JP2007114069A - 判定方法および判定キット - Google Patents

Abstract

【課題】洗浄操作を省略しても、試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在するか否かを正確に判定し得る判定方法および判定キットを提供すること。
【解決手段】本発明の判定方法は、内面にＨＩＶ抗原１０２を担持したウェル１０１内に、生体試料を含む検体液を供給した後、ウェル１０１内に抗ＨＩＶ抗体と結合する抗ＩｇＧ抗体１０４を担持した着色粒子１を含有する試薬を供給して、着色粒子１がウェル内面に吸着し分散した状態となった場合を陽性と判定し、ウェル１０１内において着色粒子１が沈降・凝集した場合を陰性と判定するものであり、検体液をウェル１０１内に供給するのに先立って、試料中に含まれ、ＨＩＶ抗原１０２と抗ＩｇＧ抗体１０４とに結合することにより、着色粒子１の沈降を阻害する阻害物質１０５に対する親和力が、ＨＩＶ抗原１０２より高いタンパク質１０６を含有する拮抗剤を検体液中に添加する。
【選択図】図４

Description

本発明は、判定方法および判定キットに関するものである。

抗体が抗原に特異的に結合する性質を利用するイムノアッセイ法は、生体試料中の微量成分を、特異的かつ高感度に測定できることから、各種感染症の診断に利用されている。

このイムノアッセイ法としては、例えば、粒子凝集法（例えば、特許文献１参照。）、酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、イムノクロマトグラフィー法等が知られている。

このうち、粒子凝集法（ＰＡ法）は、手順が少なく、短時間で判定できるという簡便は方法でありながら、感度が高く、また、特殊な機器や設備を必要としないという利点がある。

このようなことから、ＰＡ法は、ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）等の各種ウィルスに対する抗体の検出方法として期待されている。
ＰＡ法による抗ＨＩＶ抗体の検出は、例えば、次のようにして行われる。

Ｉ：まず、ＨＩＶ抗原を担持したウェル内に、血清試料を供給する。
ここで、血清試料中に、抗ＨＩＶ抗体が含まれている場合、この抗ＨＩＶ抗体が、ＨＩＶ抗原に結合する。

II：次に、ウェルを洗浄する。これにより、ＨＩＶ抗原に結合した抗ＨＩＶ抗体以外の共存成分が概ね除去される。

III：次に、ウェル内に、抗ＨＩＶ抗体に結合する抗ＩｇＧ抗体を担持した着色粒子を含有する試薬を供給する。

ここで、ＨＩＶ抗原に抗ＨＩＶ抗体が結合している場合、この抗ＨＩＶ抗体に抗ＩｇＧ抗体が結合する。その結果、この抗ＩｇＧ抗体を担持した着色粒子は、ウェル内でウェル内面に吸着し分散した状態となり、ウェル内は薄く着色する。この場合、陽性と判定される。

一方、ＨＩＶ抗原に抗ＨＩＶ抗体が結合していない場合、抗ＩｇＧ抗体は結合する相手が存在しないため、着色粒子は、ウェル内において沈降・凝集する。その結果、ウェルの底に、濃く着色した部分が形成される。この場合、陰性と判定される。

ところで、このようなＰＡ法では、ウェル内に血清試料を供給した後、ウェル内を洗浄する。これは、ＨＩＶ抗原に結合した抗ＨＩＶ抗体以外の共存成分を除去するためであるが、特に、血清試料中には、着色粒子の凝集・沈降を阻害するような阻害物資が含まれており、このような阻害物質をウェル内から排除することが重要となる。

しかしながら、ウェルの洗浄操作は煩雑であり、抗ＨＩＶ抗体の検出操作の効率が低くなるという問題がある。また、洗浄を行っている際に血清試料が周囲に飛散し、作業者が、血清試料中にＨＩＶが存在する場合、ＨＩＶに感染してしまう危険性もはらんでいる。

ところが、この洗浄操作を省略すると、ウェル内に存在する阻害物質が、試薬を供給した際に、ＨＩＶ抗原に抗ＨＩＶ抗体が結合していない場合であっても、着色粒子の沈降・凝集を阻害して、着色粒子がウェル内面に吸着し分散した状態となってしまう。すなわち、陰性であるにも関わらず、陽性と誤判定されてしまうという問題がある。

特開平７−１７４７６２号公報

本発明の目的は、洗浄操作を省略しても、試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在するか否かを正確に判定し得る判定方法および判定キットを提供することにある。

