JP2007252240A - 細胞回収用磁気ビーズ - Google Patents

Abstract

【課題】非特異吸着を抑制し、細胞を効率よく回収する磁気ビーズを提供する。
【解決手段】細胞回収用の磁気ビーズであって、磁性金属を主成分とする金属粒子核と、前記金属粒子核を被覆し、V、Ｔｉ、Ａｌ、Ｎｂ、Ｚｒ、Ｃｒの少なくとも１種の元素を主体として構成される無機材料を有することを特徴とする。さらに、好ましくは前記磁気ビーズが３μｍ以下の平均粒径を有し、回収しようとする細胞以外の細胞、核酸および蛋白質のうちの少なくとも１種に対してケイ素酸化物よりも低吸着性を示す材料で被覆されている。
【選択図】図１

Description

本発明は、広く植物、動物から採取された細胞を含む検体から細胞を回収する磁気ビーズに関するものである。

医療診断分野では、例えば、病原体の検出や、疾病の早期発見などの目的で核酸を抽出し、解析する方法が用いられている。しかしながら、血液、生体組織、糞便、尿などから核酸を抽出する場合は、夾雑物の混入による擬陽性の結果を生じることを防ぐため、細胞の精製が必要である。そこで例えば、細胞を含む検体から、遺伝子検査の対象となる一種または、数種の細胞を特異的に回収することが行なわれる。このように回収した細胞から核酸を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で核酸を増幅し遺伝子変異を検出するなどして、遺伝子診断が行われている。

がんの検査は、例えば、染色体異常を検査することにより検査する方法や、大腸がん、すい臓がん、肺がんにおいてはＫ-ｒａｓ遺伝子の変異を解析することにより検査する方法（例えば、非特許文献１）がある。

血液や糞便などの細胞を含む検体からの細胞回収方法として、検査対象の細胞と特異的に結合する磁気ビーズなどの固体担体に細胞を捕捉させ、不純物を除き回収する方法や循環系の腫瘍細胞を捕捉する方法（非特許文献２）がある。また、細胞回収に用いる磁気ビーズとしては、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体を結合された磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社製）や非特異吸着を抑制した磁気ビーズ（例えば、特許文献１）がある。

特開２００５−８３９０４号公報 「キャンサー リサーチ ４９（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９）」１９８９年，ｐ．４６８２ 「キャンサー リサーチ ５３（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３）」１９９３年，ｐ．３４５５

しかしながら、従来は細胞を含む検体から細胞を回収する場合において、細胞回収後、検査対象の核酸を抽出する際、磁気ビーズに核酸や、蛋白質などが非特異に吸着してしまい、疾病の早期発見などに必要とされる十分な感度を得にくいという問題があった。

また、非特異吸着により捕捉された不純物が核酸溶出液に混入しポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の阻害をする場合もある。

また、従来の磁気ビーズは粒径が１〜１０ｎｍのフェライトなどの超常磁性体をポリマーやシリカに内包させるなどして作製されている。そのため外部磁場によって磁性ビーズに働く外力は小さく、細胞のような磁気ビーズと同等もしくはそれ以上の大きさの対象を吸着し回収することが困難であった。また、サブミクロンサイズの粒径の小さな磁気ビーズは外部磁場の発生源に磁気カラムなど特殊な装置を必要とした。また、外部磁場によって磁気ビーズが保持される力が小さく、細胞を含む検体中の不純物の洗浄工程において不純物と共に細胞を補足した磁気ビーズが流出してしまうという問題もあった。さらに、粒径が小さいため、糞便など、多くの不純物を含む溶液から細胞を回収する場合に多大な時間がかかってしまう。

そこで、本発明では、これらの問題に鑑み、非特異吸着を抑制し、細胞を効率よく回収する磁気ビーズを提供することを目的とした。

発明者等は、上記課題を解決すべく、非特異吸着を抑制し、細胞を効率よく回収する磁気ビーズを鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
本発明の細胞回収用磁気ビーズは、磁性金属を主成分とする金属粒子核が、Ｖ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｎｂ、Ｚｒ、Ｃｒの少なくとも１種の元素を主体として構成される無機材料で被覆されていることを主な特徴とする。以下、本発明について具体的に説明する。

