JP2007123217A

JP2007123217A - 電子顕微鏡による生体ユニットの観察法

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Publication number: JP2007123217A
Application number: JP2005341923A
Authority: JP
Inventors: Chih-Yu Chao; 治宇趙; Wen-Jiunn Hsieh; 文俊謝
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2005-11-28
Publication date: 2007-05-17
Also published as: TWI277734B; TW200716971A; US20070090289A1

Abstract

【課題】生体環境下で電子顕微鏡により生体環境内の生体ユニットを観察可能である電子顕微鏡による生体ユニットの観察法を提供する。
【解決手段】ステップＡ）は、電子顕微鏡９０内の試料腔室９１において生体環境１１を提供し、生体環境１１内に生体ユニット１８と所定の環境条件を整え、環境条件を生体ユニットが基本的な生理機能を維持可能に設定し、生体環境１１の上下方に向かい合う観察窓１２を設け、生体ユニット１８を異なる臨界電荷密度に耐えられる二種以上の物件を有するように設定する。ステップＢ）は、所定区域において、所定の時間で観察窓１２から生体ユニット１８に対し所定の強度の粒子束を照射し、電子顕微鏡９０の結像装置に結像する。所定の電荷密度は粒子束の所定の強度と所定の時間との相乗であり、所定の電荷密度は生体ユニット１８の照射された区域中の観察対象物の臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しい。
【選択図】図１

Description

本発明は、電子顕微鏡の操作技術、詳しく言えば電子顕微鏡による生体ユニットの観察法に関するものである。

周知技術では、電子顕微鏡を操作し物体を観察する際、電子顕微鏡内の試料腔室は真空環境に限定されるため、観察対象物は非発揮性固体でなければ観察を行うことができない。発揮性物体、例えば液体または気体の流体物質の場合、真空試料腔室に入れられた後、大量の気体が発生するため、電子束が物体を通過して回折するか或いは結像することができないだけでなく、顕微鏡電子銃などの高真空区域における真空度が低下するか或いは汚染される事態が発生し、電子顕微鏡が損壊する事態を招く。

上述のように、真空環境に制限されるため、従来の電子顕微鏡は固体物質の構造あるいは脱水乾燥した細胞、細菌、ウィルスなどの生物組織を試料腔室内に入れることによってのみ観察可能であり、流体試料または流体環境下で生理機能を有する細胞、細菌、ウィルスなどを観察できない。さらに１気圧における流体環境下で細胞核内ＤＮＡ転写（transcription）ＲＮＡ、ＲＮＡ転移（translation）タンパク質（protein）、細胞質内微小管（microtubules）などの生物化学反応過程と、神経筋肉接合（neuromuscular junction）箇所での伝導生理（physiology of transduction）制御などの生命現象過程を観察することはできない。

また一定の電荷密度（強度×照射時間）下で生体細胞または生体組織に対し放射線または電子束を照射するとき、電荷密度が生体細胞または生体組織が耐えられる臨界電荷密度よりも大きい場合、生体細胞または生体組織は死んでしまうか或いは機能を失ってしまいそれに伴い本来の機能を維持できなくなってしまう。かつ大きすぎる電荷密度は生体細胞または生体組織を破壊し、分解してしまうことがある。

したがって、その内部に生体細胞または生体組織を保存でき、かつ電子顕微鏡の試料腔室に置かれて観察を行うことができ、その操作法が上述の生体細胞または生体組織を傷害する事態を防止できる装置が求められている。
この点に鑑みて本発明者は試作と実験を繰り返した結果、上述の問題を解決し、生体細胞または他の生体を観察するという目的を達成できる方法を見出した。

本発明の主な目的は、生体環境下で電子顕微鏡により生体環境内の生体ユニット、例えば生体細胞、生体組織、生体細胞内の物質、または生体細胞と生体細胞間の物質などを観察可能である電子顕微鏡による生体ユニットの観察法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、観察対象物となる生体ユニットを損傷する（或いはそれに機能を失わせる）事態が発生しないように電子顕微鏡により生体ユニットを観察可能である電子顕微鏡による生体ユニットの観察法を提供することである。

上述の目的を達成するために、本発明による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法は次のステップを含む。Ａ）電子顕微鏡内の試料腔室において生体環境を提供し、生体環境内に少なくとも一つの生体ユニットと所定の環境条件を整え、かつ環境条件を生体ユニットが基本的な生理機能を維持できるように設定し、かつ生体環境の上下方に少なくとも一対の向かい合う観察窓を設け、かつ生体ユニットを異なる臨界電荷密度に耐えられる二種以上の物件を有するように設定する。Ｂ）所定区域において、所定の時間で一対の観察窓から生体ユニットに対し所定の強度の粒子束を照射し、電子顕微鏡の結像装置に結像する。このとき所定の電荷密度は粒子束の所定の強度と所定の時間との相乗であり、所定の電荷密度は生体ユニットの照射された区域中の観察対象物の臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しい。
これにより、使用者は本発明の技術により電子顕微鏡を操作し生体ユニットを観察することが可能であるだけでなく、生体ユニットを損傷することなく電子顕微鏡で生体ユニットを観察することも可能である。

