JP2007238442A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新規の抗ウイルス剤を提供する。
【解決手段】前記抗ウイルス剤は、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０に対する阻害剤を有効成分として含む。前記ＨＳＰ阻害剤としては、例えば、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン又はゲルダナマイシンを挙げることができる。前記抗ウイルス剤としては、例えば、抗Ｃ型肝炎ウイルス剤を挙げることができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗ウイルス剤に関する。なお、本明細書において、抗ウイルス剤には、ウイルスに対する予防剤及び治療剤の両方が含まれる。

ゲルダナマイシン［geldanamycin；一般式（Ｉ）においてＲ^１がメトキシ基である化合物］及び１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン［17-(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin；一般式（Ｉ）においてＲ^１がアリルアミノ基である化合物。以下、１７−ＡＡＧと称する］は、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０に対する阻害作用を有することが知られており、更に、抗がん剤として期待されている化合物である。両者の構造は、非常によく似ているが、１７−ＡＡＧは、比較的細胞毒性が低く、水溶性も高い。

１７−ＡＡＧが抗がん剤として期待されている理由は、その作用がＨｓｐ９０を抑制する点にある。Ｈｓｐ９０は、細胞質内で最も多いタンパク質であり、通常の細胞の状態では細胞タンパク質の１〜２％を占めており、細胞にストレス又は３７℃を超える熱刺激が加わった場合に大量に発現し、細胞質内で凝集又は変性しようとしているタンパク質の修正に働くタンパク質である。このＨｓｐ９０は、細胞内の色々なタンパク質の成熟化に関わっており、その中には、アポトーシスなど細胞死に関わるもの、細胞周期（E1F2αK, PLK）を司るもの、シグナルの受け渡しをするステロイドホルモン受容体などに大きく関わっていることが知られている。このＨｓｐ９０を一つ抑制するだけで、さまざまなシグナル伝達分子が抑制される。

Ｈｓｐ９０を抑制する１７−ＡＡＧの機能としては、Ｈｓｐ９０はＡＴＰ／ＡＤＰ依存的にその活性を示すことが知られており、このＨｓｐ９０のＡＴＰ／ＡＤＰ結合ポケット（binding pocket）に１７−ＡＡＧが結合することでＨｓｐ９０活性を抑制するものである（非特許文献１）。Ｈｓｐ９０の活性が失われると、Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質は、その形を保てなくなり、凝集してしまうか、あるいは、ユビキチン化され、最終的にプロテアソームによって分解されてしまう。このクライアントタンパク質の分解が前記抗がん作用をもたらすものと考えられている。

１７−ＡＡＧは、抗がん剤として、現在臨床試験（Phase II）に入っている。しかしながら、１７−ＡＡＧが抗ウイルス剤として使用可能であるとの報告はない。

「クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clinical Cancer Research）」，（米国），2001年，7巻，p. 2076-2084

本発明の課題は、新規の抗ウイルス剤を提供することにある。

前記課題は、本発明による、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０に対する阻害剤（以下、Ｈｓｐ９０阻害剤と称する）を有効成分として含む、抗ウイルス剤により解決することができる。
本発明の抗ウイルス剤の好ましい態様によれば、前記Ｈｓｐ９０阻害剤が、一般式（Ｉ）：

［式中、基Ｒ^１は、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アリル基、アミノ基、アリルアミノ基、−Ｓ−アルキル基、−Ｓ−アリル基である］
で表される化合物であり、より好ましくは、式（II）：

で表される１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシンである。
また、本発明の抗ウイルス剤の別の好ましい態様によれば、前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである。

また、本発明は、Ｈｓｐ９０阻害剤と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する、医薬組成物（特には抗ウイルス剤）に関する。
本発明は、Ｈｓｐ９０阻害剤を、抗ウイルス治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、抗ウイルス治療又は予防方法に関する。
本発明は、抗ウイルス剤を製造するためのＨｓｐ９０阻害剤の使用に関する。

本発明によれば、新規の抗ウイルス剤を提供することができる。
抗Ｃ型肝炎ウイルス剤として使用する場合、公知のＨＣＶ治療法、例えば、インターフェロン単独、リバビリン−インターフェロン併用よりも効果は高く、毒性も低く、副作用を伴わない。
また、ウイルスの増殖に直接関与する薬剤ではないことから、逆転写酵素又はプロテアーゼ阻害剤のような薬剤耐性ウイルスの出現はないものと期待される。

本発明の抗ウイルス剤は、その有効成分として、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０に対する阻害剤（Ｈｓｐ９０阻害剤）を含有する。

