JP2007077169A - 皮膚基底膜賦活用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】ラミニン５の産生を促進させる皮膚基底膜賦活用組成物を提供する。
【解決手段】 フェニルプロパノイド類から選ばれる１種または２種以上の化合物および／またはその塩および／またはその配糖体を含有する皮膚基底膜賦活用組成物である。
【選択図】図１

Description

本発明は、皮膚基底膜に存在する細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニン５の産生を促進する活性を有するある特定の化合物を有効成分として含有する皮膚基底膜賦活用組成物に関する。

ラミニン５（別名カリニン、エピリグリン、ナイセイン）は皮膚の基底膜に存在するラミニン分子種の一種として同定され、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の３本のサブユニットで構成される分子量３８０〜４９０ｋDaの糖タンパク質である（非特許文献１：Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．，６５，５９９−６１０，１９９１．、非特許文献２：Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１．、非特許文献３：Ｖｅｒｒａｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９４２，４５−５６，１９８８．）。ラミニン５は表皮細胞により産生され、表皮細胞の接着を促進し、表皮細胞を基底膜に結合するとともに、ＶＩＩ型コラーゲンと結合し、真皮と基底膜の結合にも関与している（非特許文献２：Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１．、非特許文献４：Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３８，７１９−７２８，１９９７．、非特許文献５：Ｃｈｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２，１７７−１８３，１９９９）。ラミニン５遺伝子の変異は、表皮・真皮間の剥離と水泡形成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である結合型表皮水泡症（Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）を引き起こすことから、ラミニン５は正常な皮膚構造の維持に必要不可欠であることが明らかになった（非特許文献６：Ａｂｅｒｄａｍ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，６，２９９−３０４，１９９４．、非特許文献７：Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２４，３５７−３６０，１９９４．、非特許文献８：Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９５９−９６２，１９９５．）。また、ラミニン５は表皮細胞の遊走を促進させる活性を持ち、かつ皮膚の創傷治癒部位でラミニン５遺伝子およびその受容体遺伝子の発現が上昇することから、創傷治癒に関与することが示唆されている（非特許文献９：Ｖｅｒｒｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１，５６７−５７４，１９９４．、非特許文献１０：Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２２７７９−２２７８７，１９９４．）。以上のようなことから、ラミニン５は、表皮と真皮の結合を担い、正常な皮膚構造の維持に重要であるとともに、皮膚が損傷を受けた場合には、表皮細胞の遊走を促進し、創傷治癒に働くと考えられる。

一方、老化した皮膚では基底膜の重複や偏平化が起こっていることから、基底膜の構造変化が皮膚老化を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献１１：Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，７３，５９−３８９，１９７９．、非特許文献１２：Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．，４，３７９−３８９，１９８６．）。また、老化したヒトの真皮の線維芽細胞では、皮膚基底膜の主要な構成成分であるＩＶ型コラーゲンの発現が低下していることから、老化に伴い皮膚基底膜の活性が低下することが示唆されている（非特許文献１３：Ｏｌｓｅｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３，１２７−１３１，１９８９．）。したがって、表皮細胞におけるラミニン５の産生を促進し、老化による皮膚基底膜の構造変化を防止または修復することにより、皮膚の機能低下を改善できることが予想されていた。

上記のようなことから、ラミニン５自体あるいはラミニン５の産生促進活性を持つ大豆由来の調製物やリゾリン脂質を有効成分として含有することにより、皮膚賦活効果などを有する皮膚外用剤や皮膚賦活用組成物が開発されている（特許文献１：特開平１０-１４７５１５号公報、特許文献２：特開平１１-３４３２２６号公報、特許文献３：特開平１１-５２７０４号公報、特許文献４：特開２０００-２２６３０８号公報）。

