Val Leu Met Ala
885 890 895
Glu Ala Val Lys Lys Val Asn Arg Gly Asn Gly Lys Thr Ser Ser Arg
900 905 910
Ile Leu Leu Leu Thr Lys Gly His Val Ile Leu Thr Asp Thr Lys Lys
915 920 925
Ser Gln Ala Lys Ile Val Ile Gly Leu Asp Asn Val Ala Gly Val Ser
930 935 940
Val Thr Ser Leu Lys Asp Gly Leu Phe Ser Leu His Leu Ser Glu Met
945 950 955 960
Ser Ser Val Gly Ser Lys Gly Asp Phe Leu Leu Val Ser Glu His Val
965 970 975
Ile Glu Leu Leu Thr Lys Met Tyr Arg Ala Val Leu Asp Ala Thr Gln
980 985 990
Arg Gln Leu Thr Val Thr Val Thr Glu Lys Phe Ser Val Arg Phe Lys
995 1000 1005
Glu Asn Ser Val Ala Val Lys Val Val Gln Gly Pro Ala Gly Gly
1010 1015 1020
Asp Asn Ser Lys Leu Arg Tyr Lys Lys Lys Gly Ser His Cys Leu
1025 1030 1035
Glu Val Thr Val Gln
1040
<210> 3
<211> 23212
<212> DNA
<213> 犬（Canis lupus）
<400> 3
gcggattccg ggcctggaga acaggagacc tgggttctgg ttccagctcc gccaggttgg 60
cagtggtgtg atcctgggaa aggggcttct caccctaggt ctgttttctc cctgtgaaac 120
agaggatctg tagtcctttt tgcctctgac acagaggctg cttccactta cacctgggat 180
tatgtgctga tggcacttcc actggcttcc tcctcacttt ctctttccct tgcctttttt 240
ctcccttcag atatatatag gagatcaata aatcatgtaa gggcaggttg ataatggaac 300
tgctgatggg ccagtcatct gcagagtgct tctatgagag cagtaaagtt tggaccttga 360
accaagcagc tgtggctggg agttggagga tccagtctct ttgcagctaa gtgtgtgtaa 420
tgacccattt gctctttgtg catgcctggg agagagtacg gtaggcagag ggagcctgtt 480
taggaatttt cctgggtgga tgagggggta ccctggtgaa taggattgta taagctcctt 540
atctattgga ggcagctatt tccagctggg ttagtacccg ggaagcagca tatcagggtc 600
tcattcaggt tcctcataca gaaggattaa aattaggaat accaagattt gggctcaaag 660
ctgtggccaa ctgagggtca ggaagctgca ttctgttcct gccacatact gtctgtggaa 720
cctctctgag cctcagtctc tgccgctaat tttcattttc aatggagtga gtagctgcac 780
tgcctagctc acagggtggt gtgattcagt gagatgatac aggtgggaat cggtgagctg 840
acatcgatac aaatgctggg tggtattact aactatagtg tttgggtctg tttgtggggg 900
ctgactcgtg gggggggagg ggaatttggg gattttatct gcttggttcc cccaagtaat 960
ggtaatgtca ttaataccct ctgacttggg atccctgggt ggcgcagcgg tttggcacct 1020
gcctttggcc cagggcgcga tcctggagac ccgggatcga atcccacatc gggctcctgg 1080
tgcatggagc ctgcttctcc ctctgcctgt gtctctgcct ctctctctct ctctctgtga 1140
ctatcataaa aacaaacaaa caaacaaaaa aaccctctga ctcccaatga gataggaagg 1200
tttgaggcaa gtactgtttc tttgctagga agacacccca gcctaccttc ctctgacaac 1260
atttctgact ttttggaaaa gctttccctt ggctataaat cccactcttg ctcttatttc 1320
caaatttggg gggcagtgga gcaagatgtc tacctgagcc cagccaaata ccctttccta 1380
cctagaaggg gttttctcat gtcaccgagc atctccctct ggggcttcag gcctgggaag 1440
ggttaatcga gccacaccct cagcaggaac agcctcggac tttgtgctga gcagccatct 1500
ctggcctctc ctggcttgat tggcacaggg agccttggtt ggaggaggca gcacagtgga 1560
aggtcagaag cgtggacact ggcgagagga gggaaacccc tttcctggcc tcttggacac 1620
catggacagc tcccattaac gaggatacct ctccattctc cgggccttga gactcctatg 1680
cccccttcct gtcaaattgg gatttcattc accattctcc aagggacacc ctagctccgg 1740
tgttgggtga gtcttaccct aacctgtcac tgctctgcac atcttggggt gccctattct 1800
ggggactgct tctttttccc cttccctccc tccaaccaat cacattccca ctcccctcaa 1860
atccaaatcc aaatccaagg aagatggctt cttccagccc tgcttctact gctcaccatt 1920
gcctgccccg ttacttaaga acttaacttt tattttttaa tctgaaaaat gtgggatgat 1980
aataataact acttcaaggg aatattgttt gtaagcatca aatgaattca tatatgtagt 2040
gtttagagcc ttgcctggcc catggtacct gattgtcaga gattgctatt gtcactattc 2100
tttttttttt ttttttaaag attttattta ttcatgagag acacacacac agagaggcag 2160
agacgcaggc agagggagaa gcaggccccg tgcagggagc ctgatgcggg actcgatccg 2220
gggactccag gaccatgccc tgaaccagaa gcagacgcct aaccactgag ccacccgggc 2280
gtccctattg tcactattct tattgctctt agttttgtcc ttccaagaag tgacaagtgc 2340
tctcattttc tggaacttgg ggaaagcaga gtgaaggctg aaagtagcca gtgttcccct 2400
cttgccccac cttccatttc ttcttccctc ccctcccccg ccaggtttag cattgctgga 2460
gactggaagg atgtggcttt tttatttctc ttagggagta gccctgacca ttgtactaat 2520
gattctgttc tgcaccaggc caccccacct actcagtccc acaggaaaga ctgagggggg 2580
ctgggcttcc tctagaggtt acaactgcca tgtgcccact gcatggggac tgagcctcac 2640
aatgactctg ctcctcctag cccactccca ccagctacta aaaagctagg tgtgtccctg 2700
tggggcaaag tccatgccgg aaggttacag caatgggtgt aaaagctgga gatggaaaaa 2760
cagggacaga catataggca tatacagaga tcgtgacagc tacttgatgt tggagaaacc 2820
aacctaatgt ttgtttagga tattctaatc ttttttaaaa aatatatttt attatttatt 2880
tgagagagaa tgtacgtgag cagggaggag gggcagaggg agagggacaa gtaaactcct 2940
tgctaagcag ggggctggac atggggctcg tcccaggacc ctgggactca tagacctgag 3000
ctgcaggcag atgctccatt taattatttt ttaagattta cttatttatt catgagagac 3060
agagagaggc agagacacag gcagagggag aagtaggctc cctgcaggag cctgatgtga 3120
cacttgatcc caggaccccg ggatcatgag ctgagccaaa ggcagacgct caaccaccga 3180
gccacccagg caccccaagg agcaggagat tctcctcact ggaggagagt ttccacaact 3240
tcccacagct agcttgggct agtccagagt ccaccttggg ttgaggactc tctagggcta 3300
agagttggag aggaaggctc ttaggtcctt ctgcccactt ccccccacac agctactggc 3360
ccctaaagct gaggagactt cagcaaactg attcctctat tctcaggatc ctctggccat 3420
gaatctcctg gaaggctctg tgggggtgga ggaccttgtg ctcctggaac ccctagaaca 3480
ggagcctctg ctcaagaacc tccagctgcg ctatgaaagc aaggagattt atgtgagtgc 3540
atctgggtgc ccctggctgg gggtgtgtgg ccagagagtt catgggctcc tatcccttcc 3600
tccccctcca aacaccccct acccccccac ccctgctcat tctctttacc tttttttggc 3660
tctagaccta cattgggaat gtgttgatct cagtgaatcc ctaccaacaa ctgcccatct 3720
atggcccgga gttcattgcc aaataccagg actatacctt ctatgagctg aagccccata 3780
tgtatgtaaa gtggccaagg gaaggctgac cgggccccag cttcctgaca gcgacacacc 3840
ctagtttcct tcatcctttc tcctgagggg gggctctcca gcctccccct tcccccctgg 3900
ccccaggaag cccctttcct agacctacca ctgcctcagt ctagtccaag tgaggaggga 3960
ggatgactct gggggctgga gatggagtga aagctggtgt cttagattaa ccccaccttg 4020
gtcatcacct gcttcctcca cccaagctac gctttggcaa atgtggcata ccagtcgctg 4080
agggaccgag accgagacca gtgcatcctc atcacaggcg aaagcggagc tggcaagacc 4140
ggtgaggcgc ctggctaggg gaggctgtgc aatccctgct agaactactc cctcttctct 4200
ttctctttcc aagccaggcc tggtcctgcc ccaccccaga aattccttct cggcttgtct 4260
gatcctgagg gctgtgaggt gcgggactta aggggcatta aggagggtgg tggggatcca 4320
tgtgaaggtt tctctttcac agaggctagt aagctggtga tgtcttacgt ggcggctgtc 4380
tgtgggaaag gggagcaggt gaactccgtg aaggaacagc tgcttcagtc aaacccggtg 4440
ctggagggtg aggattccag tctctcttgt gcaccccagc cctaccctac tggccccaga 4500
gacactcagc cctgttctca ttctgcctgg aaaatctgag actggcatga tggctagaag 4560
accttcctcc ttccccttct ccagagcccc cctctcccct ccgatctcct cacctcccct 4620
ctctccatct ctgcagcttt tggcaatgcc aagaccattc gcaacaacaa ctcctctcga 4680
tttgtgagtg atcatctccc tggcctgaga ggagagggtg tgggggcttg agaaggaggg 4740
atgtggcaca gaccctgccg gacagggtgg tgagcagagg aagaagcaag gtctctctct 4800
ctttctctct ctctctctct ctcacctctg aagggaaaat acatggatgt tgagtttgac 4860
ttcaagggat cccccctcgg tggtgtcatc acaaactgta tgtgtctccc catgctgcca 4920
accacctctc tcgcctccct ggcccacagt tccctctttg cccatttgct atcgtgggaa 4980
ggaacagtag gctggcagga gactgcccag gcacggggga tgccagcgcc gagggcagac 5040
ttggagggaa gcggtggcgt ccccccgttc ctcaggatgc tattttctaa ccccttctgc 5100
cagatctgct tgagaaatcc cgagtggtga agcagctcaa aggagaaagg aacttccaca 5160
tcttctatca gctactggcc ggagcggatg cacacctgct gagtatgtgc ctgtcccaga 5220
cacacaacag aagagcccca acctccgttc agtccctaga gccttgggcc cctctgggtc 5280
cctgcagccc tcattcctct tcctgcgctc ctcactcagc atctcatctg ctcattgttg 5340
ggaacaatcc cctgacctct gtgttctctt ctttttcggg gattgtattg ctaggaagaa 5400
gccttcttgc ctcttgacct cctcttactc ctctctcctg cttgggttcc tctttcccca 5460
ggctggcttt aaaagcagaa cacttatttc catttttcat tctttcctac cttcaattta 5520
agggactttt ttgatagctc agcagaaaat catgcaggat attataagtg gtcaggaact 5580
tttgatgagc tggagttgaa gttgttctgg gtctacctcc acctcatcca ggccctggcc 5640
ctggtttact cttcttagat ggttttatgg gggttccatt tattcattca tcaaacatct 5700
cttgaacact tactgtgatg gaacattgtg ctagtctcta gcgattcaga agtgaatatg 5760
acatggaccg tgtcctcgag aacttgtggt cttccaggga tggcagatgt gtgagcagaa 5820
acactgcaaa atacagtgtg atcgagtgcc aacaggtctg tgcaggtggc tatgggaggg 5880
gaagtcacgg aacactctgc ttgtcccagg gagccctgga tcctcgatgg gcccaaggtg 5940
gctctgggtg ggcatcactg cagagtctgg tgggacttca ggccttgcca gagtttgcct 6000
cccaatcctg cctctagctg tgagcactgt gggtatctgg ccccaaggac ctgtcgattt 6060
ggcttctggt tgttttctgc tggacttgta tctatctcct ttcccttcct ggggatttcc 6120
gtggtttgag agcccctgca ggtctcatta ttccttcctg gctcagtggt cttggttgtg 6180