以下、本発明の構造と特徴を実施例と図面に基づいて説明する。まず図面の説明は次の通りである。
図１は本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第一操作を示す模式図である。
図２は本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法おけるエネルギーフィルターの操作状態を示す模式図である。

図３は本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第二操作を示す模式図である。
図４は本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の生体環境のもう一つの構造を示す模式図である。
図５は本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第三操作を示す模式図である。
図６は本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第四操作を示す模式図である。
図１から図３に示すように、本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法は次のステップを含む。

Ａ）電子顕微鏡９０内の試料腔室９１において生体環境１１を提供し、生体環境１１内部に少なくとも一つの生体ユニット１８と所定の環境条件１９を整え、かつ環境条件を生体ユニットが基本的な生理機能を維持できる生理環境、例えば所定の圧力の気体、所定の圧力の蒸気、所定の圧力の液体またはその混合物などに設定し、かつ生体環境１１の頂面と底面に少なくとも一対の向かい合う観察窓１２を設ける。本実施例では、生体環境１１は箱体にすることが可能である。また観察窓１２は開口状を呈し、その口径が５μｍから１００μｍの間である。続いて生体環境１１の上下方に緩衝層１５を設け、上方の緩衝層１５の頂部と下方の緩衝層１５の底部に一対の外孔１６を設け、一対の外孔１６と一対の観察窓１２を同軸に位置させる。続いて生体ユニット１８を異なる臨界電荷密度に耐えられる二種以上の物件１８１を有するように設定する。もし受けた電荷密度がそれぞれの物件１８１の対応する臨界電荷密度より大きい場合、物件１８１は機能を失ってしまうか或いは死んでしまう。ここで機能を失ってしまうというのは本来の機能を発揮できなくなってしまうということ、例えば染色体が機能を失い、細胞分裂を止めてしまうというようなことである。また結像の際、本実施例では暗視野（dark field）結像、微分干渉（Differential Interference Contrast、ＤＩＣ）、高感光イメージングプレート（Image plate、ＩＰ）などの結像技術を採用可能であるため、極めて短い露光時間条件下で、高解像度のイメージが得られるので、前述の生体ユニット１８とその内部の物件１８１が粒子束を照射され、機能を失ってしまうか或いは死んでしまうのを防止可能となると同時に、細胞においてブラウン運動（Brownian Motion）が原因で焦点を失うという問題を排除することも可能となる。また環状暗視野（annular dark-field detector、ＡＤＦ）、高角度環状暗視野（high-angle annular dark-field detector、ＨＡＡＤＦ）など結像技術と、エネルギーフィルター（Energy Filter）または電子エネルギー損失分光法（Electron energy loss spectroscopy、ＥＥＬＳ）などの分析器とを結合し、所定の粒子エネルギーＥ１を取り出すことで結像する。これにより高解像度の結像効果を得ることが可能となる。例えば撮像断面Ａ−Ａ（図２参照）から放射された粒子エネルギー以外のものを濾過したり、生体ユニット試料の背景信号（例えば水分子の背景ノイズ）を濾過したりすることでイメージの鮮明度を高め、特定のエネルギーを放射する粒子を追跡することが可能となる。図２に示すのはエネルギーフィルターの使用状態である。

Ｂ）所定区域において、所定の時間で一対の外孔１６と一対の観察窓１２から生体ユニット１８に対し所定の強度の粒子束ＥＥを照射し、そして電子顕微鏡９０の結像装置（図中未表示）に結像する。このとき所定の電荷密度は粒子束ＥＥの所定の強度と所定の時間との相乗であり、所定の電荷密度は生体ユニット１８の照射された区域中の観察対象物件１８１の臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しい。本実施例では、所定の回数（例えば３０から５０回）を複数回照射することも可能である。毎回、所定の区域を照射し、所定の時間で結像する。所定の回数で照射した電荷密度を全部足し、環境条件下で中和した電荷密度を引いて、その引いた後の電荷密度が生体ユニット１８の照射された区域中の観察対象物件１８１の臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しくなるように限定される。図３に示すＡ区域は細胞内の粗面内質網１８１’を観察するのに対し、図３に示すＢ区域は滑面内質網１８１’’とゴルジ体１８１’’’の二種の物件を同時に観察できる。照射区域に観察対象物件１８１が二種以上ある場合でも、互いに足した後の電荷密度から環境条件下で中和した電荷密度を引いた後の電荷密度を、生体ユニット１８の照射された区域中において最小の臨界電荷密度に耐えられる物件１８１の対応する臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しくなるように制御する必要がある。