このような目的は、下記（１）〜（８）の本発明により達成される。
（１） 生体がＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）に感染したか否かを判定する判定方法であって、
内面にＨＩＶ抗原を担持したウェル内に、前記生体から採取した試料を含有する検体液を供給する第１の工程と、
前記ウェル内に、抗ＩｇＧ抗体を担持した粒子を含有する試薬を供給する第２の工程と、
抗ＨＩＶ抗体がＨＩＶ抗原に結合し、さらに該抗ＨＩＶ抗体に前記抗ＩｇＧ抗体が結合することにより、前記ウェル内において前記粒子がウェル内面に吸着し分散した状態となった場合を陽性と判定し、一方、前記ウェル内において前記粒子が沈降・凝集した場合を陰性と判定する第３の工程とを有する判定方法であって、
前記第１の工程に先立って、前記試料中に含まれ、前記ＨＩＶ抗原と前記抗ＩｇＧ抗体とに結合することにより、前記粒子の沈降を阻害する阻害物質に対する親和力が、前記ＨＩＶ抗原より高いタンパク質を含有する拮抗剤を、前記検体液中に添加することを特徴とする判定方法。

これにより、洗浄操作を省略しても、試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在するか否かを正確に判定することができる。

（２） 前記タンパク質は、カゼイン、オボアルブミン、アルブミン、ラクトフェリンおよびキモトリプシノーゲンのうちの少なくとも１種である上記（１）に記載の判定方法。

これらのタンパク質は、いずれも、阻害物質に対する親和力がＨＩＶ抗原より特に高いものであることから好ましい。

（３） 前記粒子は、着色されている上記（１）または（２）に記載の判定方法。
これにより、可視光下での判定が可能となるという利点がある。

（４） 前記粒子の比重は、前記第３の工程において、前記ウェル内に存在する液体の比重より大きい上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の判定方法。

これにより、必要な時（陰性と判定すべき時）に、ウェル内において、粒子を迅速かつ確実に沈降・凝集させることができる。

（５） 前記拮抗剤は、さらに、非イオン性界面活性剤を含有する上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の判定方法。

これにより、ＨＩＶ抗原または抗体に阻害物質が結合するのをより効果的に妨げることができる。

（６） 前記ウェルの底面は、収斂形状をなしている上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の判定方法。

これにより、沈降した粒子は、ウェルの中央部に向かって転がり、集合して凝集する。その結果、粒子として着色粒子を用いる場合には、ウェルの中央部で、着色粒子の色相が濃い色で（濃く着色して）視認されるので、ウェル内での着色粒子の沈降・凝集（挙動）を容易に確認することができる。

（７） 前記試料は、血清であり、
前記検体液は、該血清を２〜１０００倍に希釈したものである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の判定方法。

本発明によれば、ウェル内に検体液を供給するのに先立って、検体液中にタンパク質を添加して、阻害物質の粒子の沈降阻害作用を阻止するため、このように低い希釈倍率でも（すなわち、検体液中に比較的多くの阻害物質が存在していても）、確実に陽性と陰性との判定を行うことができる。また、この程度の希釈倍率であれば、その操作を比較的容易かつ短時間に行うことができるため、判定操作（作業）に要する時間の短縮を図ることができる。

（８） 上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の判定方法に用いられる判定キットであって、
内面に前記ＨＩＶ抗原を担持した前記ウェルを複数有するプレートと、
前記着色粒子を含有する試薬と、
前記タンパク質を含有する拮抗剤とを有することを特徴とする判定キット。

これにより、洗浄操作を省略しても、試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在するか否かを正確に判定することができる判定キットが得られる。

本発明によれば、洗浄操作を省略しても、試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在するか否かを正確に判定することができる。このため、判定を行うための作業を安全かつ簡便で効率よく行うことができる。

以下、本発明の判定方法および判定キットを、添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。

図１は、本発明の判定キットが備えるプレートを模式的に示す斜視図、図２〜図４は、それぞれ、本発明の判定方法を説明するための模式図である。
まず、本発明の判定キットについて説明する。

本発明の判定キットは、粒子凝集法を利用して抗ＨＩＶ抗体を検出することにより、生体がＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）に感染したか否かを判定する際に用いられるものである。

