JP4822205B2 - Lnkの機能が破壊又は抑制されている血管内皮前駆細胞 - Google Patents
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Description
Huang Xら(Huang X et al PNAS. 92(25): 11618-11622;1995)は、T cell信号伝達の一部として Lnkの存在を初めて発見した。
高木ら(Takaki et al、Immunity, Nov;13(5):599-609;2000)は、遺伝子欠損マウスを作成して、生体内でのLnk遺伝子の役割を明らかにし、B cell前駆細胞の増殖作用にc-kit依存的に関与することを始めて究明した。
高木ら(Takaki et al、J.Exp.Med. 21;195(2):151-160:2002)はまた、遺伝子欠損マウスでは血球前駆細胞つまりKSL細胞が正常マウスより著しく増加していること、また移植細胞の骨髄内への接着あるいは増殖などが正常細胞よりも明らかに亢進していることを初めて証明した。
高木ら(Takaki et al、Jounal of Immunology;164(10):5199-5206;2003)は、Lnk transgenic マウスでは、免疫細胞の増殖が正常マウスより著しく抑制されていること、またLnk遺伝子がc-kit 非依存的に細胞増殖抑制に関与していることを示した。
Tong ら(Tong W et al、J.Exp.Med;200(5):569-580;2004)は、血小板生産過程に関係ある TPO依存的な信号伝達過程での制御因子としてのLnkの役割を初めて示した。
Tong ら(Tong W et al、Blood 105(12):4604-4612;2005)は、Lnk遺伝子欠損マウスを用いてEPO依存的な信号伝達が存在することを示した。
また、Ema ら( Ema H et al、Dev. Cell 8(6):907-914;2005)は、Lnk遺伝子が血球前駆細胞のself renewalityを調節している分子であることをLnk遺伝子欠損マウスを用いた実験で初めて明らかにした。
好ましくは、本発明の血管内皮前駆細胞は、ヒト又はマウス由来の細胞である。
好ましくは、本発明の血管内皮前駆細胞は、哺乳動物から取得した血管内皮前駆細胞のLnk遺伝子又はLnk蛋白質の機能を破壊又は抑制することにより取得される血管内皮前駆細胞である。
好ましくは、本発明の血管内皮前駆細胞は、SCFの存在下で培養することによって分化能力が亢進している。
好ましくは、本発明の血管内皮前駆細胞は、VEGFやSCFなどのサイトカインの存在下で、末梢血液に効率よく動員される。
好ましくは、本発明の血管内皮前駆細胞は、細胞表面に各種インテグリンを高密度に発現していて、組織への移行能力の高い。
好ましくは、本発明の細胞移植療法剤は、虚血性血管疾患の治療のために使用される。
本発明による血管内皮前駆細胞は、哺乳動物由来の細胞であり、Lnk遺伝子又はLnk蛋白質の機能が破壊又は抑制されていることを特徴とする。本発明の血管内皮前駆細胞は、ヒト又はマウス由来の細胞であることが好ましい。
(1)細胞の染色体ゲノムにLnk遺伝子のコード領域が存在していないことによって、Lnk蛋白質を産生しない細胞;
(2)Lnk遺伝子のコード領域における1以上のヌクレオチドが欠失、付加または置換していること(遺伝子変異)によって、Lnk蛋白質を産生しないか、または変異型Lnk蛋白質を産生する細胞;
(3)Lnk遺伝子の発現制御領域が欠失または部分的に変異していることによって、Lnk遺伝子が発現されず、その結果、Lnk蛋白質を産生しない細胞;
(4)Lnk遺伝子からの転写産物(mRNA)に対するセンス鎖、アンチセンス鎖、センス・アンチセンス二重鎖(siRNA)、Lnk mRNAを切断するリボザイムを発現し、mRNAからLnk蛋白質が合成されない細胞:
(1)CD31、Flk-1,VE-cadherinの発現が陽性である。
(2)血管内皮形成コロニーの数が著しく増加している。
(3)血管の損傷組織内への浸透が容易である。
(4)VEGF, SCF依存的に末梢血液への移動が促進される。
(5)SCF依存的に細胞増殖が亢進している。
(6)インテグリンの発現が陽性であり、その発現密度も高い。