本発明の細胞回収用磁気ビーズは、磁性金属を主成分とする金属粒子核が、Ｖ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｎｂ、Ｚｒ、Ｃｒの少なくとも１種の元素を主体として構成される無機材料で被覆されていることを特徴とする。前記無機材料は生体物質に対し活性がケイ素酸化物に比べ小さいので非特異吸着を抑制することが出来る。さらに、磁性金属を主成分とする金属核をもった磁気ビーズは、高い飽和磁化を有し、細胞の迅速な回収を可能とする。また、金属粒子核を被覆する無機材料がチタン酸化物であることが好ましい。チタン酸化物は塩を含む溶液などに対し高い耐食性を示し、塩濃度の高い溶液中にも適用できる。

また、前記細胞回収用磁気ビーズにおいて、前記磁気ビーズが３μｍ以下の平均粒径を有することが好ましい。粒径が小さいため、比表面積が大きく、少量の磁気磁気ビーズで細胞を回収することができる。また、粒径が３μｍ以下では、特に細胞を生きたまま回収する確率が格段に向上する。なお、平均粒径は、レーザ回折型粒径分布測定器によるメジアン径ｄ５０値である。

さらに、前記細胞回収用磁気ビーズにおいて、表面にリガンドが固定されていることが好ましい。所望の細胞の捕捉担体としての良好な特性をもつために、抗体、レクチン、ホルモンが固定されていることがこのましい。更に、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンのうち少なくとも１つが固定されていることにより簡便に抗体、レクチン、ホルモンを固定することが出来好ましい。

さらに、前記細胞回収用磁気ビーズにおいて、前記リガンドが細胞表面抗原に対する特異的抗体であることが好ましい。特異性の高い抗原抗体反応により特異的に所望の細胞を捕捉できる。

さらに、上記細胞回収用磁気ビーズにおいて、前記特異的抗体が上皮細胞、上皮系細胞のうち少なくとも１種に対する特異的抗体であることが好ましい。上皮細胞や上皮系細胞を、組織や糞便などの不純物が多く、粘性の高い検体から捕捉する場合に好適に用いることが出来る。

さらに、前記細胞回収用磁気ビーズにおいて、前記磁気ビーズの表面にはストレプトアビジン、アビジンのうち少なくとも１種が固定され、前記ストレプトアビジン、アビジンのうち少なくとも１種にビオチン化抗体、ビオチン化レクチン、ビオチン化ホルモン、ビオチン化蛍光物質およびビオチン化化学発光物質のうち少なくとも１種が結合していることが好ましい。ストレプトアビジンおよびアビジンとビオチンは高い選択性があり、目的とする抗体、レクチンやホルモンを精度よく導入することができる。また、蛍光物質または、化学物質を標識として磁気ビーズに固定することにより、フローサイトメータなど様々な光学的な測定に好適に用いることができる。

本発明によれば、非特異吸着を抑制するとともに、細胞を効率よく捕捉する磁気ビーズを提供することが出来る。

本発明の細胞回収用磁気ビーズは、細胞の回収に用いる。細胞回収用磁気ビーズは金属核とそれを被覆する層を有する。

［金属核］
金属核は磁性金属を主成分とする。該金属核は強磁性を示し、磁気応答性を発揮する。金属核は、酸化物核に比べて、高飽和磁化を得やすい。高飽和磁化を得るためには、磁性金属は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉの少なくとも１種以上から成ることが望ましい。Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉいずれかの単体またはその合金、例えばＦｅ−Ｃｏ系、Ｆｅ−Ｎｉ系、さらには他の遷移金属元素であるＣｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ｓｉ、Ｚｒなどの遷移金属元素との２元、３元または４元系等の各種合金で構成されていても良い。特に、ＦｅまたはＦｅの一部を他の元素で置換したものが高い飽和磁化を有する点で好ましい。