ここで、粒子凝集法による抗ＨＩＶ抗体の検出（生体がＨＩＶに感染したか否かの判定）は、例えば、次のようにして行われる。

まず、内面にＨＩＶ抗原を担持したウェル内に、生体から採取した試料を含有する検体液を供給し、次いで、ウェル内に、抗ＩｇＧ抗体を担持した着色粒子を含有する試薬を供給し、そして、検体液（試料）中に抗ＨＩＶ抗体が存在する（陽性）か否（陰性）かを判定する。

本発明の判定キットは、このような判定を行う際に用いられるものであり、ＨＩＶ抗原１０２を担持したウェル１０１が複数設けられたプレート１０と、抗ＩｇＧ抗体１０４を担持した着色粒子１を含有する試薬（判定試薬）と、着色粒子１の沈降を阻害する阻害物質１０５がＨＩＶ抗原１０２へ結合するのを阻止するタンパク質１０６を含有する拮抗剤とを有している。

図１に示すように、プレート１０は、平板状をなす部材で構成され、一方の面に複数のウェル１０１が、行列状に配列して設けられている。

プレート１０の構成材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンのような樹脂材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

ウェル１０１は、その内面にＨＩＶ抗原１０２を担持し、検体液および試薬を収納（貯留）するための空間である。

図１に示すように、ウェル１０１は、その底面が収斂形状（本実施形態では、深さが中央部に向かって深くなる形状）をなしている。これにより、沈降した着色粒子１は、ウェル１０１の中央部に向かって転がり、集合して凝集する。その結果、ウェル１０１の中央部で、着色粒子１の色相が濃い色で（濃く着色して）視認されるので、ウェル１０１内での着色粒子１の沈降・凝集（挙動）を容易に確認することができる。

なお、ウェル１０１は、その底面が収斂形状をなすのが好ましいが、最も深くなる箇所は、図示と異なり中央部（中心部）からズレていてもよい。

ウェル１０１の容量は、特に限定されないが、０．０３〜０．５ｍＬ程度であるのが好ましく、０．０５〜０．３ｍＬ程度であるのがより好ましい。ウェル１０１の容量を前記範囲とすることにより、プレート１０の大型化を招くことなく、判定に必要かつ十分な量の液体（検体液や試薬）を収納することができる。

このウェル１０１の内面には、例えば疎水結合によって、ＨＩＶ抗原１０２が担持されている。

ＨＩＶ抗原１０２としては、例えば、ＨＩＶ−１ ｐ１８、ＨＩＶ−１ ｐ２４、ＨＩＶ−１ ｐ５５、ＨＩＶ−１ ｐ３１、ＨＩＶ−１ ｐ５１、ＨＩＶ−１ ｐ６６、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０、ＨＩＶ−２ ｐ１６、ＨＩＶ−２ ｐ２６、ＨＩＶ−２ ｐ５６、ＨＩＶ−２ ｐ３４、ＨＩＶ−２ ｐ５３、ＨＩＶ−２ ｐ６８、ＨＩＶ−２ ｇｐ３６、ＨＩＶ−２ ｇｐ１０５、ＨＩＶ−２ ｇｐ１４０等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

ウェル１０１の内面に担持するＨＩＶ抗原１０２の量は、０．０１μｇ以上であるのが好ましく、０．０５〜１μｇ程度であるのがより好ましい。ＨＩＶ抗原１０２の量を前記範囲とすることにより、抗ＨＩＶ抗体１０３が試料（検体液）中に存在する場合には、十分な量の抗ＨＩＶ抗体１０３をＨＩＶ抗原１０２に結合させることができ、より正確な判定を行うことができる。なお、ＨＩＶ抗原１０２の量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の判定結果の精度の向上は期待できない。

試薬は、抗ＩｇＧ抗体１０４が担持された着色粒子１を含有する懸濁液である。
この試薬を用いると、図２（ａ）に示すように、ＨＩＶ抗原１０２に抗ＨＩＶ抗体（一次抗体）１０３が結合している場合、この抗ＨＩＶ抗体１０３に、着色粒子１に担持された抗ＩｇＧ抗体（標識二次抗体）１０４が結合する。これにより、着色粒子１が、ウェル１０１内においてウェル内面に吸着し分散した状態となる。

