JP2007126466A - 酵素阻害イムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、非競合的阻害剤をリガンドに結合して均一アッセイに利用することを特徴とする、生物学的サンプル中のアナライトの測定方法を提供する。アナライトとしては、薬物もしくは薬物誘導体、ホルモン、ポリペプチド、またはオリゴヌクレオチドが対象となりうる。本発明はまた、そのような測定を行うのに有用である、新規な化合物、アッセイ試薬、およびパッケージ化キットを提供する。
【選択図】なし
Description
DADOO 1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサ-オクタン
2,2'-(エチレンジオキシ)ビス-エチルアミン
DCC 1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DMPU 1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン
EDC 1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
HMPA ヘキサメチルホスホルアミド
MEM 2-メトキシエトキシメチル
NaHMDS ナトリウムビス(トリメチルシリル)アミド
NHS N-ヒドロキシスクシンイミド
RP-HPLC 逆相高速液体クロマトグラフィー
TAPSO 3-[N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシ-プロパンスルホネート, Na
TBAF テトラブチルアンモニウムフルオリド
TBDPS tert-ブチルジフェニルシリル
tBoc tert-ブトキシカルボニル
TCEP トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩
THF テトラヒドロフラン
1リットルの抗体試薬(すなわち第1の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、6.0gのACESを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、0.53gのNADを添加して完全に溶解させた。次に、10mlの腹水抗MPAモノクローナル抗体を添加した。次に、0.95gのアジ化ナトリウムを添加して溶解させ、最後に、1.0gのスットシドA(SUTTOCIDE A)(ジーエーエフ・ケミカルス・コーポレーション(GAF Chemicals Corp.))を添加して溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。
1リットルの酵素試薬(すなわち第2の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、56.3gのNaTAPSOを添加して完全に溶解させた。次に、81.6gの酢酸ナトリウム・3H2Oを添加して溶解させた。次に、1.15gのTCEPを添加して溶解させた。次に、0.319gのIMPを添加して溶解させ、次に2.23gのNa2EDTAを添加して溶解させた。次に、1.0gのSUTTOCIDE Aを添加して溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。約13.4mlの組換えヒトIMPDH-II(大腸菌(E. coli)溶解物)を添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたる340nmにおける吸光度変化が4400×10-4になるようにした。次に、0.002gのリガンド-阻害剤コンジュゲート(MPA-MPA、実施例42)を添加して溶解させた。
ミコフェノール酸を添加したヒト血漿サンプルに対して本発明の方法によりMPAアッセイを行った。3μlのサンプルおよび150μlの抗体試薬を37℃のキュベットに送入し、次に、それらを混合して5分間インキュベートし、その後、150μlの酵素試薬を添加して混合するように、HITACHI 717アナライザー(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis)をプログラムした。最初の酵素試薬添加時から酵素試薬添加の5分後まで340nmにおける吸光度の差を計算した。
ブロモ-イソプレニルリンカー(1)は、ステファニー イー. セン(Stephanie E. Sen)およびグレゴリー ジェイ. ユーイング(Gregory J. Ewing)著, ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(J. Org. Chem.), 1997年, 第62巻, p.3529-3536に発表された手順に従って調製した。
4.02ml(4.01mmol)のナトリウムビス(トリメチルシリル)アミドの溶液(テトラヒドロフラン(THF)中の1M溶液)を、アルゴン雰囲気下、ドライアイス/アセトン浴中で冷却させた。600mg(1.79mmol)のMPAメチルエステル(2)を7mlの無水THFに溶解させた溶液を、この反応混合物に滴下した。得られた溶液を-78℃で30分間攪拌し、84mg(0.46mmol)のヘキサメチルホスホルアミド(HMPA)を2mlのTHFに溶解させた溶液を添加した。反応混合物を-78℃で15分間攪拌し、840mg(2.08mmol)のブロモ-イソプレニルリンカー(1)を2mlのTHFに溶解させた溶液を滴下した。ドライアイス浴を取り除き、反応液を20分間かけてゆっくりと室温まで加温した。反応混合物に5mlの飽和塩化アンモニウムを添加して反応を停止させた。反応混合物に、100mlの水を添加し、200mlのエチルアセテートで抽出した。有機層を分離し、水性部分をエチルアセテート(3×100ml)で再抽出した。合せた有機部分を100mlのブラインで洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮した。ヘキサン中の20%エチルアセテートを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、501mg(43%、0.76mmol)の5'-イソプレニル[OTBDPS]-MPAメチルエステル(3)を得た。1H-NMR: 一致。LR-FAB MS: m/z 656。
18mLの新たに蒸留したTHFに180mg(0.27mmol)の(3)を溶解させた溶液に、0℃でテトラブチルアンモニウムフルオリドの1M溶液760μLを添加し、得られた溶液を、0℃で1時間、さらに室温で18時間攪拌した。反応混合物に、12mLの0.5M HCl溶液は添加し、次に、濃縮してできるだけ多くのTHFを除去した。残渣に50mLの水を添加し、これをエチルアセテート(3×125mL)で抽出した。合わせたエチルアセテート層を2×100mLの水を用いて洗浄し、脱水し(無水Na2SO4)、濃縮させた。ヘキサン中の80%エチルアセテートを用いてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、85mg(0.20 mmol、74%)の(x)を得た。
