JP2007099780A - 療法に対する腫瘍細胞の感受性の増大 - Google Patents

Abstract

【課題】癌の療法の効果を増大させる方法。
【解決手段】突然変異した療法感作遺伝子活性を有する腫瘍細胞に野生型の療法感作遺伝子活性を付与し、そして腫瘍細胞に癌の療法、たとえば化学療法、放射線療法、生物学的療法（免疫療法を含む）、寒冷療法および高熱療法を施すことによる、癌の療法の効果を増大させる方法。
【選択図】図１

Description

本発明は癌の療法に関するものである。本発明は特に癌の治療効果を高める方法に関するものである。

癌の治療の主力は手術、放射線療法、化学療法および生物学的療法である（全般的に以下を参照されたい：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，編者ムーサー（Ａ．Ｒ．Ｍｏｏｓｓｏｒ）ら（ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス，１９９１）；Ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，編者デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｔ．ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｓａｍｕｅｌ Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ），第４版（フィラデルフィア：Ｊ．Ｂ．リッピンコット・カンパニー，１９９３））。放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ、ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙとも言われる）は、正常組織に対する許容線量を越えない高エネルギーのＸ線、電子線、放射性同位体、および当業者に既知の他の形の放射線を用いて癌細胞を殺すものである。

化学療法とは薬物を用いて癌細胞を殺すことを意味する。異なる作用様式をもつ幾つかの群の化学療法薬がある。たとえば多くの代謝拮抗薬は正常な細胞成分と構造的に類似し、正常な細胞プロセスを阻害することによりそれらの効果を及ぼす。多くのアルキル化剤は増殖性および非増殖性の癌細胞集団に対して有効である。一般にこれらの薬物は種々の様式で細胞のＤＮＡと結合して、的確な複製および／または転写を阻害する。多くの抗腫瘍性抗生物質はそれ自身をＤＮＡに挿入し、そこでＤＮＡの破壊を誘発するか、または転写を阻害する。一般にアルカロイドは細胞分裂に必要な染色体紡錘体の機能を阻害する。ホルモン薬、たとえばタモキシフェンおよびフルタミドは、ある癌の増殖を阻害する。ただしそれらの作用メカニズムは完全には分かっていない。

一般に生物学的療法は宿主の生物学的プロセスに由来するか、またはそれを有益な形で模倣した物質を利用する。インターフェロン−αおよびインターロイキン−２は癌の治療に現在用いられている生物学的療法薬の２例である。

ある癌の療法には標準的治療法の効果を高めるために変更剤を用いる（全般的に以下を参照されたい：コールマン、グローバー、タリシ（Ｃｏｌｅｍａｎ ＣＮ，Ｇｌｏｖｅｒ ＤＪ，Ｔｕｒｒｉｓｉ ＡＴ）,“放射線および化学療法の感作薬および保護薬”，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，フィラデルフィア：ＷＢ ソーンダース，２２５−２５２，１９８９）。変更剤は通常はそれ自身は細胞毒性でなく、標準的療法、たとえば放射線療法に対する腫瘍組織の応答性を変更または増大させる。感作剤の有効性は一般に感作増大比（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｒａｔｉｏ，ＳＥＲ）として表される。ＳＥＲは、増感剤なしで一定水準の細胞死を生じるのに必要な治療用量を、増感剤を併用して同水準の細胞死を得るのに必要な治療用量で割ったものである。

放射線療法および化学療法の改良のための臨床的方法の２例は、低酸素性−細胞感作（ｈｙｐｏｘｉｃ−ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）およびチオール枯渇である。放射線およびアルキル化剤により生じる損傷は一部はＤＮＡおよび他の重要な細胞性高分子における遊離基形成に関係する。チオール化合物はＤＮＡ遊離基を阻止し、またはそれらを修復する。ＤＮＡ遊離基が酸素または酸素に類する低酸素性−細胞感作剤、たとえばニトロイミダゾールに暴露されると、ＤＮＡに対する損傷が固定され、すなわち酸化によって不可逆的となる。ブトニンスルホキシミン（ＢＳＯ）などの薬物によるチオール枯渇も、放射線および放射線様作用性化学療法薬、たとえばアルキル化剤による毒性を増大させる。

［発明の概要］
本発明は、野生型の療法感作遺伝子（ｔｈｅｒａｐｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ）活性の喪失を特色とする、癌の治療方法である。本方法は、腫瘍細胞に野生型の療法感作遺伝子活性の供給源を導入し、そして細胞に癌の療法を施すことを含む。本発明によってその効果が高められる癌の療法には放射線療法、化学療法、生物学的療法−免疫療法、寒冷療法および高熱療法を含む−が含まれるが、これらに限定されない。本発明により治療しうる癌には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：癌腫、肉腫、中枢神経系腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、造血系癌、卵巣癌、骨原性肉腫、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、膵癌、胃癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、尿生殖器癌、および頭頚部癌。

したがって本発明は、野生型の療法感作遺伝子活性を喪失していることを特色とする腫瘍細胞に野生型の療法感作遺伝子活性の供給源を付与し、そして腫瘍細胞に癌の療法を施すことにより癌の療法の効果を高める方法である。

“付与（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）”とは、薬物を哺乳動物に投与するための、当業者に既知の方法を採用することを意味する。これらの方法には、遺伝子または遺伝子のｃＤＮＡをベクターに挿入して腫瘍細胞に付与すること、遺伝子または遺伝子のｃＤＮＡをウイルスキャプシドと結合させることにより腫瘍細胞に付与すること、遺伝子または遺伝子のｃＤＮＡをリガンドと結合させることにより、またはリポソームに封入することにより腫瘍細胞に付与すること、腫瘍細胞遺伝子の点突然変異または挿入突然変異または欠失突然変異を組換え法により補正すること、あるいは蛋白質を直接に、またはハイブリッド分子中において、または封入法により細胞に付与することが含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞内に野生型の療法感作遺伝子活性を存在させる結果をもたらす他の物質および方法、たとえば以下に記載されるものも採用しうる：サムブルック、フリッチュおよびマニアチス（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９、ならびにオースベル(Ａｕｓｕｂｅｌ)ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４。これらが本明細書に参考として含まれるものとする。

“療法感作遺伝子”とは、それの正常な機能または調節の喪失により癌細胞が療法に対してより耐性となる遺伝子または遺伝子生成物を意味する。療法感作遺伝子機能を修復すると、療法に対する癌細胞の感受性が高まる。特にそれはアポトーシスを促進するか、またはその機能もしくは調節の変化が腫瘍化および療法耐性に寄与する遺伝子を意味し、これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：腫瘍サプレッサー遺伝子、たとえばｐ５３；細胞周期調節遺伝子、たとえばサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(スチール(Ｓｔｅｅｌ，Ｍ.)，Ｌａｎｃｅｔ ３４３：９３１−９３２，１９９４)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ブレニス（Ｂｌｅｎｉｓ，Ｊ．），Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８８９−５８９２，１９９３：マーシャル(Ｍａｒｓｈａｌｌ,Ｃ.Ｊ.)，Ｎａｔｕｒｅ，３６７：６８６，１９９４)、細胞周期遺伝子の阻害物質、たとえばｐ１６(多重腫瘍サプレッサー１(ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ １))(カム(Ｋａｍｂ)ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：４３６−４９０，１９９４)；およびアポトーシス遺伝子、たとえばｆａｓ。

有望な療法感作遺伝子は、療法感作遺伝子ｐ５３につき本発明の詳細な記述に示した方法で、ｐ５３をその有望な遺伝子で置き換えることにより同定しうる。たとえば腫瘍細胞をまず、ルーティンな配列分析または当業者に既知である他の診断アッセイ法により、試験すべき候補となる療法感作遺伝子をコードする遺伝子が突然変異したものまたはメッセンジャーＲＮＡが突然変異したものを含むことを解明する。次いでその遺伝子に対する正常な野生型コード配列を当業者に既知の標準法で、選択マーカー遺伝子、たとえばネオマイシン耐性遺伝子を含む適切な真核細胞発現ベクター中へサブクローニングする。たとえば正常なコード配列を正常な線維芽細胞のメッセンジャーＲＮＡ集団のｃＤＮＡから、コード配列の３′および５′末端に適切なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができる。適切な真核細胞性発現ベクター中へのサブクローニング後に、問題となっている正常な候補となる療法感作遺伝子を含むこのベクターを、突然変異した形の遺伝子を発現している腫瘍細胞中へトランスフェクションすることができる。トランスフェクションは当業者に既知の多数の方法で行うことができ、これにはリン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション（カチオン性リポソームを用いる）、エレクトロポレーションおよびＤＥＡＥ−デキストラン促進トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。トランスフェクションした細胞を適切な選択試薬、たとえばネオマイシンの存在下で拡張する。クローンが拡張および選択された時点で、それらを１）候補となる療法感作遺伝子の発現を証明するために当業者に既知のルーティンな方法で解明し、そして２）化学療法薬および／または放射線療法に対する感受性につき、ｐ５３に関する本発明の詳細な記述に記載した標準的増殖アッセイ法またはクローン原性アッセイ法により試験する。候補となる療法感作遺伝子を発現する多数のクローンにおいて母腫瘍細胞と比較して感受性が増大している場合、そのトランスフェクションした遺伝子は療法感作遺伝子であることが示される。