ttcagtgtgt ctgaatcata ggcactagta ccttgttctg gttgattctg ttacccattg 6240
atgtaagcta agtctggctg ggacctccct tgtgtcatca tccctttctg actcattctt 6300
tgtccagata cctctcttta gtaggttcct gtttcaaaat ttgtgtttct ggggaagctg 6360
ccattaaact gtagtttgag ggatattccc tgattctcag atcatttgaa taacagataa 6420
ttgatatcct tcaagctcca tgcttaacct attccttccc atctcaggtg aacagctttg 6480
actgttccct tgattaaaaa gaaagaagtt tgtacatgcc aggcaggcac acagagtatg 6540
aagattaaaa tgtcccaatg ctcaagttgt tcatttgtgg gagagacgga aaaaaacaaa 6600
aacctagccc atgtgttatg ggttgggata gagatccacc atggggatca caagagaacg 6660
gctcagcccc acaacgtcag agaaaatctt ccagaagagg ggtcaggatt ggggaacata 6720
gcatctgcct tttgttggcg cttagtgaac aaataatgaa tgagctaact ctggccaacg 6780
gtaagatgtt gaggctggat aggagatatg cgcccgccct tctttcctca cctttgtcct 6840
ctcagagcct ctgagaactg agcagggtgg agagtttgct tatttatttt tattgtttag 6900
aaactgaagg tgggaagaag agtggaatga gtcttttctt tcataaaagt cggaagaaaa 6960
ccccaacaat taagaacatg caaaccctaa atactgctta aaaatttagt ctattattgt 7020
ggaaactaat gatccccaca caaaggaggc tggggcagag cctaaaacga aaatggttcc 7080
tttgaatgag caagtaaacc aagccagggc aggggctgtg agcgtcaagg ccagaggact 7140
cctgagagct ccgagtacta accttctcct cacactggcc ctcccagcgg ctctaaagct 7200
cgagcgagac acaagtggct atgcctacct aaaccagaaa gtgtccagag ttgacggcat 7260
ggacgacgct gccaacttca aggctgtaca ggtgggtgcc tggggtgggc ccttaggctg 7320
tccccggagc ccaggatttg gctttgagaa gggaggcgtt gagctggcac cgcacagttc 7380
agcttctgat ttctgctctg tcctcaagag tgcgatgatg gtgattgggt tctcggagga 7440
ggagattcag cgggtgctag aggtgacggc cctggtgctg aagctcggga atgtggagct 7500
ggcagacgag ttccaggcca atggcgtgtc agccagtagc atccgggatg ggaaaggtct 7560
gtaccgccct gctggtacct gtctcctgca acaccaggtg gctccttgaa gctcctacta 7620
caatttctat tttttcacca tctcctgtgt aactgacttc actcccattc ggtgtcactc 7680
agcctgttcc tgagttcttc cccaaacaca ctcatggaga atccccaggg aggcatttgg 7740
gaatgaggtt atgaagtttg atagacctac attctgggac ctctctgagt ctccctggag 7800
tctttgcaaa gaacctcagg agattctcct cgtaaagcag ataatgcact cagtgtccag 7860
agctccctct ctcttctcct cctcagagat ttctcctggg ccatgctctg gatgggctgt 7920
aaggacattc tcagcaagac ccaggggcac ttgtctccca gcagtgtcat gtctcagccc 7980
ccctccctct ctgggaggga atcccttttc caggccatgc tgtatttcct ccccacccca 8040
ggtattcagg agattgggga aatggtgggt ttgaattcag aggaactaga gaaagctttg 8100
tgctcaagga ccatgaaaac agccaaagag aaggtagtca ctgccctgaa tgtcatccag 8160
gtaaggtccc tatgggagga gggtgatttg gggacccttc tgtggctgcc atcctaatga 8220
gctggctctg ccctgcaggc tcagtacgct cgcgatgctc tggctaagaa catctacagc 8280
cgccttttca attggatagt gaatcgaatt aatgagagta tcaaggtaag agattactct 8340
cctccctcct gtctgcctca cctttcttgc cctggtcacc actcccatac tttgggttct 8400
gagatgaaca gagtaagaag gatgaatggt aggatacagt tcctcccaat agtgcattgt 8460
tgtggaaaca tctctggttt tttgagtttg actctctgga tcccctactt accagctgtg 8520
tggcctttca gtttcacaga gattctgagc ctcagtttcc tgatttggaa aattggacac 8580
taatgcctac ctgtttcaca gggcttagtg aggatcagat gaggatcaga tatcagaaat 8640
tccacaccca gatatatatt taagatatat atctaagaga tttgaaaaca ggtgtccact 8700
taaaaaccgt acccatgggg atccctgggt ggctcagcgg tttagcacct gcctttggcc 8760
cagggcacga tcctggagtc ccaggattga gtcccacgtc gggttcctgg catggagcct 8820
gcttctccct cctcctgtgt ctctgcctct ctctctctct ctctcatcaa tcaatcaatc 8880
aatcttaaaa aaaaaaaaaa aaacagggat ccctgggtgg cgcagcggtt tggcacctgc 8940
ctttggccca gggcgcgatc ctggagaccc gggatcgaat cccacatcgg gctcctggtg 9000
catggagcct gcttctccct ctgcctatgt ctctgcctct ctctctctct ctctctctct 9060
gtgtgactat cataaataaa aaaaaaaaaa aacagtaccc aaaagttcat agaggcatta 9120
ttcatactag ccaaaaagtg gaaatgactc aaatgtccat ccgttgatga tagataaaca 9180
aaatgtggta tattcatata atgggatatt atctggccat aaaaaggaaa gaagtactaa 9240
ttcatcctca acatggataa accttgaaaa catacaagga ggagaagcca gacacagggc 9300
acatattgga tgattccatt tatataaaat gtccgaatag acaaatccat ggagattagg 9360
aatagattta tggttagcag ggacttaggg gatgggaagt tggagtgact actaatgggt 9420
atgggtataa gatttctttt tctttttttg gggggggtat aagatttttt ggggggatga 9480
tgaaaatgct ctggaattag gtagtggtga tggtcataca ccttttgaat ataccagaaa 9540
aactcactga agtatatacc tttaaaagta aattttatgg aatgtgaatt ggatcaaaat 9600
agagctattg ttcaaaaatt ctgtacatga aaatgccatc aattcagaag ctattactga 9660
aaggcagcag gagaaaatag gatttgaatc taggtttggg taaacgctta gccctcttga 9720
aatttgattt gttcatctgt aaaatgggaa taatcacacc ttacgggtta tcgtgaggtt 9780
taatgaagta agagcataga attttttgta aaatgctcta caaatctaag agatgattat 9840
tttcctgaga ggatcttaat gtcttcctga ctcccaccct tgggagcacc agcctggaat 9900
ctgttcatat ctcccttctc ccttcctttg cttgtcctct agcaggaagg aagaataaaa 9960
tcacaacatt tctttcccag catggtcaat ctctctctct ctctctttaa agattttatt 10020
tatatattca ttagagatac acacagagag agaggcagag acataggcag agagaaacag 10080
gctccctcca gggagcctga tgtagaactt gatcccgggg tccctgagcc aaaggcagac 10140
gctcaaccac tgagccaccc aggtgtcccc cagcatggtc aatctcactc gagtttgcct 10200
tctgctccaa tcacctccct ccagatggcc ctggcctggt gtacagagga ggcccatcct 10260
tagagttatc ttttccttcc cttcaggtgg gcgttgggga gaagaagaag gtaatggggg 10320
tcctggatat ctatggcttc gaaattttag aggtgagaga gcttcaccca attgcaacac 10380
cctgctcccc tgggcttgga atgtgtagac tcaaaggggg tggtttgaga gaggggaggt 10440
gtaaggccga gagggaaggg tcttgggctg agctgctccc tctctgcact gggtcccttc 10500
cctcaggata atagctttga gcagtttgtg atcaactact gcaatgagaa gctgcagcag 10560
gtgttcatcg agatgacgct gaaagaggag caagaggaat atgagagaga ggtacgctga 10620
gccttccccc acttaccttc ttggaaatta cttctgggca tgtgccagat ctgtcctttc 10680
ctccatcaca atttcctctc acttgtcccc agatgggaac acaaaggaca aaaagtttcc 10740
cttgcacagg tgaacaacag tctagcatta cccagaagcc ctggttgttt ttattttttt 10800
aaagatttta tttatttatt catgagagac agaaatagag gcagagacac aggcagaggg 10860
agaggcaggc tccctatggg gagcccgatg cgggacccaa tcccggatcc ccgggatcac 10920
agcttgagcc aaaggctcaa ccatcaagcc acccaggcgt cctgaagtcc tggtttttat 10980
tctccatccc ccagtccccc tgctcctctc ctccaccccc tgtaggccac gcaaagaagg 11040
gtcacactga tggaagggtg tgtgtgggga gacctcacaa gggtaaggtg acagctgtgc 11100
gtggcctgcg gcacgctgtg agccagattt agcagggaca tttctcttgg ccttgtcacc 11160
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ctggctgatg tcagcgtccc ctcttgtagc accctgatcc cagacttcct cctcagacgt 11280
gccccgtggc tcaacatttc cacactcctt ccctggttcg cgaggacctt tgttttctat 11340
ggctaggtgt tagaaaagct atctaattga gctaatccac cccaaagtgt gaacagctga 11400
agtctctcat caaaaccctc ctagggatgg ctgcctgtga gccttcagaa atttcctgtg 11460
cagaatttca gacagcgtgg tcacgatgcg ggggaaaggg ttttctttag ttgtgttgta 11520
tcttttaatt ttaaaaattt aaacgatcag atacagaata cattcctata cttccaaatt 11580
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ctccctctgc ctgtgtctct gcctcttttt tcctttcttt ttaagatttc atttatttat 11760
tcataagagg cacagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagata ggggcagaga 11820
cacaggcaga gggagaagga ggctccatgc agggagccca atgcaggacc taattccggg 11880
tctccgggat cctgccctga gccgaaggca gcgctatgcc gctgagccac ccaggctgcc 11940
ctgtgtctct gcctcttgat gtctctcatg aataaataaa taaaatctaa aaaaaaaaaa 12000
aaaaaaaaaa aaaaaaaagg agacgaagca ccttaacgaa ctgagccacc caggtgcccc 12060
cattcttttt tttttttttt ttaatacatc tgaggttagg ctgctaggat tttttttaaa 12120
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caccacagca cctacagggc tctctgcagc atctcccact ccctcacagc tgctttgggt 12780
cctcccatga gtctatccac tcacctcacc aattctccac caacgtagaa gggatgggaa 12840
cctaaacaga aaccacacca agcacccctc ttaactatag gatttttctg agccctttgt 12900
ggggtgggtg aaaggaagcc tgagtcccat gaggtcttcg aagacttgtc ttggacctgc 12960
tcctgtaacc tgtcatgtct cttcttgcca gggcatacca tggacaaagg tggactactt 13020
tgataatggc attatctgca acctcattga gcatgtgagt tacccttctc tcatctctga 13080
gacctacttc ctcttccaga aactgcctga atatccttgc cctgtctctc ccatcctctt 13140
ccactgctcc acttggtaag gatggtaagg aggacaaagg atgaggtgca gtggggcggc 13200
agtgaagatg tggacatatt ggagaacctg gcctacgttg ggctgatctt gtttccctga 13260
ccagaatcag cgaggcatcc tggccatgtt ggatgaggag tgcctacggc ctggggtggt 13320
cagtgactcc accttcttag caaagctgaa ccagcttttc tccaagcatg atcactatga 13380
gagcaaagtc acccagaatg cccagcgcca gtatgaccac accatgggcc tcagctgctt 13440
ccgcatctgc cactatgcgg gcaaggtgac acagcagggc tggagggtag agactagggc 13500
tggacatgag tggaaggcaa tgggggaaga aactgctggg agatgatatt tgggaattct 13560