一方、図２（ｂ）に示すように、ＨＩＶ抗原１０２に抗ＨＩＶ抗体１０３が結合していない場合、ウェル１０１内において着色粒子１が沈降・凝集した状態となる。

したがって、この試薬をウェル１０１内に供給したときに、着色粒子１がウェル１０１内でウェル内面に吸着し分散した状態で観察された場合には陽性、着色粒子１がウェル１０１内で沈降した状態で観察された場合には陰性と判定することができる。

なお、本実施形態では、粒子として、着色粒子１を用いる場合について説明するが、本発明では、その他、例えば、蛍光物質等を担持した粒子を用いることもできる。ただし、粒子として着色粒子１を用いることにより、可視光下での判定が可能となるという利点がある。

このような粒子（着色粒子１）には、樹脂材料やセラミックス材料で構成された粒子や、樹脂材料とセラミックス材料とで構成された複合粒子（例えば、樹脂粒子の表面をセラミックス材料で被覆した粒子）等を用いることができる。

樹脂材料としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン６、ナイロン６・６、ナイロン６・１０、ナイロン１２）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、メタクリル樹脂、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタンのような熱可塑性樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイドのような熱硬化性樹脂等が挙げられる。

また、セラミックス材料としては、例えば、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｆ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｃｌ_２、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、Ｃａ_２Ｐ_２Ｏ_７、Ｃａ（ＰＯ_３）_２、ＣａＨＰＯ_４のようなリン酸カルシウム系化合物、アルミナ、シリカ等が挙げられる。

また、前述した複合粒子は、例えば、樹脂粒子の表面に、市販のハイブリダイゼーション装置やメカノフュージョン装置等を用いて、セラミックス材料の多孔質粒子を衝突させることにより製造することができる。

粒子の比重は、後述する工程［４］において、ウェル１０１内に存在する液体の比重より大きいものが好ましく、具体的には、１．０５〜１．３ｇ／ｃｍ^３程度であるのが好ましい。これにより、必要な時（陰性と判定すべき時）に、ウェル１０１内において、粒子を迅速かつ確実に沈降・凝集させることができる。

また、粒子の平均粒径は、３０μｍ以下であるのが好ましく、１〜２０μｍ程度であるのがより好ましい。

粒子を着色粒子１とする場合には、例えば、直接染料、酸性染料、塩基性染料、媒染染料、酸性媒染染料、硫化染料、硫化建染染料、建染染料、可溶性建染染料、アゾイック染料、分散染料、反応染料、酸化染料、合成繊維用染料、蛍光増白染料のような各種染料や、各種顔料を用いて染色すればよい。

この着色粒子１（粒子）の表面には、例えば直接、または固定化剤により、抗ＩｇＧ抗体１０４が固定（担持）されている。

固定化剤としては、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド、カップリング、四塩化オスミウム等を用いることができる。このうち、カップリング剤としては、例えば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−チオプロピルトリメトキシシラン、２−（３−トリメトキシシリルプロピルジチオ）−５−ニトロピリジン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−クロロプロピルジメトキシメチルシラン等が挙げられる。

また、着色粒子（着色ビーズ）１の少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成される場合、抗ＩｇＧ抗体１０４を着色粒子１の表面に固定した後、着色粒子１の抗ＩｇＧ抗体１０４から露出する部分を、ブロッキング剤でブロック（被覆）するのが好ましい。このブロッキング剤としては、抗原・抗体反応に影響を与えないもの、例えば、カゼイン、アルブミン等が好適に用いられる。

試薬中の着色粒子１の含有量は、特に限定されないが、０．０５〜０．２ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．０８〜０．１２ｗｔ％程度であるのがより好ましい。着色粒子１の含有量を前記範囲とすることにより、ウェル１０１内での着色粒子１の挙動を確実に視認することができるようになる。なお、着色粒子１の含有量が多過ぎると、試薬をウェル１０１内に供給する際の操作において、ピペットの先端が詰まる等の不都合が生じるおそれがある。

なお、試薬の調製に用いる分散媒としては、例えば、トリエタノールアミン塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ベロナ−ル（５，５−ジエチルバルビツル酸ナトリウム）−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝液、リン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等の各種緩衝液またはこれらに生理食塩を加えたもの等が挙げられる。

ここで、生体から採取した試料（特に、血清）には、ＨＩＶ抗原１０２および抗ＩｇＧ抗体１０４に対して結合して、着色粒子１の沈降を阻害する阻害物質１０５が多数含まれている。

