JP2007089536A - Notchリガンドを用いた血管内皮前駆細胞への分化誘導法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】培養されている未成熟幹細胞にNotchリガンドを作用させることを含む、未成熟幹細胞から血管内皮前駆細胞へと分化誘導させる方法。Nochリガンドを高発現する細胞と未成熟幹細胞を隣接した状態で共培養する分化誘導方法、および、分化誘導された血管内皮前駆細胞をを含む、血管治療のための細胞移植療法剤。
【選択図】なし
Description
(1)発生段階における血管発生に対する Notch 信号伝達系の関与については、Notch1, Notch4, Jagged-1, DII-4 遺伝子変異マウスの解析がなされており、発生段階 E10において既に血管構造の異常が発見され、胎児の死亡も確認されている(非特許文献4〜7を参照)。
好ましくは、骨髄未分化細胞はlineage negative cellである。
好ましくは、Notchリガンドを高発現する細胞と未成熟幹細胞とを隣接した状態で共培養する。
好ましくは、本発明の細胞移植療法剤は、虚血性血管疾患の治療のために使用される。
本発明による未成熟幹細胞から血管内皮前駆細胞へと分化誘導する方法は、培養されている未成熟幹細胞にNotchリガンドを作用させることを特徴とする。
血管内皮前駆細胞の分化誘導系は、以下の方法で確立した。
Notch ligandである Jagged-1,DII-1, DII-4を大量発現している細胞を、3T3細胞株にretro-viral遺伝子導入法を用いて各遺伝子を導入して確立した(Hozumi, K. et al., J. Immunol;170;4973-4979;2003)。Notchリガンド遺伝子の導入は、 各々の3T3細胞からRNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いてRNAを分離精製して、特定遺伝子を増幅させる RT-PCR法によって確認した(図1a)。
実施例1に示した血管内皮前駆細胞の分化誘導系を用いて、Notchリガンドの分化誘導性について調べた。マウス骨髄組織から、まだ細胞運命が決定されていないLin (-)細胞(T細胞, B細胞, Macrophage, erythrocyteなど分化した細胞を除いた未分化細胞)を Midi MACS Separatorを用いて分離した。分離方法は、まずマウス骨髄から骨髄細胞を分離後、biotin化した Cocktail 抗体 (B220, CD3, Gr-1, Mac-1, TER-119,BD)を 4℃で20分間反応させた後、 streptoavidin beads (Miltenyi Biotec. )を同じ条件下で反応させた。これらの細胞から、Midi MACS Separatorを用いて未分化細胞 (Lin(-)細胞)を分離した。EPC分化誘導系で分離したLin (-)細胞を4日間培養した後、 RNAをRNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いて精製した。Notch receptorの発現程度をRT-PCR法で確認した結果、リセプター1,2,3,4の発現は、どのNotchリガンドでも変わりがなかった(図2a)。また、培養4日後に細胞の形態変化を顕微鏡で確認した結果、Jagged-1と DII-4で特異的に血管内皮前駆細胞と思われる形態に変化していることが観察された(図2b)。
Notchシグナルにより骨髄未分化細胞を刺激する血管内皮前駆細胞の分化誘導系で、未分化細胞の血管内皮前駆細胞(EPC)への分化の状況を調べた。EPC分化誘導系で4日間培養したLin(-)細胞を、EPCの特異的な分化マーカーであるCD31とFlk-1に対する抗体(BD,E-Bio)をそれぞれ4℃20分間反応させる方法で染色した。さらにstreptoavidin-APC抗体(e-Bio)を同じ方法で反応させた後、FACS分析を行った。その結果、Jagged-1とDII-4により、CD31/Flk-1陽性細胞が対照群より約2倍以上増加していることが見出された(図3)。このことは、NotchリガンドJagged-1とDII-4により、骨髄未分化細胞が血管内皮前駆細胞に分化していることを示す。
実施例1で確立したEPC分化誘導系で得た血管内皮前駆細胞(EPC)の特性分析のために以下の実験を行った。実施例2に記載した分離方法によって精製した骨髄組織由来のLin (-)細胞を4日間 EPC分化誘導系で培養後、EDTA-PBS (Sigma)を用いて細胞を分離させた後、細胞の特性分析を行った。まず、FACS法を用いてEPCの分化マーカーであるCD31と Flk-1 (VEGFR2) の発現を調べ、NotchシグナルのEPC分化マーカーの発現量に対する影響を検討した。EPC分化誘導系で得た細胞1x105個を、抗CD31抗体(BD)と抗Flk-1抗体 (e-Bio)で4℃20分間染色し、FACS分析法を用いて分析した。その結果、図4a
