JP2007178269A - プローブ担体の品質保証方法 - Google Patents

Abstract

【課題】プローブ担体の品質保証工程を省力化するための技術を提供する。
【解決手段】複数種のプローブが固定化されたプローブ担体の品質保証であって、以下の工程；（１）前記複数種のプローブと特異的に結合する各々の標識物質を標識する工程、（２）前記標識された標識物質を混合する工程、（３）前記混合された標的物質と前記プローブ担体とを反応させる工程、（４）プローブ担体上のプローブと結合した標的物質を検出する工程、（５）前記検出結果からプローブ担体の良否を判定する工程、を有することを特徴とする品質保証方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、複数のプローブがマトリクス状に配置されたプローブ担体の品質保証方法に関する。

DNAマイクロアレイ等のプローブ担体は、遺伝子の発現解析等の遺伝子情報取得を目的として利用されるようになってきており、また、それらの解析結果は、感染症等の診断、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。プローブ担体を先に述べた用途に使用する場合、解析結果の信頼性を得るために再現性等の品質保証をする必要がある。

従来のプローブ担体の品質保証方法は、プローブ種毎に対応する既知の標識された標的物質をそれぞれ用意し、それぞれの標的物質とプローブ担体とを反応させ、反応させたプローブ担体上の標的物質を検出することにより保証した。このため、複数のプローブ種を配置したプローブ担体を保証するためには、プローブ種に対応した数のプローブ担体を用意して反応させる必要があった。このため、プローブ種が多数配置されたプローブ担体の品質保証をする場合には、保証のためのプローブ担体数および工数が増大する問題があった。

本発明の目的は、複数のプローブ種が配置されたプローブ担体の品質保証工程を省力化する方法を提供することにある。

本発明のプローブ担体の品質保証工程を省力化する方法は、
複数種のプローブが固定化されたプローブ担体の品質保証方法であって、
以下の工程；
（1）前記複数種のプローブと特異的に結合する各々の標的物質を標識する工程、
（2）前記標識された標的物質を混合する工程、
（3）前記混合された標的物質と前記プローブ担体とを反応させる工程、
（4）前記プローブ担体上のプローブと結合した標的物質を検出する工程、
（5）前記検出結果からプローブ担体の良否を判定する工程、
を有することを特徴とする品質保証方法。

本発明によるプローブ担体の品質保証方法は、プローブ種毎にハイブリダイゼーションを行う従来法に比べ、工数を省力化する利点を持つ。また、感染症の原因を特定するプローブ担体の品質保証を行う場合には、菌種の分類パターンを明確にすることにより、対象菌種の変更時にも分類が容易に対応出来る利点を持つ。

本発明のプローブ担体は、プローブと特異的に結合する標的物質を検出することを目的とする試験用であれば、特に限定なく使用できる。

プローブとしては、無機化合物、有機化合物のどちらでも用いることができる。有機化合物のプローブにはタンパク質、核酸などが利用でき、これらは天然のもの、人工的に合成されたものどちらでもよい。例えば、プローブが核酸であるプローブ担体（核酸プローブ担体）では、ハイブリダイゼーション法を利用して、核酸プローブと標的核酸とが互いに相補的な配列部分でハイブリッド体が形成されることで検出を行う。核酸プローブ担体は、ウイルス、微生物、動植物、ヒトなど生物種に由来する特定の塩基配列を有する核酸の検出、あるいは、その塩基配列の同定、または塩基配列における各種変異の有無の検出に好適に利用できる。

複数のプローブ種は、互いの融解温度（Ｔｍ）が出来るだけ近いことが好ましい。より好ましくは融解温度が、互いの差が５℃未満となるようなプローブからなるプローブ担体である。また、プローブ長は、２０塩基以上であることが好ましい。より好ましくはハイブリダイゼーションの安定性を考慮すると、20〜30塩基であることが望ましい。

混合する複数種の標的物質が核酸であれば、互いの塩基配列のホモロジーが高い場合には、クロスハイブリダイゼーションが起こる可能性があるため、これらをあらかじめ分けた組み合わせを作って、別々にハイブリダイゼーションを行うことが望ましい。クロスハイブリダーゼーションの可能性は、プローブ配列間（ないしは標的物質のプローブと相補的な領域の塩基配列間）のホモロジーを計算することで判定する。さらにプローブ配列と標的物質が由来する生物種のゲノム配列とのホモロジーを計算すれば、より高い確率でクロスハイブリダイゼーションを防止できる。ゲノム配列はＧＥＮＢＡＮＫ等の公共のデータベースが利用できる。これらの計算結果より、ホモロジーが有意に高く、クロスハイブリダーゼーションが起こると予測される核酸配列を持つ標的物質は別の組み合わせにする。好ましくは、同一グループの組み合わせには、プローブ結合領域での互いのホモロジーが７０％未満である標的物質が含まれるように分類する。