図３に示すように、ウェル１０１内のＨＩＶ抗原１０２に、このような阻害物質１０５が結合すると、ウェル１０１内に試薬を供給した際に、この阻害物質１０５にさらに抗ＩｇＧ抗体１０４が結合し、着色粒子１がウェル内面に吸着し分散した状態となる。これにより、本来、陰性と判定されるべき検体液（試料）が陽性と誤判定されてしまう。

そこで、本発明では、検体液をウェル１０１内に供給するのに先立って（第１の工程に先立って）、検体液中に阻害物質１０５に対する親和力が、ＨＩＶ抗原１０２より高いタンパク質１０６を含有する拮抗剤を添加することとした。

これにより、タンパク質１０６が、検体液（試料）中に含まれる阻害物質１０５に選択的（特異的）に結合する。この状態で、検体液をウェル１０１内に供給すると、図４に示すように、阻害物質１０５のＨＩＶ抗原１０２との結合サイトが、タンパク質１０６によりブロックされているため、阻害物質１０５がＨＩＶ抗原１０２に結合することが妨げられる（阻止される）。

このため、ＨＩＶ抗原１０２に結合した阻害物質１０５に、抗ＩｇＧ抗体１０４がさらに結合し、着色粒子１がウェル１０１内でウェル内面に吸着し分散した状態（陽性）となる現象を回避すること、すなわち、着色粒子１を確実に沈降・凝集させることができる。その結果、抗ＨＩＶ抗体１０３が存在しない検体液を正確に陰性と判定することができる。

このタンパク質１０６には、阻害物質１０５に対する親和力がＨＩＶ抗原１０２より高く、かつＨＩＶ抗原１０２への結合性を実質的に有さないものであれば、いかなるものを用いてもよいが、カゼイン（リンタンパク質）、オボアルブミン（糖タンパク質）、アルブミン、ラクトフェリン（糖タンパク質）およびキモトリプシノーゲンのうちの少なくとも１種を用いるのが好ましく、特に、カゼイン、オボアルブミンおよびラクトフェリンのうちの少なくとも１種がより好ましい。これらのタンパク質は、いずれも、阻害物質１０５に対する親和力がＨＩＶ抗原１０２より特に高いものであることから好ましい。

拮抗剤の添加量は、特に限定されないが、タンパク質１０６の量としてＨＩＶ抗原１０２の量１μｇに対して、０．１〜１０ｍｇ程度とするのが好ましく、０．３〜８ｍｇ程度とするのがより好ましく、０．３〜３ｍｇ程度とするのがさらに好ましい。タンパク質１０６の添加量を前記範囲とすることにより、タンパク質１０６と未結合の阻害物質１０５の量を確実に少なくすることができ、阻害物質１０５の着色粒子１の沈降を阻害する作用（沈降阻害作用）を確実に妨げることができる。なお、タンパク質１０６の添加量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上のタンパク質１０６による阻害物質１０５の作用を阻止する効果の増大は期待できない。

拮抗剤としては、タンパク質１０６をそのまま用いることもできるが、適当な溶媒に溶解して用いるのが好ましい。これにより、タンパク質１０６の添加量の調製が容易となる。

この溶媒には、例えば、前記試薬の調製で挙げた緩衝液と同様のものを用いることができる。

拮抗阻害剤は、さらに非イオン性界面活性剤を含有するのが好ましい。これにより、ＨＩＶ抗原１０２または抗ＩｇＧ抗体１０４に阻害物質１０５が結合するのをより効果的に妨げることができる。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、オクトフェノール−ポリ（エチレングリコエーテル）、ポリ（オキシエチレン）−ソルビタン−モノラウレート、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ｎ−ノナノニル−Ｎ−メチルグルカミド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

次に、このような判定キットの使用方法、すなわち、生体がＨＩＶに感染したか否かを判定する判定方法（本発明の判定方法）について説明する。

［１］ まず、判定に供する検体液を調製する。
この検体液は、生体から採取した試料をそのまま、または、必要に応じて容量を調製（例えば希釈）することにより得られる。

この容量調製用の液体には、例えば、前記試薬の調製で挙げた緩衝液と同様のものを用いることができる。

また、試料としては、例えば、血清（血液）、精液、膣分泌液、母乳のような液体や、細胞（組織）のような固体（固形物）を用いることができる。なお、細胞のような固体の試料を用いる場合には、例えば、これを粉砕し、前記緩衝液に懸濁することにより、検体液とすることができる。