例えば細胞中のミトコンドリア１８２（図３中のＣ区域参照）を観察する場合、照射した電荷密度を互いに足し、かつ環境条件下で中和した電荷密度を引く。このとき引いた後の電荷密度がミトコンドリア１８２の臨界電荷密度より大きいとミトコンドリア１８２が機能を失ってしまう。
前述の生体ユニット１８は、生体細胞、細菌、ウィルス、生体生理機能を有する単体、またはこれらの組み合わせなどのいずれか一つである。前述の物件１８１は生体ユニット１８の内部、表面、または外部に位置し、かつ細胞内の細胞核、細胞質、細胞小器官、または酵素にすることが可能である。また細胞小器官は、染色体、タンパク質、またはミトコンドリア、およびその他の細胞が有するものを含む。

前述の粒子束ＥＥは電子束、イオン束、原子束、または中性子束などのいずれか一つである。
前述の電子顕微鏡９０は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ‐transmission electron microscope）または走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ‐scanning transmission electron microscope）である。走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）と、環状暗視野（ＡＤＦ）と高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）など結像技術と、電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）分析器またはエネルギーフィルター（Energy Filter）と、を結合し、特定のエネルギー粒子を取り出し、結像を行うことで比較的厚い生体ユニット（５μｍから１０μｍ）を観察可能であると同時に高解像度の結像効果を達成可能である。

上述の方法では、生体環境１１内の環境条件１９は所定の圧力の水蒸気（または１気圧の飽和水蒸気）と特定の気圧の混合気体に設定することが可能である。特定の気体は窒素、酸素、二酸化炭素、または不活性ガスなどのいずれか一つである。また環境条件は低圧の液体に設定することが可能である。実際に観察窓１２の口径により環境条件１９内の気体または液体蒸気を緩衝層１５へ徐々に拡散させるように制限する速度により、環境条件１９を生体環境１１内に保持する効果を達成可能である。また緩衝層１５から気体を取り出すことで蒸気と特定の気体が試料腔室９１内に拡散することを防止可能である。また環状暗視野（ＡＤＦ）と高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）などセンサーと、エネルギーフィルター（Energy Filter）と、電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）分析器など結像技術により特定のエネルギー粒子を取り出し、結像を行うことで高コントラスト・高解像度の鮮明なイメージを得ることが可能である。

図４に示すように、生体環境１１が液体の生理環境（例えば１気圧の液体環境）に限定される場合、図１に示すような生体環境１１外の緩衝層１５を分割して分割室１５１を形成し、そして緩衝室１５が提供する所定の圧力の気体を、総圧力が１気圧である飽和水蒸気（または未飽和水蒸気）と特定の気体の混合気体に設定することが可能である。特定の気体は窒素、酸素、二酸化炭素、または不活性ガスなどのいずれか一つであり、蒸気室１５内の飽和水蒸気圧は生体環境１１内の蒸発速度を制御可能である。また緩衝室１５に１気圧の特定の気体のみを提供し、そして特定の気体圧力と生体環境１１内の水溶液の圧力との差を、生体環境１１内の水溶液と気体界面の臨界溢出圧力より低いか或いはそれと一致させるように制御することも可能である。これにより生体環境１１内の水溶液は観察窓１２から流れることなく、蒸気形態で徐々に緩衝層１５内へ揮発することが可能となる。また分割室１５１から空気を持続的に取り出すため、緩衝層１５から分割室１５１に拡散した蒸気と気体は試料腔室９１内に拡散することなく取り出される。これにより、生体の液体生理環境を提供することが可能となる。

図５に示すように、本実施例を操作する際、生体環境１１’の観察窓１２’に二酸化シリコン、高分子または非結晶炭素膜から構成される非結晶薄膜層（amorphous film）２１を配置することで環境条件１９と外部とを完全に隔離することが可能である。これにより、前述の緩衝層１５（図１参照）を配置する必要がなくなり、生体環境１１’内の環境条件１９中の流体は溢れたり蒸気形態で外部へ拡散したりする状態が発生しない。また同時に薄膜２１の表面にpoly‐L‐lysine、poly‐L‐arginine、またはpoly‐hydroxyethyl‐methacrylate（ＰＨＥＭＡ）とその共重合体（copolymer）などから構成される固定層を配置することで生体ユニット１８を薄膜２１の表面に固定し、細胞のブラウン運動を排除することが可能である。また前述のエネルギーフィルター（Energy Filter）、電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）分析器と、環状暗視野（ＡＤＦ）と高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）などの結像技術により、薄膜２１が比較的薄いため電子束は電子を非弾性的に放射し、結像解像度を低下させるという欠点を克服することが可能である。
図６に示すのは二つの細胞を観察する状態を示す模式図である。図中のＤ区域は、細胞内、細胞外、または細胞の間の物質を観察可能である。