金属粒子核の粒子径は特に限定されるものではないが、良好な軟磁気特性を実現するために、その粒子径は平均粒径１０μｍ以下とする。下限は特に規定されるものではないが、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉそれぞれの単体金属粒子が超常磁性となる臨界粒子径以上である１０ｎｍ以上とする。

［金属粒子核を被覆する無機材料］
金属粒子核を被覆する無機材料（もしくは無機質材料）はＡｌ、Ｃｒ、Ｎｂ、Ｔｉ、Ｖ、Ｚｒから選ばれた一種以上の金属元素（Ｍ元素）を主体とし、さらにはその酸化物、炭化物、ほう化物または窒化物を主体として構成されることが好ましい。主体とするとは、Ｘ線回折でのＭ元素を含む相のメインピークの強度が核以外の構成相の中で最大であることを意味する。チタン酸化物は耐食性に優れ、化学的に安定であり好ましい。これら無機材料は金属核全体を一様に覆うことが好ましいが、高い耐食性が要求されない場合であれば一部分が被覆するものであっても良い。また、金属粒子核に接する前記無機材料はケイ素酸化物と比較し生体物質に対する活性が小さいため、非特異吸着を抑制することができる。

前記生体物質とは、広く植物、動物からに由来する物質である。例えば、所望の細胞以外の細胞、核酸、タンパク質などである。また、生物を由来する物質と類似の構造をした人工的に合成または作製された物質も含む。

金属核が無機材料によって被覆された金属微粒子は、磁性金属の金属酸化物の粉末とＭ元素の酸化物、炭化物、ほう化物、窒化物もしくは、Ｍ元素単体の粉末を混合した粉末に、窒素ガスまたは窒素ガスと不活性ガスとの混合ガスなどの雰囲気の熱処理を施すことにより製造できる。この方法は、金属酸化物の還元による金属核の生成と被覆の形成を一つの熱処理工程で実現できる。すなわち、微細な金属粒子を出発原料としないため、酸化劣化を防止し、高い磁気特性を有する金属微粒子、すなわち磁気ビーズの製造に好適である。また、ゾルゲル法等のように低温で形成した被覆に比べて緻密な被覆が得られるので、得られた被覆金属微粒子は耐食性に優れる。

金属核を採用することにより、外部磁場によって磁性ビーズに働く外力は大きく、細胞のような磁気ビーズと同等もしくはそれ以上の大きさの対象の回収を効率よく行なうことが出来る。また、特殊な装置を用いなくてもサブミクロンサイズの磁気ビーズを回収することが実現できる。被覆も含めた磁気ビーズの粒子径は細胞を吸着するのに充分な比表面積を得るには、３μｍ以下であることが好ましい。また、３μm以下の平均粒径を有することにより細胞を生きたまま回収することが出来る。例えば、細胞回収後に核酸を抽出した核酸が分断されずに回収出来、阻害なく遺伝子診断などを行なうことが出来る。下限は特に規定するものではないが、特殊な装置を用いずに細胞を回収することの出来る５０ｎｍ以上とする。

平均粒径は、例えば、金属微粒子の試料粉末を溶媒中に分散させて、レーザ光線を照射させ回折を利用して粒径分布を測定する方法により求めることができる。本発明においては、平均粒径には、堀場製作所社製レーザ回折/散乱式粒度分布測定装置ＬＡ−９２０を用い該測定方法におけるメジアン径ｄ５０値を用いた。あるいは、粒径が１００ｎｍ以下と小さい場合は、試料を透過型電子顕微鏡または走査型電子顕微鏡で観察して平均粒径を測定する。試料の電子顕微鏡写真を撮影し、写真内で任意の面積内に観察された金属粒子の粒径を測定し、その平均値を粒径として求める。後述の方法では、測定粒子の数が少なくとも５０個以上になるようにして、平均値を得ることが望ましい。測定面積内の粒子数が少ない場合には、電子顕微鏡の倍率を変えるか若しくは視野を移動することにより、他の粒子も測定して合計の測定粒子数を５０個以上にする。さらに、個々の微粒子の粒径（直径）とは、例えば被覆層を有する微粒子の外径に相当するが、断面が円形でない場合には最大長さと最小長さの平均値をその微粒子の粒径と見なす。