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ctgttcctct acaggtgact tacaatgtga acagcttcat tgataagaac aatgacctac 13680
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tccctgaggg agatcccaag caggcatctc tcaagcgccc cccaactgct ggggcccagt 13800
tcaagagttc tgtggctata ctcatgaaga acctgtattc caaaaacccc aactacatca 13860
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ccgtgcgcta tagaatttgt ccattgcagc aggggtggga tggtctctgg aaaagcctca 13980
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cagagaccag gatgggtcat gcttgcaaag gtgaagctcc tgaggcctgt gccttgcacc 14220
cttctacccc aaggtgtata aagcccaatg aacatcagca gcgaggtcag ttctcctggg 14280
atctggtggc catccagact cagtacctgg gactgctaga aaatgtgcgg gtgcgacggg 14340
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ggagcacatg gcctcgctgg aatgggggag accggtaagg cccctgggga agactgggga 14460
gcagggaagg gcagggcggg aaccatctgg gggctgggga gagagcagag agtgccatgg 14520
aaatcaccaa agctctgtga atagatacct ggggaaatgg atgatcactt ttcagaagtt 14580
ctgaagtcta ttcaagccct gaactcttct ccctgggtat atggagttga cgaaaggtga 14640
aagaagaccc ttccctggga tgcccctgag cagctttccc tatctgttcc tgtagggagg 14700
gggtcgagaa ggtcctggga gacctgaact tgtcctcaga ggtggccttc gggaagacaa 14760
agatcttcat cagaagcccc aggacagtga gttggagagg ccccttgtgt ttggcggggg 14820
tgggaggcag agggttggag agcccacgag tgagatgctg gggtaacggg cagcatctgt 14880
aactggagat agatggtggg tgaggaagtc tgttctcggc aggggctttg tccctgggac 14940
ctgaatcctc gggctaccac cctgccctga gccctggcag ttaggtgctt gcacggttca 15000
ccctgagtgc ctctagctga actaggactc ttgaggctcc gggggatgtg ccactcctgt 15060
ctgagtgtct gaacctagca caggcctggg acagagttta gtaggtgcct gttgagtgag 15120
tgaacagctg aatgaaggtg ctaaggaagc actggctggg aaggccctgg cacccacggc 15180
accggagagt agcacagttt ccccaggcca gcctttctgc ccctctttcc ccatttctgc 15240
agctgttctt cctggaagag cagcggcgcc tgcgcctgca gcagctggcc acgctcatac 15300
agaaggtcta cagaggctgg cgctgccgga ctcactacca gctgatgcgc aagagtcaga 15360
tcctcatctc ctcctggttt cggggcacca tggtattggt caccccccag tctgatcccc 15420
atcactccga taagaggctg gaagcaggag agagatggtt cgggacatgg agtttcttct 15480
aacagtccta ttcttttctg cagcaaaagc aacgatacga gaagatgaag gcatcagcag 15540
tgttgatcca ggcttttgtg agagggtgga aggtaatggg gaattgcaga ggggtttcct 15600
cccctacgtg ggcccttccc ccatgtggct tctcctggat tgtgccagct gctggggaga 15660
aatatagtag cagaaagcaa gtcctgccca cacccaggac gtcctgtgat gtgatggcat 15720
gtctgagtct gggtgtgttt ccgggtgcac tgatgtgtgt ctgggagtgc gggtgcgcat 15780
tggggagaga gtatgtatgc ctggatgcat ctcccacctg gcggcagagc tctgcctgct 15840
gctttaagcg ccctcctctt ggccaacgtg tctgcctgta cactctccct ccagcaccag 15900
ctcggctctt gatctttctg tgtcctttgt gtgggtgaga gacagtagaa cctccgctag 15960
aacctcctct aggtctaact gtctatcttt attttggctc ctttcttgaa tgtccttgcc 16020
aggcccgcaa gaattatcga aaatacttcc gatcaggggc tgccctcacc ttggcaaatt 16080
tcatctacat gagcatggta agtggtaggg gtcaaaagtg gaaggtgggg ggttgaggag 16140
ggagggacag gtttggaaaa ggaagatgag ggatttgaga agatgtgact caaagttttc 16200
ctccaaaaag cttctccact ctgcttgtac ttaatttttt tttttaagat tttatttatt 16260
cattcatgag agagagatag gcagagggag aagcagggtc cacacaggga gcccgacgtg 16320
ggactcgatc ccaggtctcc aggattgggc cctgggctga aggcagtgct aaaccactga 16380
gccacccggg ctgccctgta cttaattatt aagtcctagg atacaacgta acggggcagc 16440
aacccacagg gagcaggctc cagtgtcccc tcgtgcattc tggcatgagc ggacactgca 16500
ggcaaccttg tggcgggaag gggccccagc acaccctcac tggtccatag tgaatagttt 16560
tgagaagaga tgggctgggt ggttaacaac agtggaagag tctgagcctc gtggaagagt 16620
gctgtgaaga tgcacacagg gtgaattaac ccagccttcc aagatccatt ttagggttgg 16680
ggtgaaggtg gaggaatcat atctcttttc cacctcctct gaaactagag caagtgagtc 16740
caaaaattaa atctcaggaa agatcttaat tctggaagac ttgactccag gtggcaagac 16800
gaagccagga catcaaacta tgggcagttt ccagtgagag gaaagcagac agaggaggct 16860
ggtttctgga gatgtccacc caatagcgac ggtgctcctg aagagtggtg agggacagca 16920
gacaggtagc taggagcatt tccagcaaaa ccttgagaaa ggccagagag agggagggag 16980
agcaagacat cttggacaga gggctgcggt aaaagagaac tggcttctgc tgattctgtt 17040
tttgacagtt gttagggctc ttactaatta tgcttgagag acacactgga gctccccttt 17100
gtggttggag aggcgggatt cctaggtcga attgtggaat gaggtctctg gtctccttat 17160
cacctcccta agtgttcact gtgcccctct ctcgccccag ggaggttcca tcttcccagc 17220
cctcttccat tgcctgtgtc tccagctggc tgtagggcgg ctgccttcct agaggacatg 17280
ctgtcttgct gcatacctga ggcctgcaat ctgatttgac acttatctcc agactgatcc 17340
ctcctctacc ttttctttca cctgtacatt atcaggcatc tgctgaatgt caccccagga 17400
gctgttgggt ttagactaat atctcattga atcacaaccc ctgcagaagc atgcatacag 17460
gggccactcg gcatcgattc ctccagtgtt tctaactagt ctgtattctg ctgttgcctt 17520
gcctataacc aatgctgata cttattatct tttgaacact tactatgcgc taagcccttc 17580
acatgcatta actctaatgc tgtcaaaaat cctgtgaggt agattcttgt ctttcccaca 17640
ttttgtaggt aaaaaactga ggcctagaga ggctgagtaa ctcactaggg gtcccacttg 17700
tggtaagtgc aagagagctg ggatacaaac tctttgactc cagagtttta acgcctgcct 17760
gagattgtct ccccacactg tccccccacc accacccata gaggcctact cggggcagaa 17820
gggctataaa gggaaaggca ggactttcta gatctagaaa aaacaaacac ttaaaaaaag 17880
aaaaccctca gaggttccac atcaattaga acatggggga ttgcatgaaa tgcttaggaa 17940
tatttattga attaaatcaa actagaccag accaaggact ggggatttaa acgaaggtct 18000
aaggtgatta gaccaagcct gctagatctt tgtagtggaa gaatcaaaga gcttggatag 18060
ttcttagagg ggtacagcaa tatactgagt gtattgcctt tttctcttac aatttttcta 18120
aactaatgtc ttagtagaac attttttata aaaataccca aaacgtggaa gtgctcaaaa 18180
atcaagtcat tttttaaata atttattttt ttttagagaa agagagcatg agtgagtaag 18240
gcagagagag gtgggggagg ggcagaggga gcgagagaat cctgaagcag actctgagca 18300
gagcgtggag cctgacgtgg ggctcgagct cacaaccctg agatcatgac cttagctaaa 18360
atcaagagtt ggccacttaa cctactgagc ctgggcgccc caagagcaag ccattttctt 18420
tatcttcaag tctacctcac aaatagagtg ctgggtgctc cctgggctat aaagacttag 18480
gggtccttgt tcaaattggg ggagactaaa cagatgccat gggtgaaact tgattggatc 18540
ctagaacagg aaaaataaac acaaaacttt ttttaaaagg acatttttag aagtttataa 18600
aggacattag gaaaaatttg cacatgcatc gctgttggat gagtgtatct aattaacgtt 18660
agtcttctta cattggaggt ggaattatga tttgtatagg ataatgtcct agttcttgga 18720
agatacatgc ttaagtttta gggaaaaaaa tgtcatgatt tctataacct actttaggat 18780
gatatggtgg caaagattta tctatatgtg catatgtgtg tatttatata tttatactca 18840
ttggttatat atgtgtgcat gtgttagaga gcctgcaagt agggcaaggt gttaatatca 18900
gttggtgaat ttagggagga gtatatggta tacaattgtt tgctgtaatg tttttttaaa 18960
cttttatgta agtttaaaaa ctttcagagg cacctgggtg gctccatttg gtaaagccat 19020
ctgcattcag ctcaggttgt aatcccaggg ccttgggatg gagaccctgg tgtcaggctc 19080
cctgctcagc ggggagtctg cttctccttc tccctctgcc cctccccctt gctcatgctc 19140
tctctctctc tctctctctc tcaaataaat aaaatctttt ttaaaaagct ttcaaaataa 19200
gacaataagt tgtataaatt ttttaaaaat taagtcagat tatatcactc tttcccttaa 19260
aatcctttat ggtgttctgt ttcactccga ataaaagcca gtgttcttat ctcagcctac 19320
aaggcccttc atgacctgta cttgaccagc caactctctg atctcctctt gctcgattta 19380
atccagtcac tctttttgtt tctggaatat gctgtcactc attttctgtc tcagggccag 19440
cttttttttg cagcatagca tataaattta tctgacattc catgatatgt tcacttgctg 19500
tgggttgtct cctttcccac ccccagtaga gtgtaagtaa gctcaatggg aatagagacc 19560
ctgctctgtt cattgctgtg tctccatacc tagaacagtg tcaagcatag agcagacact 19620
caataaatgt ggaatggtga gggaaaaaaa actcagctgg ggatccagac ccccaaggac 19680
tcgctgtcta gaagaggaaa aagttttcca tgcaaataac agtagtccaa acacagaagt 19740
atagaccaag tgccatgggg cttcagagaa aggagaggca gccttggttt ggggaatcca 19800
ggaggacttt gaactacatc tcaaaggaca ggtaggatct gagtgggcag agctgagctg 19860
agcgtagaat gggctaaggc acagagtgat gatgcatggg ctggtcggag gccacgatga 19920
ggagtcctgt ctcagaggtg tgccgagatg gtgcagggga tcctgcagca cgaggctggg 19980
ctctaagtag aagacttcta atgccagatt gaggtgttgg gcttgactga tgagtgagga 20040
ggggagatgg ccactgcaga cagtggcggc cagctgtagg catgtgcgaa gtgagacagc 20100
cataggggca aaatatggag gccagttttc atcttggttc ctctcacctc atgaccctgg 20160
gcagcaggtc tctacttgga actaatcctt ccctcccttc ggtctcccat gcatgctctt 20220
actagccagc ctccatgctt ctccctctgg gtggcctccc tcttttttag tagcaggatc 20280
tggatgagaa tttgtctgtt gggaggtctt tcttctcatc agtccactcc caatctcccc 20340
ccgcccccgc ccccaccgtc tgcattccca atctagacac agaagttcct gctggggcta 20400
aagaacaatt tgccatctac caacatcctg gacagaacgt ggccagctgc cccatacagg 20460
tacttccaca cggctaacca ggagctgcag aaactcttct accactggaa ggtgagtggg 20520