上述の通り、本実施例による方法は使用者に電子顕微鏡で生体ユニットを観察する技術を提供可能である。
同時に本実施例は生体ユニットを損傷することなく電子顕微鏡で生体ユニットを観察する技術を提供可能である。
また本実施例に挙げた技術は説明のための一例に過ぎず、本発明の請求範囲を限定できないため、本発明の主張した技術範囲の効果と同等な応用は本発明の請求範囲に属すべきである。

本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第一操作を示す模式図である。本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法におけるエネルギーフィルターの操作状態を示す模式図である。本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第二操作を示す模式図である。本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の生体環境のもう一つの構造を示す模式図である。本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第三操作を示す模式図である。本発明の一実施例による電子顕微鏡による生体ユニットの観察法の第四操作を示す模式図である。

符号の説明

１１、１１’ 生体環境、１２、１２’ 観察窓、１５緩衝層、１６外孔、１８生体ユニット、１８１物件、１８１’ 粗面内質網、１８１’’ 滑面内質網、
１８１’’’ ゴルジ体、１８２ミトコンドリア、１９環境条件、２１薄膜、９０電子顕微鏡、９１試料腔室、ＥＥ粒子束

Claims

電子顕微鏡内の試料腔室において生体環境を提供し、生体環境内に少なくとも一つの生体ユニットと所定の環境条件を整え、かつ環境条件を生体ユニットが基本的な生理機能を維持可能に設定し、かつ生体環境の上下方に少なくとも一対の向かい合う観察窓を設け、かつ生体ユニットを異なる臨界電荷密度に耐えられる二種以上の物件を有するように設定するステップＡ）と、
所定区域において、所定の時間で一対の観察窓から生体ユニットに対し所定の強度の粒子束を照射し、電子顕微鏡の結像装置に結像するステップＢ）と、
を含み、
そのうち所定の電荷密度は粒子束の所定の強度と所定の時間との相乗であり、かつ所定の電荷密度は生体ユニットの照射された区域中の観察された物件の臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しいことを特徴とする電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
ステップＡ）では、物件が耐えた電荷密度が臨界電荷密度より大きい場合、物件は機能を失ってしまうか或いは死んでしまうことを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
ステップＢ）では、所定の回数で一対の観察窓から生体ユニットに対し所定の強度の粒子束を照射し、かつ毎回、所定の区域に照射し、所定の時間で結像することを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
ステップＢ）では、所定の回数で照射した電荷密度を全部足し、環境条件下で中和した電荷密度を引いて、引いた後の電荷密度は生体ユニットの照射された区域中の観察された物件の臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しくなるように限定され、また照射区域に観察された物件が二種以上ある場合でも、互いに足した後の電荷密度は観察された物件中の最小の臨界電荷密度に耐えられる物件の対応する臨界電荷密度より小さいか或いはそれに等しくなるように限定されることを特徴とする請求項３に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
生体ユニットは、生体細胞、細菌、ウィルス、またはこれらの組み合わせのいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
物件は、生体ユニットの内部、表面、または外部に位置することを特徴とする請求項５に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
物件は、細胞内の細胞核、細胞質、細胞小器官、または酵素のいずれか一つであり、細胞小器官は、染色体、タンパク質、またはミトコンドリアを含むことを特徴とする請求項５に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
生体環境は箱体から形成され、観察窓は開口状を呈し、別々に生体環境の頂面と底面に形成されることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
環境条件は、所定の圧力の蒸気、所定の圧力の気体、所定の圧力の液体、またはこれらの混合物に設定されることを特徴とする請求項８に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
観察窓の口径は５μｍから１００μｍの間であり、生体環境は外部に少なくとも一つの緩衝層を有し、緩衝層は頂部と底部とに少なくとも一対の外孔を有し、一対の外孔と一対の観察窓とは同軸に位置することを特徴とする請求項８に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
少なくとも一つの観察窓には薄膜を有することを特徴とする請求項８に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
粒子束は、電子束、イオン束、原子束または中性子束のいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
ステップＡ）では、電子顕微鏡は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ‐transmission electron microscope）または走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ‐scanning transmission electron microscope）であることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。
ステップＡ）では、暗視野（Dark Field）結像技術、エネルギーフィルター、または電子エネルギー損失分光法の分析器を使用することにより所定の粒子を取り出し、結像することで良好な結像効果を達成することを特徴とする請求項１３に記載の電子顕微鏡による生体ユニットの観察法。