試料として血清を用いる場合、検体液は、血清を２〜１０００倍程度（特に、５〜１００倍程度）に希釈して用いるのが好ましい。本発明によれば、ウェル１０１内に検体液を供給するのに先立って、検体液中にタンパク質１０６を添加して、阻害物質１０５の着色粒子１の沈降阻害作用を阻止するため、このように低い希釈倍率でも（すなわち、検体液中に比較的多くの阻害物質１０５が存在していても）、確実に陽性と陰性との判定を行うことができる。また、この程度の希釈倍率であれば、その操作を比較的容易かつ短時間に行うことができるため、判定操作（作業）に要する時間の短縮を図ることができる。

［２］ 次に、検体液中に、拮抗剤を添加して混合する。
検体液中に拮抗剤を添加すると、阻害物質１０５と拮抗剤に含まれるタンパク質１０６とが結合する。

なお、拮抗剤が液体（液状）である場合、前記工程［１］における試料の容量調整（希釈）は、この拮抗剤を用いて行うようにしてもよい。

［３］ 次に、ウェル１０１の内面にＨＩＶ抗原１０２を担持したプレート１０を用意し、ウェル１０１内に、検体液を供給する（第１の工程）。

ウェル１０１内に検体液を供給すると、図２（ａ）に示すように、検体液中に抗ＨＩＶ抗体１０３が含まれている場合、この抗ＨＩＶ抗体１０３が、ウェル１０１に担持されたＨＩＶ抗原１０２に結合する（捕捉される）。

このとき、検体液中に含まれる阻害物質１０５もＨＩＶ抗原１０２に結合するが、本発明では、図４に示すように、前記工程［２］において添加したタンパク質１０６が阻害物質１０５に結合している。これにより、阻害物質１０５のＨＩＶ抗原１０２との結合サイトが、タンパク質１０６によりブロックされており、ＨＩＶ抗原１０２と阻害物質１０５との結合が妨げられる。

検体液のウェル１０１内への供給量は、特に限定されないが、０．０２〜０．２５ｍＬ程度であるのが好ましく、０．０４〜０．０６ｍＬ程度であるのがより好ましい。

［４］ 次に、ウェル１０１内に試薬を供給して、検体液と混合する（第２の工程および第３の工程）。

ウェル１０１内に試薬を供給すると、図２（ａ）に示すように、ＨＩＶ抗原１０２に抗ＨＩＶ抗体１０３が結合している場合、この抗ＨＩＶ抗体１０３に、着色粒子１に担持された抗ＩｇＧ抗体１０４が結合する。これにより、着色粒子１が、ウェル１０１内（検体液と試薬との混合液中）でウェル内面に吸着し分散した状態となり、ウェル１０１内の液体は薄く着色する程度である。この場合、陽性（抗ＨＩＶ抗体陽性）と判定される。

一方、図２（ｂ）に示すように、ＨＩＶ抗原１０２に抗ＨＩＶ抗体１０３が結合していない場合、抗ＩｇＧ抗体１０４を担持した着色粒子１は、沈降・凝集した状態となり、ウェル１０１の底に、濃く着色した部分（本実施形態では、スポット）が形成される。この場合、陰性（抗ＨＩＶ抗体陰性）と判定される。

なお、このとき、ＨＩＶ抗原１０２に阻害物質１０５が結合していると、図３に示すように、検体液中に抗ＨＩＶ抗体１０３が存在していないにも関わらず、この阻害物質１０５に抗ＩｇＧ抗体１０４が結合することにより、着色粒子１がウェル１０１内でウェル内面に吸着し分散した状態となり、陽性と誤判定されてしまう。

しかしながら、本発明では、阻害物質１０５のＨＩＶ抗原１０２への結合が、タンパク質１０６により阻止されているので、前述したように、誤った判定を確実に防止することができる。これにより、試料中に抗ＨＩＶ抗体１０３が存在するか否か、すなわち、生体がＨＩＶに感染したか否かを正確に判定することができる。

また、各種試料の中でも、血清は、前記阻害物質１０５の含有量が特に多いものである。このため、本発明は、特に試料として血清を用いる場合への適用に適する。

また、本発明では、タンパク質１０６により阻害物質１０５の沈降阻害作用を阻止するので、この阻害物質１０５をウェル１０１内から除去するための洗浄操作が不要である。したがって、作業効率がよく、また、洗浄操作を行っている際に検体液等が周囲に飛散し、作業者が、ＨＩＶに感染する危険を回避することができ、安全性が高い。