また、検出を高精度に行うために、ハイブリダイゼーション反応は、高ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。よって、ハイブリダイゼーション温度の設定はプローブの融解温度とハイブリダイゼーション温度との関係を考慮し、プローブの融解温度とハイブリダイゼーション温度との差は１０℃を超えないことが好ましい。

検出方法としては、標的核酸に標識を施し、特定の塩基配列を有する核酸プローブとハイブリッド体形成して、固定化された標的核酸を検出する方法を好適に利用できる。標識を施す方法としては、放射性物質、ビオチン等の酵素、および蛍光色素、などの標識物質を用いた以下の方法などを利用することができる。
（１）標識物質を核酸の末端に付加する方法。
（２）ＰＣＲ法での増幅時に標識物質でラベルしたプライマーを利用する方法。
（３）標識物質でラベルした塩基を取り込んだＰＣＲ増幅産物を得る方法。
（４）ＰＣＲ増幅産物を基に一本鎖ＲＮＡを生合成する過程で該標識物質でラベルした塩基を標識として取り込ませる方法。本発明では蛍光色素を用いる方法が好適に利用できる。さらに蛍光色素としてはCy3、Cy5が好適に利用できる。

ハイブリダイゼーション反応は以下の手順で行うことができる。まず、前記プローブ担体を、標識を付加した標的核酸を含むハイブリダイゼーション溶液に浸して、所定の温度および時間でハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション温度は５０〜６０
℃、ハイブリダイゼーション時間は４〜１８時間が好ましい。ハイブリダイゼーション後、標識が蛍光色素であれば蛍光スキャナーにより各細菌検体をスポットした箇所の蛍光強度を測定する。さらに、プローブ担体に結合している標的物質をデハイブリダイゼーションして取り除くことも可能である。デハイブリダイズする温度は、プローブの融解温度より１０℃以上高い温度であることが好ましい。このプローブ担体に適切な洗浄を施すことにより、塩等の残存物質を除くことで未使用のプローブ担体と同じ状態に戻すことができる。よって、デハイブリダイゼーション工程を含む品質保証方法では、検査による製品ロスが発生しない。よってこの方法を用いた抜き取り試験により全数の品質保証を行う方法では、十分なサンプル数を用いた統計的に信頼性の高い品質保証を実施することができる。

以上の点は、プローブ及び標的物質がともに核酸であり、反応がハイブリダイゼーション反応である場合について説明したが、本発明はこれに限定されない。本発明の反応は、DNA-DNA以外の形態のハイブリダイゼーション反応や、抗原抗体反応、あるいは酵素活性反応を行うプローブと標的物質との反応でも利用できる。

本発明の実施の形態について、以下具体例を示して詳細に説明する。なお「％」表記は特に断らない限り重量基準である。実施例１では菌種が違う菌であれば、一度にハイブリダイゼーションすることができることを示し、実施例２では菌種が同じ菌についても、一度にハイブリダイゼーションすることができることを示した。

（実施例１）
(1)基板作成
1インチ×3インチ、厚さ1mmのガラス石英基板を準備した。石英ガラス基板を水で軽く洗浄した後、基板洗浄専用液に浸し２０分間超音波洗浄を行った後、一昼夜そのまま放置した。基板を取り出し、水及び超純水にて洗浄液を洗い流した後、６０℃にあらかじめ加熱した１ＭのＮaＯＨ水溶液に２０分間浸した。基板を取り出し、水及び超純水でＮaＯＨ水溶液を洗い流し、超純水中で２０分間超音波洗浄を行なった。

続いて、あらかじめ１％の濃度となるように水に溶解し、約１時間加水分解したシランカップリング剤(信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３)に基板を１時間浸した。超純水にて軽く洗浄した後、表面に残った水滴を窒素ガスにて飛ばし乾燥させ、１２０℃のオーブンにて２時間ベークした。このシランカップリング剤をガラス表面に結合させたことでガラス表面にアミノ基が導入されたことになる。

続いて、同仁化学社製の架橋剤であるＥＭＣＳ(Ｎ-(６-Ｍaleiｍidocaproyloxy)succiniｍide)を混合溶媒(エタノール:ＤＭＳＯ １:１)に１０ｍｌあたり３ｍｇの割合で溶解させた。得られたＥＭＣＳ溶液に先にベークしたガラス基板を浸し、２時間放置した。ＥＭＣＳ溶液より基板を出し、先程と同じ混合溶媒にて軽く洗浄を行なった後、表面の液滴をエタノールに置換し、窒素ガスにて液滴を飛ばし乾燥した。これによりＥＭＣＳが基板全面(両面)に結合された基板(ＥＭＣＳ基板)を得た。ＥＭＣＳはスクシイミド基とマレイミド基を有し、スクシイミド基が基板表面のアミノ基と結合するため、基板表面にはマレイミド基が導入されたことになる。