gccggggagc ctctcctctc atttgtcttt ttcccctcct ccctctgatt ttcctcttct 20580
gcctccctct tccacttttt ttttttcttt aaagcataca tgacaaacct ggccatttta 20640
accattttta agtagacagt tccgtggcat taagcacatt catattgttg tgccaccatc 20700
actactaccc atctccatac tatttttcat cctcccaaac tgaaactctg aacacattag 20760
acagtaaccc ccagtactgt accagtaccc ggtaccagta accccccact cctccagccc 20820
ctggcatgta gactctactt tctctgagtc cgactgttct aggcacctca tataagtaga 20880
atcatacatt tgtcctttta tgtctggttt attgcactca gcacagtgtt ctgccatcgg 20940
gaaatactta tcgagcacct tctagactag gccttgcgct gtgtgctggg catacagcct 21000
tccctcctag ggctggcatt tgatcatctc catccgtctc ccccagagtc cctcagcccc 21060
cagtcctccc ccagccctgc cctctctgaa gtgctagagc ctcttccatt ccctgtctct 21120
cctcttctcc agtccctgcc ctccctccac ctctgagtac ccccccaacc ccccagcccc 21180
ttgcctccct gagcttagcc ccgaccctcc ccctcacagt gcaagagatt ccgggatcgg 21240
ctgtccctga agcaggtaga gatcctgaag gagaagctct gtgccagcga actgttcaag 21300
gacaagaagg cttcctaccc ccagaggtga gagcccctca ggccctgtgc atgtccattg 21360
agagcacaga gaggatcctc caggtgggat agggtggtgg ttcccaaact tgaatgtgca 21420
tcagcaccac ctggcaggct tgataacacc cagactgctc cacccccttc tcaaagtttc 21480
tgaatcaaaa ggtctggggc tgtgggccca agaatttgcc tttctagtaa gtccccaggg 21540
ggcgcagctg ttggtcctgg accatgctct gagaaccact gagatagagg atagggtgga 21600
ggatgggaaa agaagcacaa gaggactagg atggggcctc actgtgagga ggtgctgggc 21660
cttgggggtc aggggcaagg actgaggctc cactgcatac ctcctgtgtg tcctcagtgt 21720
cccgatccca ttccacggtg actacattgg gctgcaaggg aaccccaagc tgcagaaact 21780
gaagggtggg gcggaagggc ccattctgat ggcggagact gtgaagaagg tcaatcgtgg 21840
caacggcaag gtgaaggctg gcgtcctgag cctgctccag agccttgggg ctgctagctg 21900
gaggggtggg ggttagccct cacccttcct cacacttccc tcttctgtcc ctagacttcc 21960
tctcgaactc ttctcttgac caaggggcat gtgattctca tagacaccaa gagttcccag 22020
gccagaactg tcattgcgct ggacaatgtg gctggggtgt cagtcaccag cttcaaggat 22080
gggcttttca gcttacatct gagtgaggta tcagagctcc aggggtgcag gccctcacac 22140
tggaggtggt aggcatccca gggtcggggt gggctggagg tgatggggcc cagacccctc 22200
actctgggcc ttcaatacct cttagcctgc tcctatggaa gaaaaatgaa tcccttcctc 22260
attcttttcc cccttcctaa gatatcatca gtgggttcca agggggattt cctgctggtc 22320
agcgaacatc tgattgaact actaaccaaa atgtaccagg ctgtgctgga tgccacacag 22380
aagcagcttc cagtcaccgt gactgagaag taaggccatg agctggtgct gagggccagc 22440
ttggggacag atgaccaagc tgttggtcat tgtgaccagg agaatttgtg tagtcagaaa 22500
ctgaagcaca ctccgtcagg gcaaggctcg gaggtgcttc ttagtctccc cacccaagtt 22560
ctctggggcc ctgagtcttc tgactcgagg ggaggagatg tactaccttc aggaagggga 22620
gggaaagcca tagtgcaaat atgggagtag gggtgagggg atggggggga tgggctttac 22680
ccctctctat tccccgtcca gattctcact gaagttcaag gagaacagag tggatgtcaa 22740
ggtcatccag ggccctgagg gtggtaaaaa tggcaagcta agctgcaaga agaaagggag 22800
ccgttgcctg gaagtgactg tatagcgtgg aggtggaggc ttaacacaga gactgcagct 22860
ttgtctcctg gatcagggcc aatcccaccc acccactcac ccaccgaccc acccacgttt 22920
gtggggggat ctcatgtcca acccctctga cccttgtatg gggctcagag actgaagaac 22980
ccttgaagag gacctttcct ctcccaagct cttccagtcc cctctccctt agaacttagc 23040
ttcctcccac cctcaacctc cttgctcact aataaaacaa gtgacttccc aaacatttga 23100
ttaatgtggg tgggtccctg ttcccccacc tttgcagggc ttgtattttg tctgccttca 23160
cccccttccc ctccttgggc tccttggagc tagcaaatac agataataag aa 23212
<210> 4
<211> 1041
<212> PRT
<213> 犬（Canis lupus）
<400> 4
Met Asn Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val Glu Asp Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Pro Leu Glu Gln Glu Pro Leu Leu Lys Asn Leu Gln Leu Arg Tyr
20 25 30
Glu Ser Lys Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly Asn Val Leu Ile Ser Val
35 40 45
Asn Pro Tyr Gln Gln Leu Pro Ile Tyr Gly Pro Glu Phe Ile Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Asp Tyr Thr Phe Tyr Glu Leu Lys Pro His Ile Tyr Ala Leu
65 70 75 80
Ala Asn Val Ala Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Gln Cys
85 90 95
Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys
100 105 110
Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val Cys Gly Lys Gly Glu Gln Val
115 120 125
Asn Ser Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala
130 135 140
Phe Gly Asn Ala Lys Thr Ile Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Met Asp Val Glu Phe Asp Phe Lys Gly Ser Pro Leu Gly Gly
165 170 175
Val Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Val Val Lys Gln Leu
180 185 190
Lys Gly Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Asp Ala His Leu Leu Thr Ala Leu Lys Leu Glu Arg Asp Thr Ser Gly
210 215 220
Tyr Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Val Ser Arg Val Asp Gly Met Asp Asp
225 230 235 240
Ala Ala Asn Phe Lys Ala Val Gln Ser Ala Met Met Val Ile Gly Phe
245 250 255
Ser Glu Glu Glu Ile Gln Arg Val Leu Glu Val Thr Ala Leu Val Leu
260 265 270
Lys Leu Gly Asn Val Glu Leu Ala Asp Glu Phe Gln Ala Asn Gly Val
275 280 285
Ser Ala Ser Ser Ile Arg Asp Gly Lys Gly Ile Gln Glu Ile Gly Glu
290 295 300
Met Val Gly Leu Asn Ser Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Cys Ser Arg
305 310 315 320
Thr Met Lys Thr Ala Lys Glu Lys Val Val Thr Ala Leu Asn Val Ile
325 330 335
Gln Ala Gln Tyr Ala Arg Asp Ala Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Ser Arg
340 345 350
Leu Phe Asn Trp Ile Val Asn Arg Ile Asn Glu Ser Ile Lys Val Gly
355 360 365
Val Gly Glu Lys Lys Lys Val Met Gly Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe
370 375 380
Glu Ile Leu Glu Asp Asn Ser Phe Glu Gln Phe Val Ile Asn Tyr Cys
385 390 395 400
Asn Glu Lys Leu Gln Gln Val Phe Ile Glu Met Thr Leu Lys Glu Glu
405 410 415
Gln Glu Glu Tyr Glu Arg Glu Gly Ile Pro Trp Thr Lys Val Asp Tyr
420 425 430
Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Asn Leu Ile Glu His Asn Gln Arg Gly
435 440 445
Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys Leu Arg Pro Gly Val Val Ser
450 455 460
Asp Ser Thr Phe Leu Ala Lys Leu Asn Gln Leu Phe Ser Lys His Asp
465 470 475 480
His Tyr Glu Ser Lys Val Thr Gln Asn Ala Gln Arg Gln Tyr Asp His
485 490 495
Thr Met Gly Leu Ser Cys Phe Arg Ile Cys His Tyr Ala Gly Lys Val
500 505 510
Thr Tyr Asn Val Asn Ser Phe Ile Asp Lys Asn Asn Asp Leu Leu Phe
515 520 525
Arg Asp Leu Ser Gln Ala Met Trp Lys Ala Gln His Pro Leu Leu Arg
530 535 540
Ser Leu Phe Pro Glu Gly Asp Pro Lys Gln Ala Ser Leu Lys Arg Pro
545 550 555 560
Pro Thr Ala Gly Ala Gln Phe Lys Ser Ser Val Ala Ile Leu Met Lys
565 570 575
Asn Leu Tyr Ser Lys Asn Pro Asn Tyr Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn
580 585 590
Glu His Gln Gln Arg Gly Gln Phe Ser Trp Asp Leu Val Ala Ile Gln
595 600 605
Thr Gln Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Arg Val Arg Arg Ala Gly
610 615 620
Tyr Ala Tyr Arg Gln Arg Tyr Glu Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Arg Leu
625 630 635 640
Leu Ser Arg Ser Thr Trp Pro Arg Trp Asn Gly Gly Asp Arg Glu Gly
645 650 655
Val Glu Lys Val Leu Gly Asp Leu Asn Leu Ser Ser Glu Val Ala Phe
660 665 670
Gly Lys Thr Lys Ile Phe Ile Arg Ser Pro Arg Thr Leu Phe Phe Leu
675 680 685
Glu Glu Gln Arg Arg Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile Gln
690 695 700
Lys Val Tyr Arg Gly Trp Arg Cys Arg Thr His Tyr Gln Leu Met Arg
705 710 715 720
Lys Ser Gln Ile Leu Ile Ser Ser Trp Phe Arg Gly Thr Met Gln Lys
725 730 735
Gln Arg Tyr Glu Lys Met Lys Ala Ser Ala Val Leu Ile Gln Ala Phe
740 745 750
Val Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys Asn Tyr Arg Lys Tyr Phe Arg Ser
755 760 765
Gly Ala Ala Leu Thr Leu Ala Asn Phe Ile Tyr Met Ser Met Thr Gln
770 775 780
Lys Phe Leu Leu Gly Leu Lys Asn Asn Leu Pro Ser Thr Asn Ile Leu
785 790 795 800
Asp Arg Thr Trp Pro Ala Ala Pro Tyr Arg Tyr Phe His Thr Ala Asn
805 810 815
Gln Glu Leu Gln Lys Leu Phe Tyr His Trp Lys Cys Lys Arg Phe Arg
820 825 830
Asp Arg Leu Ser Leu Lys Gln Val Glu Ile Leu Lys Glu Lys Leu Cys
835 840 845
Ala Ser Glu Leu Phe Lys Asp Lys Lys Ala Ser Tyr Pro Gln Ser Val
850 855 860
Pro Ile Pro Phe His Gly Asp Tyr Ile Gly Leu Gln Gly Asn Pro Lys
865 870 875 880
Leu Gln Lys Leu Lys Gly Gly Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ala Glu
885 890 895
Thr Val Lys Lys Val Asn Arg Gly Asn Gly Lys Thr Ser Ser Arg Thr
900 905 910