MPA-オキサゾリジノンイミド(xi)は、ローロフ(Rohloff)ら(ジェイ.シー. ロホルフ(J.C. Rohloff), ジェイ.オー. ガードナー(J.O. Gardner)およびアール.ダブリュー. トウネ(R.W. Towne), テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Lett.), 1995年, 第36巻, 第43号, p.7803-7806)の方法によりミコフェノール酸(MPA)から作製された。
240mg(0.36mmol)の(3)を5mlの無水ジクロロメタンに溶解させた溶液を氷浴中で冷却させた。反応混合物に、76μl(0.433mmol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミンを添加し、続いて42μl(0.36mmol)の2-メトキシエトキシメチルクロリドを添加した。混合物を、氷浴中で1時間さらに室温で18時間攪拌した。混合物を15mlのジクロロメタンで希釈した。有機層を3×20mlの水で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮した。エチルアセテート中の60%ヘキサン溶液を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、175mg(0.23mmol、64%)の(4)を得た。
1.09g(1.46mmol)の(4)を40mlのTHFに溶解させた溶液を0℃まで冷却させた。この冷却溶液に、4.37ml(4.35mmol)のテトラブチルアンモニウムフルオリド(THF中の1M溶液)をアルゴン雰囲気中で添加した。反応混合物を0℃で1.5時間および室温で1時間攪拌した。反応混合物に5mlの水を添加して反応を停止させ、濃縮した。反応混合物を75mlのジクロロメタンで希釈し、3×75mlの水で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮した。ヘキサン中の80%エチルアセテート溶液を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、408mg(0.806mmol、55%)の(5)を得た。1H-NMR: 一致。LR-FAB MS: m/z 506。
4.5g(5.8mmol)のL-チロキシンと、18mlのDMFと、5.85mlの1N NaOHと、495mgのNaHCO3と、18mlの水と、の混合物を磁気攪拌した。1.28g(5.8mmol)のジ-t-ブチルジカーボネートを18mlのジメチルホルムアミドに溶解させてこの懸濁液に添加した。得られた反応混合物を4時間攪拌し、次に、減圧下、室温で濃縮した。残渣に45mlのメタノールを添加し、未溶解物質を濾別した。沈殿が完了するまで濾液に1N HCl(20ml)を添加した。固形物を濾過し、風乾し、4.2g(4.78mmol、82%)のL-チロキシン[N-tBoc](6)を得た。
500mg(0.57mmol)のL-チロキシン(N-tBoc)(6)に15mlの無水DMFを添加し、続いて149mg(1.29mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび283mg(1.47mmol)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミドを添加した。混合物を室温で3時間攪拌した。この活性化エステルをin situで次のステップに使用した。
25mg(0.049mmol)の(5)に1mlのTHFを添加し、続いて12.6mg(0.046mmol)のN,N’-ジスクシンイミジルカーボネートおよび20μlのトリエチルアミンを添加した。混合物を室温で18時間攪拌して、対応するN-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを得た。
22mg(0.015mmol)の5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA[OMEM]メチルエステル(8)に2mlのメタノールおよび40mg(1.6mmol)の水酸化リチウム(水1ml中の溶液)を添加した。混合物を室温で2日間攪拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。反応混合物に2mlの水を添加し、希リン酸を用いてpHを6に調整した。反応液を濃縮乾固し、100mlのメタノールを添加した。混合物を濾過し、濾液を濃縮した。、0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する水/アセトニトリルグラジエント系を用いて分取RP-HPLC[Rainin C-18(ODS)21.4mm×250mm]により残渣を精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを蒸発させ、残存混合物を凍結乾燥させ、11mg(0.007mmol、52%)の(9)を得た。
5mg(0.003mmol)の5'-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲート(9)に1.5mlのジクロロメタンを添加し、溶液を0℃まで冷却させた。この溶液にジクロロメタン中の50%トリフルオロ酢酸の氷冷溶液200μlを5分間隔で2回に分けて添加した。混合物を氷浴中でさらに15分間攪拌した。これを減圧下で濃縮した。0.1%トリフルオ酢酸を含有する水/アセトニトリルのグラジエント系を用いて分析用RP-HPLC[C-18、Vydac 4.6mm×250mm]により生成物の形成をモニターした。反応液を再びトリフルオロ酢酸処理に供した。粗反応混合物を1.5mlのジクロロメタンに再溶解させ、溶液を0℃まで冷却させた。この溶液にジクロロメタン中の50%トリフルオロ酢酸の氷冷溶液200μlを5分間隔で2回に分けて添加した。混合物を0℃で25分攪拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、次いで高真空ポンプで濃縮した。0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する水/アセトニトリルのグラジエント系を用いて分析用RP-HPLC[C-18、Vydac 4.6mm×250mm]により生成物の形成をモニターした。その結果から、反応液が主にMEM-脱保護5'-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレン-アミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA(10)といくらかの所望の生成物(11)とを含むコンジュゲート混合物であることが示された。
700μlの濃H2SO4を含有する1,4-ジオキサンの溶液にミコフェノール酸(860mg、2.68mmol)を溶解させた。溶液を加圧ボトルに移し、これを氷で冷却させた。イソブチレン(20ml)をミコフェノール酸溶液に注いだ。加圧ボトルに蓋をして、室温で2日間にわたり非常にゆっくり磁気攪拌した。混合物をドライアイス/アセトン下で冷却させ、圧力を徐々に開放した。混合物を室温まで加温し、150mlのエチルアセテートで希釈した。水性部分を分離し、3×100mlのエチルアセテートで抽出した。合せた有機層を100mlの水、100mlの飽和NaHCO3、続いて100mlの水で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮した。エチルアセテート中の80%ヘキサン溶液を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、590mg(1.63mmol、60%)のMPA t-ブチルエステル(12)を得た。