本発明の抗ウイルス剤は、ＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスのいずれにも適用することができ、本発明の抗ウイルス剤を適用可能なウイルスとしては、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を挙げることができる。

Ｃ型肝炎ウイルスとしては、例えば、１ａ型、１ｂ型、１ｃ型、２ａ型、２ｂ型、２ｃ型、２ｋ型、３ａ型、３ｂ型、４ａ型、５ａ型、６ａ型、６ｂ型の各Ｃ型肝炎ウイルス、並びにそれらの変異体を挙げることができる。

本発明で有効成分として用いることのできるＨｓｐ９０阻害剤としては、例えば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を挙げることができる。一般式（Ｉ）において、基Ｒ^１は、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アリル基、アミノ基、アリルアミノ基、−Ｓ−アルキル基、−Ｓ−アリル基であり、アリルアミノ基又はメトキシ基であることが好ましく、アリルアミノ基であることが特に好ましい。一般式（Ｉ）において基Ｒ^１がアリルアミノ基である化合物は、前記式（II）で表される１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシンである。また、一般式（Ｉ）において基Ｒ^１がメトキシ基である化合物は、ゲルダナマイシンである。

−Ｏ−アルキル基又は−Ｓ−アルキル基におけるアルキル基は、一般式（Ｉ）で表される化合物がＨｓｐ９０阻害活性を有する限り、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基、より好ましくは炭素数１〜４個の低級アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、又はｔ−ブチル基であり、メチル基又はエチル基が特に好ましい。

本発明の抗ウイルス剤は、有効成分であるＨｓｐ９０阻害剤を単独で、あるいは、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる公知の担体又は希釈剤と共に、含有することができる。
本発明の抗ウイルス剤は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の抗ウイルス剤の投与量は、治療対象動物（哺乳類、特にはヒト）の種及びその薬剤に対する個体の応答性、並びに選択される製剤の剤形及び投与時間や間隔などに応じて、適宜選択することができる。

本発明の抗ウイルス剤は、有効成分であるＨｓｐ９０阻害剤以外に、場合により医薬的に許容することのできる公知の担体又は希釈剤との組合せで、経口、非経口、又は局所的な経路のいずれかにより、単回又は複数回で投与することができる。本発明の抗ウイルス剤は、種々の異なる剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー、粉末剤、スプレー剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁剤、注射用溶液剤、エリキシル剤、又はシロップ剤などにすることができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：細胞毒性評価》
本実施例及び以下の実施例では、評価系として、ＮＮＣ（Full length replicon）細胞（京都大学ウイルス研究所）を使用した。前記ＮＮＣ細胞は、図１に示すように、ＨＣＶ ＩＲＥＳ（internal ribosomal entry site）でＮｅｏ^ｒとＨＣＶ全長のタンパク質を発現する細胞である。

ＮＮＣ細胞は、１０％ウシ胎児血清（FBS）ＤＭＥＭ（GIBCO社）及びＧ４１８（Sigma社）でセレクションを行い、３７℃及び５％ＣＯ_２濃度のインキュベーターで培養した。

毒性評価実験は、以下の手順で実施した。すなわち、２４ウェルプレートに、ＮＮＣ細胞を１．５×１０^５細胞／ウェルとなるように蒔き、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ；SIGMA社）で薬剤処理（0 nmol/L, 250 nmol/L, 500 nmol/L, 1μmol/L）を施した。３７℃及び５％ＣＯ_２濃度のインキュベーターで２４時間又は４８時間培養後、０．０２％トリパンブルー（Trypan Blue Stain；GIBCO社）で細胞を染色して生細胞数及び死細胞数を測定し、細胞毒性評価を行った。

結果を図２（ＮＮＣ細胞）に示す。
図２に示すとおり、ＮＮＣ細胞では、コントロールの非薬剤処理と比較して、２５０ｎｍｏｌ／Ｌ、５００ｎｍｏｌ／Ｌ、又は１μｍｏｌ／Ｌの１７−ＡＡＧで処理した場合の生存率（viability）は８０％前後とほとんど細胞毒性が無いことが示された。また、２４時間後及び４８時間後の生存率の変化においても、ほとんど差が見られないことから、ＮＮＣ細胞において細胞毒性は無いことが示唆された。
これらの結果より、１７−ＡＡＧは、肝細胞由来のＨＣＶレプリコンシステム細胞において非薬剤処理と薬剤処理サンプルとの間に生存率変化がほとんど無いことから、細胞毒性はほとんど無いことが示唆された。