“野生型の療法感作遺伝子活性”とは、正常な非新生細胞における療法感作遺伝子の活性を意味する。詳細には、それは療法感作遺伝子によりコードされる蛋白質または蛋白質の一部が腫瘍細胞を癌の療法に対して感作する能力を意味する。それの療法感作能に影響を及ぼさない“突然変異”を１または２以上含む療法感作蛋白質も、本発明の目的にとって“野生型”とみなされる。その活性は、野生型の療法感作遺伝子のコード配列またはその一部から発現する蛋白質に具体化される。

“野生型の療法感作遺伝子活性の喪失”とは、正常な療法感作遺伝子活性の不在または変化、たとえば細胞内に突然変異型の療法感作蛋白質が存在すること、野生型の療法感作蛋白質が存在しないこと、または野生型の療法感作蛋白質が阻害されていることを意味する。正常なものとの療法感作活性の相異は、１または２以上の遺伝子座における遺伝子の相異により起こる可能性がある。遺伝子の相異には幾つかの異なるタイプがあり、これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：１塩基対が他の塩基対に変化した点突然変異、１もしくは２以上の塩基対の挿入、１もしくは２以上の塩基対から療法感作遺伝子の全長にまで及ぶ欠失、１遺伝子と他の遺伝子の融合、既存の療法感作遺伝子の付加的コピーの導入、以前は存在しなかった非−療法感作遺伝子のコピー１もしくは２以上の導入、当業者に既知の他の遺伝子転写、翻訳および蛋白質機能の変化、または上記のいずれかの組み合わせ。

“腫瘍細胞”とは、インビボで動物に生じる、組織の望ましくない増殖、または異常な存続もしくは異常な浸潤を起こしうる細胞を意味する。

本発明は好ましい態様においては、野生型の療法感作蛋白質の療法感作部分を腫瘍細胞に導入し、そしてその腫瘍細胞に癌の療法を施す。

“野生型の療法感作蛋白質の療法感作部分”とは、野生型の療法感作蛋白質において、突然変異した療法感作活性を発現する腫瘍細胞を癌の療法に対して感作する能力をもつ部分を意味する。野生型の療法感作蛋白質の療法感作部分は当業者に既知のルーティンな配列分析により確認することができる。これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：欠失突然変異、点突然変異、ならびにウンガー（Ｕｎｇｅｒ）ら，“転写調節、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）阻害、およびトランスフォーメーション抑制に関与する野生型および突然変異型の療法感作蛋白質の機能性ドメイン”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５１８６−９４，１９９４、ならびにサムブルック、フリッチュおよびマニアチス（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９、ならびにオースベル(Ａｕｓｕｂｅｌ)ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４。これらが本明細書に参考として含まれるものとする。

本発明は他の好ましい態様においては、野生型の療法感作遺伝子、そのｃＤＮＡ、またはその療法感作遺伝子活性をコードする部分を腫瘍細胞に導入し、療法感作遺伝子を発現させ、そしてその腫瘍細胞に癌の療法を施す。

さらに他の好ましい態様においては、療法感作遺伝子、そのｃＤＮＡ、またはその一部を、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびパピローマウイルスベクターよりなる群から選ばれるウイルスベクター（これらに限定されない）により腫瘍細胞に導入する。療法感作遺伝子、そのｃＤＮＡ、またはその一部は、ポリリシンを介してウイルスのキャプシドもしくは粒子に結合させるか、またはアシアログリコプロテインなどのリガンドに結合させ、またはリポソームに封入することにより、腫瘍細胞に導入することもできる。動物への導入手段には直接注射、またはエーロゾル化製剤、動脈内注入、腔内注入および静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。

場合により、突然変異した、または異常な療法感作活性が異常に増大した遺伝子発現または遺伝子生成物活性を反映する可能性があり、これらはトランスドミナント陰性突然変異または当業者に既知の他のダウンレギュレーション法によりダウンレギュレーションすることができる。

本発明の他の特色および利点は以下の本発明の詳細な記述および請求の範囲から明らかであろう。

［発明の詳細な記述］
本発明は、腫瘍細胞から失われている療法感作活性の供給源を腫瘍細胞に導入することにより（遺伝子、ｃＤＮＡまたは蛋白質の導入により）癌の療法の効果を高める新規な方法である。それらの活性の例にはｆａｓ遺伝子、網膜芽腫遺伝子、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子および他の腫瘍サプレッサー遺伝子、細胞周期調節遺伝子およびアポトーシス遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

ヒトの癌に対する腫瘍感作遺伝子ｐ５３の関連
突然変異、欠失または不活性化による正常なｐ５３機能の喪失は、ヒトの癌において極めて頻繁に遭遇する変化の１つであり、ヒトの癌のほぼ５０％に起こる（ニグロ（Ｎｉｇｒｏ）ら，“ｐ５３遺伝子における突然変異は種々のヒト腫瘍タイプに起こる”，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：７０５−７０８（１９８９）；タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら，“ｐ５３：肺癌における遺伝子異常の頻繁な標的”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：４９１−１９４（１９８９））。さらに、ｐ５３の遺伝性突然変異を伴う個体は種々の癌を生じやすいことを幾つかの研究が示唆している（マーキン（Ｍａｌｋｉｎ）ら，“乳癌、肉腫その他の新生物の家族性症候群における生殖細胞系ｐ５３突然変異”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１２３３−１２３８（１９９０）；スリバスタバ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）ら，“リー−フラウメニ症候群を伴う癌傾向家族における突然変異ｐ５３遺伝子の生殖細胞系伝達”，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：７４７−７４９（１９９０）：リー（Ｌｉ）ら，“２４人の血族における癌家族症候群”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８：５３５８−５３６２（１９８８））。これらの個体の腫瘍は野生型ｐ５３対立遺伝子を喪失していることが示され、これは網膜芽腫その他の腫瘍における網膜芽腫サプレッサー遺伝子のヘテロ接合性の喪失を連想させる（ヌッソン（Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ａ．Ｇ．）“突然変異と癌：網膜芽腫の統計学的研究”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６８：８２０−８２３（１９７１）；カミングズ（Ｃｏｍｉｎｇｓ，Ｄ．Ｅ．）“発癌の一般論”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７Ｕ：３３２４−３３２８（１９７３））。

多様な腫瘍細胞系に野生型ｐ５３遺伝子をインビトロ導入すると培養において細胞増殖がダウンレギュレーションされ、またはインビボでの細胞の再移植に際して腫瘍形成性表現型が抑制されることを幾つかの研究が示している。これらの研究には以下のものが含まれる：神経膠芽腫由来の腫瘍細胞（マーセル（Ｍｅｒｃｅｒ）ら，“ヒト野生型ｐ５３を条件付き発現する神経膠芽腫腫瘍細胞系における負の増殖調節”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７：６１６６−６１７０（１９９０））、結腸癌（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ら，“野生型ｐ５３によるヒト結腸直腸癌細胞増殖の抑制”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：９１２−９１５（１９９０）、骨肉腫（ディラー（Ｄｉｌｌｅｒ）ら，“骨肉腫における細胞周期制御蛋白質としてのｐ５３の機能”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：５７７２−５７８１（１９９０）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら,“ヒトｐ５３遺伝子による腫瘍抑制の遺伝的メカニズム”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１７５６−１５８０（１９９０））、白血病（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら，“ヒト野生型ｐ５３遺伝子による急性リンパ芽球性白血病の抑制”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：２２２−２２６（１９９２））、および肺癌（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら,“野生型ｐ５３は多重遺伝子病変を伴うヒト肺癌細胞の増殖を抑制するが、突然変異ｐ５３は抑制しない”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２３４０−２３４３（１９９２））。しかし野生型ｐ５３遺伝子を非悪性細胞にインビトロ導入しても、腫瘍細胞系に見られるような細胞増殖低下は生じない（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ら，前掲）。

ｐ５３突然変異を伴う腫瘍細胞すべてが野生型ｐ５３の発現によって著しい増殖ダウンレギュレーションを示すわけではない。ヒンズ（Ｈｉｎｄｓ）ら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｔｉｏｎ １：５７１−８０（１９９０）は、必ずしもすべてのｐ５３突然変異体が同等な表現型を生じるわけではないことを示している。ミカロビッツ（Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｔｚ）ら，Ｃｅｌｌ６２：６７１−６８０（１９９０）は、ある突然変異体は増殖調節に関して野生型ｐ５３に対し優性である可能性があることを示している。野生型ｐ５３の発現は、ある腫瘍細胞系の増殖性には影響を及ぼさない。これにはヒトパピローマウイルス発現細胞系、およびＡ６７３横紋筋肉腫細胞（チェン（Ｃｈｅｎ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１７９９−１８０５，１９９１）が含まれる。ｐ５３が細胞増殖を抑制したと報告された例では、効果は時に小さいことがあった（チェン（Ｃｈｅｎ）ら，１９９２，前掲）。

さらに、腫瘍細胞をダウンレギュレーションするために野生型ｐ５３を単独で用いる方法は、腫瘍細胞において安定な野生型ｐ５３の発現を必要とする。ｐ５３の温度感受性突然変異体の研究に際して、野生型ｐ５３がトランスフォームした細胞の増殖に及ぼす抑制効果は野生型ｐ５３の発現が停止した時点で失われるのが観察された(ミカロビッツ（Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｔｚ）ら，１９９０，前掲)。現在用いられている大部分の有効な遺伝子伝達方法は一時的なｐ５３発現をもたらすにすぎないので、これはｐ５３単独による療法の効果を制限する。

