TWI277734B - Method for observing living bodies using an electron microscopy - Google Patents

Description

1277734 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 特別是指一 本發明係與電子顯微鏡之操作技術有關， 種以電子顯微鏡觀察活體單元之方法。 ’ 5【先前技術】 射，在操作電子顯微鏡來觀察物體時 通常係受限於電子顯微鏡内的樣品腔室之真空環境J； 待觀察的物體必須為非揮發性的固體方能進行觀致。若Γ 揮發性物體，例如液態或氣態的流體物質，在置二真】 10品腔室後會產生的大量氣體，不僅會造成電子東 . 滅騎騎或成像的實驗，亦會導致顯微鏡電;;搶= 真空區域的真空度下降或造成污染，而損壞電子顯微鏡。门 由上可知，受限於真空環境的限制，傳統電子顯微鏡 只能在其樣品腔室内觀察固態物質之結構，或觀察乾燥脫 15水後的細胞，細菌，病毒等等生物組織，並不能觀察流體 Φ 樣品或流體環境中具有生理功能的細胞，細菌，病毒等等, §然更無法在一大氣壓的流體環境下觀察細胞核内dna 轉錄（transcription) RNA、RNA 轉譯(translation)蛋白質 (protein)、細胞質内微管體(microtubuies)等生化反應過程， • 2〇以及神經肌肉接合(neuromuscular junction)處的傳導生理 (physiology of transduction)機制等等生命現象過程。 此外，活體細胞或活體組織在受到放射線或電子束照 射於一定的電荷密度（強度x照射時間）時，當該電荷密度大 於活體細胞或活體組織可承受的臨界電荷密度時，該活體 i277734 大的==組織即死亡或失能，而無法維持原有的功能。過 分解。何在度甚至會破壞該活體細胞或該活體組織，使其 5 ^此，必須有-錄置可在其内部置人活體細胞或活 …亚可將該裝置置人於電子顯微鏡之樣品腔室内進 =祭，而其操作方法必須避免上述可能傷害活體細胞或 居體組織之情形發生。 有鑑於此，本案發明人乃經過不斷之試作與實驗後， 終於發展出本方法，而可解決前述問題，達到觀察活體細 10 胞或其他種活體之目的。 【發明内容】 本發明之主要目的在於提供一種以電子顯微鏡觀察活 體單元之方法，其可在一活體環境下，以電子顯微鏡來對 15该活體環境内的活體單元進行觀察，其中該活體單元可為 活體細胞，或活體組織，或活體細胞内的物質，或活體細 胞與活體細胞間的物質。 本發明之次一目的在於提供一種以電子顯微鏡觀察活 體單元之方法，其可在不損傷欲觀察的活體單元（或不使其 2〇失能)的情形下，以電子顯微鏡來對活體單元進行觀察。 緣是，為了達成前述目的，依據本發明所提供之一種 以電子顯微鏡觀察活體單元之方法，包含有下列步驟：A 於一電子顯微鏡内的樣品腔室中提供一活體環境，該活體 環境内具有至少一活體單元及預定環境條件，該環境條件 5 1277734 係指可使該活體單元維持其基本生理功能，且該活體環境 之上下方具有彼此相對的至少一對觀視窗，該活體單元具 有二種以上的物件分別可承受不同的臨界電荷密度；B.以 預定強度的粒子束透過該對觀視窗照射於該活體單元於預 5 定區域以及預定時間，並於該電子顯微鏡之成像裝置上成 像；其中，該粒子束的預定強度與該預定時間的乘積即為 預定電荷密度，該預定電荷密度小於或等於該活體單元被 照射區域中被觀測物件的臨界電荷密度。 