《実施例２：分子シャペロンと１７−ＡＡＧの結合評価》
２４ウェルプレートに、ＮＮＣ細胞を１．５×１０^５細胞／ウェルとなるように蒔き、１７−ＡＡＧで薬剤処理（0 nmol/L, 0.25 nmol/L, 25 nmol/L, 50 nmol/L, 250 nmol/L, 500 nmol/L, 1μmol/L）を施した。３７℃及び５％ＣＯ_２濃度のインキュベーターで２４時間又は４８時間培養した後、培養上清を捨て、１×ＰＢＳ（phosphate buffered saline）で２回細胞を洗浄し、市販の溶解液（1×CAT ELISA；Roche社）により細胞を４℃で３０分間溶解した。細胞溶解液を１．５ｍＬマイクロチューブに回収し、遠心操作（5000 r.p.m.、４℃、５分間）により上清を回収した。回収したサンプルを、市販キット（BCATM Protein Assay kit；PIERCE社）を用いて９６ウェルプレート上で反応（３７℃、３０分間）させた後、プレートリーダーを用いてタンパク質濃度を測定した。

Ｈｓｐ９０に関するウエスタンブロッティングは、以下の手順で実施した。すなわち、タンパク質濃度測定後のサンプル１５μｇ／μＬと、サンプルバッファー３μＬとを混ぜ、９５℃で２分間変性後、氷上に移し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でタンパク質の分離を行った。泳動後、タンパク質をメンブレンに転写し、５％スキムミルク（wako社）で１時間ブロッキングを行った後、一次抗体として、希釈（５％スキムミルク：抗体＝1000：0.5）した抗Ｈｓｐ９０抗体（cell signaling社）を４℃で一晩反応させた。反応後、ＴＢＳ／Ｔ（Tris-buffered saline/Tween）で３回洗浄し、二次抗体として、抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Amersham Biosciences社）［５％スキムミルク：抗体：抗ビオチンプロテインマーカー（Cell signaling）＝1000：0.5：1］を室温で一時間反応させた。反応後、ＴＢＳ／Ｔで３回洗浄し、市販キット（ECL Plus；Amersham Biosciences社）を使用し、タンパク質を化学発光させた後、現像液及び固定液を使用して暗室で現像を行った。

Ｈｓｐ７０に関するウエスタンブロッティングは、以下の手順で実施した。すなわち、タンパク質濃度測定後のサンプル１５μｇ／μＬと、サンプルバッファー３μＬとを混ぜ、９５℃で２分間変性後、氷上に移し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でタンパク質の分離を行った。泳動後、タンパク質をメンブレンに転写し、５％スキムミルク（wako社）で１時間ブロッキングを行った後、一次抗体として、希釈（５％スキムミルク：抗体＝5000：1）した抗Ｈｓｐ７０モノクローナル抗体（Sigma社）を４℃で一時間反応させた。反応後、ＴＢＳ／Ｔ（Tris-buffered saline/Tween）で３回洗浄し、二次抗体として、抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Amersham Biosciences社）［５％スキムミルク：抗体：抗ビオチンプロテインマーカー（Cell signaling）＝1000：0.5：1］を室温で一時間反応させた。反応後、ＴＢＳ／Ｔで３回洗浄し、市販キット（ECL Plus；Amersham Biosciences社）を使用し、タンパク質を化学発光させた後、現像液及び固定液を使用して暗室で現像を行った。

ウエスタンブロッティングの結果を図３（ＮＮＣ細胞）に示す。図３において、レーン１及び５は、１７−ＡＡＧ濃度が０ｎｍｏｌ／Ｌ（コントロール）である場合の結果であり、レーン２及び６は、１７−ＡＡＧ濃度が２５０ｎｍｏｌ／Ｌである場合の結果であり、レーン３及び７は、１７−ＡＡＧ濃度が５００ｎｍｏｌ／Ｌである場合の結果であり、レーン４及び８は、１７−ＡＡＧ濃度が１μｍｏｌ／Ｌである場合の結果である。

図３に示すとおり、ＮＮＣ細胞では、１７−ＡＡＧ処理から２４時間後では、Ｈｓｐ９０の発現及び分解には何も影響は見られなかったが、Ｈｓｐ７０では１７−ＡＡＧを加えると若干発現が増加しているのが見られた。また、４８時間後では、１７−ＡＡＧを５００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌと濃度を増加させると、対照的にＨｓｐ９０のタンパク質量は濃度依存的に減少しているのが見られた。一方、Ｈｓｐ７０では、２４時間後と同様に、１７−ＡＡＧを加えると濃度依存的に発現が増加しているのが見られた。
これらの結果より、１７−ＡＡＧがＨｓｐ９０のＡＴＰ結合ポケットに結合することで起こる熱ショックタンパク質翻訳因子（Heart shock protein translation factor）ＨＳＦ１の解離がおこり、Ｈｓｐ７０の発現を増加させていることが示唆され、このことから、ＨＣＶレプリコンシステム細胞において１７−ＡＡＧの薬剤効果が示され、Ｈｓｐ９０を抑制していることが示唆された。