ところで、これまでフェニルプロパノイド類の化合物は、様々な理由から化粧料や皮膚外用剤などに用いられている。例えば、フェニルプロパノイド類の化合物が紫外線吸収活性、チロシナーゼ阻害活性、メラニン産生抑制活性をもつことから、イソフェルラ酸および／またはその誘導体（特許文献５：特公平６−５５６６４号公報（特許第１９２８８０２号））、フェルラ酸アミド誘導体（特許文献６：特公平６−８０００６号公報（特許第１９４５４５９号））、イソフェルラ酸および／またはその塩とアスコルビン酸および／またはその誘導体および多価アルコール（特許文献７：特許第２５３３７７３号公報）、イソフェルラ酸および／またはその塩と抗酸化剤（特許文献８：特許第２５３３７７４号公報）、イソフェルラ酸および／またはその塩と多価アルコール（特許文献９：特許第２５３３７７５号公報）、イソフェルラ酸および／またはその塩と有機酸および／またはその塩（特許文献１０：特許第２５３３７７６号公報）、フェルラ酸および／またはその塩と有機酸および／またはその塩（特許文献１１：特許第２５６４１３９号公報）、カフェー酸配糖体（特許文献１２：特許第２９９７３５８号公報）、フェルラ酸−２，３−ジヒドロキシプロピルおよび／またはその塩（特許文献１３：特開平６−１５７２７２号公報）を有効成分として含有する化粧料および皮膚外用剤が開発されている。フェルラ酸および／またはフェルラ酸エステルがヒト正常線維芽細胞の分化を促進することを見出し、それらを有効成分として含有する細胞分化促進剤、育毛・発毛剤、皮膚老化防止剤が開発されている（特許文献１４：特開平５−３１０５２６号公報）。カフェー酸、フェルラ酸、コニフェリルアルコールが活性酸素消去作用を有することを見出し、それらの活性酸素消去剤を有効成分として含有する化粧料、医薬組成物および食用組成物が開発されている（特許文献１５：特開平７−３００４１２号公報）。フェルラ酸エステルを有効成分とする抗酸化剤が開発されている（特許文献１６：特開平９−４０６１３号公報）。フェニルプロパノイド類の化合物に太陽光紫外線および大気汚染物質による光毒性を抑制する効果を見出し、それらの光毒性抑制剤を有効成分として含有する化粧料および飲食品が開発されている（特許文献１７：特開２０００−３１９１５４号公報）。
Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．，６５，５９９−６１０，１９９１． Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１． Ｖｅｒｒａｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９４２，４５−５６，１９８８． Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３８，７１９−７２８，１９９７． Ｃｈｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２，１７７−１８３，１９９９． Ａｂｅｒｄａｍ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，６，２９９−３０４，１９９４． Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２４，３５７−３６０，１９９４． Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９５９−９６２，１９９５． Ｖｅｒｒｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１，５６７−５７４，１９９４． Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２２７７９−２２７８７，１９９４． Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，７３，５９−３８９，１９７９． Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．，４，３７９−３８９，１９８６． Ｏｌｓｅｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３，１２７−１３１，１９８９． 特開平１０-１４７５１５号公報 特開平１１-３４３２２６号公報 特開平１１-５２７０４号公報 特開２０００-２２６３０８号公報 特公平６−５５６６４号公報（特許第１９２８８０２号） 特公平６−８０００６号公報（特許第１９４５４５９号） 特許第２５３３７７３号公報 特許第２５３３７７４号公報 特許第２５３３７７５号公報 特許第２５３３７７６号公報 特許第２５６４１３９号公報 特許第２９９７３５８号公報 特開平６−１５７２７２号公報 特開平５−３１０５２６号公報 特開平７−３００４１２号公報 特開平９−４０６１３号公報 特開２０００−３１９１５４号公報

しかしながら、ラミニン５を有効成分として含有する皮膚外用剤は、ラミニン５が非常に高分子の糖タンパク質であることから、安定性、皮膚浸透性などに問題があり、必ずしも十分な皮膚賦活用効果を期待できない。また、大豆由来の調製物やリゾリン脂質は、ラミニン５の産生を促進させる活性が十分でなく、それらを有効成分として含有する皮膚賦活用組成物は、必ずしも十分な皮膚賦活効果を期待できない。

一方、フェニルプロパノイド類の化合物には前述したような活性が知られているが、皮膚基底膜成分に着目しその成分の産生を促進することで、皮膚基底膜ひいては皮膚全体を賦活化しようという試みはなされていない。

本発明者らは、種々の化合物について、表皮細胞におけるラミニン５の産生を促進する活性を検討した。その結果、フェニルプロパノイド類の化合物がラミニン５産生を有意に促進させることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
１．フェニルプロパノイド類から選ばれる１種または２種以上の化合物および／またはその塩および／またはその配糖体を含有する皮膚基底膜賦活用組成物、２．フェニルプロパノイド類から選ばれる１種または２種以上の化合物および／またはその塩および／またはその配糖体を含有するラミニン５の産生促進用組成物、
３．皮膚外用である１または２記載の組成物、
４．有効成分がフェルラ酸である１、２または３記載の組成物
に関する。

フェニルプロパノイドの化合物は、ラミニン５の産生を促進することから、皮膚基底膜の構造維持および機能向上を促す。したがって、老化により機能が低下した皮膚や紫外線により障害を受けた皮膚に対して、皮膚基底膜の構造変化および機能低下を防止することにより、皮膚全体を賦活化することができる。