Leu Leu Leu Thr Lys Gly His Val Ile Leu Ile Asp Thr Lys Ser Ser
915 920 925
Gln Ala Arg Thr Val Ile Ala Leu Asp Asn Val Ala Gly Val Ser Val
930 935 940
Thr Ser Phe Lys Asp Gly Leu Phe Ser Leu His Leu Ser Glu Ile Ser
945 950 955 960
Ser Val Gly Ser Lys Gly Asp Phe Leu Leu Val Ser Glu His Leu Ile
965 970 975
Glu Leu Leu Thr Lys Met Tyr Gln Ala Val Leu Asp Ala Thr Gln Lys
980 985 990
Gln Leu Pro Val Thr Val Thr Glu Lys Phe Ser Leu Lys Phe Lys Glu
995 1000 1005
Asn Arg Val Asp Val Lys Val Ile Gln Gly Pro Glu Gly Gly Lys
1010 1015 1020
Asn Gly Lys Leu Ser Cys Lys Lys Lys Gly Ser Arg Cys Leu Glu
1025 1030 1035
Val Thr Val
1040
<210> 5
<211> 20110
<212> DNA
<213> 猫（Felis catus）
<400> 5
tgaagttaca ccctagtttg ttccagtgtt gggtgagtct tgccttgacc tgtccctgct 60
ctgcatcttt tggggtgccc tatctgggag ctgctttgtt tttccctttc ccacctccaa 120
ccaatcacat tcccactccc ctcaaatcca aatccaaaga agatggcttc ttccagccct 180
atttctgttt ctcacccttg tctgccaagt tacttaaaag tttaacttct gttttttaat 240
ctggagcatg tggaatagta atagtttcta ctttgtgagg atactgtttg taagcatcaa 300
atgaattagt atatgtagtg tttagagctc tgcctggccc atggcacctg attgtttgcg 360
attgctactg tcagtattct tattgctttc tcagttgtgt ccttccagga agtgacaagt 420
gctctcattt tctggaactt gggggaggca tagtgaaggc tgaaggcagc ctgtgttccc 480
ctcttgcccc accttcagtt cctgcttccc tcccctcccc cgcccaggtt cagcattgct 540
ggagactagg aggatgtggc tcttttattc ctgttaggga gtagccctga ccattgtact 600
aataattctg tcctgctcca gaccacccca cctactcagt cccacaggca agactgagga 660
gggctgggct tcctccttcg gttacacctg ccatgtgccc actgcgcagg ggatgagccc 720
cacaataact ctgttcctcc ttgcccactc ccaccagctg ctaaaaagct gggtgtgtcc 780
ctatggggca aagtccatgc cggaaggtta cagcaatggg tataaaaact ggagatagaa 840
aaatagatac atccagagat cctgacagct acttgatgtt ggagaaacca aacttttatt 900
ctcttcaggg tattctaatc ttttatggag gaacttctgc ctctgttcct ctaactcatc 960
aacttatccc atttaaaaga tgaatcttga tgtggcaatg taagggatct ttggaagagc 1020
ttttgcaatg gttctgggtg gactgggtga ctgaaataga agctgtgagg gatagagagt 1080
tgagaaggag aactgggggc agagggtcag ggagtctgga ccctggccag ggcctcagcg 1140
caggacagag caagttttca gagttaacct ttcctcccca gccctctctc ctgcaagcac 1200
aactgtgctt ccccaggtgc tacctgctgg gtgccttcct taccctggtc aaaggcagat 1260
ggtcctgtcc cacccctgcc cctccctgct ggggagagtt tctgcagcct cccacagtta 1320
gctttgacta gtccagagga cccctaggtt gaggattgtc tctagggccc agagttggag 1380
aaggctcttt aagtccttct gccctcctca cacacccctt ccccccccct cacccccccc 1440
cccacacaca gttactggcc cctaaagcag agcagacttc agcaaactga cctccttact 1500
cccaggatca gcagaacctc tggacatgac tctcatggaa gactctgtgg gggtggggga 1560
ccttgtgctc ctggaacccc tggaggagga gcctctgctc aagaacctcc agctgcgcta 1620
tgaaaacaag gagatttatg tgagtgcata tgcgtgcccc cggctctggg tatgtggtca 1680
gagagttcat gtgctcccac tcccttctcc cctctcagcc tcccctaacc ccaccgctgc 1740
tcattctctt tacttttttt ggctccagac ctacattggg aatgtgttga tctccatgaa 1800
tccctaccag cagctgccca tctatggtcc agagttcatt gccaaatacc gggactatac 1860
cttctatgag ctgaagcccc atatgtaagt aaaggaactg agggaaggct gacagggccc 1920
taacttctga cagtgagaca ccctaatttc ctcgatcctt tctcctgaag gaagttctcc 1980
ggcttcccct tccccactgg ccccaggaag acccttccta ggcctatcac ttacctcagt 2040
ctagtccaag tgaggagggt ggatgactct ggaggctgga gattgagtgg aaggtagtgt 2100
cttggattag ctccacatca gtcttcacct gcttcctcct cccaagctat gctttggcaa 2160
atgtggcata ccagtcactg agggaccggg accgagacca gtgtatcctc ataacgggcg 2220
agagcggagc cggcaagact ggtgaggtgc ctggcttggg gaggctgtgc agtcactgct 2280
ggaaccaccc cctcatctct ttccgagcca gacctggtct tgccccaccc cagaaattcc 2340
ttcccacttt ttctgattct gaggggtatg gtgctggaat gacaggagtt aaggagagtg 2400
gtggggatcc atgtgaaggt ttctcttgca cagaggccag taagctggtg atgtcttatg 2460
tggcggctgt ctgtgggaaa ggggagcagg tgaactctgt gaaggagcaa ctgcttcagt 2520
caaacccggt gctggagggt gagtatccca gtctctgccc tctccaccct ccaccctgct 2580
ggcccagaga cactcagccc tacaccctct taccctgttc ttgttcagct tgaaaactct 2640
gagattggcc tgatgactag aagacgtcct tccttcccct tctctcgagc ccctcttctt 2700
ccctcagtta cctcaccttc tctctcatct ctgcagcttt tggcaatgcc aagaccattc 2760
gcaacaacaa ctcctctcgc tttgtgagtg accatctccc tggcctggga ggagagggtg 2820
tgggggcttt agaaggagga atgcagcaca gaccccctcc tgagtggggt ggtgagaaga 2880
agaggaagca aaacctcttt ctctctctgg tctctgtagg gaaaatacat ggatattgag 2940
tttgacttca aaggatcgcc ccttggtgga gtcatcacaa actgtacgtg tctccccatt 3000
ctgcttacca gctctctctt ctccccatcc cacagtgtcc ctttctggtg atttgaaacc 3060
gtaggaagga atagtaggct accaggaggc ttccctacta gtaggaacac cagcggagag 3120
ggcaggctta gagggaagcc gtggaatctc cctgagctct aggacattat tttctaattc 3180
cctgccagac ctgcttgaga aatcccgagt ggtgaagcag ctcgaaggag aaaggaactt 3240
ccacatcttc tatcagctac tggccggagc agatgcacac ctgctgggta cgtgcctgcc 3300
cagacacatg gaagaaggtc cccaacgtcc atttaatccc tagaaccttt gggcccctct 3360
gcacccctgc agccctcttt ccctgagccc tcagcctcct tcttcctgca ttcctcacac 3420
tgaatttcgt ccactcattg ttggaaacaa tcccctgacc tctgtgttct cctctttttt 3480
ctaggattgt attgctagga ataaaccttc ttgtctcttg acctgctctt attcctctgt 3540
cctgcttggg ttcctctttt ctcaggctgg cttcagaaat gggacactta tttccaccta 3600
ccgttcttcc ctatcttcaa tttaagggac ttaatcacta gctcagcaga aaatcagaca 3660
ggatatttaa gtgttaaaga aattttgata agcagtagtt gaagttgttc tgggtctaca 3720
tctgcctcac ccagcccctg tccttgattt cttcttctta gatggcttga tggaggtttc 3780
atgtattcat tcatcaaata tctcttgaac acctactatt atcgaacatt gtgctagcct 3840
ctagcaatgc agagttgaat aagataacat ggctcttgtc ctcgaagaac ttaaggtctt 3900
ctagggatga cagatatgtt caataggcct gtgtgggtgg ctgtaggagc agaaggcatg 3960
gagacctctg ccttgtcctg gagagccctg ggtgctggat gggcctgagg tggttctggg 4020
tgggcatcac tgcagagtct ggtgggactt cgggccctgc cagagtttgc ctcccaatgc 4080
cccctctagc tgtgagcagt gtgggtgtat ggcccccaag gacctgtcct tttggttcct 4140
ggttattctc tgctggactt gtgcctatct cttttcccct cctagggatc tccatggttc 4200
aagagccccc acaggtctca ttattccttc ctagctcagt agtcttggtt gtgctcaatt 4260
tgttcgaatc ataggcacca gtatcttatt ctgtctgact gttacctatt ggcttaagct 4320
aagtctggac agggcctccc tggtgtcatt atcccagggc ctttctgact cattctttat 4380
ccagacacct ttctttagca ggttcctctt tcaaaatctg tgtctcaggg gaagctgtca 4440
ttaaactcta gtttgaggga ctttccctga ttctcagatc atttgaataa cagatcattg 4500
atatccctca agctccatgc ttaacctact tcttcccatc tcaggtgaac agcttggatc 4560
ataaccttga ctcatttatt aaaaagaaaa aagtttatgt atgccaagca ggcacacaga 4620
aaacaaagat gaaaaacaca gtcccaatgt gtcgttcatt tgtgggagag acagaaaaaa 4680
caaaacctag cccatgtgtt atggactggg atagagatcc accatggggg aacacaagag 4740
agccttttgg ctcagcccca caatgtccaa ggagagtttc caggagaggg gtcaggatta 4800
gggaacatag tacctgcaac tttgttggtg cttactgaac aaataatgaa tgagccaacc 4860
caggcctagg gtgagatgtt gaggctctgg gtgggtggga gatatgtgct caccggtctt 4920
tcctctctga gccactgaga actgagtagg atggagggtt ggcttgtttg tttttattgt 4980
tgagaaccct gaggatggga agaagagcag aatgagtctt ttctttcatc aaagttagga 5040
aaacccccac aattaagaat acccaaactc taaatactgc ttgaaagttt agtctattat 5100
aatgggaatt aatgatccca aaacaaagga ggcaggggac gaaccgaaaa caaaaatggc 5160
tccttcgaat aaatgagtaa accaagctag ggcaagggct gtgagagtca aggccggagg 5220
actcctgaga gcctgggtac taaccctcct cccaagcact ttaacgtttt ctagttgcca 5280
aaggatataa agtacatgat taaatgctaa ctccccatga aatcattgcc ttccacattc 5340
agcacaggga tccaagcctg ctttgtttga tgggaaaggc cactacaatt tactggtcat 5400
ttaaaagtag aatttctgtt gcctataaga attagaggga ggtttatacc ctatgatgca 5460
tatagacaaa aaacctatca aaattcatta taactagttt gtgaatataa aatgaaagca 5520
catagttaga gttggtgact ttaaaaagat tgaatgttga atcagattct catactgacc 5580
cttgcagagg ccctgaagct cgagcgggac acaagtcatt atgcctatct gaaccagaaa 5640
gtgtctagag ttgatggcat ggacgatgcc tccaacttca agtctgtaca ggtgggtgcc 5700
cagggtgggc cttaggctat cccctgagcc caggctttgg ctttgagaag ggaggcattg 5760
agctggcacc acagttcaac ttctcatttc tgctatctcc tccagaatgc aatgactgtg 5820
attgggttct cggaggtaga gattcagcag gtgctagagg tgacggccct ggtgctgaag 5880
ctggggaacg tggagctagc agatgagtcc caggccaatg ggacatcagc aagtggcatc 5940
cgtgatggga gaggtctgca ccgccctgct ggtaccctct aagccgctcc ctgaatctcc 6000
tactacaatt tctgttcgtc caccatctgc tgagtaactg acttcattcc gattcagtcc 6060
cactcagcca ttcctgagtt ctaccccaaa cacactcatt aagaattcct agtgaggcat 6120
tttggagtga ggttatgaag ttagaccttg gttctggcac gtctctgagt ctaagtggag 6180
tctttgcaaa gaatttcagg agattctcct attgaagtag ataatgcagg ggcacttggg 6240