3.2ml(3.19mmol)のナトリウムビス(トリエチルシリル)アミドの溶液(THF中の1.0M溶液)をアルゴン雰囲気下でドライアイス/アセトン浴により-78℃まで冷却させた。この冷却溶液に0.32ml(2.64mmol)のDMPUを添加し、-78℃で15分間攪拌した。新たに蒸留した5mlのTHF中に398mg(1.10mmol)のMPA t-ブチルエステル(12)を溶解させた溶液を、この反応混合物に滴下した。反応混合物を-78℃で30分間攪拌し、0.18ml(1.61mmol)のエチルブロモアセテートを添加した。得られた混合物を-40℃で3時間および0℃で1時間攪拌した。反応液に10mlの飽和塩化アンモニウムを添加して反応を停止させ、混合物を室温まで加温した。さらに80mlの飽和塩化アンモニウムを添加し、水部分をエチルアセテートで抽出した(3×80ml)。有機層を合わせ、脱水し(Na2SO4)、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて最初にエチルアセテート中の80%ヘキサン溶液で、次いでヘキサン中の50%エチルアセテート溶液で溶出させることにより精製し、不純物を含有する生成物330mgを得た。0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する水/アセトニトリルのグラジエント系を用いて分取RP-HPLC[Rainin C-18(ODS) 21.4mm×250mm]により、これを再精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを蒸発させ、残存混合物を凍結乾燥させ、163mg(0.35mmol、32%)の(13)を得た。1H-NMR: 一致。HR-FAB MS: M+Naに対する計算値 485.2151、観測値 485.2140。
41.1mlのDMSOに141mg(0.30mmol)の(13)を溶解させた溶液を調製した。これを81mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で希釈し、306μlのエステラーゼ(ブタ肝臓由来、Roche Diagnostics, 10mg/mlの懸濁液)を添加した。反応混合物を室温で3日間攪拌し、濾過した。分取RP-HPLC[WATERS DELTAPAK C-18 50×250mm、0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する水/アセトニトリル系]を用いて濾液を精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを蒸発させ、混合物を凍結乾燥させ、76mg(0.17mmol、57%)の5'-カルボキシメチル-MPA t-ブチルエステル(14)を得た。
5'-カルボキシメチル-MPA t-ブチルエステル(20mg、46μmol)を193μlのDMFに溶解させた。この反応混合物に7.95mg(69μmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび11.4mg(55.2μmol)のDCCを添加した。反応混合物を室温で3時間攪拌した。さらに2.65mg(23μmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび2.85mg(13.8μmol)のDCCを55μlのDMFに溶解させて添加し、反応混合物を室温で1時間攪拌した。23.2mg(46μmol)の3-β-アミノ-ジゴキシゲニンを63.8μl(460μmol)のトリエチルアミンおよび120μlのDMFに溶解させた溶液を添加した。反応混合物を室温で1時間攪拌し、蒸発させ、68mgの粗生成物(15)を得た。さらなる精製を行うことなくこれを次のステップで使用した。
5'-(ジゴキシゲニン-3-イル-β-アミドメチル)-MPA t-ブチルエステル(15)の粗生成物を3mlのジクロロメタンに溶解させた。反応混合物に3mlのトリフルオロ酢酸を添加し、溶液を室温で正確に30分間攪拌した。次にこの溶液を蒸発させ、直ちに以下のように残渣を精製した。
1リットルの抗体試薬(すなわち第1の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、6.0gのN-[2-アセトアミド]-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)を添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、0.663gのNADを添加して完全に溶解させた。その後、0.95gのアジ化ナトリウムを添加して溶解させ、最後に1.0gのSUTTOCIDE Aを添加して溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。最後に、10mgの抗L-チロキシンモノクローナル抗体を添加した。
1リットルの酵素試薬(すなわち第2の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、168.8gのNaTAPSOを添加して完全に溶解させた。次に、1.15gのTCEPを溶解させた。次に31.4gのIMPを溶解させ、その後、2.23gのNa2EDTAを溶解させた。次に、1.0gのSUTTOCIDE Aを溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。十分な組換えヒトIMPDH-II(大腸菌(E. coli)溶解物上清の35%硫酸アンモニウム沈殿物として)を添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたる340nmにおける吸光度変化が780×10-4になるようにした。次に、0.0005gのリガンド-阻害剤5'-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノ-エチレンアミド)-チロキシン]-MPAコンジュゲート(11)を添加して溶解させた。
L-チロキシンを添加した生理食塩水サンプルに対して本発明の方法によりチロキシンアッセイを行った。生理食塩水中にL-チロキシン(Sigma Chemical)を懸濁させ、1N NaOHの滴下により溶解させ、その後、最終濃度が100、250、500、および1000ng/mlになるように生理食塩水で希釈することにより、サンプルを調製した。
1リットルの抗体試薬(すなわち第1の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、6.0gのACESを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、0.53gのNADを添加して完全に溶解させた。その後、0.95gのアジ化ナトリウムを添加して溶解させ、最後に、1.0gのSUTTOCIDE Aを添加して溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。最後に、25mgの抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体を添加した。