[生体物質低吸着層]
細胞回収用磁気ビーズ表面は、回収しようとする細胞以外の細胞などの生体物質に対し低吸着性を有する材料でブロックされていることが好ましい。生体物質に対し低吸着性を有する材料は特に限定するものではなく、生体物質に低吸着性を有する材料であれば用いることが出来る。生体物質に対し低吸着性を有する材料の例は、例えば、ウシなどの血清や、アルブミンがある。安価に入手可能であることからアルブミンが好適に用いることが出来る。

[ビーズ表面]
細胞回収用磁気ビーズ表面は、細胞を含む検体から所望の細胞を特異的に補足する担体の特性を持たせるために、リガンドとして所望の細胞と親和性を有するプローブ、例えば、抗体、レクチン、ホルモンなどが固定化されていることが好ましい。また、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンなどが固定化されていることにより簡便に抗体、レクチン、ホルモンなどプローブを固定することができ好ましい。また、抗原抗体反応により特異的に所望の細胞を捕捉するために、所望の細胞の細胞表面抗原に対する特異的抗体が固定化されていることがより好ましい。例えば、ヒト上皮細胞または上皮がん細胞に発現している抗原に対する特異的抗体を結合することによりヒト上皮細胞等を回収するのに好適に用いることができる。また、前記ヒト上皮細胞等に発現している抗原に対する特異的抗体が固定された磁気ビーズを用いて糞便中の上皮細胞等を特異的に捕捉して回収することにより、糞便中の潜血に含まれる白血球や、タンパク質などを含まない純度のよい上皮細胞等を回収できる。このように得られた細胞より抽出した核酸を用いることにより感度よくがん細胞の検出をすることができる。すなわち、本発明の磁気ビーズはがん細胞検出に用いることができる。所望の細胞と親和性を有するプローブの固定の有無は、二次抗体を用いて蛍光標識を付し、蛍光顕微鏡で観察することにより確認することができる。また、ストレプトアビジンや、アビジンの固定の有無はビオチン化蛍光物質で標識を付し、蛍光顕微鏡で観察することで確認することができる。

細胞を含む検体とは、広く植物、動物から採取された細胞を含む検体である。例えば、血液、生体組織、尿、糞便、骨髄、臍帯血、唾液、口腔スワブ、培養細胞などである。これらの検体の種類によっては、採取された細胞を含む検体に、水溶液を加えてもよい。特に生体組織や、糞便のように粘度が高い、もしくは、細胞が溶液中に分散されていない検体の場合は磁気ビーズが分散しにくく、水溶液を加え粘度を低くすることが好ましい。水溶液は、検体中に含まれる細胞を劣化させないために水系溶媒であることが好ましい。より好ましくは細胞の劣化がより少ない緩衝溶液が望ましい。さらに、好ましくは細胞の劣化がより少ない細胞培養に用いる培地が望ましい。

細胞回収後観察のために、細胞回収用磁気ビーズ表面に蛍光物質や、化学発光物質、例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｒｅｄ、ＡＰＣ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５などを固定化することが好ましい。例えば、細胞Ａを特異的に捕捉する磁気ビーズに蛍光物質Ｂで標識し、細胞Ｃを特異的に捕捉する磁気ビーズに蛍光物質Ｄで標識し、細胞Ａと細胞Ｂが混在する検体より細胞を捕捉後、フローサイトメータなどを用い測定する。これにより検体中での細胞Ａと細胞Ｂの割合を細胞捕捉後に染色することなく、迅速に測定することに用いることができる。