tgggtcagtc agttaagtgt ctgactcttg atttcagctc aggtcttgat gtcagggttg 6300
tgagttcaag ccccacgttg ggctccactt tgggtgtgaa gactactcaa aaataaaata 6360
aagtagataa tgcatttaaa gtgtccgcag ctccctctcc tctccccaga gtttcctctt 6420
gggccatgtt atggatgggc tgcaagaata tccccaagac cttgggagac cagtctccta 6480
gcagtgtcac ttctcagccc tccctcccta ggagatagct ctctttcagg ccatgttgta 6540
tttcctcatc actccaggag tccaggagat tggggaaatg ataggtttga attcagagga 6600
actagagaaa gctttgtgct caaggaccat gaaaacagcc aaagaggagg tggtcactac 6660
actgaacttc acccaggtaa gggccctatg ggagggggct gattttgaga ctattctgtg 6720
gctgccatcc taaccagctg gctctgccca acaggctcag tatgctcggg atgctctggc 6780
taagaacatc tacagccgcc ttttcaactg gatagtgaat cgaatcaatg agagtatcaa 6840
ggtgagagat tgctctcctc cctcaacact ctcctgtctg cctcactttt cttgtcccgg 6900
tcaccatccc tatacttcgg gttctgagat gaagagagta agaaggatga agggtaaggt 6960
acagttgctt ccaatagtgt gttgttgtgg aagcatctct ggtttttgag tttgactgtc 7020
tggatcccct gcttaccagc tgtgtggcct tttagtttca cagagattct gagcctcagt 7080
ttcctgattt ggaaaattgg atgctaatgc ctacctcctt catagtgagg atcagataaa 7140
attatggaca tggttaccat ataacccaga aattccactc cagatataga tccaagagaa 7200
ttgaaaacag atgttcacgt aaaaacctgt acccaaatgt tcatagaggc attacccata 7260
atagccaaaa agtggaaaca actcaaatgt ccatcagttg atgaatgggt aaataaaagt 7320
ggtatatcca tacaatggga tataaataaa taaacaggcc ataaaaagga atgaagtact 7380
gatacatgct caacacagac aaatcgtgaa aacattcaag tggaagcagc cagacacaaa 7440
aggtgattcc atttatatga aatgtaatag gcaaatctat ggagagggtg gtagattaat 7500
ggttagcagg ggcttggagt ggagggagag gggaaggtgg aatgacagct aatgggtatg 7560
agtacaagat ttctttgggg gatcatgaaa atgctctgga attaggtagt ggtgatggtc 7620
atacactttt ttttttttaa gtttattttg agagagtggg ggaggagcag agagaaagag 7680
gaagagagag agagaatctt aagcagggcc tgtgctgtcg gcgtagagcc tagtgcaggg 7740
cttgaactca tgaactgtga gatcatgacc tgagctaaaa ccaagagttg gacacttacc 7800
cgattgagcc acctaggcac ccccatatgc attttgaata tactgaaaaa tcactgaatt 7860
gtataccttt aaagggcaaa ttttatagaa tgtgaattag ataaaaatag agctattatt 7920
taaaaaattt tgtgcatgag aggtgcctgg gtggctcagt cggttaagca tccgacttag 7980
gctcagctca tgatctcacg gtttgtgggt tcgagtccca cgtcaggctc tgtgctgtca 8040
gctcggagcc tggaacctgc ttccgattct gtcactccct ctttctctgc ccctccccca 8100
cttgcagtct gcctctctct ctcaaaaaat aaataaacat taaaaaaaat tttttttaat 8160
cttgtacatg aaaatgcctt caattcagaa gctactatgg aaaggcaaca ggggaaaatg 8220
ggatttaaaa acgcttagtc cctttgaaat ttgatctgtc catctgtaaa atgagaatta 8280
tcacaccata tagggttatc atgagattta atgaagtaag aacatagaat tttttctaaa 8340
ttgctctaca aatgtacgag atggttattt tcctcagaag attttaaagt ctttctacct 8400
cgtcccctgg gagcaccatc ctggaatctg cttacatctc cctccccctc tcctccctct 8460
gcttggcccc tagtgtgtag aggaggaagg agaataaaat cacaactggt caagctcacc 8520
cgagttctgt ttgccctctg ctccaatcac atccgcccca gaagggcctg gcctggtgtg 8580
cagagggggc ccgtcctcag atttatcttt ccctcctctt caggtgggca gcggggagaa 8640
aaagaaggta atgggggtcc tggatatcta cggctttgaa attttaaagg tgagagagct 8700
tcccccaacc gcagccaccc tgcatcccta gggttggggt gcggaggctc aaagggaggg 8760
gcttgcgaga ggggaggcgt ggggctgaga gggaggaagg gtcttggact gagctgctct 8820
ctctctaacc tgggtcccct ccttcaggac aatagctttg agcagtttgt gatcaactac 8880
tgcaatgaga agctgcagca ggtgttcatc gagatgacgc tgaaagagga gcaggaggaa 8940
tataagagag aggtgcgcgg agccttcccc cacagcccct ctccaaagtg acgctggtgt 9000
gcgcgccacg tctgtctttc tcctcaatcc cggtttcctc tcactcgtgc ccagatggga 9060
acacaaagga caaaaagttc ccctttcact gctcaacagt gcagcattac caagaagccc 9120
tagtttttgc tctccacccc ccagtcccct gctcccaccc caggccgtgc cagcaagggg 9180
cagactgatg gaaggctgtg tggggggagt cctcacaagg gtgaagtgac agctgtgcgt 9240
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accacatcca ttttggtgct cttctctgac acctcacaat tctttgtctc ctcgggccct 9360
ggctgatgtc accatctcct cgtgtagcac cctgatccca gacttcctcc ccagaagttc 9420
cccatggctc aacatttcca cactccttcc cctgttcagc aagaaggctt gctttctatg 9480
gctaggtgtt agaaaagcta tctgattgag ctaattcccc ccaaagtgtg aatggctgag 9540
agtctcactc atcaaaacgc tgccagggat gctgcctgtg agcccttggg aatctgctgc 9600
agcagaattt cagacaatgt ggtcacaatg tgtgggaaag gtttttttta agttgttttt 9660
catgttttta tcttaaaatt ttaaatgatc aactagagaa tacattccca tgcctcaaaa 9720
ttcaaaaagc ttaaaaaggc atataaagaa agggctctct cccagcctat ccccagcctc 9780
ttagttctcc aaccatctag aggcaactaa agtggccctc ttttcagagg tcttttatgt 9840
gtaatcaggc aaatgtagaa gtttattttc ccacagaatt tttttcaaat ggcagtgaat 9900
atgctctgct ctaccccttg ctttcatcaa ttaatgagat ctttccatat cgtatataaa 9960
gatgcatctt tacagctaca cagggttgta aggatatcat acttcattta actagttggg 10020
gaaagtattt tggggatgaa atgggaaggc aactacttaa ttccactcta cattccctga 10080
agatctgtga gggggtggga gagtgttccc cagccacacc cccacacctg ggaatggtct 10140
gagtctggga gggctggccc ttgggtggga tcagaagcta tcctgtctgc ggctacccct 10200
aagtggggaa cgattgtctt tgggtctcct tctgtaccat tcttgcttaa aacaaaaaca 10260
aaaacaaaaa caaaaactat acagtcccag agtatcaggt agattagtag ttcttaaagt 10320
gtggtcctgg accagcagca tccctggaaa ggtgttagaa agacagattc ctaggctcta 10380
tcccagacat gctgaatcag aaaccctggg gatggggcct agcagtctgt ttttacaagc 10440
cctctagctg actgccatgc aagtttgaaa agcactgatg taggtctttg aagatgtatc 10500
aagttaggtt tgttgcttga tgaaattcac tcatgtgctt tggttttatt ggtcgttgcc 10560
agaacagtgt ggcctttgct cttgcacacg ctcaaggatc cttcctcact ccacagtggg 10620
gcaatcccta ccccgatctt caccccacac cacctacagg gctctcttca gcatctcccc 10680
ctctctcaca gctgctctgg gtcctttcac gtgtctccca ccccacaaat tctccatcaa 10740
cctggaggga tgggaaccta aacagaagcc acaccaagga cccctcttaa ttatagggct 10800
ttctgagtcc ttcttgggtt gggtgagagg gagcctgagt ctggtgaggt ctttggagac 10860
ttgtcctgga cctgctcttg taacctgtca tgcctcttct tgccagggca taccgtggac 10920
aaaggtggac tactttgata atggcattat ctgtaacctc attgagcacg tgagttatct 10980
ttatgttatc tctgagacct cttgcagact gactgaatat ccttgtcctt ccccctcccc 11040
ttgccccact tggtaaggat ggtgaagtgg gcaaaggatg aaggggcaga gggacagcag 11100
tgaggatgtg gacatcttgg aggatcaggt ctaagttggg ctgatcttgt tcccctgacc 11160
agaatcagca aggcatcctg gccatgctgg atgaggagtg cctacggcct ggggtggtca 11220
gtgactccac cttcctagcg aagctgaacc aggtcttctc caagcatggt ttctatgaga 11280
gcaaagtcac ccagaatgcc cagcgccagt atgaccacac catgggcctc agctgctttc 11340
gcatctgcca ctatgcgggc aaggtgacat gcagggctgg agggtagaaa tgggcctggg 11400
catgggtgga aggcaatggg ggaggacctg cggggagatg agatctggga atacttcaca 11460
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tcctctacag gtgacttaca acgtgaacgg cttcattgat aagaacaatg acctactctt 11580
ccgggacttg tcccaggcca tgtggaaggc ccagcacccc ctccttcagt ccttgttccc 11640
tgaaggagtt cccacacaga catctctcaa gcgcccccca actgctggag cccaattcaa 11700
gagttctgtg gccatactca tgaagaactt atattccaaa aaccccaact acatcaggtg 11760
acatgctggg tacatgggga aatgcagcat atgtgatggc agatgcaggg tccagcacta 11820
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tccctcataa aaaatgagga actgagaatc ctgtggcagg gagagcatca gactttagta 11940
ggaaccacgc tatagtgagt gaagctggga aggccagtgt gttcacttcc tctgaaaata 12000
accctccaga atagggttat agagaccagg atgggtcaca cttgcaaagg tgaagctcct 12060
catgcctgtg ccttgcacct ctccccccac cccaaggtgt ataaagccca atgagcatca 12120
gcagcgaggt cagttctcgt cagagctggt ggccgtccag actcggtacc tgggactgct 12180
agagaacgtg cgggtgcgtc gggcgggcta tgcctaccgc cagaggtatg ggcccttcct 12240
ggaaaggtac cgattgttgg ggcggagcac gtggcctcgc tggaatgggg gagacaggta 12300
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actcatgtct aaatttccag acctcgcacg tgcctctgac agagttagaa ttcagtaggt 12960
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ctaagaagtc aatggaatga ataaaacact ggctgggaag cccctggcac ctgggctccg 13080
ggaggagaga gtgctattcc cctaggccag cctttccgcc ccaccttcca cctctccaca 13140
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gaagatctac cggggctggc gctgccgcat ccactaccag ctgatgcgca agagtcagat 13260
cctcatttcc tcctggtttc gaggcaacat ggtatcagtt gctccctaaa gtcccatccc 13320
tttcactcca ataaaagagt cgggggcacc tgggtggcac agtcggttaa gcatccaact 13380
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aaaataaata aacatttaaa aaagagagag ggagagagtg ggaagtagga gaggtggttc 13560
aggggatgga gtttttctaa caggcctatt gtttttctgc agcaaaggaa gcgctatgcg 13620
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tgtgccagct gctgggagga aagagtagca gaaagcaagt cctgcccaca cccagggcat 13800
acctctgtgt gatggcatgc ctgcatctgg gtgtgtgtct gggagtgtgg gtgcgtactg 13860