ｐ５３の機能は著しく複雑であり、以下を含めた多様な細胞プロセスに関与している：増殖（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：９１２−９１５，１９９０；ミカロビッツ（Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｔｚ）ら，Ｃｅｌｌ ６２：６７１−６８０，１９９０）、分化（シャウルスキー（Ｓｈａｕｌｓｋｙ）ら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：８９８２−８９８６（１９９１）、プログラミングされた細胞死（すなわちアポトーシス）（ヨニシュ−ルーチ（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：３４５−３４７，１９９１）、細胞老化（シェイ（Ｓｈａｙ）ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９６：３３−３９，１９９１）、ＤＮＡの結合（ケルン（Ｋｅｒｎ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１７０８−１７１１，１９９１；バルゴネッチ（Ｂａｒｇｏｎｅｔｔｉ）ら，Ｃｅｌｌ ６５：１０８３−１０９１，１９９１）、およびＤＮＡ損傷により誘導されるＧ１期停止（カスタン（Ｋａｓｔａｎ）ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：６３０４−６３１１，１９９１；クルビッツ（Ｋｕｅｒｂｉｔｚ）ら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７４９１−７４９５，１９９２）。癌の療法に関して、ＤＮＡ損傷により誘導されるＧ１期停止におけるｐ５３の改善が、療法の最も興味ある役割の１つである。

野生型および突然変異型のｐ５３遺伝子を、内因性ｐ５３を欠如する腫瘍細胞に導入した。これらの細胞をガンマ線で照射すると、野生型ｐ５３の発現はＧ１／Ｓ期境界での一時的な細胞周期停止状態になる（カスタン（Ｋａｓｔａｎ）ら，“ＤＮＡ損傷に対する細胞応答へのｐ５３蛋白質の関与”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：６３０４−６３１１（１９９１）；クルビッツ（Ｋｕｅｒｂｉｔｚ）ら，“野生型ｐ５３は照射後の細胞周期チェックポイント決定基である”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７４９１−７４９５（１９９２）；ヨニシュ−ルーチ（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ）ら，“野生型ｐ５３がインターロイキン−６により阻害された骨髄性白血病細胞のアポトーシスを誘導する”，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：３４５−３４７（１９９１））。ｐ５３を欠如するか、または突然変異ｐ５３を発現する細胞は、停止しなかった（カスタン（Ｋａｓｔａｎ）ら，前掲；クルビッツ（Ｋｕｅｒｂｉｔｚ）ら，前掲）。

ｐ５３はＤＮＡ損傷が修復されるまでＳ期に入るのを阻止する重要なチェックポイント機能を果たすということが提唱された（フォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）ら，Ｃｅｌｌ ７０：５２３−５２６，１９９２）。したがってＤＮＡ損傷を与える放射線または化学療法が癌細胞にもたらす結果は、突然変異ｐ５３または野生型ｐ５３の発現により影響される可能性がある。

これに関して、野生型ｐ５３機能を喪失した癌細胞はＤＮＡ損傷を与える薬物および放射線に対して、より感受性が高いことを幾つかの系統の証拠が示唆している。酵母における類似のチェックポイントとの相似性によれば、ｐ５３誘導Ｇ１期停止の欠損は、細胞分裂前に行われる致死的ＤＮＡ損傷の修復を阻害することにより細胞破壊を促進する可能性がある（フォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）ら，前掲）。

フォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）ら，前掲，は以下のように述べている： 腫瘍細胞はＤＮＡ損傷を与えるもの、たとえば放射線療法および化学療法に用いられるものに対して、より感受性であることが多い；この感受性はｐ５３機能の喪失がもたらす有益な副作用であり、これがなければ細胞の死が制限されるであろう。したがってｐ５３突然変異は抗腫瘍薬に対する細胞の感受性を低下させるのではなく増大させる幾つかの変化の１つをなす。

この見解は、突然変異ｐ５３遺伝子伝達に伴って放射線および化学療法に対する腫瘍細胞の感受性が増大することを証明する研究により支持される（ペティ（Ｐｅｔｔｙ）ら，“ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子生成物の発現は化学的感受性の決定因子である”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９９：２６４−２７０，１９９４，先行技術とは認められない）。

しかしｐ５３ヌルトランスジェニックマウス由来の正常な造血細胞、線維芽細胞および胃腸細胞につき実施した他の研究は、アポトーシスにｐ５３が必要であることを示した（ローウェ（Ｌｏｗｅ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８４７−８４９，１９９３；クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８４９−８５２，１９９３；ローテムおよびザクス(Ｌｏｔｅｍ Ｊ，Ｓａｃｈｓ Ｌ)，Ｂｌｏｏｄ，８２：１０９２−１０９６，１９９３；ローウェ（Ｌｏｗｅ）ら，Ｃｅｌｌ ７４：９５７−９６７，１９９３；およびメリット（Ｍｅｒｒｉｔｔ）ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：６１４−６１７，１９９４，先行技術とは認められない）。これらの研究においては、ｐ５３を欠如する正常細胞は放射線またはＤＮＡ損傷を与える薬物に暴露されたのちのアポトーシスに対して、より耐性であった。同様にバーキットリンパ腫細胞系の研究により、野生型ｐ５３遺伝子配置をもつ若干の細胞（すべてではない）が放射線に対して、より感受性であることを明らかにした（オコンナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ）ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：４７７６−４７８０，１９９３，先行技術とは認められない）。しかし頭頚部癌細胞系の評価は、放射線感受性と内因性野生型ｐ５３または突然変異ｐ５３との関連を示さなかった（ブラッハマン（Ｂｒａｃｈｍａｎ）ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３６６７−３６６９，１９９３，先行技術とは認められない）。

ローウェ（Ｌｏｗｅ）ら，“ｐ５３依存性アポトーシスは抗癌薬の細胞毒性に類似する”Ｃｅｌｌ，７４：９５７−９６７，１９９３（先行技術とは認められない）は以下のように述べている： ｐ５３欠失マウス胚線維芽細胞を用いて、広範な群の抗癌薬に対する細胞感受性および耐性におけるｐ５３の必要性を系統的に調べた。それらの結果は、腫瘍遺伝子、特にアデノウイルスＥＩＡ遺伝子は電離性放射線、５−フルオロウラシル、エトポシドおよびアドリアマイシンにより誘導されるアポトーシスに対して線維芽細胞を感作しうることを証明する。さらに、死のプログラムを効果的に執行するためにはｐ５３腫瘍サプレッサーが必要である。

ローテムおよびザクス（Ｌｏｔｅｍ，Ｓａｃｈｓ），“野生型ｐ５３を欠失するマウスに由来する造血細胞はいくつかの薬剤によるアポトーシス誘導に対して、より耐性である”Ｂｌｏｏｄ，８２：１０９２−１０９６（１９９３）（先行技術とは認められない）は以下のように述べている： 正常な線維芽細胞において、照射およびＤＮＡ損傷を与える他の薬剤は野生型ｐ５３の発現を誘導し、この野生型ｐ５３発現の誘導が細胞をＧ１期の制御時点に停止させる。ＤＮＡ損傷の伝播を阻止するためにＤＮＡ複製の開始前にＤＮＡを修復するのに、このＧ１期停止が必要であることが示唆された。ｐ５３欠失マウス由来の線維芽細胞はこのＧ１期制御を喪失し、照射後に細胞周期を継続し、したがってＤＮＡ損傷が伝播された。我々の得た結果は、生存力因子が高濃度である条件下では野生型ｐ５３の有無によってマウスの骨髄性コロニー形成細胞数に差がなかった。しかし骨髄前駆細胞が低濃度の生存力因子、たとえばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６もしくはＳＣＦを含むにすぎない場合、またはこれらの細胞において照射もしくは熱ショックによりアポトーシスを誘導した場合、ｐ５３欠失マウス由来の細胞の方が高い生存力を備えていた。ｐ５３欠失につきホモ接合性のマウスとヘテロ接合性のマウスとを比較すると、アポトーシス誘導に対する耐性の増大には野生型ｐ５３の１対立遺伝子の喪失で十分であることが示された。ｐ５３欠失マウスの方がアポトーシスの誘導に対する耐性が高いことは照射された胸腺細胞においても認められたが、グルココルチコイドであるデキサメタゾンで処理した胸腺細胞、または成熟した腹腔顆粒球においては認められなかった。照射した骨髄前駆細胞および胸腺細胞における耐性の程度は野生型ｐ５３の投与量に関係していた。

このように、突然変異および野生型ｐ５３が化学療法および放射線感受性に及ぼす影響はこれら従来の研究からははっきりせず、またこれらの従来の研究はいずれも内因性突然変異ｐ５３を発現している腫瘍細胞の治療感受性に野生型ｐ５３遺伝子伝達が及ぼす影響に向けたものではない。