以上、本発明の判定方法および判定キットについて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。

例えば、本発明の判定方法は、必要に応じて任意の１または２以上の工程が追加されてもよい。

次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．マイクロプレートの用意
まず、Ｖ底のウェル（容量：０．３ｍＬ）が９６個設けられたマイクロプレートを用意した。このマイクロプレートには、各ウェル内に、それぞれ、以下の６種類のＨＩＶ抗原溶液を混合した混合液５０μＬを供給し、ウェルの内面に、６種類のＨＩＶ抗原を担持させた。

・組み換えHIV-1 IIIB gag p24（ImmunoDiagnostics社製）
：１μｇ／ｍＬ
・組み換えウィルス蛋白HIV-1 gp120（Advanced Biotechnologies社製）
：０．５μｇ／ｍＬ
・組み換えHIV-2 env(gp36)（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
・組み換えHIV-1 env(gp41-gp120)（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
・組み換えHIV-1 p17/24/gp120・gp41（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
・組み換えHIV-1/-2 env（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ

２．判定
（実施例１Ａ）
＜１＞ まず、タンパク質としてカゼインを３．４ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤としてポリ（オキシエチレン）−ソルビタン−モノラウレート（和光純薬工業株式会社社製、「Ｔｗｅｅｎ２０」）を０．２４ｖｏｌ％となるように、それぞれリン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝生理食塩液に溶解して拮抗剤を調製した。

＜２＞ そして、予め調製しておいた抗ＨＩＶ抗体陰性の陰性血清（試料）および抗ＨＩＶ抗体陽性の陽性血清（試料）に、それぞれ拮抗剤を添加して１００倍に希釈することにより陰性検体液および陽性検体液を調製した。また、参照液として、リン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝生理食塩液のみを用意した。

なお、陰性血清および陽性血清には、それぞれＥＬＩＳＡ法により、抗ＨＩＶ抗体陰性および抗ＨＩＶ抗体陽性と判定されたものを用いた。

＜３＞ 次に、陰性検体液、陽性検体液および参照液を、それぞれウェル内に０．０５ｍＬずつ供給した。すなわち、カゼインは、ＨＩＶ抗原１μｇに対して０．６１８ｍｇ添加されることとなる。

なお、ＨＩＶ抗原１μｇに対するカゼインの添加量は、具体的には以下のようにして求められる。

・１ウェル当たりに供給したカゼイン量
＝３．４ｍｇ／ｍＬ×０．０５ｍＬ＝０．１７ｍｇ
・１ウェル当たりに供給した混合液中におけるＨＩＶ抗原の合計濃度
＝５．５μｇ／ｍＬ
・１ウェル当たりのＨＩＶ抗原の合計担持量
＝５．５μｇ／ｍＬ×５０μＬ＝０．２７５μｇ
・１ウェルにおけるＨＩＶ抗原１μｇ当たりのカゼイン量
＝０．１７ｍｇ÷０．２７５μｇ＝０．６１８ｍｇ
そして、各ウェル内に、抗ＨＩＶ抗体に結合する抗体（抗ＩｇＧ抗体）を担持したハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズ（青色着色粒子）を含有する試薬を供給した。

なお、試薬中のハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの含有量は、０．１ｗｔ％とした。また、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズは、平均粒径５．８μｍ、比重１．１３ｇ／ｃｍ^３であった。

＜４＞ 次に、各ウェル内におけるハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（比較例１Ａ）
前記工程＜２＞において、陰性血清および陽性血清に、それぞれリン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝生理食塩液のみを添加して１００倍に希釈することにより陰性検体液および陽性検体液を調製した以外は、前記実施例１Ａと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。
これらの結果を、図５に示す。

図５に示すように、実施例１Ａでは、陰性検体液は、いずれも陰性と判定すべき結果であり、陽性検体液は、陽性と判定するべき結果であった。

これに対して、比較例１Ａでは、陰性検体液および陽性検体液のいずれもが陽性と判定すべき結果となった。

また、参照液では、実施例１Ａおよび比較例１Ａのいずれの場合も、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの沈降・凝集が確認された。この結果から、血清中には、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの沈降・凝集を阻害する物質が存在することが判る。