本発明で使用するフェニルプロパノイド類は、天然に存在する化合物群の一つであり、ベンゼン核（Ｃ６，ｐｈｅｎｙｌ）に直鎖状３炭素（Ｃ３，ｐｒｏｐａｎｅ）が結合したものである。これらの化合物は、広範な生物源から直接もしくは間接的に得ることが出来るが、化学合成品であってもよい。

自然界では、維管束植物においてアミノ酸フェニルアラニン（イネ科ではチロシン）の脱アミノ化によりトランスケイヒ酸（イネ科ではｐ−クマリン酸）が生成される。トランスケイヒ酸は酸化されてｐ−クマリン酸、さらに酸化されてカフェー酸となる。カフェー酸はメチル化を受けてフェルラ酸となる。被子植物はフェルラ酸をさらに酸化して５−ヒドロキシフェルラ酸に、次にメチル化してシナピック酸とすることができるが、シダ植物や裸子植物はできない。自然界において、これら酸のフェノール性水酸基は部分的にメチル化され、そしてカルボキシル基は逐次還元されて対応するアルデヒド、アルコール、あるいはオレフィンとなる（天然物化学、改訂第４版、三橋博ら編、南江堂）。

カフェー酸は下記式（１）で表され、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制効果や５−リポキシゲナーゼおよびロイコトリエン生成の阻害活性がある（天然薬物辞典、奥田拓男編、１９８６、廣川書店）。コーヒー豆、ノコギリソウ、オトギリソウなどに数％含まれるクロロゲン酸、ヨモギおよび同族植物の主成分の３，５−ｄｉ−Ｏ−カフェイルキナ酸、その他いわゆるカフェータンニンの構成成分として存在する。また、遊離してタバコ葉、サツマイモ、ナシ葉などの広い範囲の植物に存在する。３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、無水酢酸、酢酸カリウムの混合物を加熱する（パーキン反応）ことにより得られる。また、クロロゲン酸の酸加水分解によって生成する。

フェルラ酸は下記式（２）で表され、抗酸化作用、紫外線吸収能を持つことが知られている。それ自体およびその誘導体は植物の細胞壁を形成するリグニンの前駆体である。遊離状、エステル型、リグニンの形で、微量ながら広く植物に存在する（化学大辞典、１９９７、東京化学同人）。４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒドとマロン酸をピペリジン存在下ピリジン中で縮合脱炭酸させることにより得られる。また、コメヌカから効率的に抽出する方法が開発されている（特開平５−３３１１０１号）。

ケイヒ酸は下記式（３）で表され、そのエステル類は香料および医薬品として用いられる（天然薬物辞典、奥田拓男編、１９８６、廣川書店）。通常、ケイヒ酸とはトランス形のものを指し、シス形のものはアロケイヒ酸と呼ばれる。シス形は不安定でトランス形になりやすい。カシア油、ペルーバルサム、トルーバルサムの樹脂などに遊離酸あるいはエステルとして存在する。ケイヒアルデヒドの酸化、あるいはベンズアルデヒド、無水酢酸、酢酸カリウムの混合物を加熱する（パーキン反応）ことにより得られる。

ケイヒアルデヒドは下記式（４）で表され、強い特有の芳香と甘味があることから、菓子などの食品香料に用いられている（天然薬物辞典、奥田拓男編、１９８６、廣川書店）。また、医薬品、化粧品にも用いる。ケイの樹皮、葉に含まれ、ケイヒ油、カシア油の主成分で香りの本体であり、その他ミルラ油、パチョウリ油にも含まれる。ベンズアルデヒドとアセトアルデヒドをアルカリで縮合させて得られる。

オイゲノールは下記式（５）で表され、バニリンの製造原料、香料、殺菌剤、防腐剤などに用いられる（天然薬物辞典、奥田拓男編、廣川書店）。チョウジ油に多く含まれるほか、広く植物の精油中に存在するフェノール性精油成分である。グローブ油、桂葉油をアルカリ抽出することにより得られる。

コニフェリルアルコールは下記式（６）で表され、針葉樹の形成層とその周辺の柔細胞、コンフリーの根、テンサイ、アスパラガスなどに配糖体のコニフェリンとして存在する（天然薬物辞典、奥田拓男編、１９８６、廣川書店）。植物体内で脱水素重合によってリグニン様の物質になる。リグニンには、抗腫瘍作用、肝カタラーゼ活性促進作用などの作用が認められている。コニフェリンに加水分解酵素エムルシンを作用させることにより得られる。