癌の療法の効果の増大
本発明は、腫瘍細胞に療法を施す前に野生型の療法感作遺伝子活性の供給源を腫瘍細胞に導入することにより癌の療法の効果を増大させるための新規方法である。療法感作遺伝子の例としてｐ５３を用いると、本発明は以下に従って実施することができる：
まず患者の腫瘍がｐ５３突然変異を含むことを標準的診断法により判定する。次いで野生型ｐ５３活性、たとえばｐ５３蛋白質の療法感作活性を示す部分、またはｐ５３蛋白質のその部分をコードする遺伝子発現ベクターを腫瘍細胞に導入する。これによって、ｐ５３突然変異を含む腫瘍細胞は野生型ｐ５３活性期間中に施された癌療法に対して、より感受性となる。この方法で効果を高めることができる癌療法には、放射線療法、化学療法、生物学的療法、たとえば免疫療法、寒冷療法および高熱療法が含まれるが、これらに限定されない。

突然変異した療法感作遺伝子活性、たとえば突然変異ｐ５３蛋白質を含む細胞においては、修復されないＤＮＡ損傷がＳ期への進行を遮断せず、またはアポトーシスを始動させない可能性がある。本発明者らは、いかなる理論にも拘束されないが、内因性の突然変異した療法感作遺伝子活性をもち、かつ野生型ｐ５３の遺伝子または蛋白質を再生された腫瘍細胞は、ゲノム損傷および修復プロセスの過負荷または障害があるとすれば、療法様式によるアポトーシスの誘導に対して特に感受性であると考える。腫瘍細胞中に野生型の療法感作遺伝子活性が存在すると、それらの細胞はこれらのＤＮＡ損傷を与える薬剤に対して、また恐らくアポトーシスを誘導しうる他の多様な療法様式に対しても感作されるであろう。

ｐ５３感作療法と他の療法を組み合わせる方法は、いずれか単独の療法より効果的である。外因性の野生型ｐ５３活性を腫瘍細胞に導入すると、細胞を死滅させるのに必要な薬物または放射線の量が少なくなり、薬物または放射線を投与しても毒性を生じない療法ウインドウ濃度を高めることができる。腫瘍抑制のためには持続的なｐ５３遺伝子発現が必要であるｐ５３遺伝子療法単独と対比して、ｐ５３感作療法と他の療法との組み合わせ効果によれば、腫瘍細胞を死滅させる処置期間中、一時的に腫瘍細胞中に野生型ｐ５３蛋白質の療法感作部分が存在する必要があるにすぎない。この方法は生物学的療法の効率も改善する。これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：免疫療法、たとえば受動免疫療法（たとえば抗体）；活性化された免疫系のエフェクター細胞を投与する養子免疫療法；抗腫瘍免疫を誘導するための免疫化を伴う能動免疫療法；種々のサイトカイン（インターロイキン、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子、腫瘍増殖因子、インターフェロン、増殖因子、たとえばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦが含まれるが、これらに限定されない）により仲介される療法であって、これらのサイトカインに対する、またはこれらのサイトカインにより活性化される免疫系のエフェクターメカニズムに対する腫瘍細胞の感受性を高めることによる療法。さらに、本発明のｐ５３仲介による感作療法は、細胞毒性免疫細胞（細胞毒性Ｔ細胞、リンホカイン活性化キラー細胞、天然キラー細胞、マクロファージ、単球および顆粒球が含まれるが、これらに限定されない）による死滅に必要なアポトーシス経路の再生により、腫瘍細胞を免疫系に対するより良い標的となす。

療法感作活性は野生型ｐ５３遺伝子／蛋白質の部分に例示される。療法感作部分は当業者に既知のルーティンな突然変異分析、たとえば点突然変異および欠失突然変異により確認することができる。

癌の療法を増強するために野生型の療法感作遺伝子生成物活性を模倣した小型の分子を用いることもでき、これにはペプチド、修飾したペプチド、または有機化合物が含まれるが、これらに限定されない。他の有用な物質には、突然変異した療法感作遺伝子の生成物に結合してその遺伝子生成物の野生型療法感作活性を確立する立体配置の変化を誘導するアロステリック調節剤として作用する小型の分子が含まれる。

ｐ５３または他の療法感作遺伝子の突然変異は、検査した癌の実質的にすべてに見られたので、本発明は著しく広範な用途をもつ。好ましい態様においては、野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を、現在利用しうる遺伝子付与用ベヒクルによって直接付与することにより、局在化した腫瘍を治療することができる。これにはｐ５３アデノウイルスベクターの感染、ｐ５３レトロウイルスベヒクルパッケージング系列の移植、または結合コンプレックス中のアデノウイルスキャプシドにより促進させたｐ５３ ｃＤＮＡのトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。遺伝子伝達ベクターを腫瘍部位に蓄積しうるターゲティング法の開発に伴って、この方法は散在性癌にも拡大することができる。他の遺伝子発現ベクター系を利用することもでき、これにはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）または直接ＤＮＡ注射が含まれるが、これらに限定されない。当業者に既知の他の遺伝子伝達および発現方法も利用しうる。療法感作遺伝子ｐ５３につき以下に示す例を、当業者は癌の治療のために他の療法感作遺伝子にも適用することができる。

実施例１．腫瘍細胞へのｐ５３遺伝子の伝達
野生型ｐ５３遺伝子またはその遺伝子の一部をベクター中において、その遺伝子が染色体外に残留するように導入することができる。染色体外にある野生型ｐ５３遺伝子またはその遺伝子の一部から野生型ｐ５３蛋白質が発現される。

あるいは野生型ｐ５３遺伝子を、細胞中に存在する内因性突然変異ｐ５３遺伝子を置換するように腫瘍細胞中へ導入することができる。この方法によればｐ５３遺伝子突然変異が補正されるであろう（レベット（Ｒｅｖｅｔ）ら，“ＲｅｃＡ蛋白質コーティングした短いＤＮＡプローブによる同種ＤＮＡターゲティング、および線状二重らせん分子上における電子顕微鏡マッピング”,Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３２（３）：７７９−９１，１９９３；トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら，“胚幹細胞における配列置換ベクターを用いた高精度遺伝子ターゲティング”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２（７）：２９１９−２３，１９９２；マンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら，“同種組換えによるマウスｉｎｔ−２遺伝子座中へのｌａｃＺリポーター遺伝子の導入”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７（１９）：７６８８−９２，１９９０；キャペチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）,“同種組換えによるゲノムの変更”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１２８８−９２，１９８９；セディビイおよびジョイナー（Ｓｅｄｉｖｙ，Ｊｏｙｎｅｒ），“Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ”，Ｗ．Ｈ．フリーマン発行，１９９２；本明細書に参考として引用する）。

ｐ５３遺伝子伝達のための好ましいベクターは、標的細胞集団内のすべてまたは大部分の細胞に遺伝子を伝達し、かつ目的とする効果を促進するのに十分なほど長い発現期間および十分なほど高い発現水準で達成する能力をもつ。可能なベクター設計および遺伝子伝達方法には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
１）アデノウイルスベクター。アデノウイルスベクターはレトロウイルスベクターより高い力価のものが得られ、より高い遺伝子付与効率が得られる可能性がある。それらは分裂している細胞および分裂していない細胞の両方の広範な細胞タイプに感染しうるという点で、特に関心がもたれる（グラハム、プレベック（Ｇｒａｈａｍ ＦＬ，Ｐｒｅｖｅｃ Ｌ），アデノウイルスベクターの取り扱い，ムレイ（Ｍｕｒｒａｙ ＥＪ）編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”ｖｏｌ．７，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，クリフトン，ニュージャージー；ザ・ヒューマナ・プレス・インコーポレーテッド（１９９１），ｐｐ．１０９−１２８；本明細書に参考として引用する）。これらのベクターはウイルスの複製に必要な初期領域遺伝子の一部が、目的とするトランスジーン（すなわち細胞に伝達すべき外因性遺伝子）で置換される。失われた複製機能を供給する適切なパッケージング細胞系内へ、このＤＮＡをトランスフェクションすることにより、ウイルス粒子が得られる。そのようなベクターの例は文献に記載されている（ベルナー（Ｂｅｒｎｅｒ ＫＬ），“異種遺伝子の発現のためのアデノウイルスベクターの開発”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６６１６−６２９；本明細書に参考として引用する）。肝癌および頭頚部癌には動脈内注入が適切であろうが、これらに限定されない。

２）レトロウイルスベクター。これらのベクターはヒト遺伝子の伝達に極めて良好な特性をもち、遺伝子療法プロトコールに用いられている（ウー（Ｗｕ）ら，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６：１４３３８−１４３４２，１９９１；本明細書に参考として引用する）。レトロウイルスベクターは伝達すべき目的遺伝子（すなわちトランスジーン）を含む変更レトロウイルスゲノム、およびしばしば選択マーカー遺伝子からなる。ベクター自体は遺伝子の安定な組込みに必要なウイルスＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）配列を提供するが、複製に関しては欠失性であり、トランス作用性複製因子を提供するパッケージング細胞系を必要とする。レトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞系の例は文献に記載されている（クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ）（１９９０），“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ストックトン・プレス，ニューヨーク、およびジョリー（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５１−６４，１９９４；本明細書に参考として引用する）。ｐ５３レトロウイルスベクターは文献に記載されている（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９２）“ヒト野生型ｐ５３遺伝子による急性リンパ芽球性白血病の抑制”,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２２２−２２６；本明細書に参考として引用する）。

レトロウイルスベクターは細胞タイプに関して広範な感染性をもつ。トランスジーン発現は通常は、広範な組織特異性をもつ強力なウイルスプロモーターにより駆動される。その例はウイルスＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターである（ミラーおよびロスマン（Ｍｉｌｌｅｒ ＡＤ，Ｒｏｓｍａｎ ＧＪ），“遺伝子の伝達および発現のための改良されたレトロウイルスベクター”，（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；本明細書に参考として引用する）。