血管損傷に対するLnkの役割を動物モデルで明らかにするために、Lnk遺伝子欠損マウス(Takaki et al、Immunity、13(5):599-609;2000)と対照群マウス(C57BL6/J, 日本クレア)を用いて下肢虚血疾患モデルを作成した(Kalka C. et al, PNAS; 97;3422-3427;2000, Iwaguro H. et al、Circulation 105;732-738;2002)。作成後、4日、7日、14日、28日の4回にわたって Moor LDI(Moor Instruments)を用いて血管の修復程度を測定した。非誘導部分との比較により再生程度を数値化して比較した結果、対照群に比べて著しい血流の回復が認められた(図1a及び図1b)。以上の結果から、Lnk遺伝子を破壊することによって血管再生を亢進することができることが示された。
Lnk遺伝子の血管内皮前駆細胞の分化への役割を明らかにするために、FACS法を用いてLnk遺伝子欠損マウス由来の血液単核球細胞(MNC)の分析を行った。末梢血液から血液単核球細胞を比重分離法(Iwaguro H et al、Circulation 105;732-738;2002)を用いて分離精製後、EPC特異的マーカー (Sca-1, CD31, VE-cadherin,Flk-1) の蛍光標識抗体を血液単球細胞1x105個あたり2.5〜3ulを用いて、4℃で20分間染色を行い、FACS分析を行った。図2aに示すように、Lnk遺伝子欠損マウス血液由来のSca-1 (+) 細胞にCD31、Flk-1,VE-cadherin陽性細胞が対称群に比べて多く含まれていることを確認した。
Lnk遺伝子の調節がEPCの分化増殖を促進する可能性を調べるため、Stem span media (StemCell Technologies Inc.)に VEGF(R&D) 50ng/ml, mTPO(GT) 20ng/ml, mIL6(GT) 20ng/ml, mSCF(KIRIN) 100ng/ml, mFlt3(GT) 100ng/mlを添加したExpansion培養系(serum free)を用いて、試験管内でのEPCの増殖や分化の程度を調べる実験を行った。
Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCにおいて血管再生能力が亢進していることを調べるため、実施例1の下肢虚血疾患動物モデルを用いて移植実験を行った。ヌードマウス(日本クレア)の下肢の動静脈を ligationする方法(Iwaguro H et al、Circulation 105;732-738;2002)によって下肢虚血疾患モデルを作成した。正常マウス由来と Lnk遺伝子欠損マウス由来のSca-1 (+) / Lin (-)細胞を骨髄組織から分離後、2.5x105個の細胞を上記のモデルマウスに静脈注射した。Moor LDI(Moor Instruments)を用いて14日目、28日目に血流の改善を非誘導部分との比較により再生程度を数値化した結果、Lnk遺伝子欠損マウス由来のSca-1 (+) / Lin (-) の細胞移植群で血流改善が著しく亢進したことが明らかとなった(図4a及びb)。
Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCが生体内で血管修復メカニズムにどのように関係しているかを明らかにするために、正常マウスと Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCにDiI色素を用いた染色を行った。下肢虚血疾患モデルマウスに2x105個のDil染色EPC (Sca-1 (+) / Lin (-))を静脈注射により投与し、その4日後に、損傷組織部位の6μm切片を作成して20分間組織染色を行った後、蛍光標識Iso-lectinGS-IB4 (Sigma)を反応させて、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCは正常マウスに比べて、 Iso-lectinGS-IB4によって緑色に染色された虚血組織の毛細血管中により多数存在することが確認された(図5)。この結果は、Lnk遺伝子欠損EPCは、損傷組織内に容易に浸透することできることを示している。