藉由本發明之技術，不僅可讓使用者操作電子顯微鏡 10來觀察活體單元，並可在不損傷活體單元的情形下，以電 子顯微鏡來對活體單元進行觀察。 【實施方式】 為了詳細說明本發明之構造及特點所在，茲舉以下之 15 一較佳實施例並配合圖式說明如后，其中： 第一圖係本發明一較佳實施例之第一操作示意圖。 第二圖係本發明一較佳實施例之原理說明圖，顯示使 用能量濾鏡之操作狀態。 第三圖係本發明一較佳實施例之第二操作示意圖。 20 第四圖係本發明一較佳實施例之活體環境另一結構示 意圖。 第五圖係本發明一較佳實施例之第三操作示意圖。 第六圖係本發明一較佳實施例之第四操作示意圖。 如第一圖至第三圖所示，本發明第一較佳實施例所提 1277734 供之-種以電子顯微鏡觀察 下列步驟： ㈣70之方法，主要包含有 々.於-電子顯微鏡90内的樣品腔 11，該活體環境u内 中棱i、一活體 =環祕们9,騎料件触可及 基本生理功能之生理環境，例如可為，早轉持其 預定壓力之蒸氣，或預定壓力之夜體=之哺，或 體環境η於本實關中係且;亥活 之頂面以及底面具有彼此相對的至少 ^體减u 觀視窗12於本實施例中係為一開口 :口”該 5μιη-1〇〇μΐη之間。該活體環境丨丨更於苴；:從"於 緩衝層15, 一對外孔16分別上/方 γ二Μ — ；rnr^15 12同軸。該活體單元18具有_ 、^丁硯視自 15 參 20 受不__密度，分別可承 r所對應的臨界電荷密度時’該=== 此處之失能係指無法再發揮其原有的功能，例㈣色體失 =即無法再進行細齡裂。又，在成像時， 用暗視野（Dark脇）成像、微分干涉差（職贈lal 、片 ，）與兩感光影像板(Image plate, IP) 成像等技術，可在極短_光時間條件，取制高清晰之 影像，可避免前述活體單元18及其内部物件181不致因粒 子束的照射而失能或死亡。同時亦可排除細胞因布朗運動 (Brownian Motion)所產生失焦的問題。此外亦可使用環狀 7 1277734 暗視野(annular dark-field detector，ADF)與高角度環狀暗視 野(high-angle annular dark-field detector，HAADF)成像技術 結合能量濾鏡(Energy Filter)，或者是電子能損譜(Electr〇n energy loss spectroscopy，EELS)分析器，以擷取預定之粒子 5能量El來成像，可達到更高解析之成像效果，例如可濾除 不是來自於取像截面A-A(示於第二圖）所散射的粒子能 里、遽除活體早元樣品的背景訊號(例如水分子的背景雜訊) 以增加影像清晰度、以及追蹤特定散射能量之粒子，而使用 能量濾鏡之狀態係如第二圖所示。 B·以預定強度的粒子束EE透過該對外孔16及該對觀 視囪12照射於該活體單元is於預定區域以及預定時間，並 於該電子顯微鏡90之成像裝置（圖中未示)上成像。其中，該 粒子束EE的預定強度與該預定時間的乘積即為預定電^ 密度，該駭電躲度小於或等於該活體單元18被昭射區 15 域中被觀測物件181的臨界電荷密度。本實施例中，可昭射 多次而於預定次數(例如3㈣次)，每次均舦區域以 及預定時間並成像，該等預定次數照射的電荷密度相加並 扣除掉該環境條件所中和掉的電荷密度後，仍必須小於或 $該活體—單元18被照射區域中被觀測物件i8i的臨界電 ，山度帛一圖中的A區域係針對細胞内的粗緩内質網