ｐ５３レトロウイルスベクターを分泌するパッキング細胞系を腫瘍部位に移植して、レトロウイルス遺伝子伝達の効率を高めることができる。この細胞系は連続的なベクター供給源を提供し、遺伝子伝達の効率を改良する（クルバー、ラム、ウォールブリッジ、イシイ、オールドフィールド、ブレーゼ（Ｃｕｌｖｅｒ ＫＷ，Ｒａｍ Ｚ，Ｗａｌｌｂｒｉｄｇｅ Ｓ，Ｉｓｈｉｉ Ｈ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ ＥＨ，Ｂｌａｅｓｅ ＲＭ），実験的脳腫瘍の治療のためのレトロウイルスベクター産生細胞を用いたインビボ遺伝子伝達，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１５５０−２）。

３）アデノ随伴ウイルス。アデノ随伴ウイルスに基づくベクターはアデノウイルスがもつ範囲の感染性をもつ。さらに、これらのベクターは宿主ゲノムの好みの部位に外因性ＤＮＡを安定に組み込む可能性をもたらす。そのようなベクターについての考察は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”ｖｏｌ．１５８，（ムジツカ（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ）編），スプリンガー・フェルラーク，ｐｐ．９７−１２９（１９９２）に見られ、これを本明細書に参考として引用する。

４）他のウイルスベクター。ヘルペス、ワクシニア、パピローマウイルスに基づくベクターも遺伝子を腫瘍細胞に伝達するために使用しうる。これらのベクターについての考察はクリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ），“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ストックトン・プレス，ニューヨーク（１９９０）、およびジョリー（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ），“遺伝子療法のためのウイルスベクター”Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１：５１−６４（１９９４）に見られ、これを本明細書に参考として引用する。

５）結合したアデノウイルスキャプシド。外因性ＤＮＡをアデノウイルスキャプシドにより腫瘍細胞に伝達することができる。この方法では伝達すべきＤＮＡをウイルスキャプシドの外側にポリリシン橋により結合させる（キュリー（Ｃｕｒｉｅｌ）ら，“ＤＮＡ−ポリリシンコンプレックスに結合したアデノウイルスにより仲介される高効率遺伝子伝達”（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１４７−１５４；本明細書に参考として引用する）。細胞内へのＤＮＡの進入は天然のウイルスインターナリゼーション経路により達成されるが、遺伝子の伝達および発現はウイルスゲノムとは無関係である。たとえばｐ５３遺伝子をアデノウイルスのキャプシドに結合させ、次いでこれを受容体介在性エンドサイトーシスにより肺癌細胞内へ付与することができる。したがってこの方法ではウイルス粒子は感染のためのベヒクルとしてではなく、ＤＮＡトランスフェクションのためのキャリヤーとして利用される。この方法で、特にウイルスとＤＮＡのコンプレックスが付加的リガンド、たとえばトランスフェリン（これに限定されない）を含む場合、遺伝子伝達の高効率を達成しうる（ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら，“トランスフェリン−ポリリシン／ＤＮＡコンプレックスへのアデノウイルスの結合は、トランスフェクションした遺伝子の受容体介在性遺伝子付与および発現を大幅に高める”，（１９９２）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０９９−６１０３；本明細書に参考として引用する）。標的組織へのコンプレックスの蓄積を促進するために、組織および細胞タイプに特異性のリガンドを含んでもよい。

６）他の方法。リポソーム仲介による遺伝子伝達はインビボ遺伝子伝達に有効である（チュー（Ｚｈｕ）ら，“マウス成体に静脈内ＤＮＡ付与したのちの全身的な遺伝子発現”，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−１１；ヨシムラ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ）ら，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：３２３３−３２４０；本明細書に参考として引用する）。ＤＮＡ−リポソームコンプレックスを局所的または全身的に投与することができる。この方法の利点は、低毒性であること、およびウイルスゲノムが存在しないことである。適切なプロモーター（たとえばＣＭＶプロモーター）を選ぶと、長期間の発現を達成しうる（チュー（Ｚｈｕ）ら，“マウス成体に静脈内ＤＮＡ付与したのちの全身的な遺伝子発現”，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−１１；本明細書に参考として引用する）。

さらに、トランスジーン発現を特定の細胞タイプにターゲティングするためにリガンド−ＤＮＡコンジュゲートが用いられている。たとえばアシアログリコプロテイン−ＤＮＡコンジュゲートが、アシアログリコプロテイン受容体を介して外因性遺伝子を肝細胞に特異的にターゲティングするために用いられている。ある組織、たとえば筋肉（これに限定されない）には裸のＤＮＡの直接遺伝子伝達も有効であろう。当業者がこれらの遺伝子伝達方法を単独で、または組み合わせて用いて、野生型ｐ５３遺伝子または他の療法感作遺伝子の、療法感作活性をコードする部分を腫瘍内で発現させることができる。

実施例２．腫瘍細胞へのｐ５３蛋白質の導入
野生型ｐ５３蛋白質、または野生型ｐ５３蛋白質の療法感作活性をもつ部分を、突然変異ｐ５３対立遺伝子を保有する細胞に供給することができる。これはインビボでいくつかの方法により達成され、これらには静脈内、腫瘍内、動脈内、腔内またはくも膜内注入が含まれるが、これらに限定されない。エーロゾル化製剤は呼吸管への付与に用いることができ、また局所製剤も使用しうる。有効分子をマイクロインジェクション、リポソームまたはエレクトロポレーションなどの方法で細胞に導入することもできる。ｐ５３蛋白質を受容体介在性エンドサイトーシスにより腫瘍細胞に導入することもできる。あるいはｐ５３蛋白質を細胞が能動的に取り込み、または拡散により取り込み、細胞にｐ５３活性を再生することができる。

ｐ５３とターゲティング配列を含むキメラ蛋白質を用いて、ターゲティング配列の受容体を保有する細胞に野生型ｐ５３活性を導入することができる。たとえばインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）のターゲティング特異性を利用して、ｐ５３蛋白質をＩＧＦ−Ｉ受容体またはＩＬ−２受容体保有細胞に付与することができる。キメラ蛋白質は組換え法によりキメラｃＤＮＡを構築し、それらを原核細胞系または真核細胞系において発現させることにより得られる。
したがってｐ５３を、肺癌細胞の特異的細胞表面受容体に結合する増殖因子ＩＧＦ−Ｉにキメラ化した場合、このキメラ蛋白質を受容体介在性エンドサイトーシスにより肺癌細胞にターゲティングすることができる。

実施例３．薬剤の投与
本発明方法を実施するに際しては、組成物、たとえば前記の実施例１および２に述べたものを単独で、または互いに組み合わせて、または他の治療薬もしくは診断薬と組み合わせて使用しうる。これらの組成物をインビボでヒト患者に、またはインビトロで使用しうる。インビボで使用する際には、組成物を患者に多様な様式で投与することができ、これらには非経口、静脈内、皮下、筋肉内、結腸、直腸、膣、鼻、経口、経皮、局所、眼、腹腔内、腔内、くも膜下に、または適切に配合された外科用移植体として多様な投与形態を用いる様式が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の組成物の投与量は目的とする効果および適応症に応じて広範に及びうる。当業者に自明のとおり、有用なインビボ投与量および個々の投与方式は患者の状態、治療すべき癌、および用いる個々の組成物に応じて異なるであろう。有効な投与水準、すなわち目的とする結果を達成するために必要な投与水準は当業者が容易に判定しうるであろう。一般に投与は低い方の投与水準から開始し、目的とする効果が達成されるまで投与水準を高める。

有効な付与のためには薬剤が腫瘍細胞に侵入する必要がある。化学的修飾は透過に必要なすべてであってよい。ただしそのような修飾が不十分であったとしても、修飾された薬剤を透過促進剤、たとえばアゾン（Ａｚｏｎｅ）またはオレイン酸（これらに限定されない）と共に、リポソーム中に配合することができる。リポソームは徐放性をもたらすベヒクルであって、修飾された薬剤および透過促進剤がリポソームからトランスフェクションされた細胞内へ伝達されるものでもよい。あるいはリポソームのリン脂質が修飾された薬剤および透過促進剤と共に直接に細胞への付与に関与してもよい。

薬物付与ベヒクルを全身または局所投与に使用しうる。薬剤の局所投与が有利である。これによって全身吸収を最少にして投与部位に局所濃縮することができるからである。これによって疾患部位への薬剤の付与方式が簡略化され、中毒性の程度が低くなる。さらに、物質の投与量は他の投与経路に必要なものよりはるかに少ない。

薬剤を全身投与することもできる。全身吸収とは、薬物が血流中に蓄積され、次いで全身に分散することを意味する。全身吸収をもたらす投与経路には経口、静脈内、動脈内、リンパ管内、皮下、腹腔内、鼻内、筋肉内、くも膜下および眼内が含まれるが、これらに限定されない。これらの投与経路はいずれも到達可能な組織を薬剤に暴露する。皮下投与は局所リンパ節に流入し、これによってリンパ網を通して循環系に進入する。循環系への進入速度は分子量または大きさの関数であることが示されている。腹腔内投与も循環系に進入し、薬剤付与ベヒクルコンプレックスの分子量または大きさが進入速度を制御する。