《実施例３：ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害効果の検討》
２４ウェルプレートに、ＮＮＣ細胞を１．５×１０^５細胞／ウェルとなるように蒔き、１７−ＡＡＧで薬剤処理を施した。３７℃及び５％ＣＯ_２濃度のインキュベーターで４８時間培養後、ＲＮＡを、市販試薬（TRIZOL；Invitorogen社、1×CAT ELISA；Roche社）を用いて抽出した。

ＮＮＣ細胞におけるＨＣＶ ＲＮＡの定量を、Ｔａｑ−Ｍａｎ−ＰＣＲ法を用いて解析することで、ウイルスの複製抑制効果の検討を行った。具体的には、抽出したＲＮＡを５０ｎｇ／μＬに調製し、逆転写反応（５５℃３０分間、９５℃１０分間、及び４℃１分間）及びＰＣＲ反応（５０℃２分間、及び９５℃１０分間の後、９５℃１５秒間及び６２℃１分間からなるサイクルを６０サイクル繰り返し、４℃で１分間）を実施した。

なお、逆転写反応におけるＨＣＶ ＲＮＡリバースプライマーとして、塩基配列：
5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’（配列番号１）
からなるオリゴヌクレオチドを使用した。また、ＰＣＲ反応におけるＨＣＶ ＲＮＡフォワードプライマー及びＨＣＶ ＲＮＡリバースプライマーとして、塩基配列：
5’-CGGGAGAGCCATAGTGG -3’（配列番号２）
からなるオリゴヌクレオチド及び塩基配列：
5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’（配列番号３）
からなるオリゴヌクレオチドを、ＨＣＶ ＲＮＡプローブとして、塩基配列：
5’-FAM-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-TAMRA-3’（配列番号４）
からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ使用した。

結果を図４に示す。なお、比較のために、１７−ＡＡＧ処理に代えて、１００Ｕ／ｍＬ濃度でインターフェロン（天然型インターフェロン−α製剤；持田製薬）処理を実施すること以外は、前記操作を繰り返した。
図４に示すとおり、ＨＣＶ ＲＮＡの複製は、０ｎｍｏｌ／Ｌ（すなわち、１７−ＡＡＧ非存在下）、０．２５ｎｍｏｌ／Ｌ、 ２５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５０ｎｍｏｌ／Ｌ、５００ｎｍｏｌ／Ｌ、若しくは１μｍｏｌ／Ｌ濃度の１７−ＡＡＧで、又は１００Ｕ／ｍＬ濃度のインターフェロンで薬剤処理したところ、２５ｎｍｏｌ／Ｌの１７−ＡＡＧ処理で、ほぼ完全にＨＣＶゲノムの複製を抑えた。一方、インターフェロン１００ＩＵ／ｍＬでＨＣＶ複製阻害をほぼ完全に抑制することが示された（図は示さず）。
最適薬剤濃度を求めるため、更に細かく薬剤濃度を分けて実験を行ったところ、０．２５ｎｍｏｌ／Ｌでも７０％を超えるＨＣＶ ＲＮＡ複製抑制効果があることがわかった。
以上の結果より、１７−ＡＡＧは抗がん剤及びＨｓｐ９０阻害剤であるとともに、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を９９．８％抑制することが示された。

本発明の抗ウイルス剤は、抗ウイルス（特には抗Ｃ型肝炎ウイルス）治療又は予防の用途に適用することができる。

配列表の配列番号１〜３の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号４の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列である。

ＨＣＶフルレングスレプリコン（Full length replicon）の構造を模式的に示す説明図である。 ＮＮＣ細胞における１７−ＡＡＧの細胞毒性評価の結果を示すグラフである。 ウエスタンブロッティング（電気泳動）により、ＮＮＣ細胞における１７−ＡＡＧと分子シャペロンとの結合評価の結果を示す、図面に代わる写真である。 ＮＮＣ細胞における１７−ＡＡＧのＲＮＡ複製阻害効果を示すグラフである。

Claims (4)

1. 熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０に対する阻害剤を有効成分として含む、抗ウイルス剤。
2. 前記阻害剤が、一般式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、基Ｒ^１は、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アリル基、アミノ基、アリルアミノ基、−Ｓ−アルキル基、−Ｓ−アリル基である］
   で表される化合物である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
3. 前記阻害剤が、式（II）：
   

   

   で表される１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシンである、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
4. 前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。

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