に示すように、Jagged-1とDII-4の誘導系において分化マーカー発現パターン(赤色)が空ベクターの発現パターン(黒色)と比べて右側へシフトしていることが観察された。このことは、Jagged-1とDII-4の誘導系のほうが対照群よりもEPC分化マーカー(CD31, VEGFR2)の平均的な発現量が著しく増加していることを示している。また、RT-PCR法によりEPC分化マーカーのRNA量を測定した結果、Jagged-1とDII-4の誘導系においてCD31と Flk-1(VEGFR2)のmRNA発現が増加していることがわかった(図4b)。また、VE-cadherinのmRNA量の増加も見られた(図4b)。
EPC分化誘導系でのLin(-)細胞のEPCへの分化の程度を調べるために、Ac-LDL導入実験(Takahashi T et al、Nature Med.;5;434-438;1999)を行った。EPC分化誘導系で4日間共培養した骨髄組織由来のLin (-)細胞を、Fibronectinコーティングされている4 chamber(BD)で培養後、Acetyl LDL(red) (Biomedical Technologies Inc.)を導入した。この緑色の蛍光が付着した細胞群に蛍光標識Iso-lectinGS-IB4 (Sigma)を30分間反応させた後、染色された細胞群を高倍率蛍光顕微鏡を用いて観察した。そのうちから高倍率のイメージ写真50枚を無作為に選び、染色された細胞数を数値化した結果、Jagged-1と DII-4のEPC分化誘導系において対照群およびDII-1より多くの細胞が観察され,著しい分化の亢進が認められた(図5)。このことより、NotchシグナルのうちJagged-1とDII-4は強力にEPCへの分化を誘導することができることがEPCの機能的側面からも明らかになった。
実施例1で樹立したEPC分化誘導系で得たEPCの増殖能力を調べた。骨髄組織から得たLin(-)細胞をEPC分化誘導系で4日間共培養した後細胞数を計測したが、細胞数の変化は認められなかった。しかし、これらの細胞をWST法でその増殖能力を調べた結果、Jagged-1群のみ増殖能力の亢進が認められた(図6a)。
実施例1のEPC分化誘導で得た細胞を1%FBSを含む培地で12時間 starvationさせた後、Boydenチェンバーの下方に様々な濃度のVEGF(0, 4, 20, 100 ng/ml, R&D)を添加後、細胞移動を調べる Boyden Chamber Migration実験を行った。その結果、図7に示すように、Jagged-1と DII-4グループで対照群およびDII-1と比較して細胞移動能力がVEGF濃度依存的に増加していることが確認された。
実施例1〜7までの実験結果から、Notchシグナルによって刺激された骨髄組織由来の未分化細胞(Lin(-)細胞)はEPCに分化誘導できているということを確認した。そこで、これらのEPC分化誘導系で得たEPCの血管形成能力をin vivoで調べるために、下肢虚血動物モデルを作成した(Kalka C et al,PNAS;97;3422-3427;2000, Iwaguro H et al、Circulation 105;732-738;2002)。この下肢虚血動物モデルに2.5 x 105のEPCを静脈注射し、下肢の傷害改善程度を肉眼的な観察やMoorLDI (Moor Instruments)を用いて調べた。
実施例8で、EPC分化誘導系で得たEPCは下肢虚血動物モデルで虚血組織の治癒、再生を促進する能力があることが認められたので、さらにそのメカニズムを明らかにするためにEPCの虚血組織内への浸透について調べた。GFPマウス(文献)の骨髄より実施例2に示した方法で未分化細胞(Lin(-)細胞)を分離し、これらの細胞を実施例1に示したEPC分化誘導系で4日間分化誘導した。このGFPマウス由来のEPC2.5x105個を下肢虚血モデルマウスに細胞移植 (下肢虚血モデル作成と同時に静脈注射)を行った。移植1週間後、
虚血部位の組織より10umの切片を作成し免疫染色を行った。組織切片を抗CD31抗体 (purified rat anti-mouse CD31, BD)と4℃で12時間反応させた後、Alexaflour 598 を結合させた抗マウスIgG抗体(Molecular probes)を4℃で1時間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。血管内皮細胞の特異的マーカーであるCD31の組織染色の結果から、下肢虚血モデルマウスの血管内に導入されたGFPマウス由来のEPCは対照群およびDII-1よりJagged-1, DII-4グループで顕著に増加していることが観察された(図9a及びb)。