薬物付与ベヒクルは徐放性のレザバーとして作用するように、またはそれらの内容物を直接に標的細胞に付与するように設計することができる。直接付与型の薬物ベヒクルを用いる利点は、１回のベヒクル取込み事象当たり多数の分子が付与されることである。それらのベヒクルは、他の場合には血流から急速に消失する薬物の循環半減期を高めることも示されている。このカテゴリーに属するこのような特殊な薬物付与ベヒクルの若干の例にはリポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ポリマー（外科用移植片またはナノカプセル）、および生体接着性マイクロスフィアが含まれるが、これらに限定されない。

リポソームは幾つかの利点をもたらす：それらは一般に無毒性かつ生物分解性の組成をもち；それらは長い循環半減期を示すことができ；また組織のターゲティングのための認識分子を容易にその表面に付着させることができる。最後に、脂質懸濁液または凍結製品の形のリポソーム系薬剤を安価に製造しうることは、この技術が許容しうる薬剤付与システムとして存続しうることを証明する。

経口投与配合物は幾つかの形態で製造することができ、これにはカプセル剤、そしゃく錠、腸溶コーチング錠、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、または投与前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適した固体の形のものが含まれるが、これらに限定されない。適切な賦形剤は、たとえば水、食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システインなどである。さらに所望により、薬剤組成物は少量の無毒性補助物質、たとえば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤などを含有しうる。所望により吸収促進製剤（たとえばリポソーム）を使用しうる。

実施例４．化学療法に対する腫瘍細胞の感受性の増大
１）細胞。Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞（マーセル（Ｍａｒｃｅｒ）ら“ヒト野生型ｐ５３を条件付き発現する神経膠芽腫腫瘍細胞系における負の増殖調節”，（１９９０）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７：６１６６−６１７０）をＡＴＣＣから入手し、３７℃で１０％ＣＯ₂中において、１０％の熱不活性化したウシ胎児血清、ゲンタマイシン、非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを補充したダルベッコの変更イーグル培地中で培養した。これらの細胞は多形性神経膠芽腫を伴う患者の生検により得られたものであり、コドン２３７（ｍｅｔからｉｌｅまで、ＡＴＧからＡＴＡまで）にホモ接合性突然変異を含むことが示された（ウルリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）ら，“ヒト野生型ｐ５３はインビボで神経膠芽腫細胞の増殖停止期間中、特異なコンホメーションおよびリン酸化の状態を とる”（１９９２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７（８）：１６３５−４３）。

２）プラスミド。野生型ｐ５３遺伝子およびネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子を含むプラスミド（ｐＬｐ５３ＲＮＬ）を用いた。プラスミドｐＬｐ５３ＲＮＬはＤｒ．マーチン・ハース（カリフォルニア大学、サンディエゴ）により好意的に提供され、これは先に文献に記載されている（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら，“ヒト野生型ｐ５３遺伝子による急性リンパ芽球性白血病の抑制”（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：２２２−２２６）。このプラスミドはレトロウイルス配列Ｌｐ５３ＲＮＬを保有し、これにおいて野生型ｐ５３発現はモロネー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲにより駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターにより駆動される。

３）トランスフェション。プラスミドをカチオン性リポソームによりＴ９８Ｇ細胞に導入した。Ｔ９８Ｇ細胞を１０ｃｍの培養皿内に平板当たり５×１０⁵個接種した。翌日、細胞に１５μｇのＤＮＡをリポフェクタミン（ＢＲＬ）により、製造業者の指示に従ってトランスフェションした。トランスフェションの５日後に、培養物を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択した。クローンを約３週間後に採取し、拡張させた。増殖動態および平板効率を測定する前に、培養物をＧ４１８の不在下で７−１０日間、増殖適応させた。１コロニーが外因性の野生型ｐ５３遺伝子を含むので、これをＴ９８Ｇｐ５３と表示する。

３）平板効率。細胞を６ｃｍの平板当たり１００−５００個の低密度で３重に接種し、２週間増殖させた。平板をメタノール中の０．５％メチレンブルーで染色し、コロニーを計数した。トランスフェションした細胞の平板効率は２０％であった。母細胞は平板効率５０％であった。

４）抗生物質Ｇ４１８の不在下で２週間適応させた対照の母体Ｔ９８Ｇ細胞およびＴ９８Ｇｐ５３細胞を、２４ウェルのプレートに２×１０⁴個／ウェルで接種した。翌日、それらを１時間、１０μＭから４０μＭまで１０μＭずつ増大する種々の濃度のシスプラチン（化学療法薬）に暴露した。１時間後にシスプラチンを除去し、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）と交換し、細胞を７日間増殖させた。７日後に細胞を計数し、またはクリスタルバイオレットで染色した。後者の場合、５４０ｎｍにおける吸収は細胞生存力に比例する。クローン原性アッセイのために、細胞を処理後に６ウェルプレートに５００−１０００個／ウェルで再接種した。７−１０日後に０．５％メチレンブルー、７０％ＥＴＯＨ中で染色することによりクローンを計数した。ｐ５３トランスフェション体と母体Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞とから得たコロニー数を比較した。図１に示すように、Ｔ９８Ｇｐ５３細胞の方が母体Ｔ９８Ｇ細胞よりシスプラチンの作用に対してかなり感受性であった。後続アッセイによりこの感受性の増大を確認した。コロニー数の５０％減少を達成するのに必要なシスプラチンの濃度は、Ｔ９８Ｇ母細胞および空のベクター形質導入細胞の場合の約３０μＭから、野生型ｐ５３遺伝子形質導入細胞の場合の約１５−２０μＭに低下した。

実施例５．放射線療法に対する腫瘍細胞の感受性の増大
対照の母体Ｔ９８Ｇ細胞およびＴ９８Ｇｐ５３細胞をＧ４１８の不在下で２週間増殖させ、次いでＴ２５フラスコ当たり約５，０００個で接種した。翌日、細胞をコバルト６０源からのγ線により、１００ラドから１５００ラドまで１００ラドずつ増大する線量で照射した。次いで細胞をさらに５−１２日間インキュベートし、コロニーを０．５％メチレンブルー−メタノール中で染色し、計数し、対照の非処理細胞と比較した。図２に示すように、野生型ｐ５３を形質導入したＴ９８Ｇｐ５３細胞は放射線に対して増大した感受性を示し、コロニー数の５０％減少は母細胞の４００ラドと比較して約２００ラドで起こった。

実施例６．ｐ５３遺伝子感作療法
以下に記載する処理を突然変異ｐ５３活性をもつ腫瘍に適用する。

１．ｐ５３異常を含む腫瘍の同定
ｐ５３異常を含む腫瘍を同定するために、ルーティンな分子生物学的診断法を用いることができ、これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：一本鎖コンホメーション多形（ＳＳＣＰ）、ＰＣＲ、配列決定法、および遺伝子異常を検出するための、当業者に既知の関連する分子生物学的方法（“Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，１９９４；およびサムブルック、フリッチュ、マニアチス（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９；参考として本明細書に引用する）。

２．直接注射またはエーロゾル化製剤によるｐ５３ベクターを用いた腫瘍感作
この適用に際しては、適切な野生型ｐ５３ベクターおよび／または産生細胞系を腫瘍に、または外科的切除もしくは剥離後の過去の腫瘍部位に（残留腫瘍細胞を処理するために）注射し、腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を発現させる。エーロゾル化したベクター製剤も切除部分または呼吸管内の腫瘍に野生型ｐ５３遺伝子を付与するために使用しうる。次いで患者を、腫瘍の治療に適した当業者に既知の化学療法、放射線療法、生物学的療法、寒冷療法または高熱療法で、下記に従って治療する：“Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ”，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット、１９９３；“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＯｎｃｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット、１９９３；および“Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”，デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）ら編、リッペンコット、１９９１；参考として本明細書に引用する）。

この方法は局所原発腫瘍の治療に用いることができ、これには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：中枢神経系腫瘍、肉腫、および初期癌腫（肺癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、肝細胞癌、膵癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肛門癌、頭頚部癌、胆道癌および尿生殖器癌）。

この方法はこれらおよび他の腫瘍の転移性病変の治療にも用いることができる。これらの適用に際しては、適切な野生型ｐ５３ベクターおよび／または産生細胞系を転移性腫瘍に、または外科的切除もしくは剥離後の過去の転移性腫瘍部位に注射し、腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を発現させる。エーロゾル化したベクター製剤も切除部分または呼吸管内の腫瘍に野生型ｐ５３遺伝子を付与するために使用しうる。次いで患者を、腫瘍の治療に適した当業者に既知の化学療法、放射線療法、生物学的療法、寒冷療法または高熱療法で、下記に従って治療する：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット，１９９３；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”，デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）ら編、リッペンコット、１９９１；参考として本明細書に引用する）。

３．動脈内注入によるｐ５３ベクターを用いた腫瘍感作
動脈内注入用の化学療法薬および他の薬物を、多様な原発癌および転移性癌の治療に用いることができる（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット）。このｐ５３療法感作法の適用に際しては、これらの動脈内注入法を用いて適切な野生型ｐ５３ベクターおよび／または産生細胞系を付与し、腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を発現させる。次いで患者を、原発または転移性腫瘍の治療に適した当業者に既知の化学療法、放射線療法、生物学的療法、寒冷療法または高熱療法で、下記に従って治療する：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”，デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）ら編、リッペンコット、１９９１；参考として本明細書に引用する）。この方法は原発性肝細胞癌腫、転移性肝癌および頭頚部腫瘍などの腫瘍の治療に適用することができるが、これらに限定されない。この方法は動脈注入の分野の専門家が、注入可能な動脈管につきいかなる腫瘍の治療にも適用することができる。