血管内皮前駆細胞は、骨髄組織から血液を経て損傷組織部位に移動する。この過程ではVEGF,SDF-1, G-CSF, SCFなどのサイトカインが重要な役割を果たしていると考えられている。Lnk遺伝子欠損マウスでの、これらのサイトカインによるEPCの動員過程を調べるため、 VEGF (2.5μg/kg, R&D), SDF-1 (2.5μg/kg,PEPROTECH.INC.), G-CSF(10μg/kg,KIRIN), SCF(20μg/kg,KIRIN)を毎日一回ずつ5日間腹腔内注射した。一週間後、末梢血液由来の単核球(MNC)を比重分離法(Kalka C et al 、PNAS;97;3422-3427;2000)で分離し、骨髄組織から血液中に動員されたEPC数を測定した。その結果、どのサイトカインを投与した場合でも、Lnk遺伝子欠損マウスでは正常マウスに比べてより多数のEPCが末梢血液に動員されていたが、特にVEGF, SCFはその動員力が強いことが明らかになった(図6a)。
サイトカインによるEPCの末梢血中への動員の時間的な変化を調べ、動員された細胞が確かにEPCの特徴を備えていることを確認するために次の実験を行った。即ち、20ug/kgのSCF(KIRIN)を毎日1回、5日間Lnk遺伝子欠損マウスおよび正常マウスの腹腔内に注射した後、末梢血液中の単核球画分を分離して細胞数を計測した。分離した単核球画分の細胞に、様々なEPC分化マーカー(Sca-1,VE-cadherine,CD31)の蛍光標識抗体を4℃で20分間反応させ染色を行った後、FACS法によりEPC分化マーカーの分布を調べた。
Lnk遺伝子欠損マウスから採取したEPCの増殖に対する種々のサイトカインの作用を調べた。EPC培養のための基本培地EBM-2(Asahara et al、Science 275;964-967;1997)に、各種サイトカインを加えた後、細胞数を計測した。また、増殖反応活性化をWST-1増殖アッセイ法(Roche Applied Science)を用いて検討した。
Lnk遺伝子の血管内皮前駆細胞の分化増殖に対する重要性を確認するために、Lnk遺伝子欠損マウスと対照群マウスに下肢虚血疾患動物モデルを作成した(Kalka C et al, PNAS;97;3422-3427;2000及びIwaguro H et al,Circulation 105;732-738;2002)。動物モデル作成後3日目および7日目に末梢血液を採取した後、 単核球画分中の単核球及びSca-1 (+)細胞の細胞数を測定した。その結果、下肢虚血疾患動物モデルのLnk遺伝子を欠損させた場合、末梢血液中に単核球が多く動員されており(図9a)、なかでもSca-1(+)細胞が著しく増加していることを確認した(図9b)。
Lnk遺伝子欠損マウスにおけるEPCの増殖亢進にLnk遺伝子がどのように関わっているかを調べるため、Lnk遺伝子欠損マウスと正常マウスを用いて下肢虚血疾患モデルを作成した。下肢虚血疾患モデルを作成後3日目及び7日目に骨髄組織よりEPC(BM-Sca-1(+)/ Lin(-) cells)を分離して、免疫生化学的に調べた。すなわち、分離したEPCにリン酸化Akt(Ser473)およびリン酸化e-NOS(Ser1177)を特異的に認識する抗体(Cell Signalling)を用いてWestern Blotting法を行った。その結果、下肢虚血作成後7日目に、リン酸化Aktの増加が認められたが、その強度はLnk遺伝子欠損マウスでは正常マウスに比べてほぼ2倍であった(図10)。更にリン酸化e-NOSも、Lnk遺伝子欠損マウスで下肢虚血作成後7日目に増加していた(図10)。上記の結果から、下肢虚血疾患モデルにおいてはAkt-eNOS 信号伝達システムを通じてEPC分化の亢進が行われており、Lnk遺伝子の欠損によりこのシステムがさらに亢進されていることが明らかになった。