1リットルの酵素試薬(すなわち第2の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、56.3gのNaTAPSOを添加して完全に溶解させた。次に、81.6gの酢酸Na・3H2Oを添加して溶解させた。次に、1.15gのTCEPを溶解させた。次に、0.319gのIMPを溶解させ、その後、2.23gのNa2EDTAを溶解させた。次に、1.0gのSUTTOCIDE Aを溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。十分な組換えヒトIMPDH-II(大腸菌(E. coli)溶解物上清の35%硫酸アンモニウム沈殿物として)を添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたる340nmにおける吸光度変化が1280×10-4になるようにした。次に、0.001gのリガンド-阻害剤4'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAまたは5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAを添加して溶解させた。
ジゴキシゲニンを添加した生理食塩水サンプルに対して本発明の方法によりジゴキシゲニンアッセイを行った。最初に、ジゴキシゲニン(Sigma Chemical)を100% DMSO中に溶解させ、その後、0.5、1.0、5.0、および10.0μg/mlの濃度になるように正常ヒト血漿に添加した。37℃のキュベットに20μlのサンプルおよび150μlの抗体試薬を注入し、次に、これを混合して5分間インキュベートし、その後、150μlの酵素試薬を添加して混合するように、HITACHI 717アナライザー(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis)をプログラムした。最初の酵素試薬添加時から酵素試薬添加の5分後までの340nmにおける吸光度差を計算した。得られた結果を図3に示す。
1リットルの抗体試薬(すなわち第1の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、6.0gのACESを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、0.663gのNADを添加して完全に溶解させた。その後、0.95gのアジ化ナトリウムを添加して溶解させ、最後に、1.0gのSUTTOCIDE Aを添加して溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。最後に、10または15mgの抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体を添加した。
1リットルの酵素試薬(すなわち第2の試薬)を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、168.8gのNaTAPSOを添加して完全に溶解させた。次に、1.15gのTCEPを溶解させた。次に、31.4gのIMPを溶解させ、その後、2.23gのNa2EDTAを溶解させた。次に、1.0gのSUTTOCIDE Aを溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。十分な組換えヒトIMPDH-II(大腸菌(E. coli)溶解物上清の35%硫酸アンモニウム沈殿物として)を添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたる340nmにおける吸光度変化が3300×10-4になるようにした。次に、0.0002gのリガンド-阻害剤(5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-β-アミドメチル]-MPA(異性体A)もしくは5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-β-アミドメチル]-MPA(異性体B))を添加して溶解させた。またはその代わり、0.0005gのリガンド-阻害剤(5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPA(ラセミ体))を添加して溶解させた。
ジゴキシゲニンを添加した生理食塩水サンプルに対して本発明の方法によりジゴキシゲニンアッセイを行った。最初に、ジゴキシゲニン(Sigma Chemical)を100% DMSO中に溶解させ、その後、0、10、20、30、40、50 、60、70、80、90、および100μg/mlの濃度になるように生理食塩水に添加した。37℃のキュベットに3μlのサンプルおよび150μlの抗体試薬を注入し、次に、これを混合して5分間インキュベートし、その後、150μlの酵素試薬を添加して混合するように、HITACHI 917アナライザー(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis)をプログラムした。最初の酵素試薬添加時から酵素試薬添加の4分42秒後までの340nmにおける吸光度差を計算した。得られた結果を図4に示す。この実施例は、リガンド-阻害剤コンジュゲートにおける異なる長さのリンカーの使用を示すものである。
1リットルの第1の試薬を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、6.0gのACESを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、0.66gのNADを添加して完全に溶解させた。その後、0.95gのアジ化ナトリウムを添加して溶解させ、最後に、1.0gのSUTTOCIDE Aを添加して溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。
1リットルの第2の試薬を次のように調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、168.8gのNaTAPSOを添加して完全に溶解させた。次に、1.15gのTCEPを溶解させた。次に、31.4gのIMPを溶解させ、その後、2.23gのNa2EDTAを溶解させた。次に、1.0gのSUTTOCIDE Aを溶解させた。脱イオン水で体積を1リットルに調整した。十分な組換えヒトIMPDH-II(大腸菌(E. coli)溶解物上清の35%硫酸アンモニウム沈殿物として)を添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたる340nmにおける吸光度変化が3100×10-4になるようにした。次に、0.00027gのリガンド-阻害剤5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA(20)を添加して溶解させた。最後に、10mgまたは25mgの抗テオフィリンモノクローナル抗体を添加した。