(2)プローブ設計
プローブ配列として、感染症に関する下記の10菌種の検出用のプローブを表１〜１０に示すとおり設計した。これらのプローブは、各菌種の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を対象として設計した。
（１）黄色ブドウ球菌
（２）表皮ブドウ球菌
（３）大腸菌
（４）肺炎桿菌
（５）緑膿菌
（６）セラチア菌
（７）肺炎連鎖球菌
（８）インフルエンザ菌
（９）エンテロバクター・クロアカエ菌
（１０）エンテロコッカス・フェカリス菌

（3）プローブ結合
（2）で設計したプローブ配列について、5'末端にチオール基(ＳＨ基)を結合させた修飾ＤＮＡ(プローブ)を株式会社ベックスに依頼して合成した。次に（1）で準備した基板へのプローブの固定化を特開平１１−１８７９００号公報の実施例に従い、バブルジェットプリンターを用いたスポッティングによりおこなった。具体的には次の手順である。まず、吐出用溶液として、各プローブについて、最終濃度が約４０００ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。グリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０％を用意し、上記プローブ溶液に加えプローブＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調製した。

この液体をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−６２０；キヤノン社製）用インクタンクに充填し、バブルジェットヘッドに装着した。なお、前記バブルジェットプリンターは、基板面上へのＤＮＡ溶液のスポッティングに使用するため、平板への印字が可能なように改造が施されている。このバブルジェットプリンターは３６０×７２０dpiの解像度で印字可能である。次いでこのプリンターを用いてＤＮＡプローブを、表面にマレイミド基が導入された石英ガラス基板にスポッティングした。バブルジェットヘッドの液体吐出面と石英ガラス基板との距離は１．２〜１．５ｍｍであった。またスポッティングの後２回の空吐出を行い、７２０dpiの方向には１回のスポッティングの後５回の空吐出を行うように条件設定した。また、１吐出動作あたりのＤＮＡプローブ溶液の吐出量は約２４ｐｌであった。

スポッティング終了後、石英ガラス基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、石英ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のチオール基とを反応させ、プローブＤＮＡの固定を行った。３０分間の反応後、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液により、基板表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流した。石英ガラス基板表面に、目的とする複数種の一本鎖ＤＮＡがアレイ状に固定されている遺伝子チップが得られた。さらに石英ガラス基板を２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を行った。

（4）標識化標的物質の作成
上記感染症に関する10菌種の標準株を特開2004-318840号公報の実験例に基づき、PCR増幅および蛍光標識の取り込みを行うことにより、標識化標的物質を調製した。詳しくは以下のとおりである。
<プライマー配列>
菌検出用のための１６ｓ ｒＲＮＡ核酸増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒとして表１に示す核酸配列を設計した。具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１５００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に検出できるように複数種類のプライマーを設計した。

表１１に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製した。精製されたForward Primerを３種、Reverse Primerを３種混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10ｐmol／μｌとなるようにTE緩衝液に溶解した。
<菌株の培養とゲノムＤＮＡの抽出>
各菌種(黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、エンテロバクター・クロアカエ菌およびエンテロコッカス・フェカリス菌)の標準株を定法に従って培養した。培養後、それぞれの菌の培養液1.0ml(OD₆₀₀=0.7)を1.5mlマイクロチューブに採取した。遠心分離で菌体を回収し(8500rpm、5min、4℃)、上精を捨てた後、Enzyme Buffer(50mM Tris-Hcl:p.H.8.0、25mM EDTA)300μlを加え、ミキサーを用いて再懸濁した。この菌液を再度、遠心分離して上清を捨てた。その後、回収された菌体にLysozyme溶液(20mg／ml in Enzyme Buffer)50μl、N-Acetylmuramidase SG溶液(0.2mg／ml in Enzyme Buffer)50μlを加え、ミキサーを用いて再懸濁した。次に、酵素溶液を加え再懸濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。この処理後、核酸精製キット(MagExtractor -Genome-:TOYOBO社製)を用いてGenome DNA抽出を行った。

回収された微生物のGenome DNAは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０nmの吸光度測定を行い、品質と回収量を検定した。その結果、約１０μｇのGenome DNAが回収され、Genome DNAのデグラデーションやrRNAの混入は認められなかった。回収したGenome DNAは最終濃度が５０ng／μlとなるようにTE緩衝液に溶解し、以下の実験操作に使用した。
<検体の増幅と標識化>