Si觀;，而第三圖中的B區域則具有平滑内質網 =及南基氏體181’’’二種物件而可同時觀察。當照射區 二！7^皮觀測物件181時，亦需控制該相加後的 毛何後度亚扣除掉該環境條件所中和掉的 20 1277734 小於或等於該活體單元18被照射區域中可承受最小臨界電 荷控度之物件181所對應的臨界電荷密度。 例如，欲觀察一細胞中的粒腺體182(第三圖中之C區 域)，則其相加後的照射的電荷密度並扣除掉該環境條件所 5中和掉的電荷密度後，仍不能大於該粒腺體182的臨界電 荷密度，否則該粒腺體182即會失能。 、耵，之活體單元18,係可為一活體細胞，或一細菌， 或一病毒，或一具有活體生理機能之單體，或前述單元之 組合。而前述之物件181係位於各該活體單元18内部或表 ίο面或外部，而可為細胞内的細胞核或細胞質或胞器或酵素， 该胞杰係包含染色體或蛋白質或粒腺體以及其他細胞所且 有之物體。 〃 前述之粒子束EE可為電子束或離子束或原子束或中 子束。 15 20 前述之電子顯微鏡90係可為穿透式電子顯微鏡(TEM-=an=miSslon dectr〇n micr〇sc〇pe)，或為掃瞄穿透式電子顯 mtiSTEU - scanning transmission electron microscope) 〇 ^ 用掃瞒穿透式電子顯微鏡(STEM)，結合環狀暗視野(adf) 與高角度環狀暗視野(HAAD戰像技術，α及電子能損譜 (EELS)刀析為或者是能量濾鏡(Energy 來擷取特定能 置粒子進行成像，即可針對較厚之活體單元(5_1() 觀祭且可達到高解析的成像效果。 、上述之方法中，對於該活體環境n内的環境條件Μ 可以疋預定壓力的水蒸氣（或一大氣壓的飽和水蒸氣)與特 9 1277734 定氣體之混和氣體，該特定氣體可為氮氣、氧氣、二氧化碳 與惰性氣體等，又該環境條件亦可為低壓的液體。實際上藉 由該觀視窗12的小口徑來限制環境條件19内的氣體或液 體蒸氣緩慢向外逸散至該等緩衝層15的速率，藉以達到將 5 u亥環丨兄條件19保持於該活體環境η内的效果，並可藉由對 該等緩衝層15抽氣來避免蒸氣與特定氣體逸散進入該樣品 腔室91之内。此外，藉由環狀暗視野(ADF)與高角度環狀 • 暗視野(HAADF)偵測器、能量濾鏡(Energy Filter)、以及電 子能相譜(EELS)分析器等成像技術，可擷取特定的粒子來 10進行成像，而取得到高對比、高解析之清晰影像。 如第四圖所示，對於活體環境n需為液態的生理環境 日寸(例如一大氣壓的液態環境)，則亦可由第一圖所示之活 體環境11外之緩衝層15再分隔出一分隔室151，對該緩衝 層15提供預定㈣之氣體，例如總壓為—大氣壓的飽和水 15蒸氣（或^未飽和水蒸氣)與特定氣體之混合氣體，該特定氣 ⑩體可為氮氣、氧氣、二氧化碳與惰性氣财，該蒸氣室Η 内之飽和水蒸氣壓可以抑制該活體環境u内水的蒸發速率， 另外，亦可僅提供-大氣壓的特定氣體於該緩衝層15中， JE控制鋪定氣缝力與活體環境u内水紐的壓力差小 ‘ 20於或，於該活體環境u内水溶液與氣體介面的臨界溢漏壓 力，藉此―可避免活體環境u内的水溶液自觀視窗12流出， 而僅以瘵氣形怨緩慢揮發進入該緩衝層15内。對該分隔室 151—持續進行抽氣，戶斤以從該緩衝層15逸散進入分隔室i5i 的条氣與氣體會被抽走而不會逸散進入該樣品腔室91内， 1277734 藉此可提供一活體的液態生理環境。 再如第五圖所示，本發明在操作時，亦可於該活體環 境11’的觀視窗12,上封設一層非結晶(am〇rph〇us film)薄膜 21，係為二氧化矽、高分子或非結晶碳質膜，可將環境條件 5 19完全與外界隔絕，藉此即可不設置前述之緩衝層15(示 於第一圖），該活體環境丨1，内的環境條件19中之流體將不 會溢出或以蒸氣形態向外逸散。同時可在此薄膜21表面附 著一層固定層，例如poly-Ldy—e、p〇ly丄_arginine或 poly_hydroxyethyl_methacrylate (PHEMA)及其共聚合物 1〇 (copolymer)等，可將活體單元18固定於該薄膜21表面，而可 排除細胞的布朗運動。此外藉由前述的能量濾鏡(Energy Filter)、電子能損譜(EELS)分析器、以及環狀暗視野(adf) 與高角度環狀暗視野(HAADF)等成像技術，可以克服電子 束因該薄膜21較厚而產生電子非彈性散射所導致成像解析 15 度下降的缺點。 苐六圖所示者，係為對兩個細胞進行觀察之示意圖， 此時圖中之D區域係可觀察細胞内或細胞外或細胞間的物 質。 由上可知，本發明所提供之方法，揭露出可讓使用者 2〇操作電子顯微鏡來觀察活體單元的技術。 同時，本發明亦揭露出在不損傷活體單元的情形下， 以電子顯微鏡來對活體單元進行觀察的技術。 本案於實施例中所揭露之技術僅為了舉例說明，並非 用以限制本案之申請專利範圍，其他與本案所主張之技術 11 1277734 範圍等效之運用，亦應為本案之範圍所涵蓋。