本発明の細胞捕捉用磁気ビーズにおいて、抗体、レクチン、ホルモン、蛍光物質、及び化学発光物質を固定化する方法としては、物理吸着または、化学結合法を用いることが出来る。安定に使用する為には、磁気ビーズ表面を修飾しアミノ基、チオール基、カルボシル基などの官能基を固定し、これらの官能基と抗体を化学的に結合させることが好ましい。また、磁気ビーズ表面に固定された官能基と、官能基と結合するように誘導体を導入したストレプトアビジンを結合させる。このストレプトアビジンが表面に固定化されている磁気ビーズと、ビオチン化された抗体とを結合させる方法がある。ストレプトアビジンを経由し、抗体を固定化する方法は、種々のビオチン化されている抗体が市販されており、様々な細胞の表面抗原に対する特異的抗体を簡便に固定できて好ましい。

以下、本発明に係る実施例を詳細に説明する。ただし、これら実施例によって必ずしも本発明が限定されるわけではない。

本発明に用いられる無機材料被覆金属微粒子の例およびその比較例を以下に示す。
（実施例１）
平均粒径３０ｎｍの酸化鉄粉末と平均粒径２μｍのチタンとを等量混合し、窒素ガス雰囲気において熱処理を施し、この生成物の非磁性不要成分を磁気分離し、除去することで、金属微粒子を得た。Ｘ線回折の結果から、Ｆｅ以外では、チタン酸化物のピーク強度が最も大きく、得られた金属微粒子は、粒子表面がチタン酸合物で被覆されたチタン酸化物被覆鉄粒子であった。レーザ回折型粒径分布測定器で測定した平均粒径ｄ５０は０.８μｍであった。

（比較例１）
実施例１でチタン酸化物被覆鉄粒子５ｇをエタノール溶媒１００ｍｌ中に分散し、これにテトラエトキシシランを添加した。この溶媒を攪拌しながら純水とアンモニア水と塩化カリウムの混合溶液を添加した。純水とアンモニア水と塩化カリウムはそれぞれ２２ｇと４ｇと０.０３ｇ使用した。その後、ボールミルにおいて攪拌した。この生成物の非磁性不要成分を磁気分離し、除去することで、粒子表面がケイ素酸化物で被覆された平均粒径が１.２μｍのケイ素酸化物被覆鉄微粒子を得た。

実施例１のチタン酸化物被覆鉄粒子５ｍｇを２ｍＬマイクロチューブに加え、リン酸バッファー（ＰＢＳ）により１０％に希釈したウシ胎児血清（ＦＢＳ）５００μＬ加え、４℃で１６時間放置した。磁気分離により上澄みを抽出した液（Ａ液）をタンパク質定量キット（ＡＣＴＩＶＥ ＭＯＴＩＦ社製ＰｒｏＳｔａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてタンパク質を蛍光色素で標識し、蛍光光度計（日立製作所製Ｆ４５００形分光蛍光光度計）を用い蛍光強度を求めた。また、２ｍＬマイクロチューブにＰＢＳにより１０％に希釈したＦＢＳ５００μＬ加え、４℃で１６時間放置した液（Ｂ液）に対して、タンパク質定量キットでタンパク質を蛍光色素で標識し、蛍光光度計を用い蛍光強度を求めた。Ａ液の蛍光強度からＢ液の蛍光強度を引くことによりチタン酸化物被覆鉄粒子のタンパク質吸着度を求めた。測定サンプル数を５サンプルとし、平均値を求めた。その結果、タンパク質吸着度は１.２９であった。比較例１のケイ素酸化物被覆鉄粒子でも、上記実施例１の場合と同様の方法でタンパク質吸着度を求め７.９７であった。タンパク質吸着度が小さい程、タンパク質の吸着は少ない。すなわち、本発明の磁気ビーズはタンパク質に対する活性が低く、低吸着性であり非特異吸着が少ないことを示す。

（実施例２）
平均粒径３０ｎｍの酸化鉄粉末と平均粒径２μｍのチタンとを等量混合し、窒素ガス雰囲気において１０００℃で２時間熱処理を施し、この生成物の非磁性不要成分を磁気分離し、除去することで、金属微粒子を得た。Ｘ線回折の結果から、Ｆｅ以外では、チタン酸化物のピーク強度が最も大きく、得られた金属微粒子は、粒子表面がチタン酸合物で被覆されたチタン酸化物被覆鉄粒子であった。レーザ回折型粒径分布測定器で測定した平均粒径ｄ５０は２.７μｍであった。