クロロゲン酸は下記式（７）で表され、中枢神経興奮作用に加えて、胃液や胆汁分泌を促進する作用がある（天然薬物辞典、奥田拓男編、１９８６、廣川書店）。また、抗酸化作用（日本女子大・グエン教授ら、１９９５）や癌細胞転移抑制作用（東京農工大・矢ケ崎教授ら、２０００）が報告されている。コーヒー豆からはじめて単離されたが、双子葉植物の果実や葉などに広く分布し、特にナス科、キク科、セリ科などの植物にこれを多く含むものが多い。カフェー酸とキナ酸をエステル化することにより得られる。

いずれの化合物も市販されており、これを用いることができる。

本発明によれば、フェニルプロパノイド類の化合物を含有する組成物は、ラミニン５の産生を促進し、皮膚基底膜の構造維持および機能向上を促すことにより、皮膚基底膜を賦活化することができる。これらは、表皮角化細胞におけるラミニン５の産生を促進する。さらに、皮膚基底膜を賦活化することで、表皮のターンオーバーを正常に保つと同時に、表皮と真皮の結合を強くし、真皮のコラーゲンやエラスチンなどの弾性繊維を正常に保つことができる。したがって、フェニルプロパノイド類の化合物を含有する組成物は、加齢や紫外線暴露などによる皮膚基底膜の構造変化および機能低下に伴なう皮膚の機能低下、例えば、皮膚のしわや硬化などを改善することができる。

本発明における化合物は、それらを各種溶媒を用いて溶解した状態でも使用できる。例えば、水またはエタノール、メタノールなどのアルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール、エーテル、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて溶解した状態で使用できる。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。

本発明の化合物の皮膚基底膜賦活用組成物への有効含有量は、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に限定されないが、総組成物重量当たり０．００１〜４０重量％が適当である。

本発明の皮膚基底膜賦活用組成物は、皮膚外用剤として使用することができ、また、経口または非経口投与することができる。ローション剤、乳液剤、クリーム剤、抽出製剤、散剤、造粒製剤、カプセル剤、錠剤、軟膏剤、硬軟剤、懸濁剤、シロップ剤、ハップ剤、坐剤、注射剤、エアゾール剤などの製剤として、製剤上の常套手段を用いて製剤化することができ、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入することができる。また、必要に応じて、賦形剤、安定化剤、乳化剤、結合剤、保存剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、粘度調製剤、湿潤剤、着色剤、等張化剤、香料などの添加剤を適宜含有できる。

次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

調製 フェニルプロパノイド化合物含有液の調製；ケイヒ酸、ケイヒアルデヒド、オイゲノール、コニフェリルアルコール、カフェー酸、フェルラ酸、クロロゲン酸（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を９９．５％エタノールで１０ｍｇ／ｍｌに調製した。

試験結果１．表皮角化細胞におけるラミニン５産生能の測定試験；表皮角化細胞および培地（ＫＧＭ）は、胎児由来正常ヒト表皮角化細胞およびＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（旭テクノグラス）を用いた。細胞はＫＧＭで３７℃−５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。本実験には継代数が３〜５代の細胞を使用した。

ＫＧＭで継代培養した表皮角化細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、ＫＧＭにて再懸濁し、２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。ケイヒ酸、ケイヒアルデヒド、オイゲノール、コニフェリルアルコール、カフェー酸、フェルラ酸、クロロゲン酸を１００μｇ／ｍｌで処理し、さらに２４時間培養し、細胞培養上清を回収した。８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去し、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして用いた。

細胞培養上清液をリン酸緩衝溶液｛ＰＢＳ（−）｝で適当に希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに３７℃で２時間吸着させた。細胞培養上清液を除去後、ブロッキング溶液｛１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（−）｝に浸し、３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬）を含むＰＢＳ（−）｝にて洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で５ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ4Ｂ５）（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ,Ｈ.,ｅｔａｌ.,Ｈｏｒｍ.Ｒｅｓ.,５０,７−１４,１９９８.）｝を添加し、３７℃で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）｝を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）｝を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ,Ｉｎｃ.）を含む０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．３）｝を添加し、３７℃で３０分反応後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。結果を表１に示す。

各フェニルプロパノイド化合物を処理した時のラミニン５の産生について、無処理対照を１００％として評価した結果、いずれの化合物もラミニン５産生を有意に促進した。尚、ラミニン５の産生を促進することが知られている上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．)（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ,Ｈ.,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１２０,１１９６−１２０２,１９９６.）を５０ｎｇ／ｍｌで処理した場合も同様にラミニン５の産生を有意に促進した。