テオフィリンを添加した生理食塩水サンプルを本発明の方法によりアッセイした。最初に、テオフィリン(Sigma Chemical)を生理食塩水に溶解させ(1mg/10ml)、その後、0、5、10、20、40、および50μg/mlの濃度になるように希釈した。37℃のキュベットに3μlのサンプルおよび150μlの第1の試薬を注入し、次に、これを混合して5分間インキュベートし、その後、150μlの第2の試薬を添加して混合するように、HITACHI 717アナライザー(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis)をプログラムした。第2の試薬の最初の添加時から第2の試薬の添加の5分後までの340nmにおける吸光度差を計算した。得られた結果を図5に示す。
IC50(阻害定数)とは、酵素活性の50%阻害を引き起こす阻害剤のモル濃度である。この実施例を用いて、種々のMPA誘導体による酵素阻害の能力を例示する。
1.3mlのトリエチルアミンおよび15mlのジオキサンに1.35g(9.2mmol)のジアミノ-ジオキサ-オクタンを溶解させ、室温で撹拌した。500mg(0.92mmol)のジゴキシゲニン-3-cme-NHSを10mlのジオキサンに溶解させた溶液を滴下ロートにより15分以内でこの混合物に添加した。室温で1時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、粗生成物を10mlのメタノールに溶解させ、分取RP-HPLC(Waters Delta Pak C-18 50×250 mm、水/アセトニトリル/0.1% TFA)で精製した。純粋画分をプールして凍結乾燥させ、520mgの油状生成物を得た。
820μlのTHFに41mg(0.1084mmol)のジカルボキシMPA(27、実施例43)を溶解させた溶液に、8.77μl(0.1084mmol)のピリジンおよび15.3μlのトリフルオロ酢酸無水物を添加し、混合物を3時間撹拌した。69.3mg(0.1084mmol)の(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOOを820μlのピリジンに溶解させて添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を1mlの酢酸で希釈し、分取RP-HPLC(Waters Delta Pak C-18 50×250 mm、水/アセトニトリル/0.1%TFA)を用いて精製した。生成物を含有する画分をプールして凍結乾燥させ、66mgを得た。1H-NMRおよびMSにより生成物の特性決定を行った。
テオフィリンアミン(17)は、国際公開第87/07955号(1987年)パンフレットに発表された手順に従って調製した。
アルゴン下で撹拌しながら、2.4mlのメタノールに11.7mg(0.014mmol)の5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲート(18)を溶解させた溶液に、24mg(0.572mmol)の水酸化リチウム一水和物を1.2mlの水に溶解させた溶液を添加した。RP-HPLC(Vydac C-18 ;300Å218TP54;4.6mm×250mm;0.1%TFA-H2O/0.1%TFA-CH3CNグラジエント)によりモニターしながら、アルゴン下、室温で反応液を撹拌した。室温で4日後、出発物質の消費はほぼ完了し、より短い保持時間のピークの出現が増加した。反応混合物を希リン酸で酸性化し(沈殿)、濃縮乾固させ、メタノールで摩砕し、固体を濾別した。濾液を濃縮乾固させ、残渣を再びCH3CN-H2O(1:1)中に溶解させ、0.1%TFA-H2O/0.1%TFA-CH3CN勾配を用いて分取RP-HPLC(Rainin C-18(ODS) 21.4mm×250mm)により精製した。生成物を含む画分を合わせて減圧下でアセトニトリルを蒸発させ、残渣を凍結乾燥させ、8mg(0.0097mmol、69%)の白色固体の(19)を得た。
200mlの無水メチレンクロリドに1.0mg(0.0012mmol)の5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA[OMEM]コンジュゲート(19)を溶解させた溶液を、アルゴン下、氷浴中で冷却させた。これに、20mlのトリフルオロ酢酸を40mlのメチレンクロリドに溶解させた冷却溶液を約1分間かけて3回に分けて添加した。冷却を続けながら20分撹拌した後、高真空下で直接吸引することにより揮発性物質を蒸発させた。残渣のRP-HPLC(Vydac C-18;300Å218TP54;4.6mm×250mm;0.1%TFA-H2O/0.1%TFA-CH3CNグラジエント)および1H-NMR(CD3OD)から、所望のMEM脱保護生成物が部分的に生成しているが示された。この物質を再プールし、濃縮乾固させ、無水メチレンクロリドに再溶解させ、そして再蒸発させた(3×)。35分間撹拌した以外は上述したように残渣をTFA処理した。前と同じように溶媒を除去した。残渣のRP-HPLCおよび1H-NMR分析から、所望の生成物がさらに生成し、出発物質が減少していることが示された。再プールした物質を再濃縮し、前と同じように処理し、30分間撹拌しながら上述したように3回目のTFA処理を行った。得られた反応混合物のRP-HPLC分析から、反応が本質的な終了し、副生物のピークが増加していることが示された。反応液を濃縮乾固させ、CH3CNに再溶解させ、半分取RP-HPLC(Vydac C-18;300Å218TP510;0.1%TFA-H2O/0.1%TFA-CH3CNグラジエント)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、減圧下でCH3CNを蒸発除去し、残渣を凍結乾燥させ、約0.5g(約0.00068mmol、約56%)の白色固体として(20)を得た。1H-NMR: 一致。LC/MS: M+H 739.3、M+Na: 761.3。
ナトリウムビス(トリメチルシリル)アミドの溶液(THF中の1.0M溶液) 26ml(26mmol)を、アルゴン雰囲気下、ドライアイス/アセトン浴中で-78℃まで冷却させた。この冷却溶液に2.6ml(22mmol)のDMPUを添加し、-78℃で15分間撹拌した。新たに蒸留した45mlのTHF中に2.86g(8.56mmol)のMPAメチルエステル(2)を溶解させた溶液を、反応混合物に滴下した。反応混合物を-78℃で1時間撹拌したところ、反応混合物の色が淡黄色から橙黄色に変化した。反応混合物に1.9ml(912.8mmol)のt-ブチルブロモアセテートを添加し、-78℃で反応混合物を3時間撹拌した。20mlの飽和塩化アンモニウム溶液で反応を停止させ、混合物を室温まで加温した。さらに200mlの飽和塩化アンモニウムを添加し、反応混合物をエチルアセテート3×200mlで抽出した。合わせた有機層を300mlの飽和塩化アンモニウムで洗浄し、乾燥させ、濃縮した。エチルアセテート中の30%ヘキサンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、3.87gの半固体を得た。0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル/水のグラジエント系を用いてRP-HPLC(Rainin C-18(ODS) 21.4mm×250mm)によりこの生成物を一部分(1.45g)ずつ数回に分けて精製した。生成物を含む画分を合わせてアセトニトリルを蒸発させた。残渣を凍結乾燥させて669mg(1.49mmol、47%)の5'-t-ブトキシカルボニルメチル-MPAメチルエステル(21)を得た。