gggagatgtg tgtagacacc tgggtgtgtc cctgacttgg ctttgagtgc cttcctcatt 13920
gccagcttgt ctgcctttac tttctccctc cagtagagtc tcggcacttt atctaactgt 13980
gctctttgta tggttggaaa acagtagaac ctctgtctcc ttatcttcta ggtctgtcta 14040
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cttccggtcg ggggctgccc tcaccttggc agatttcatc tataagagca tggtaagtgg 14160
tcttacttac tatgggggtt gagggtggaa ggtggagggg aggttgtgga gggagggtca 14220
ggtttggaaa aggaagatga ggggtttgag aagaggtgat caaagttttc cctggaaggg 14280
tttctttgat ctgcatgtac ttaattatta agtcctaggg taagaaggaa tggggctttg 14340
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aaccttgggg caggaagggg tcccagcaca cccactgact ggcccatgat gaataggccc 14460
gagaagagac gggctggatg gctaacaaca gtttaaagag actgagcctc atgaaagagc 14520
agagtgagga catagggtta cctaacttaa ccttccgaga tccattttat ggtaggggtg 14580
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cttttattta tcattttcga gagacagaaa gagacagagc acaagcaggg aaggggcaga 14760
gagggagaca cagaatcgga agcaggctcc aggctctatc agcacagagc ccaacgcaga 14820
gctcaaaccc atggaatgtg agaccatgac ctgagctgaa gtcagacact taactgactg 14880
agccacccag gtgatctgac cccagagttt taatgcctgc cgaagactgc ttccccacac 14940
tgtcccccca ctccccctag agacctactg gggcaggagg gctatatagg gaaaggaaag 15000
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gatctttgta gcagaggaat caaagagctt ggatagttcc tggagaatta tagcaatata 15240
ctgcataccc tcccttttcc cattttaatt tttttaacct aatgtgttag taagaagttt 15300
tcataaaaat tccaaaaact tgggggcgca tgggtggctc agtcagttaa gtgtctgact 15360
cttgattttg gcttaggtca cgatctcaca gtttgtgagt tcgagcccca catcaggctc 15420
catgctgaca gtgctaagcc tgcttggaat tctctctctc tccctctctt tctgctcctc 15480
ccccacttgc tccctctctc tctctctctc aaaaataaat aaacttaaaa aaaaaaatcc 15540
aaaacttgga agtactcaag atcaagctat tttctatacc ttcaataatt ctaccccaca 15600
aacaaacagg gtgctgggtg ttccctggga tataaagact ggagagtcct tattctagat 15660
tgggggagac taaacagatg ccatgggtga tacttgatct gatcctggaa caggaagaat 15720
aagaacaaag ctacaaaggg catttttaga agtttataaa ggacattagg agaaatttga 15780
gcatgcattg ctgttggatg agtgtatcca attaatgttt gtcttcttag gtatggaggt 15840
ggaattatga tttgtgtagg agaatgtcct ggttcttggg agatgtgtgc ttaagttttg 15900
ggggaaaatg ccatgatttc tctaacctac tttaggatga tatggtagca aagatttata 15960
tatgtgtgag tgtgtgtatg tatttattta tgcccatttg tatacatgtg tgcatgtgtt 16020
agaaagcctg caaatatggc caattgttaa cattatcagt tggtggattt aggtaaggaa 16080
tatgtggcat gcagatattc actgtaatgt ttcttcaact tttatgtaag tttaaaaact 16140
ttcaatataa gacagtaagt tatatgaaat aaaaaagaac gtaaggcaga ttatgtcact 16200
cttcccctta aaatcctcta atggcattcc atttgactcc caataaaagc cagtgttctt 16260
acctcagcct acaaggccct tcacgaatgt acttgaccaa ccagtcctct gatcttcttt 16320
cttcttgctc gatttaatcc agtctcactt tcttttcatt tctgggatat gctactgctc 16380
atttctggtc tcagggccag cttttttgca tcatagcata tataattatc tgcaattatt 16440
tgcatcatag catatataat taacatatat tatatatgtt tgtttgctgt ggggttcttc 16500
cctcccccgg tagaatataa gctcagtgag aatagagatt ttgtttgttc tgttcactgc 16560
tgtgtatcca tacctagaac agtgccaggc acagagcaga cactcaataa atgttgttga 16620
atggcagggg aaaaaaaaca acaacaacaa gaactcagct tgggatccag actcccaagg 16680
actcattgtc tagaagaggg aaaagatttc cacacagata atagtagtac aaacacagaa 16740
gtatagacaa agtgctgtgg ggcttcaaag aaaggagagg cagccctggc ccagggaatc 16800
agggagggct tcgagctgtg tctgaaagga taggtagaat ctagatgggc acagctgagt 16860
tgagagcagg atgggctgag gcaccgagtg atcacgcctg ggctaggcag agggcttgat 16920
gaggaacact acctgagagg tgtgctggga tcatgcaggg gatcctgggg catgagattg 16980
ggccctaaat agaagacttt gaatgccagg ttgaggcatt gggcttgacc gatcagggaa 17040
ggggggaggt ttggtacctg tcctatagcc aatgcagaca gtggcagcca gctgtaggca 17100
gctatgaact gagacaatag gaagtcacag gagcaaaata ctgaggccag ttttcatctt 17160
ggttgctttc acctcactac cctgggcagc aggtctctgc ttggaactaa cccttccttc 17220
cctccctccc agtctcctgt tcacgctctc actgcccagc ctccagtgaa cactggaccc 17280
acaagagatc caggaggtga ctcccttctg actcctcgct ctacttgttg cttcttactc 17340
tgggtggcct ccctcctttc aggtggcagg tcctggatga gagtttgcct gttgggaggt 17400
ctgtcttctc atccgtccac tcccaatccc cctgcttcca atctagacgc agaagttcct 17460
gctggggctg aggaacaatt tgccgtctac caacatcctg gacagaacgt ggccagcggc 17520
cccttacaga tgcttcaaca cagcaaacca ggagctacag cagctcttct accgctggaa 17580
ggtgagtggg gcccagcacg actcctctca tttgtctttt tttcctcctc cctctgattt 17640
tcatcttctg cctccttctt ccactttttt tcttcatggt gaaaacaaca tagatcacaa 17700
aattggccat cttaaccatt tgtaagtccg gtgtcataaa gcacgttcac actattgtgc 17760
agccgtcacc accatccgtc tctgtatttc ttttttatca gcccaaactg caatcctgta 17820
cacattaagc agtaactccc cattccccac tcttgtagcc cctgggactt ataatcgact 17880
ttctctgtga atttgactgt tctcggtacc tcatggaagt agaatcatac atttgtcctt 17940
ttctatctgg cttatttcac tcagcacagt gtgcttccat tcaggaaata tgtaccgagc 18000
acctgtctag agtaggcctt gtgctgtgtg ctggcatata gccctcctcc tgggtctgac 18060
acatttgatt gtttccatcc ccctctccca gagtcccttt gagggggggc agtgctcctc 18120
cagcagctgc cctctctgaa gtgcctagag cctattctat tccctgtctc tcctcttttc 18180
cagcccctgc cctccttcca cctctcagtg ttctcccaaa cccccacccc aggcctgcct 18240
tctgcctcca cgagcttagc ccctgcccct ccctctcaca gtgcaagaga ttccgggatc 18300
gactgtcccc aaagcaggta gagatcctga aggagaagct ctgtgccagt gaactgttca 18360
agggcaagaa ggcttcctac ccccagaggt gagggccccg cagaccctgc acagtcagtt 18420
tcatccagag caaagacagg atcccccagg tgggataggg cagtggtccc caaactagtg 18480
tgcatcagca ccacttggca ggcttgatga cacccagatg gctgcaccac cccccgccca 18540
gagtttctga ttcagcagat ctggggctgg ggcccaataa tttgcctttc taacaagttc 18600
tcaggggatg ctgatgttgg tcctggacca tgctgagata gaggatatgg tggagcatgg 18660
gggaagggac atgggaactc actgtgggga ggctcagggc cttgggggtc agtggtgagg 18720
aacttgtctc caccacatac ctcctgtgtg tcttcagtgt ccccattcca ttctgcggtg 18780
actaccttgg gctgcaaggg aaccccaagc tgcagaagct gaagggcggg gaggaagggc 18840
ctgttctgat ggcagacact gtgaagaagg tcaatcgtgg caatggcaag gtgaatgcct 18900
gcaccctgga cttctgccca cggccggatc cagagccttg ggactggtag ctggaagggt 18960
ggggttaatc ttcacctttc ctcacatttt cctcttctgt ccttagactt cctctcgaat 19020
tcttctcttg accaaggggc atgtgattct catagacacc aagaagtccc aggccaaaac 19080
cgtcattgga ctagatagtg tggccgaggt gtcagtcacc agcttcaagg atgggctttt 19140
cagcttgcat ctgaatgagg tatcagagct ctgtgggtgc agtacctcac gctggagaag 19200
gtggtgggca tcacggggct ggggtgggct ggaggtgatg aggaccagac ctctcactct 19260
gggccttcag tgcctctcag gctgctcctg cagagggaaa aatgaatccc ttccccactt 19320
tttccccctt cctaagatat catcagtggg ctccaggggg gacttcctgc tggtcagcga 19380
acatgtgatt gaactgctaa ccaaaatgta ccaggctgtg ctggatgcca cacagaggca 19440
gcttctaatc tccgtgactg agaagtaagg ccatgagctg ggggtgaggg ccagcctggg 19500
ggcagatgac caagctgttg gtcattgtga ccgggaaaat tcatgtagtc agaaagtgaa 19560
gcatattctg tcaaggcaag gtttggaggt gtttcttagt ctccccactc aggttctctg 19620
gggccctgaa tcttctgaca cgaggggagg agagatgtac ttcctttaag aaggagaatg 19680
gaaaccatca tgaaagtatg ggagtagaga tgagaggatg agggtaccag ctttacccct 19740
ctgtctgttt cccctccagg ttctcagtga ggttcaagga gagtagtgtg gctgtcaagg 19800
tcatccaggg ccctgagggt gataggaacg gcaagctaaa atgcaagaag aaagggagcc 19860
gttgcctgga agtgactgta tagtgaagag gtgggggcct gatgcagaga cagcagcttc 19920
tctggacccg tgccaacccc acccacccat gtttgcagga ggatctgatc gtggtgtggg 19980
gctcagagat tgaggaaccc ttgaagagga cctttcttct cccaaactct tctgggcccc 20040
tctcccttag aacttatcct cccaccctca gctgctttgc ccactaataa aacaagtgac 20100
ttcccaaata 20110
<210> 6
<211> 1042
<212> PRT
<213> 猫（Felis catus）
<400> 6
Met Thr Leu Met Glu Asp Ser Val Gly Val Gly Asp Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Pro Leu Glu Glu Glu Pro Leu Leu Lys Asn Leu Gln Leu Arg Tyr
20 25 30
Glu Asn Lys Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly Asn Val Leu Ile Ser Met
35 40 45
Asn Pro Tyr Gln Gln Leu Pro Ile Tyr Gly Pro Glu Phe Ile Ala Lys
50 55 60
Tyr Arg Asp Tyr Thr Phe Tyr Glu Leu Lys Pro His Ile Tyr Ala Leu
65 70 75 80
Ala Asn Val Ala Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Gln Cys
85 90 95
Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys
100 105 110
Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val Cys Gly Lys Gly Glu Gln Val
115 120 125
Asn Ser Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala
130 135 140