試験結果２．光傷害抑制効果の測定試験；
（１）ヒト表皮角化細胞の光傷害抑制効果の測定試験；
ヒト表皮角化細胞をＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。この細胞懸濁液に１００μｇ／ｍｌのフェルラ酸および５μｇ／ｍｌのラミニン５中和抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ｃｌｏｎｅＰ３Ｈ９−２）をそれぞれ単独または組み合せて処理した。本実験では、フェルラ酸の光傷害抑制効果が、ラミニン５の産生促進に依るものかどうかについて調べるために、ラミニン５中和抗体を用いた。この細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで播種し、２４時間培養した。ＵＶＢを０、７５および１２５ｍＪ／ｃｍ^２で照射し、さらに２４時間培養した。ＰＢＳ（−）で洗浄し浮遊細胞を除去した後、５％グルタルアルデヒド水溶液にて室温、１５分間処理し、細胞を固定した。水道水にて洗浄後、蛍光染色液｛５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．)および０．００１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬）を含む水溶液｝を室温、暗所にて１．５時間処理した。水道水にて洗浄後、蛍光プレートリーダーを用いて、蛍光強度を測定することにより細胞生存率を評価した。

結果を図１に示す。フェルラ酸およびラミニン５中和抗体を無処理で、ＵＶＢ非照射の場合を１００％として光障害抑制効果を評価した。ＵＶＢ非照射の場合は、フェルラ酸およびラミニン５中和抗体をそれぞれ単独または組み合せて処理したいずれの場合でも、無処理と同程度の細胞生存率であった。一方、ＵＶＢを７５および１２５ｍＪ／ｃｍ^２で照射した場合は、無処理に比べて、フェルラ酸を処理した場合は有意に細胞生存率が上昇した。フェルラ酸およびラミニン５中和抗体を組み合せて処理した場合の細胞生存率は、無処理と同程度であった。よって、フェルラ酸の光傷害抑制効果はラミニン５の産生促進に起因すると考えられる。

（２）ヒト皮膚三次元モデルの光傷害抑制効果の測定試験；
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡績）を用い、プロトコールにしたがって培養した。フェルラ酸（１００μｇ／ｍｌ）を含む培地をアッセイリング内の組織上に添加し、２４時間培養した。ＵＶＢを０、１２０、２４０および３６０ｍＪ／ｃｍ^２で照射し、さらに２４時間培養した。組織培養液を回収し、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して組織片を除去した。

この組織培養液を用いて、細胞膜に傷害を受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テストキット（和光純薬）を用いて行った。ＰＢＳ（−）を用いて適当に希釈した組織培養液を９６ウェルの反応プレートに分注後、発色液を処理し、室温で２０分間反応させた。反応停止液を処理後、マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を測定し、細胞毒性を評価した。

結果を図２に示す。フェルラ酸を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合の細胞毒性率を１００％として評価した。ＵＶＢを非照射の場合は、フェルラ酸の処理の有無に関わらず、ほぼ同程度の細胞毒性率であった。一方、ＵＶＢを照射した場合は、ＵＶＢの照射量が増えるにつれて、細胞毒性率は高くなるが、フェルラ酸を処理した場合は、無処理に比べて細胞毒性が有意に低下した。

処方例１．クリームの製造；
（組成） （含有量）
（Ａ） ステアリルアルコール ６．０％
ステアリン酸 ２．０％
水添ラノリン ４．０％
スクワラン ９．０％
オクチルドデカノール １０．０％
ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル ３．０％
モノステアリン酸グリセリン ２．０％
フェルラ酸 ０．１％
防腐剤 適量
香料 適量
（Ｂ） １，３ブチレングリコール ６．０％
ＰＥＧ １５００ ４．０％
精製水 残余
（製法）Ａ、Ｂをそれぞれ７０℃に加熱調節する。ＡをＢに加えて、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にして、脱気、濾過、冷却する。

処方例２．錠剤の製造；
（組成） （含有量）
フェルラ酸 ２０．０％
乳糖 ６５．０％
コーンスターチ １４．０％
グァーガム １．０％

ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸およびラミニン５中和抗体を処理した場合の光障害抑制効果を示す図である。 ヒト皮膚三次元モデルにフェルラ酸を処理した場合の光障害抑制効果を示す図である。

Claims (4)

1. フェニルプロパノイド類から選ばれる１種または２種以上の化合物および／またはその塩および／またはその配糖体を含有する皮膚基底膜賦活用組成物。
   
2. フェニルプロパノイド類から選ばれる１種または２種以上の化合物および／またはその塩および／またはその配糖体を含有するラミニン５の産生促進用組成物。
   
3. 皮膚外用である請求項１または２記載の組成物。
   
4. 有効成分がフェルラ酸である請求項１、２または３記載の組成物。