300mg(0.67mmol)の5'-t-ブトキシカルボニルメチル-MPAメチルエステル(21)にジクロロメタン中の50%トリフルオロ酢酸溶液15mlを添加した。混合物を室温で撹拌し、濃縮した。エチルアセテート中の20%メタノールを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、250mg(0.63mmol、95%)の5'-カルボキシメチル-MPAメチルエステル(22)を得た。1H-NMR: 一致。HR-FAB MS: M+Naに対する計算値 415.1369、観測値 415.1352。
3.6mlのジクロロメタン中に360mg(0.8mmol)の(21)を溶解させた溶液に、3.6mlのTFAを添加し、反応混合物を10分間撹拌した。200mlの0.5Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0を添加し、混合物を100mlのエチルアセテートで3回抽出した。有機層をプールし、硫酸マグネシウムで脱水し、溶媒を蒸発させた。HPLCおよび1H-NMRにより生成物の特性決定を行った。
244mg(2.12mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび437mg(2.12mmol)のジシクロヘキシルカルボジイミドを2mlのTHFに溶解させて200mgの粗製5'-カルボキシメチル-MPAメチルエステル(22)に室温で添加し2時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシルウレアを濾別し、分取RP-HPLC(Waters Delta Pak C-18 50×250mm、水/アセトニトリル/0.1%TFA)を用いて濾液を精製した。
1.74mlの無水DMFに127mg(0.259mmol)の(23)を溶解させて、3.48mlの無水DMFおよび179μlのトリエチルアミンに166mg(0.259mmol)の(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOOを溶解させた溶液に、ピペットで添加した。反応混合物を2時間撹拌した。次に、この溶液に500μlの酢酸を添加し、分取RP-HPLC(Waters Delta Pak C-18 50×250mm、水/アセトニトリル/0.1%TFA)を用いて混合物を精製した。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥させ、240mgの(25)を得た。1H-NMRおよびMSにより生成物の特性決定を行った。
200mg(0.2098mmol)の5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAメチルエステル(25)を28.7mlのDMSOに溶解させて56mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0と徐々に混合した。混合物はわずかに濁った状態になった。219μlのエステラーゼ(Roche Diagnostics, Cat. No. 104698)を添加し、混合物を13日間撹拌した。沈殿物を濾過し、分取RP-HPLC(Waters Delta Pak C-18 50×250mm、水/アセトニトリル/0.1%TFA)を用いて濾液を精製した。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥させ、68mgの(26)を得た。1H-NMRおよびMSにより生成物の特性決定を行った。
ミコフェノール酸メチルエステル(2)(1.337g、4mmol)を6mlのテトラヒドロフランに溶解させた溶液を、不活性雰囲気下で-78℃まで冷却させ、25分間にわたりナトリウムヘキサメチルジシラジド(9ml、テトラヒドロフラン中1M、9mmol)で処理した。15分間撹拌した後、米国特許第5,493,030号明細書中の実施例ZA-12Bに従って調製した(E)-4-1,3-ジヒドロ-6-メトキシ-4-メトキシエトキシメトキシ-7-メチル-3-オキソイソベンゾフラン-5-イル)-2-メチルブト-2-エニルブロミド(1.36g、3.17mmol)をテトラヒドロフラン(4ml)に溶解させた溶液として15分間かけて添加した。反応液を1.5時間かけて約-40℃まで徐々に加温し、その後、氷と水と濃塩酸との混合物(2ml)上に注ぐことにより、反応を停止させた。エチルアセテート(2×100ml)中に生成物を抽出した後、硫酸マグネシウムで脱水した。有機物を濾過し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。ヘキサン中の40%エチルアセテート、次に、ヘキサン中の60%エチルアセテート、最後に、ヘキサン中の80%エチルアセテートを用いてクロマトグラフィーを行い、油としてアルキル化生成物(191mg)を得た。これを次の反応で使用した。
144mg(0.28mmol)の5'-イソプレニル[OH]-MPA[OMEM]メチルエステル(5)に10mLの新たに蒸留したTHFを添加し、続いて、96mg(0.36mmol)のトリフェニルホスフィン、53mg(0.36mmol)のフタルイミド、および72μL(0.36 mmol)のジイソプロピルアゾジカルボキシレートを添加した。反応混合物を室温で18時間攪拌し、ヘキサン中の50%エチルアセテートを用いて薄層クロマトグラフィー(TLC)により反応の進行をモニターした。TLC分析から、所望の生成物が形成されていることおよび反応混合物中に有意量の出発MPAアルコール(5)が存在していることが示された。追加の96mg(0.36mmol)のトリフェニルホスフィン、53mg(0.36mmol)のフタルイミド、72μL(0.36mmol)のジイソプロピルアゾジカルボキシレート、および1gの4Åモレキュラーシーブを、反応混合物に添加した。反応混合物を室温で18時間攪拌し、減圧下で濃縮乾固した。残渣を100mLのエチルアセテートに溶解し、2×50mLの水で洗浄した。有機層を脱水し(Na2SO4)、濃縮した。ヘキサン中の50%エチルアセテートを用いてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、粘稠な無色のガムとして151mg(0.24mmol、84%)の(A)を得た。1H-NMR: 一致。HR-ES(+)MS: 計算値 M+Na 658.2622、観測値 658.2617。
2Mのメチルアミンを含有するメタノール4mLを165mg(0.25mmol)の(A)(実施例44で得た化合物)に添加した。混合物を室温で18時間攪拌し、次に、濃縮した。溶出液としてメタノール中の80%クロロホルムを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、粘稠な無色のガムとして70mg(0.14mmol、53%)の(B)を得た。1H-NMR: 一致。HR-ES(+)MS: 計算値 M+H 506.2749、観測値 506.2750.