４．腔内注入によるｐ５３ベクターを用いた腫瘍感作
これらの適用に際しては、腫瘍細胞を含む体腔に、適切な野生型ｐ５３ベクターおよび／または産生細胞系をまず付与し、腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を発現させる。次いで患者を、原発または転移性腔内腫瘍の治療に適した当業者に既知の化学療法、放射線療法、生物学的療法、寒冷療法または高熱療法で、下記に従って治療する：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”，デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）ら編、リッペンコット、１９９１；参考として本明細書に引用する）。

この方法は悪性の胸膜浸出液腫瘍（胸膜腔）、腹水腫瘍（腹腔）、軟髄膜腫瘍（脳脊髄／脳室系）、心膜浸出液癌（心膜腔）および膀胱癌（膀胱注入）の治療に適用することができるが、これらに限定されない。

５．ｐ５３感作による造血幹／前駆細胞の腫瘍のパージ
この適用に際しては、患者を骨髄抑止／切除式癌療法の影響から救済するために、自己造血幹／前駆細胞から使用前に残留腫瘍細胞をｐ５３感作によりパージする。造血幹／前駆細胞試料を標準法により患者から採取し（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”，フォルマン（Ｆｏｒｍａｎ）ら編，１９９３；参考として本明細書に引用する）、ｅｘ ｖｉｖｏで適切な野生型ｐ５３ベクターおよび／または産生細胞系形質導入し、野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を発現させる。次いで形質導入した細胞調製物を当業者に既知の細胞毒性パージ法で処理する（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”，フォルマン（Ｆｏｒｍａｎ）ら編，１９９３；参考として本明細書に引用する）。

次いで患者を骨髄抑止／切除式癌療法で治療し、次いで残留腫瘍細胞をｐ５３感作によりパージじた造血幹／前駆細胞を患者に注入して、極めて攻撃的な癌療法の骨髄抑止の影響から患者を救済する。

骨髄抑止／切除式治療の実施および造血幹／前駆細胞注入による救済は先行技術に十分に述べられており、多様な充実性および造血系の悪性疾患の治療に用いられている（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウイッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”，フォルマン（Ｆｏｒｍａｎ）ら編，１９９３；参考として本明細書に引用する）。残留腫瘍細胞を細胞毒性パージ剤により破壊するためにｐ５３感作すると、患者の救済に用いられる造血幹前駆細胞注入液中の腫瘍細胞の数が減少するであろう。これにより、残留腫瘍細胞を含有する造血幹／前駆細胞調製物の注入により起こる可能性のある腫瘍再発の可能性が低下するであろう。

６．ｐ５３感作による散在性転移性腫瘍の治療
これらの適用に際しては、適切な野生型ｐ５３ベクターおよび／または産生細胞系を全身的または非経口的に注射し、腫瘍細胞に野生型ｐ５３遺伝子の療法感作活性をコードする部分を発現させる。次いで患者を、転移性腫瘍の治療に適した当業者に既知の化学療法、放射線療法、生物学的療法、寒冷療法または高熱療法で、下記に従って治療する：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ(Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ)編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“ＢｉｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”，デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）ら編、リッペンコット、１９９１；参考として本明細書に引用する）。

上記に概説したｐ５３仲介による感作療法の個々の適用を組み合わせて用いることができ、これは多重様式の癌療法の技術分野における専門家が下記に従って適用することができる：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，デビタ、ヘルマン、ローゼンバーグ（Ｄｅｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）編、リッペンコット；およびＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ウィッテス（Ｗｉｔｔｅｓ）編、リッペンコット；および“Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅ ｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”，デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）ら編、リッペンコット、１９９１；参考として本明細書に引用する）。

７．ｐ５３仲介感作療法による多形神経膠芽腫の治療
多形神経膠芽腫は最も頻繁に遭遇する頭蓋内脳腫瘍であり、米国では毎年ほぼ２０，０００の新たな症例が診断されている。それは中枢神経系の外へはめったに転移しないが、それにもかかわらず最も悪性の神経膠星状細胞腫であり、現行の一般的方法を用いる医師の療法を撃退する。これらの方法には外科処置、放射線療法および化学療法が含まれ、あらゆる分野で進歩が得られてはいるが、診断からの平均生存時間はなおわずか１年である。神経膠芽腫は放射線療法に対してかなり耐性であり、大部分の化学療法薬に対してわずかしか応答しない。最初はある程度の有効性をもつことが示されたこれらの化学療法薬−−シスプラチン、ＢＣＮＵ（カルムスチン）およびＰＶＣ（プロカルバジンＣＣＮＵ、ビンクリスチン）を含む−−のうちに持続的有効性を示すものはない。

それらが脳内に位置するため、神経膠芽腫患者においては中程度の腫瘍進行であっても病的状態が高い。腫瘍体積のわずかな減少が患者にとって有益な効果があると期待される。さらに、神経膠芽腫は中枢神経系の外へ転移することはまれであり、このためこの疾患は、腫瘍部位におけるｐ５３保有アデノウイルスの局所感染、またはアデノウイルスキャプシドで促進されたｐ５３ ｃＤＮＡの局所トランスフェクション、またはｐ５３保有ウイルスベクターパッケージング系列の移植を含めた局所遺伝子伝達にとって理想的な標的となる。またこの方法は、腫瘍体積のわずかな減少ですら病的状態の減少が生じる他の癌の脳内転移にとっても有益であろう。

８．ｐ５３仲介感作療法による肝細胞癌および頭頚部癌の治療
肝細胞癌および頭頚部癌はｐ５３突然変異の頻度が高い（最高３０％）ことを特色とし、アデノウイルス系ｐ５３仲介感作療法および関連のｐ５３仲介感作療法にとって卓越した標的である。ｐ５３ベクターを動脈内付与すると、高い効率で腫瘍内へ野生型ｐ５３療法感作活性を付与することができる。しかし多くの場合は、臨床効果を得るためにｐ５３遺伝子を全身付与する必要はない。肝細胞癌および頭頚部癌は神経膠芽腫と同様に局所的に病的状態を生じる場合が多いからである。ｐ５３突然変異を伴う結腸直腸癌および他の腫瘍の肝臓転移も、ｐ５３ベクターの動脈内注入により治療し、次いで癌治療の分野の専門家に既知である適切な腫瘍療法により治療することができる。

９．ｐ５３仲介感作療法による肺癌の治療
肺上皮もアデノウイルス系ｐ５３仲介感作療法にとって卓越した標的である。最初は化学療法に著しく感受性である小細胞性肺癌が疾患の進行に伴って耐性を獲得する。野生型ｐ５３の導入は、腫瘍細胞を療法に対して感作することにより、この腫瘍の治療に利用しうる。同様にほぼ５０％の症例においてｐ５３突然変異を特色とする非−小細胞性肺癌はしばしば化学療法に対して抵抗性である。したがってｐ５３仲介感作療法をこれらの腫瘍の治療に用いることができる。

実施例７．療法感作活性をもつ小型分子のスクリーニング
療法感作性をもつ小型分子は、候補となる小型分子を含有しない対照溶液に対比してそれらが癌治療効率を高めうることにより同定される。それぞれの候補分子を、細胞系、動物モデルおよび制御された臨床研究において癌療法を感作する効率につき、当業者に既知の、かつ食品医薬品局が承認した方法、たとえば連邦官報４７（ｎｏ．５６）：１２５５８−１２５６４，１９８２年３月２３日、に公布された方法（これに限定されない）で試験する。療法感作活性または増強活性をもつ小型分子を、野生型の療法感作活性をもつ蛋白質につき先に記載した方法を採用した癌療法に用いることができる。小型分子は投与後に容易に組織内へ拡散するので、この方法を他の療法と併用して、局在化した腫瘍および転移性腫瘍の両方を治療することができる。

野生型の療法感作活性を模倣した、またはそれを与える小型分子は、適切な標的を用いる結合アッセイによりスクリーニングすることができる（ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．），“ペプチドライブラリー、基準および動向”，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：２３５−２３９，１９９３参照）。ペプチド、修飾ペプチドまたは有機化合物の組合わせライブラリーは当業者に既知の方法で形成することができる（ジャヤリクレーム（Ｊａｙａｔｉｃｋｒｅｍｅ）ら，“多用途ペプチドライブラリーの形成および機能スクリーニング”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１６１４−１６１８；ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．），“ペプチドライブラリー、基準および動向”,Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：２３５−２３９，１９９３；フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら，“移行状態の解明；阻害薬類似体および酵素構造の変更を組み合わせた新規方法”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，３１（４）：９５９−６３；アイヒラーおよびホーテン（Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ），“合成ペプチド組み合わせライブラリーのスクリーニングによる基質類似トリプシン阻害薬の同定”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１１０３５−１１０４１，１９９３；ハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら，“単鎖抗体の医療応用”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，１０（２−３）：１９５−２１７；ファン・デ・ウォータービームド（Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ Ｈ．），“ＱＳＡＲ技術における最近の進歩”，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１９９３，９（３−４）：２７７−８５）。