前記磁気ビーズとしてこの実施例２のチタン酸化物被覆鉄粒子と１ｖｏｌ％３−アミノプロピルトリエトキシシラン(ＡＰＳ)水溶液とを混和し、１時間攪拌した。さらに、大気中において１２０℃で１時間加熱処理を施し、アミノ基が導入された磁気ビーズ（アミノ基コート磁気ビーズ）を得た。Ｂａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＢｉｏＭａｇ Ｐｌｕｓ Ａｍｉｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔを用い、下記の手順で前記アミノ基コート磁気ビーズに抗体を固定化した。まず、アミノ基コート磁気ビーズ５ｍｇとキット付属ピリジンウォッシュバッファー（ＰＷＢ）により５％に調整したグルタルアルデヒド４００μＬを混和させ、３時間室温で攪拌した。その後、非磁性成分を磁気分離により除去し、ＰＷＢで４回洗浄した。このようにして得た磁気ビーズをＰＷＢに懸濁させた懸濁液と、ストレプトアビジン（和光純薬社製）を混和させ、４℃で１６時間攪拌した。ここに、キット付属クエンチング溶液を４００μＬ加え３０分室温で攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、ＰＷＢで４回洗浄し、ストレプトアビジンコート磁気ビーズを作製した。

次に、リガンドとしてビオチン化された抗ヒトＣＤ４４抗体（Ａｎｃｅｌｌ社製Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ ＣＤ４４／Ｂｉｏｔｉｎ）１．６μＬと上記ストレプトアビジンコート磁気ビーズ４ｍｇをリン酸バッファー（ＰＢＳ）１６０μＬに懸濁させた懸濁溶液を混和し、室温で３０分攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、抗ヒトＣＤ４４抗体固定化磁気ビーズを得た。

２ｍＬマイクロチューブに、検体として１ｍＬのＰＢＳに培養したヒト子宮頸部がん細胞ＨｅＬａ細胞を１００万細胞懸濁させた細胞懸濁液を入れ、４ｍｇの上記抗ヒトＣＤ４４抗体固定化磁気ビーズを加え３０分室温で攪拌した。マイクロチューブを磁気スタンドに立て２０秒間放置し、磁石と接する壁面に磁気ビーズを回収・保持させ、非磁性成分（磁気ビーズと結合していない成分）を除去した。更に、マイクロチューブを磁気スタンドより外し、５００μＬのＰＢＳを加え攪拌し、マイクロチューブを磁気スタンドに立て２０秒間放置し、磁石と接する壁面に磁気ビーズを回収して保持させ、非磁性成分を除去、洗浄した。この洗浄工程を計２回行ない、細胞回収を行なった。

細胞数は、血球計算板を用い下記手順により求めた（視算法）。細胞計算板にはカバーガラスとの間の容量が１区画０．１μＬとなるような格子状の目盛りが刻まれている。前記血球計算板にカバーガラスを載せ、血球計算板とカバーガラスの隙間に、回収した細胞を２００μＬのリン酸バッファ（ＰＢＳ）に分散させた細胞懸濁液を入れた。血球計算板を位相差顕微鏡に載せ、８区画の細胞数を数え、１区画辺りの細胞数の平均値を求め２０００倍することにより細胞懸濁液全体の細胞数を求め回収細胞数／懸濁液中細胞数を１００倍することにより細胞回収率を求めた。その結果、細胞回収率は８７％であった。すなわち、本発明の磁気ビーズは優れた細胞回収性能を示した。