（実施例１Ｂ）
検体液として陰性検体液のみを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（実施例２Ｂ）
カゼインに代えて、キモトリプシノーゲンＡを用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（実施例３Ｂ）
カゼインに代えて、ラクトフェリンを用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（実施例４Ｂ）
カゼインに代えて、アルブミンを用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（実施例５Ｂ）
カゼインに代えて、オボアルブミンを用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（比較例１Ｂ）
前記工程＜２＞において、陰性血清にリン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝生理食塩液を添加して１００倍に希釈することにより陰性検体液を調製した以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（比較例２Ｂ）
カゼインに代えて、チロシンを用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

（比較例３Ｂ）
カゼインに代えて、ミオグロビンを用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。

なお、チロシンおよびミオグロビンは、いずれも阻害物質に対する親和力が、ＨＩＶ抗原より低いものである。

これらの結果を、図６に示す。
図６に示すように、各実施例では、いずれも陰性と判定すべき結果であった。

特に、実施例１Ｂ（カゼイン）、実施例３Ｂ（ラクトフェリン）および実施例５Ｂ（オボアルブミン）では、青色着色粒子の凝集がより明確に確認できた。
これに対して、各比較例では、いずれも陽性と判定すべき結果となった。

なお、タンパク質として、カゼイン、オボアルブミン、アルブミン、ラクトフェリンおよびキモトリプシノーゲンＡのうちの任意の２種以上を組み合わせて、前記と同様の判定を行ったところ、前記と同様の結果が得られた。

本発明の判定キットが備えるプレートを模式的に示す斜視図である。 本発明の判定方法を説明するための模式図である。 本発明の判定方法を説明するための模式図である。 本発明の判定方法を説明するための模式図である。 実施例１Ａおよび比較例１Ａにおける判定結果を示す写真である。 実施例１Ｂ〜５Ｂおよび比較例１Ｂ〜３Ｂにおける判定結果を示す写真である。

符号の説明

１ 着色粒子
１０ プレート
１０１ ウェル
１０２ ＨＩＶ抗原
１０３ 抗ＨＩＶ抗体
１０４ 抗ＩｇＧ抗体
１０５ 阻害物質
１０６ タンパク質

Claims (8)

1. 生体がＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）に感染したか否かを判定する判定方法であって、
   内面にＨＩＶ抗原を担持したウェル内に、前記生体から採取した試料を含有する検体液を供給する第１の工程と、
   前記ウェル内に、抗ＩｇＧ抗体を担持した粒子を含有する試薬を供給する第２の工程と、
   抗ＨＩＶ抗体がＨＩＶ抗原に結合し、さらに該抗ＨＩＶ抗体に前記抗ＩｇＧ抗体が結合することにより、前記ウェル内において前記粒子がウェル内面に吸着し分散した状態となった場合を陽性と判定し、一方、前記ウェル内において前記粒子が沈降・凝集した場合を陰性と判定する第３の工程とを有する判定方法であって、
   前記第１の工程に先立って、前記試料中に含まれ、前記ＨＩＶ抗原と前記抗ＩｇＧ抗体とに結合することにより、前記粒子の沈降を阻害する阻害物質に対する親和力が、前記ＨＩＶ抗原より高いタンパク質を含有する拮抗剤を、前記検体液中に添加することを特徴とする判定方法。
2. 前記タンパク質は、カゼイン、オボアルブミン、アルブミン、ラクトフェリンおよびキモトリプシノーゲンのうちの少なくとも１種である請求項１に記載の判定方法。
3. 前記粒子は、着色されている請求項１または２に記載の判定方法。
4. 前記粒子の比重は、前記第３の工程において、前記ウェル内に存在する液体の比重より大きい請求項１ないし３のいずれかに記載の判定方法。
5. 前記拮抗剤は、さらに、非イオン性界面活性剤を含有する請求項１ないし４のいずれかに記載の判定方法。
6. 前記ウェルの底面は、収斂形状をなしている請求項１ないし５のいずれかに記載の判定方法。
7. 前記試料は、血清であり、
   前記検体液は、該血清を２〜１０００倍に希釈したものである請求項１ないし６のいずれかに記載の判定方法。
8. 請求項１ないし７のいずれかに記載の判定方法に用いられる判定キットであって、
   内面に前記ＨＩＶ抗原を担持した前記ウェルを複数有するプレートと、
   前記着色粒子を含有する試薬と、
   前記タンパク質を含有する拮抗剤とを有することを特徴とする判定キット。

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