推定小型分子は同様に機能に関する生物学的アッセイ法で分析することができる。具体例においては、ペプチドをコードおよび発現するレトロウイルスベクターライブラリーを療法感作活性につき、前記実施例に記載した方法およびグッドコブ（Ｇｕｄｋｏｖ）ら，１９９３，“ヒトトポイソメラーゼＩＩ ＣＤＮＡからの、トポイソメラーゼＩＩ作用性細胞毒性薬物に対する耐性を誘導する遺伝子サプレッサー要素の単離”，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３２３１−３２３５（参考として本明細書に引用する）により、直接にスクリーニングすることができる。

実施例８．推定される療法感作分子の毒性試験
前記のいずれかの方法において活性である薬剤が健康な細胞に対してほとんど、または全く作用しないか否かを判定する方法を提供する。次いでそれらの薬剤を薬剤学的に許容しうる緩衝剤または標準的な動物試験に用いられる緩衝剤中に配合する。

“薬剤学的に許容しうる緩衝剤”とは、貯蔵および後続の投与のために調製される、薬剤学的に許容しうるキャリヤーまたは希釈剤中における薬剤学的に有効な量の本明細書に記載する薬剤を含む薬剤組成物に使用しうる任意の緩衝剤を意味する。療法用として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤は当技術分野で周知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マック・パブリシング・コーポレーション（ジェナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編，１９８５）に記載されている。防腐薬、安定剤、色素、さらには矯味矯臭薬を薬剤組成物に含有させることができる。たとえば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを防腐薬として添加することができる。同上、１４４９に。さらに、酸化防止剤および懸濁化剤を使用しうる。同上。

Ａ．毒性に関する追加のスクリーニング：方法１
療法感作活性をもつと同定された薬剤を培養ヒト細胞に対する毒性に関して評価する。この評価は生細胞が２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホニルフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド］（以下、ＸＴＴと呼ぶ）を還元する能力に基づく（パウル（Ｐａｕｌｌ）ら，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｌ．Ｃｈｅｍ．２５：７６３−７６７（１９８７）；ウイスロウ（Ｗｉｓｌｏｗ）ら，（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８１：５７７）。生存力のある哺乳動物細胞はＸＴＴのテトラゾール環のＮ−Ｎ結合を還元開裂してＸＴＴホルマザンを形成しうる。死細胞またはエネルギー代謝が損傷を受けた細胞はこの開裂反応を行うことができない。開裂の程度は被験生細胞数に正比例する。

ヒト細胞系由来の細胞、たとえばＨｅＬａ細胞を、９６ウェルのミクロタイタープレートのウェルにウェル当たり１０³個で０．１ｍｌの細胞培地（１０％ウシ胎児血清を補充した変更ダルベッコ最小必須培地）中に接種する。３７℃で９５％空気、５％ＣＯ₂の雰囲気中における培養によりプレートに付着させる。一夜培養したのち、被験物質の溶液を８回の半１０進（ｈａｌｆ−ｄｅｃａｄｅ）対数希釈である濃度で２重にウェルに添加する。平行して、被験物質の溶解に用いた溶剤を他のウェルに２重に添加する。細胞培養を一般に２４時間続ける。その期間が終了した時点でＸＴＴおよびカップラー（硫酸メチルフェナゾニウム）を被験ウェルそれぞれに添加し、さらに４時間インキュベーションを続けたのち、各ウェルの光学濃度を４５０ｎｍで自動プレート読取り装置により測定する。哺乳動物細胞を死滅させ、またはそれらのエネルギー代謝に損傷を与え、またはそれらの増殖を遅延させる物質を、被験物質を添加しなかったウェルと比較した４５０ｎｍにおけるウェルの光学濃度の低下により判定する。

Ｂ．毒性に関する追加のスクリーニング：方法２
療法感作分子を培養ヒト細胞系に対する細胞毒作用に関して、細胞生存力の指示体としての蛋白質中への³⁵Ｓメチオニンの取り込みにより試験する。ＨｅＬａ細胞を９６ウェルのプレート内で、１０％ウシ胎児血清ならびに５０μｇ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ最小必須培地中において増殖させる。細胞をまず１０³個／ウェル、０．１ｍｌ／ウェルで接種する。細胞を療法感作分子に暴露せずに４８時間増殖させ、次いで培地を除去し、完全培地中に調製した療法感作分子の種々の希釈液を各ウェルに添加し、対照ウェルにはサイトカインモジュレーターを添加しない。細胞をさらに４８−７２時間インキュベートする。培地を２４時間毎に交換し、同濃度の療法感作分子を含有する新鮮な培地と入れ替える。次いで培地を除去し、抗真菌薬を含有しない完全培地と入れ替える。細胞を療法感作分子の不在下で２４時間インキュベートし、次いで蛋白質中への³⁵Ｓの取込みにより生存力を推定する。培地を除去し、メチオニンを含有しない完全培地と入れ替え、３０分間インキュベートする。培地を再度除去し、メチオニンを含有しないが、０．１μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓメチオニンを含有する完全培地と入れ替える。細胞を３時間インキュベートする。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いで細胞を１００％メタノールの添加により１０分間、透過性処理する。氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加してウェルを満たす；プレートを氷上で５分間インキュベートする。このＴＣＡ洗浄をさらに２回反復する。ウェルを再度メタノール中で洗浄し、風乾する。５０μｌのシンチレーションカクテルを各ウェルに添加し、遠心分離によりウェル上で乾燥させる。プレートを用いてＸ線フィルムを露光する。抗真菌薬を含有しないウェルも含めたオートラジオグラムの濃度計走査を用いて、５０％の細胞が生存しえない用量（ＩＤ₅₀）を測定する（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ．Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．（１９８７）．フレッシュニー（Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレーテッド、ニューヨーク）。

実施例９．療法感作分子の投与
本発明は、前記方法で見出した新規な療法感作分子である。本発明は、薬剤学的に許容しうる配合物中に配合した、前記方法で見出した新規な療法感作分子を含有する新規な薬剤組成物をも包含する。

“薬剤学的に有効な量”とは、患者の疾患または状態の１または２以上の症状を軽減する（ある程度は）量を意味する。さらに、“療法上有効な量”とは、真菌性の疾患または状態に付随するか、またはその原因である生理学的または生化学的パラメーターを部分的または完全に正常に戻す量を意味する。一般にそれはそのＥＣ₅₀、ならびに患者の年齢、体格および付随する疾患に応じて、約１ｎｍｏｌ−１μｍｏｌの量である。

引用する刊行物はすべて、各刊行物に挙げられたアミノ酸配列をも含めて、本明細書に参考として含まれるものとする。

他の態様は請求の範囲に包含されるものである。

Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞（黒丸）、および野生型ｐ５３を発現した同細胞Ｔ９８Ｇｐ５３細胞（白丸）のシスプラチン感受性を示す。 Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞（上側の曲線）、およびＴ９８Ｇｐ５３細胞（下側の曲線）の放射線感受性を示す。

Claims (22)

1. 癌の療法の効果を増大させる方法であって：
   野生型の療法感作遺伝子活性を、その野生型の療法感作遺伝子活性の喪失を特徴とする腫瘍細胞に付与し、そして
   腫瘍細胞に癌の療法を施す
   工程を含む方法。
2. 療法感作蛋白質の療法感作遺伝子活性を有する部分を腫瘍細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
3. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分を、腫瘍細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
4. 癌の療法が放射線療法である、請求項１に記載の方法。
5. 癌の療法が化学療法である、請求項１に記載の方法。
6. 癌の療法が生物学的療法である、請求項１に記載の方法。
7. 癌の療法が寒冷療法である、請求項１に記載の方法。
8. 癌の療法が高熱療法である、請求項１に記載の方法。
9. 腫瘍細胞が癌腫細胞、肉腫細胞、中枢神経系腫瘍細胞、黒色腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、造血系腫瘍細胞、卵巣癌細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝細胞癌細胞、神経膠芽腫細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、肛門癌細胞、胆道癌細胞、尿生殖器癌細胞および頭頚部癌細胞よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
10. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分が、ベクター内にある、請求項３に記載の方法。
11. ベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびパピローマウイルスベクターよりなる群から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
12. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分が、ウイルスキャプシドまたはウイルス粒子に結合している、請求項３に記載の方法。
13. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分が、ウイルスキャプシドまたはウイルス粒子にポリリシン橋により結合している、請求項１２に記載の方法。
14. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分が、リポソームに封入されている、請求項３に記載の方法。
15. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分が、リガンドに結合している、請求項３に記載の方法。
16. リガンドがアシアログリコプロテインである、請求項１５に記載の方法。
17. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分を、腫瘍細胞に直接注射またはエーロゾル化製剤により導入する、請求項３に記載の方法。
18. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分を、腫瘍細胞に動脈内注入により導入する、請求項３に記載の方法。
19. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分を、腫瘍細胞に腔内注入により導入する、請求項３に記載の方法。
20. 療法感作遺伝子の療法感作遺伝子活性をコードする部分、またはｃＤＮＡの療法感作遺伝子活性をコードする部分を、腫瘍細胞に静脈内注入により導入する、請求項３に記載の方法。
21. 療法感作遺伝子活性がｆａｓ療法感作活性である、請求項１に記載の方法。
22. 療法感作遺伝子活性がｐ５３療法感作活性である、請求項１に記載の方法。

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