移植したEPCの、組織での分化の状況を明らかにするために、移植から4週間後、下肢虚血モデルマウスの虚血組織の切片を毛細血管や静脈の染色が可能なIso-lectin GS-IB4(Molecular probes;図9c)とalpha- smooth muscle actin抗体 (Sigma;図9d)を用いて染色を行った。その結果、Jagged-1やDII-4で誘導されたEPCは対象群やDII-1に比較して、毛細血管への分化が頻繁に観察され、動静脈などの血管組織への分化にも貢献していることが認められた。以上の結果から、 Notchシグナルによって分化誘導されたEPCは、虚血組織に浸透して血管内皮細胞に分化し、血管の再生に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
EPCの分化増殖に対するNotchリガンドの役割を明らかにするために、Notchリガンド遺伝子のconditional 遺伝子欠損マウスを作成した。conditional 遺伝子欠損マウスの作成は、Hozumiらの方法(Hozumi K. et al., Nature Immunology;5;638-644)に準じて行った。すなわち、conditional 遺伝子欠損の方法は200μg/miceのPoly I/C(Amersham Biosciences)を4回にわたってマウス腹腔内に注射後、Cre 遺伝子特異的な酵素反応によってJagged-1や DII-1遺伝子を選択的に除去した(図10)。
conditional 遺伝子欠損マウスの骨髄組織から未分化細胞をMidiMACS separatorを用いて実施例2の方法で精製後、Sca-1陽性Beads(Miltenyi Biotec. )でさらに分離精製してFACS分析をおこなった。これらの細胞をEPC特異的なマーカーであるCD31とFlk-1の抗体で4℃、20分間反応させた後、streptoavidin APC(e-Bio)でさらに20分間反応させFACS法により分析を行った。その結果、Jagged-1 遺伝子欠損マウスでは、CD31(+)Flk-1(+)細胞がDII-1欠損マウスや対照群より少ないことがわかった(図11a)。
実施例10の2種類(Jagged-1, DII-1)のconditional遺伝子欠損マウスに、実施例8の方法で下肢虚血疾患モデルを作成し、虚血組織部分の修復程度を観察した。Jagged-1遺伝子欠損マウスでは血流の改善度が著しく阻害されていたが(図12a及びb)、DII-1遺伝子欠損マウスでは対照群マウスとほとんど差が認められなかった (図12c及びd)。
さらに実施例8に述べた方法で、conditional遺伝子欠損マウスの骨髄組織よりEPCを分離精製後 5 x 105の細胞を静脈注射する方法によって下肢虚血性疾患モデルヌードマウスに移植した。その結果、Jagged-1遺伝子欠損マウスからのEPC移植マウスではDII-1欠損マウスや対象群と比較して血流の修復が阻害されていた(図12e)。以上の結果、Jagged-1遺伝子の欠損によりEPCはその組織修復能力も劣ることが明らかになった。
<110> Tokai University
<120> A method for inducing differentiation into endothelial progenitor cell using Notch ligand
<130> A51747A
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<212> DNA
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Claims (8)
- 培養されている未成熟幹細胞にNotchリガンドを作用させることを含む、未成熟幹細胞から血管内皮前駆細胞へと分化誘導させる方法。
- 未成熟幹細胞が骨髄未分化細胞である、請求項1に記載の方法。
- 骨髄未分化細胞がlineage negative cellである、請求項1又は2に記載の方法。
- Notch 信号伝達系のリガンドが、Jagged-1又はDelta-4である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- Notchリガンドを高発現する細胞と未成熟幹細胞とを隣接した状態で共培養する、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- 請求項1から5の何れかに記載の方法により作製される分化誘導された血管内皮前駆細胞。
- 請求項1から5の何れかに記載の方法により作製される分化誘導された血管内皮前駆細胞を含む、血管治療のための細胞移植療法剤。
- 虚血性血管疾患の治療のために使用される、請求項7に記載の細胞移植療法剤。
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