実施例46: MPA[OMEM]-5'-イソプレニルアミンメチルエステル(B)からMPA-5'-イソプレニルアミン(D)への脱保護
(i) メタノール(MeOH、1mL)にMPA[OMEM]-5'-イソプレニルアミンメチルエステル(B)(24mg)を溶解させた溶液に、水酸化リチウム(LiOH)一水和物(25mg)を1mLの脱イオン水に溶解させた溶液を添加し、アルゴン下、室温で混合物を3日間攪拌した。分析用RP-LC/MSにより反応液を追跡したところ、出発物質が徐々に消失し、ラクトン開環物質(Ca)に帰属されるより移動速度の大きい物質(分子イオン=C+18)と共に対応するMPA[OMEM]-5'-イソプレニルアミン(C)が出現することが示された。次に、1N HCLを用いて混合物をpH0〜1に酸性化し、室温で攪拌した。分析用LC/MSから、(Ca)に帰属されるピークが消失し(ラクトン環の再閉環に起因するものと思われる)、メトキシエトキシメチル(MEM)基が徐々に脱保護され、所望の完全に脱保護された物質(D)が得られることが示された。減圧下(回転蒸発器(rotavap))で混合物を濃縮してメタノールを除去し、続いて、高真空下(ドライアイス/アセトン凝縮器を備えた回転蒸発器(rotovap))でさらなる濃縮を行って、わずかに粘着性のある固体として粗製の(D)を与えることにより、脱保護を終了した。この物質を1:1アセトニトリル(MeCN):水に再溶解させ、分取RP-HPLC([0.1% TFA/水]中の[0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)/MeCN]を20分間にわたり5%ずつ100%まで増加させるグラジエント;流量=20mL/分)により精製し、2つの画分を凍結乾燥させた後、トリフルオロ酢酸塩に帰属される(D)(10.9mg)を白色固体として得た。1H-NMR: 一致。LC/MS: M+H 404.2。
(i) SatohおよびAoyama(D. Satoh and K. Aoyama Chem. Pharm. Bull. (Jpn), 1970, 18, 94-99)の報告に準拠してジギトキシンを用いる類似の手順に従って水性エタノール中において過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させることによりジゴキシンからジゴキシンジアルデヒド(E)を合成した。
ジギトキシンジアルデヒド(I)は、SatohおよびAoyama (D. Satoh and K. Aoyama Chem. Pharm. Bull. (Jpn), 1970, 18, 94-99)の方法に従って水性エタノール中において過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させることによりジギトキシンから調製した。
20mg(0.039mmol)の5'-イソプレニルに[OH]-MPA[OMEM]メチルエステル(5)に1mLのTHFを添加し、続いて、10.1mg(0.039mmol)のN,N'-ジスクシンイミジルカーボネートおよび25μLのトリエチルアミンを添加した。混合物を室温で18時間攪拌することにより、対応するN-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを得た。
図23aおよび23bに関連した説明を行う。V形ウェルを有しv形攪拌子をも内包する0.5mL容量バイアル(Wheaton Reacti-Vial)中で、完全に保護されたゲンタマイシン-MPAコンジュゲート(N)(1.0mg、0.73μmol)をMeOH(200μL)に溶解させた。水酸化リチウムの水溶液(100μLの[20mg/mL LiOH一水和物水溶液]、2mgのLiOHと等価)を添加した。バイアルにしっかりとキャップをして、清澄な溶液を室温で攪拌した。分析用HPLCにかけたところ、中間体(Q)に帰属されるより移動速度の大きいピークを介して中間体(P)に帰属されるさらに移動速度の大きいピークへと反応が徐々に進行することが示された。室温で3日後、分析用HPLCにより、反応液はほぼ化合物(P)から構成されていることが示された。希リン酸(2mLの水に85%H3PO4を1滴加えたもの)を用いて注意深く反応液のpHを約6に調整し、少量の固体(リン酸リチウム)を沈澱させた。高真空下で混合物を蒸発乾固させた。MeOHを用いて残渣を摩砕し、濾過し、減圧下で濾液を蒸発させ、少量の1:1 MeCN-水に残渣を再溶解させ、半分取RP-HPLC(カラム: Vydac 218TP510; 300Å, 5μ, C18, 10×250mm. ガード: Vydac 218GK54. グラジエント: [A = 0.1% TFAを含有する水]中の[C = 0.1% TFAを含有するMeCN]の濃度を次のように変化させた; 0分のとき5% C, 10分後 50% Cまで増加, 30分後 75% Cまで増加, 35分後 100% Cまで増加, 40分後 5% Cまで減少; 流量 = 3 mL/分)により精製した。所望の生成物を含有するピーク(保持時間[tR]〜20分)の部分を収集し、凍結乾燥させ、白色固体として5'-[(N2',N3,N6'-トリ-t-ブトキシカルボニル-ゲンタマイシン[C1a]-N1-カルボニルオキシ)-イソプレニル]-MPA[OMEM](P)(0.5mg)を得た。1H-NMR: 一致。LC/MS: M+H 1268.6。
さらに他の実験では、先に述べたのと同じように、200μLのDMF中の1.0mgの(N)を100μLの水中の2mgのLiOHで処理し、追加の20μLの水で希釈して、清澄な溶液を得た。分析用HPLCにかけたところ、中間体(Q)はかなり急速に形成されるが、(P)に至る反応は非常に遅いことがわかった。室温で一晩攪拌した後、先に述べたように反応を停止させて仕上げ処理を行い、先に述べたような方式で半分取HPLCにより精製した。生成物[tR 約22 1/2分]を含有するピーク部分を収集し、凍結乾燥させ、部分的に脱保護された中間体(Q)(<0.5mg)を得た。1H-NMR: 一致。