Phe Gly Asn Ala Lys Thr Ile Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Met Asp Ile Glu Phe Asp Phe Lys Gly Ser Pro Leu Gly Gly
165 170 175
Val Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Val Val Lys Gln Leu
180 185 190
Glu Gly Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Asp Ala His Leu Leu Glu Ala Leu Lys Leu Glu Arg Asp Thr Ser His
210 215 220
Tyr Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Val Ser Arg Val Asp Gly Met Asp Asp
225 230 235 240
Ala Ser Asn Phe Lys Ser Val Gln Asn Ala Met Thr Val Ile Gly Phe
245 250 255
Ser Glu Val Glu Ile Gln Gln Val Leu Glu Val Thr Ala Leu Val Leu
260 265 270
Lys Leu Gly Asn Val Glu Leu Ala Asp Glu Ser Gln Ala Asn Gly Thr
275 280 285
Ser Ala Ser Gly Ile Arg Asp Gly Arg Gly Val Gln Glu Ile Gly Glu
290 295 300
Met Ile Gly Leu Asn Ser Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Cys Ser Arg
305 310 315 320
Thr Met Lys Thr Ala Lys Glu Glu Val Val Thr Thr Leu Asn Phe Thr
325 330 335
Gln Ala Gln Tyr Ala Arg Asp Ala Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Ser Arg
340 345 350
Leu Phe Asn Trp Ile Val Asn Arg Ile Asn Glu Ser Ile Lys Val Gly
355 360 365
Ser Gly Glu Lys Lys Lys Val Met Gly Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe
370 375 380
Glu Ile Leu Lys Asp Asn Ser Phe Glu Gln Phe Val Ile Asn Tyr Cys
385 390 395 400
Asn Glu Lys Leu Gln Gln Val Phe Ile Glu Met Thr Leu Lys Glu Glu
405 410 415
Gln Glu Glu Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Pro Trp Thr Lys Val Asp Tyr
420 425 430
Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Asn Leu Ile Glu His Asn Gln Gln Gly
435 440 445
Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys Leu Arg Pro Gly Val Val Ser
450 455 460
Asp Ser Thr Phe Leu Ala Lys Leu Asn Gln Val Phe Ser Lys His Gly
465 470 475 480
Phe Tyr Glu Ser Lys Val Thr Gln Asn Ala Gln Arg Gln Tyr Asp His
485 490 495
Thr Met Gly Leu Ser Cys Phe Arg Ile Cys His Tyr Ala Gly Lys Val
500 505 510
Thr Tyr Asn Val Asn Gly Phe Ile Asp Lys Asn Asn Asp Leu Leu Phe
515 520 525
Arg Asp Leu Ser Gln Ala Met Trp Lys Ala Gln His Pro Leu Leu Gln
530 535 540
Ser Leu Phe Pro Glu Gly Val Pro Thr Gln Thr Ser Leu Lys Arg Pro
545 550 555 560
Pro Thr Ala Gly Ala Gln Phe Lys Ser Ser Val Ala Ile Leu Met Lys
565 570 575
Asn Leu Tyr Ser Lys Asn Pro Asn Tyr Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn
580 585 590
Glu His Gln Gln Arg Gly Gln Phe Ser Ser Glu Leu Val Ala Val Gln
595 600 605
Thr Arg Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Arg Val Arg Arg Ala Gly
610 615 620
Tyr Ala Tyr Arg Gln Arg Tyr Gly Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Arg Leu
625 630 635 640
Leu Gly Arg Ser Thr Trp Pro Arg Trp Asn Gly Gly Asp Arg Glu Gly
645 650 655
Val Glu Lys Val Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ser Ser Glu Glu Leu Ala
660 665 670
Phe Gly Lys Thr Lys Ile Phe Ile Arg Ser Pro Lys Thr Leu Phe Tyr
675 680 685
Leu Glu Glu Lys Arg Arg Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile
690 695 700
Gln Lys Ile Tyr Arg Gly Trp Arg Cys Arg Ile His Tyr Gln Leu Met
705 710 715 720
Arg Lys Ser Gln Ile Leu Ile Ser Ser Trp Phe Arg Gly Asn Met Gln
725 730 735
Arg Lys Arg Tyr Ala Lys Ile Lys Ala Ser Val Val Leu Ile Gln Ala
740 745 750
Phe Val Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys Asp Tyr Arg Lys Tyr Phe Arg
755 760 765
Ser Gly Ala Ala Leu Thr Leu Ala Asp Phe Ile Tyr Lys Ser Met Thr
770 775 780
Gln Lys Phe Leu Leu Gly Leu Arg Asn Asn Leu Pro Ser Thr Asn Ile
785 790 795 800
Leu Asp Arg Thr Trp Pro Ala Ala Pro Tyr Arg Cys Phe Asn Thr Ala
805 810 815
Asn Gln Glu Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Trp Lys Cys Lys Arg Phe
820 825 830
Arg Asp Arg Leu Ser Pro Lys Gln Val Glu Ile Leu Lys Glu Lys Leu
835 840 845
Cys Ala Ser Glu Leu Phe Lys Gly Lys Lys Ala Ser Tyr Pro Gln Ser
850 855 860
Val Pro Ile Pro Phe Cys Gly Asp Tyr Leu Gly Leu Gln Gly Asn Pro
865 870 875 880
Lys Leu Gln Lys Leu Lys Gly Gly Glu Glu Gly Pro Val Leu Met Ala
885 890 895
Asp Thr Val Lys Lys Val Asn Arg Gly Asn Gly Lys Thr Ser Ser Arg
900 905 910
Ile Leu Leu Leu Thr Lys Gly His Val Ile Leu Ile Asp Thr Lys Lys
915 920 925
Ser Gln Ala Lys Thr Val Ile Gly Leu Asp Ser Val Ala Glu Val Ser
930 935 940
Val Thr Ser Phe Lys Asp Gly Leu Phe Ser Leu His Leu Asn Glu Ile
945 950 955 960
Ser Ser Val Gly Ser Arg Gly Asp Phe Leu Leu Val Ser Glu His Val
965 970 975
Ile Glu Leu Leu Thr Lys Met Tyr Gln Ala Val Leu Asp Ala Thr Gln
980 985 990
Arg Gln Leu Leu Ile Ser Val Thr Glu Lys Phe Ser Val Arg Phe Lys
995 1000 1005
Glu Ser Ser Val Ala Val Lys Val Ile Gln Gly Pro Glu Gly Asp
1010 1015 1020
Arg Asn Gly Lys Leu Lys Cys Lys Lys Lys Gly Ser Arg Cys Leu
1025 1030 1035
Glu Val Thr Val
1040
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myo1a F1引物
<400> 7
gaaaatactt ccggtcaggt g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myo1a R1引物
<400> 8
caagggttct tcatctctga gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myo1a F2引物
<400> 9
taccagtgga agtgcaagaa gt 22
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myo1a R2+T7引物
<400> 10
taatacgact cactataggg acactacgaa gttctgctcc ag 42
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gabra2 F1/F2引物
<400> 11
acttggttac ttttgggctg t 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gabra2 R1引物
<400> 12
tgattgaagt gagctgaaag gt 22
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gabra2 R2+T7引物
<400> 13
taatacgact cactataggg aacatccttt catggtgact ca 42
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB-F1引物
<400> 14
ctgagagggc cagtcacttc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB-R1引物
<400> 15
catggcaggt caacaagcta 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB-F2引物
<400> 16
cagtgggtct cagcacagaa 20
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TrkB-R2+T7引物
<400> 17
taatacgact cactataggg ctaggaccag gatggctctg 40
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myo1a F引物
<400> 18
ctacgagcag cttcccatct 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myo1a R引物
<400> 19
ccacatttgc caaagcatag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gabra2 F引物
<400> 20
acaaaaagag gatgggcttg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gabra2 R引物
<400> 21
tcatgacgga gcctttctct 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Wfdy1 F引物
<400> 22
aaaggccgga cactcctc 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Wdfy1 R引物
<400> 23
tgagctgcag gtagcacagt 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nnt F引物
<400> 24
cctggtggca ccttcgta 18
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nnt R引物
<400> 25
ctgagcccag gtacatgatt t 21

Claims (13)

1.编码肌球蛋白IA(Myo1a)的DNA、编码Myo1a的mRNA或Myo1a蛋白的用途，其用作生物标志物来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。
2.权利要求1的用途，其中当与表达功能性肌球蛋白IA(Myo1a)的Myo1a纯合子(Myo1a+/+)参比受试者中观察到的表达比较时，受试者中Myo1a的缺失、表达减少或非功能性表达使所述受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
3.权利要求1或2的用途，其中所述损伤诱导的慢性机械性疼痛是炎性慢性机械性疼痛、神经性慢性机械性疼痛或术后慢性机械性疼痛。
4.一种评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的体外方法，其中所述方法包含对从所述受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸序列进行分析、通常是测序的步骤，检测到在与以SEQ ID NO：1鉴定的Myo1a野生型核酸序列比较时所述受试者的Myo1a的核酸序列改变，则指示所述受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛，而不存在改变则指示所述受试者没有产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。
5.权利要求4的方法，其中所述生物样品是血液、血浆或血清样品。
6.编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或肌球蛋白IA蛋白的激动剂，其用于预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
7.一种组合物，其包含肌球蛋白IA蛋白的激动剂以及药学上可接受的载体。
8.权利要求7的组合物，其用于预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。
9.权利要求1至3任一项的用途，权利要求4或5的方法，权利要求6的供使用的编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或肌球蛋白IA蛋白的激动剂或权利要求8的供使用的组合物，其中所述受试者是哺乳动物，优选人类。
10.一种包含固定在承载体上的至少一种互补核酸的装置，所述互补核酸结合Myo1a基因的全部或部分。
11.一种用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，所述试剂盒包含用于对从所述受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸。
12.一种用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物的体外或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂，并鉴定为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂。
13.一种Myo1a KO(Myo1a-/-)动物模型的用途，其用于筛选Myo1a调节剂和/或筛选用于预防、减少或抑制疼痛的药物。
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