12 1277734 【圖式簡單說明】 第一圖係本發明一較佳實施例之第一操作示意圖。 第二圖係本發明一較佳實施例之原理說明圖，顯示使 用能量濾鏡之操作狀態。 5 第三圖係本發明一較佳實施例之第二操作示意圖。 第四圖係本發明一較佳實施例之活體環境另一結構示 意圖。 第五圖係本發明一較佳實施例之第三操作示意圖。 第六圖係本發明一較佳實施例之第四操作示意圖。 10 【主要元件符號說明】 11，11’活體環境 12, 12’觀視窗 15緩衝層 16外孔 18活體單元 181物件 15

181’粗糙内質網 18Γ’平滑内質網 18Γ”高基氏體 182粒腺體 19環境條件 21薄膜 90電子顯微鏡 91樣品腔室 EE粒子束 13

Claims (1)

1277734 卜、申請專利範圍： 列步電子輸鏡觀察活體單元之方法，包含有下 兮二二：::微鏡内的樣品腔室中提供-活體環境， 活體早兀及預定環境條件，該環 二 二/單7^維持其基本生理功能，且該活體環 ^ 彼此相對的至少一對觀視窗，該活體單元 八一、分別可承受不同的臨界電荷密度； 一二，度的粒子束透過該對觀視窗照射於該活體 成ΠΓ及預定時間，並於該電子顯微鏡之成像 J ^也箱二/、中，該粒子束的預定強度與該預定時間的 ，即為予，节密度，該預定電荷密度小於或等於該活 體早兀L區域中被觀測物件的臨界電荷密度。 2·依據申請專利節圚笛， 、 昨—+、 阗弟1項所述之以電子顯微鏡觀察 15 20 活體单元之法，其中：於步驟Α.中，在物件承受的電荷 密度超過臨界電雜度時，_件即失能或死亡。 3·依據申請專利範圚笛，= 、 ^ 、 国弟1項所述之以電子顯微鏡觀察 活體夺兀之方法，其中：於步驟Β·中，係以預㈣度的粒 子束透過賴觀視㈣料絲料元㈣以數，每次 均照射預定區域以及預定時間並成像。 4:依據中β專利$_第3項所狀以電子顯微鏡觀察 活體之方法，、，其中：於步驟Β.中，該等預定次數照射 的電荷②度相加並扣除掉該環境條件所巾和掉的電荷密度 後，係小於或等於該活體單元被照射區域中被觀測物件的 臨界電荷密度；該照射區域中有二以上之被觀測物件時， 14 1277734 該相加後的電荷密度係小於 受最小臨界電荷密度之物件或等於該等被觀測物件中可承 5_依據申請專利範圍第所對應的臨界電荷密度。 活體單元之方法，其中· 項所述之以電子顯微鏡觀察 -細菌，或-病毒，或前述單係為—活體細胞，或 6·依據申請專利範圍第 且0 活體單元之方法，i中.所述之以電子顯微鏡觀察 或表面或外部。.μ物件係錄絲體單元内部 7.依據中β專利範圍第5項所述之 活體單元之方法，其中.夂兮板丛〜1子，.級鏡齡 、，、田胞貝或Μ或酵素，該胞!!係包含染色體或蛋白 腺體。 、 專利範圍第1項所述之以電子顯微鏡觀察 活體平兀之方法，其中：該活體環境係由—盒體所形成， 15各該觀視窗係為-開口，分別形成於該活體環境之頂面以 及底面。 9.依據申請專利範圍第8項所述之以電子顯微鏡觀察 活體單元之方法，其中：該環境條件係為預定壓力之蒸氣, 或為預定壓力之氣體，或為預定壓力之液體，或為前述之 20 混合。 10.依據申請專利範圍第8項所述之以電子顯微鏡觀察 活體單元之方法，其中：各該觀視窗之口徑介於 5μιη-100μιη之間；各該活體環境更於其外部形成至少一緩 衝層，至少一對外孔分別形成於該緩衝層的頂部及底部, 1277734 錢外孔係與該對觀視窗同軸。 活體單元之=、、Γ專利關第8項所述之以電子_微鏡觀察 法，其中：至少一該觀視窗封設—層薄膜。 活體^依據㈣翻_« 1賴紅以電子!〗微馳察 兀之方去，其中：該粒子束係為電子束或離子束或 原千束或中子束。 依據申明專利範圍弟1項所述之以電子顯微鏡觀察 ^體單元之方法，其中：於步驟Α·中，該電子顯微鏡係為 牙透式電子顯微鏡(ΤΕΜ - transmission electron microscope)， 或為掃目苗穿透式電子顯微鏡(STEM · scanning transmission electron microscope) 〇 15 Η·依據申請專利範圍第13項所述之以電子顯微鏡觀 察活體單元之方法，其中··於步驟Α·中，更包含使用暗視 野(Dark Field)成像技術，或能量濾鏡或電子能損譜分析器， 藉以擷取預定之粒子來成像，達到較佳的成像效果。

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