15g(73.8mmol)のテレフタロイルクロリドに300mLのジクロロメタンを添加した。アルゴン雰囲気下、0℃で混合物を10分間攪拌した。反応混合物に30g(0.26mol)のN-ヒドロキシスクシンイミドを添加し、続いて、0℃で30mL(0.22mol)のトリエチルアミンを滴下した。混合物に室温で加温し、次に、室温で2日間攪拌した。固体を濾別し、残渣を200mLのジクロロメタンで洗浄した。残渣を300mLのジクロロメタン中に懸濁させ、10分間攪拌した。固体を濾過し、乾燥させ、白色の粉末として24.12g(66.9mmol、91%)の生成物(テレフタル酸の1,4-ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を得た。
12mg(0.008mmol)のMPA-ゲンタマイシン(保護されている)コンジュゲート(S)に1.5mLのメタノールおよび24mgの水酸化リチウム一水和物および750μLの水を添加した。混合物を室温で3日間攪拌した。追加の24mgの水酸化リチウム一水和物を750μLの水に溶解して添加した。反応混合物を室温でさらに2日間攪拌し、次に、減圧下で濃縮乾固した。残渣に2mLの水を添加し、pHを6〜7に調整した。得られた溶液を濃縮し、残渣を3×50mLのメタノールと混合し、濾過した。濾液を濃縮乾固させ、メタノール中の50%エチルアセテートを用いて分取薄層クロマトグラフィー(20×20cm×0.025cmシリカ厚さのプレート)により残渣を精製し、保護されたゲンタマイシン-C1aMPAコンジュゲート(T) 7mg(0.005mmol, 70%)を白色の粉末として得た。1H-NMR: 一致。LC/MS: M+H 1372.6。
7mg(0.005mmol)の保護されたゲンタマイシン-C1a-MPAコンジュゲート(T)に1mLの無水ジクロロメタンを添加し、溶液を0℃まで冷却させた。反応混合物に500μLのトリフルオロ酢酸を添加し、室温まで加温しながら反応混合物を15分間攪拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮乾固させた。0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水/アセトニトリルのグラジエント系(流量=3mL/分)を用いて半分取RP-HPLC(C-18, Vydac 218TP510, 10mm×250mm; Vydac 218GK54ガードモジュール)により残渣を精製した。生成物を含有する画分を合わせて凍結乾燥させ、白色の粉末として3mg(0.003mmol、60%)の(U)を得た。1H-NMR: 一致。LR(+)FAB MS: M+H 982。HR-ES MS: 計算値 (M+2H)2+ 492.2523、観測値492.2528.
実施例55: フェニトイン-3-酪酸NHSエステル(W)の調製
5,5-ジフェニルヒダントイン-3-酪酸(V)(フェニトイン-3-酪酸)は、ES 389999に記載の手順に従って調製した。
37mg(0.073mmol)のMPA-5'-イソプレニルアミン(B)(実施例45で得られたもの)を5mLの無水DMFに溶解させた溶液に、200μLのトリエチルアミンを添加した。52mg(0.12mmol)のフェニトイン-3-酪酸NHSエステル(W)(実施例55で得られたもの)を1mLの無水DMFに溶解させた溶液を、反応混合物に滴下した。得られた溶液を室温で18時間攪拌し、次に、減圧下で濃縮乾固させた。ヘキサン中の50%エチルアセテートを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、いくつかの不純物を含有する所望の生成物48mgを得た。エチルアセテート中の5%ヘキサンを用いて分取層クロマトグラフィー(20×20cm×0.2cmシリカ厚さのプレート)により混合物を再精製し、26mg(0.031mmol, 61%)の保護されたコンジュゲート(X)を得た。1H-NMR: 一致。LC/MS: M+H 826.3。
22mg(0.026mmol)の保護されたコンジュゲート(X)(実施例56で得られたもの)に4.5mLのメタノールおよび2mLの水を添加し、続いて、100mgの水酸化リチウム一水和物を添加した。混合物を室温で72時間攪拌し、次に、減圧下で濃縮した。残渣に1mLの水を添加し、希リン酸(1mLの85% H3PO4を9mLの水に加えたもの)を用いて反応混合物のpHを6に調整した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮乾固させた。残渣を15mLのメタノールで摩砕し、無機固体を濾別した。濾液を濃縮し、ヘキサン中の50%エチルアセテートを用いて分取薄層クロマトグラフィー(20×20cm×0.025シリカ厚さ)により精製し、12mg(0.016mmol, 63%)のフェニトイン-MPAコンジュゲート(Y)を得た。1H-NMR: 一致。HR-ES(+) MS: M+Naに対する計算値 746.3048、観測値 746.3044。
フェニトインおよびゲンタマイシンのアッセイは、HITACHI 917を用いて次のように行った。3μLのサンプルをキュベットに添加し、150μLの抗体試薬を添加し、混合し、37℃で5分間インキュベートし、次に、150μLの酵素試薬は添加し、混合した。抗体試薬の添加後、340nmの吸光度変化を9〜10分間モニターした。既知量のフェニトインまたはゲンタマイシンを含有する標準を用いて検量線を作成した。フェニトインまたはゲンタマイシンに対する値は、HITACHI 917アナライザーにより計算した。方法の比較試験のために、Roche INTEGRAフェニトインまたはゲンタマイシン較正物質およびRoche INTEGRA FPフェニトインまたはゲンタマイシン試薬カセットを、Roche INTEGRA 700アナライザーと共に使用した。Passing/Bablock回帰統計を使用した。患者サンプルは血漿であった。酵素試薬および抗体試薬の組成を以下に記載する。
Claims (5)
- xが-NH-CO-(CH2)3-フェニトインである、請求項1に記載のリガンド-阻害剤コンジュゲート。
- xが-O-CO[NH-ゲンタマイシン]である、請求項1に記載のリガンド-阻害剤コンジュゲート。
- xが5'-[[[(ジゴキシン(1,4-オキサゼピン))-4-イル]-フェニル-4-カルボニル]アミノ]-である、請求項1に記載のリガンド-阻害剤コンジュゲート。
- xが5'-[[[(ジギトキシン(1,4-オキサゼピン))-4-イル]-フェニル-4-カルボニル]アミノ]-である、請求項1に記載のリガンド-阻害剤コンジュゲート。
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