表１２の組成の反応液を市販のサーマルサイクラ−を用いて増幅反応を行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃で１０分間熱変性後、９２℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃４５秒のサイクルを３５回行い、最後に７２℃で１０分間保持する条件を用いた。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification kit）を用いてPrimerを除去した後、増幅産物の定量を行った。

（5）菌種の分類
上記10種類の菌種を以下のように分類した。
（Ａ）大腸菌群 (大腸菌、肺炎桿菌、セラチア菌、エンテロバクター・クロアカエ菌)
（Ｂ）ブドウ球菌群 (黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌)
（Ｃ）その他 (緑膿菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、エンテロコッカス・フェカリス菌)
上記の（Ａ）および（Ｂ）のそれぞれの群内の菌種間では、クロスハイブリダイゼーションが生じるため、上記（Ａ）、（Ｂ）の各群から1つずつ選択した組み合わせでハイブリダイゼーションするグループを作製した。以下に示す4種類である。
(a)大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌
(b)肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌
(c)セラチア菌、エンテロコッカス・フェカリス菌
(d)エンテロバクター・クロアカエ菌、表皮ブドウ球菌
よって、(4)で調製した各菌の増幅産物を上記４つのグループ（a）〜（d）に分けて、等量ずつ含まれるように混合し、標識化標的物質の混合物を４セット調製した。

（6）ハイブリダイゼーション
(1)〜(3)で作製したプローブ担体と(4)〜（5）で調製した４セットの標識化標的物質の混合物を用いてそれぞれハイブリダイゼーションを行った。プローブ担体をハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc.製 Hybridization Station)にセットし、以下に示す条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
・ハイブリダイゼーション溶液
6×SSPE/10%ホルムアミド/0.05%SDS/混合標識化標的物質
(6×SSPE : NaCl 900mM, NaH₂PO₄・H₂O 60mM, EDTA 6mM, pH 7.4)
・ハイブリダイゼーション条件
65℃で3分、92℃で2分、50℃で4時間ハイブリダイゼーション反応を行った後、2×SSC/0.1%SDS溶液で洗浄(25℃)、2×SSCで洗浄(20℃)後、純水でリンスしスピンドライした。

(7)蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後のプローブ担体を蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いて蛍光測定を行った。各プローブ担体のプロファイルから、4枚のプローブ担体で10菌種のプロファイル保証が可能なことが明らかとなった。
（実施例２）
実施例1におけるプローブ担体の品質保証方法において、上記感染症に関する10菌種の標識化標的物質を全て等量混合してハイブリダイゼーションを行った。実験条件は全て実施例1に記載の実験条件を用いて行った。蛍光測定を行ったところ、1枚のプローブ担体で、実施例１の各菌種の輝度プロファイルを加算した場合とほぼ同様の輝度プロファイルが得られた。このため、1枚のプローブ担体でも10菌種のプロファイル保証が可能なことが明らかとなった。

Claims (7)

1. 複数種のプローブが固定化されたプローブ担体の品質保証方法であって、
   以下の工程；
   （1）前記複数種のプローブと特異的に結合する各々の標的物質を標識する工程、
   （2）前記標識された標的物質を混合する工程、
   （3）前記混合された標的物質と前記プローブ担体とを反応させる工程、
   （4）前記プローブ担体上のプローブと結合した標的物質を検出する工程、
   （5）前記検出結果からプローブ担体の良否を判定する工程、
   を有することを特徴とする品質保証方法。
2. 前記標的物質の標識を蛍光色素を用いて行い、
   前記検出がプローブと結合した標的物質の蛍光強度の検出であり、
   前記検出結果が標識物質の蛍光強度のプロファイルである請求項1に記載の品質保証方法。
3. 前記プローブおよび前記標的物質が核酸である請求項1または2に記載の品質保証方法。
4. 前記標識された標的物質を複数種混合し、前記混合した複数種の標的物質の組み合わせが、クロスハイブリダイゼーションを起こさない組み合わせである請求項3に記載の品質保証方法。
5. 前記プローブ担体上のプローブと前記標的物質とのハイブリッド体をデハイブリダイズすることで、標的物質をプローブ担体から剥離する工程を更に有する請求項3または4に記載の品質保証方法。
6. ロット内の所定数のプローブ担体について請求項5に記載の品質保証方法を用いた抜き取り試験を行うことを特徴とする、
   ロット内の全数のプローブ担体についての品質保証方法。
7. 請求項1乃至6のいずれかに記載の品質保証方法を用いた検査工程を含むプローブ担体の製造方法。