さらに、ロッシュ社製核酸抽出キット（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔI）付属試薬を用い、下記手順で核酸抽出を行なった。ＨｅＬａ細胞１００万細胞に、キット付属溶解結合バッファー３００μＬを加えボルテックスで１０秒攪拌した。プロテアーゼ溶液を１００μＬ加えボルテックスで攪拌し、３．３分間６０℃で攪拌し、サンプルを室温に冷却した。上記ストレプトアビジンコート磁気ビーズ１５ｍｇとイソプロピルアルコール１５０μＬを加えて攪拌し、室温で８分間攪拌した。上澄みを磁気分離により除去し、核酸を洗浄する溶液としてキット付属洗浄バッファーIを８５０μＬ加え、ボルテックスで５秒攪拌した。上澄みを磁気分離により除去し、核酸を洗浄する溶液としてキット付属洗浄バッファーIIを４５０μＬ加え、ボルテックスで５秒攪拌し、上澄みを磁気分離により除去した。この工程を２回繰り返した。磁気ビーズから核酸を脱離させる溶液としてキット付属溶出バッファーを１００μＬ加え、６０℃で８分間攪拌し、磁気分離により上澄み液を採取し上澄み液を得た。

上記上澄み液の核酸の抽出量及び純度は吸光度を測定し定量した（ＯＤ法）。核酸の抽出量は２６０ｎｍの吸光度より溶液の濃度を求め、抽出量を定量した。また、純度は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比率（Ａ２６０/Ａ２８０）より判断し、１．７以上であれば純度が良いとする。その結果、純度が０.３となりＯＤ法で検出可能な濃度以下であった。つまり、本発明の磁気ビーズは核酸に対する活性が低く、低吸着性を示す。

（比較例２）
実施例２と同様の方法で得たチタン酸化物被覆磁気ビーズ５ｇをエタノール溶媒１００ｍｌ中に分散し、これにテトラエトキシシランを添加した。この溶媒を攪拌しながら純水とアンモニア水と塩化カリウムの混合溶液を添加した。純水とアンモニア水と塩化カリウムはそれぞれ２２ｇと４ｇと０．０３ｇ使用した。その後、ボールミルにおいて攪拌した。この生成物の非磁性不要成分を磁気分離し、除去することで、粒子表面がケイ素酸化物で被覆された平均粒径が３μｍの鉄微粒子を得た。更に、上記実施例１と同様の方法でストレプトアビジンをコートし、ＨｅＬａ細胞から核酸の抽出を行なった。上記のＯＤ法により核酸抽出量を定量した結果、５.４μｇの核酸を抽出した。また、Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７９０と純度よく抽出した。すなわち、実施例２に比べ核酸に対する活性が高く非特異吸着が多い。

（実施例３〜５）
酸化鉄粉末とチタンとを混合し、窒素ガス雰囲気において熱処理を施し、この生成物の非磁性不要成分を磁気分離し、除去することで、粒子表面がチタン酸合物で被覆された平均粒径が１.２μｍ、２.４μｍ、３.６μｍのチタン酸化物被覆磁気ビーズを得た。

実施例１と同様の方法でストレプトアビジンをコートし、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ４ｍｇとリガンドとしてビオチン化されたＶＵ−ＩＤ９抗体（ｂｉｏｍｅｄａ社製Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｅ）１６μＬをリン酸バッファー（ＰＢＳ）１６０μＬに懸濁させた懸濁溶液を混和し、室温で３０分攪拌し、非磁性成分を磁気分離で除去し平均粒径１.２μｍ、２.４μｍ、３.６μｍのＶＵ―ＩＤ９抗体固定化磁気ビーズを得た。平均粒径１.２μｍのＶＵ―ＩＤ９抗体固定化磁気ビーズを実施例３、平均粒径２.４μｍのＶＵ―ＩＤ９抗体固定化磁気ビーズを実施例４、平均粒径３.６μｍのＶＵ―ＩＤ９抗体固定化磁気ビーズを実施例５とし、以下の細胞回収を行なった。

ビーズ２ｍＬマイクロチューブに、検体として１ｍＬのＰＢＳに培養した大腸がん細胞ＨＴ−２９細胞を１００万細胞懸濁させた細胞懸濁液を入れ、４ｍｇの上記前記実施例３〜５のＶＵ―ＩＤ９抗体固定化磁気を加え３０分室温で攪拌した。マイクロチューブを磁気スタンドに立て２０秒間放置し、磁石と接する壁面に磁気ビーズを回収・保持させ、非磁性成分（磁気ビーズと結合していない成分）を除去した。更に、マイクロチューブを磁気スタンドより外し、５００μＬのＰＢＳを加え攪拌し、マイクロチューブを磁気スタンドに立て２０秒間放置し、磁石と接する壁面に磁気ビーズを回収して保持させ、非磁性成分を除去、洗浄した。この洗浄工程を計２回行ない細胞回収を行なった。