虚血組織内へEPCが移動して血管を形成するにはインテグリンなどの接着因子の役割が重要である。EPCのLnk遺伝子の欠損が接着因子の発現に与える影響を調べた。Lnk遺伝子欠損マウスと正常マウスの骨髄組織由来のEPC(BM-Sca-1+/Lin-)細胞を7日間試験管内で培養後、実施例6と同様の方法によりEPCへ分化誘導した。これらの細胞をインテグリン特異的な抗体で染色を行った後、FACS法を用いてヒストグラム分析を行った。即ち、各種インテグリン (Integrin alphaV, Integrin beta1, Integrin beta2, Integrin beta3, BD)およびFlk-1に特異的なビオチン化抗体を4℃で20分間反応させた後、 さらにStreptoavidin-APC(e-Bio)を4℃で20分間反応させた後、FACS解析を行った。その結果、Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCは正常マウスのEPCに比べて、各種インテグリンの陽性細胞が増加していることが確認された(図11)。また、ヒストグラムの分析により、Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCは正常マウスのEPCに比べて、細胞表面のインテグリンの密度も高いことが示唆された(図11)。これらの結果は、Lnk遺伝子を欠損させることにより、EPCは高い虚血組織修復能力を獲得することができることを示唆する。
Lnk遺伝子欠損マウスのEPCの高い虚血組織修復能力は、インテグリンを介して発揮されるものであることを確認するために以下の実験を行った。実施例5での実験方法と同様に、下肢虚血疾患モデルマウスにLnk遺伝子欠損マウスと正常マウス由来のDiI染色EPC(BM- Sca-1 (+)/Lin(-))を静脈注射し、同時にインテグリン信号伝達を特異的に制御するRGD peptide(20 ug/ml)を静脈注射した。虚血組織へのDil染色EPCの浸透程度を計測すると、Lnk遺伝子欠損マウス由来のEPCを投与した場合に見られた虚血組織へのEPCの浸透がRGD peptideによって低下しており、その程度は正常マウスにおける低下に比べて著しいことが観察された(図12)。以上の結果から、Lnk遺伝子欠損EPCはインテグリンを介して移動すること、およびそのインテグリンへの依存程度は正常EPCよりも高いことが明らかになった。すなわち、Lnk遺伝子欠損EPCは正常EPCに比べて高い移動能力を発揮して虚血組織へ浸透することによって強い修復能力を発揮するものであることが示唆された。
Claims (9)
- Lnk遺伝子又はLnk蛋白質の機能が破壊又は抑制されていることを特徴とする、哺乳動物由来の血管内皮前駆細胞を含む、血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞が、ヒト又はマウス由来の細胞である、請求項1に記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞が、Lnk遺伝子をノックアウトしたノックアウト非ヒト哺乳動物から取得される血管内皮前駆細胞である、請求項1に記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞が、哺乳動物から取得した血管内皮前駆細胞のLnk遺伝子又はLnk蛋白質の機能を破壊又は抑制することにより取得される血管内皮前駆細胞である、請求項1に記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞において、遺伝子相同組み換えによる遺伝子ターゲティング法によりLnk遺伝子の機能が破壊又は抑制されている、請求項4に記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞が、SCFの存在下で培養することによって増殖能力が亢進している血管内皮前駆細胞である、請求項1から5の何れかに記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞が、VEGF又は SCFの存在下で末梢血液中に効率よく動員される、請求項1から6の何れかに記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 血管内皮前駆細胞が、細胞表面に各種インテグリンを高密度に発現している、組織への移行能力の高い血管内皮前駆細胞である、請求項1から7の何れかに記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
- 虚血性疾患の治療のために使用される、請求項1に記載の血管治療のための細胞移植療法剤。
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