前記実施例２と同様の方法で細胞回収率を求めた。また、前記血球計算板にカバーガラスを載せ、血球計算板とカバーガラスの隙間に、回収した細胞を１００μＬのリン酸バッファ（ＰＢＳ）に分散させた細胞懸濁液にトリパンブルー１００μＬを加え染色した細胞懸濁液を入れた。血球計算板を位相差顕微鏡に載せ、８区画の染色されていない生細胞数と染色された死細胞数を数え、１区画辺りの生細胞と死細胞数の平均値を求め生細胞数/（生細胞数+死細胞数）を１００倍することにより生細胞率を求めた。その結果を表１に示す。また、実施例３の磁気ビーズによって回収された細胞をカルセインで染色し蛍光顕微鏡で観察した結果を図１に、実施例５の磁気ビーズによって回収された細胞をトリパンブルーで染色し位相差顕微鏡で観察した結果を図２に示す。図１から明らかなように、蛍光物質を標識として磁気ビーズ２に固定することにより、磁気ビーズを明瞭に確認することができる。

表１おいて明らかなように、実施例３〜５の磁気ビーズは高い細胞回収率を示し、平均粒径が３μｍ以下では、細胞回収率は７５％を超えている。本発明の細胞回収用磁気ビーズが所望の細胞を回収するための磁気ビーズとして有用であることが示された。また、平均粒径が３μｍ以下である実施例３および実施例４は平均粒径が３μｍ以上の実施例５と比べ生細胞率が極めて高く、生細胞率が９０％を超える高い値を示している。平均粒径が１.２〜２.４μｍの実施例３と実施例４の磁気ビーズでは、細胞回収率８１〜８５％、生細胞率９５〜９７％と、細胞回収率、生細胞率ともに優れた性能を示している。すなわち、本発明の平均粒径が３μｍ以下の細胞回収用の磁気ビーズが所望の細胞を生きたまま回収するための磁気ビーズとして特に好適であることが示された。図２では、磁気ビーズ５がトリバンブルーに染色されていない生細胞４を捕捉している様子が確認できる。死細胞３はトリバンブルーに染色されている。

実施例３の磁気ビーズによって回収された細胞をカルセインで染色し蛍光顕微鏡で観察した図である。 実施例５の磁気ビーズによって回収された細胞を位相差顕微鏡で観察した図である。

符号の説明

１：細胞 ２：磁気ビーズ ３：死細胞 ４：生細胞 ５：磁気ビーズ

Claims (6)

1. 磁性金属を主成分とする金属粒子核と、前記金属粒子核を被覆し、Ｖ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｎｂ、Ｚｒ、Ｃｒの少なくとも１種の元素を主体として構成される無機材料を有する細胞回収用磁気ビーズ。
2. 前記磁気ビーズが３μｍ以下の平均粒径を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞回収用磁気ビーズ。
3. 前記磁気ビーズの表面に少なくとも１種のリガンドが固定されていることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の細胞回収用磁気ビーズ。
4. 前記リガンドが細胞表面抗原に対する特異的抗体であることを特徴とする請求項３に記載の細胞回収用磁気ビーズ。
5. 前記特異的抗体が上皮細胞、上皮系細胞のうち少なくとも１種に対する特異的抗体であることを特徴とする請求項４に記載の細胞回収用磁気ビーズ。
6. 前記磁気ビーズの表面にはストレプトアビジン、アビジンのうち少なくとも１種が固定され、前記ストレプトアビジン、アビジンのうち少なくとも１種にビオチン化抗体、ビオチン化レクチン、ビオチン化ホルモン、ビオチン化蛍光物質およびビオチン化化学発光物質のうち少なくとも１種が結合していることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞回収用磁気ビーズ。