JP2007037501A

JP2007037501A - New dna derived from plant of genus eucalyptus and method for individual identification of plant of genus eucalyptus using the dna

Info

Publication number: JP2007037501A
Application number: JP2005227449A
Authority: JP
Inventors: Keiji Tomita; 啓治冨田; Kosuke Nakajima; 康介中島
Original assignee: Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2007-02-15

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for surely identify the plant of the genus Eucalyptus. <P>SOLUTION: The method for the identification of the individual body of the plant of the genus Eucalyptus comprises the detection of at least one kind of DNA selected from (a) a DNA containing the total or a part of 28 base sequences having a specific sequence and (b) a DNA hybridizing with a DNA composed of a base sequence complementary to the DNA containing the total or a part of either one of the 28 base sequences under a stringent condition and having polymorphism between the individuals in the genom DNA of the plant of the genus Eucalyptus. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、ユーカリ属植物における新規ＤＮＡおよび、それらを利用したユーカリ属植物の個体識別方法に関する。 The present invention relates to novel DNA in Eucalyptus plants and a method for individual identification of Eucalyptus plants using them.

ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属）植物は主にオーストラリアやインドネシアなどの温帯から熱帯地域を原産とし、７００種以上が知られている。世界的に有用な産業造林樹種であり、成長量および材質の優れた品種開発のための育種が各国で進められている。 Eucalyptus ( Eucalyptus spp.) Plants originate mainly from temperate zones such as Australia and Indonesia, and more than 700 species are known. It is a globally useful industrial plantation tree species, and breeding for the development of varieties with excellent growth and materials is being promoted in each country.

近年、早成樹林業では、世界的にクローン林業が指向されている。また、ＤＮＡ分子マーカーによる家系／クローン管理技術を組込んだ新育種システムが提唱されており、育種事業を効率的に進めるためには、確実で簡便な個体鑑定技術が不可欠となっている。 In recent years, clonal forestry has been oriented globally in early-wood forestry. In addition, a new breeding system incorporating a family / clone management technique based on DNA molecular markers has been proposed, and a reliable and simple individual identification technique is indispensable in order to advance the breeding business efficiently.

これまで個体の識別法としてはＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）分析やマイクロサテライト分析を利用することが多かった（特許文献１及び２参照）。ＲＡＰＤ法は手順が簡便で、少量のＤＮＡでも分析できるという利点をもつ。しかし、再現性が悪く実験室間で結果が異なる場合があるという致命的欠点があり、必ずしも正確で確実な個体識別法とは言い難い。また、マイクロサテライトはＡＣやＴＣなど２〜６塩基の配列が数回〜数十回繰り返しているＤＮＡ領域で、ゲノムＤＮＡ中に散在し、その繰り返し数の違いによる変異性が非常に高いことが分かっている。このマイクロサテライトを利用して個体識別する方法も開発されているが、ＤＮＡシーケンサーを用いて分析する必要があるため、必ずしも簡便な個体識別法とは言い難い。 Until now, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analysis and microsatellite analysis have often been used as individual identification methods (see Patent Documents 1 and 2). The RAPD method has the advantage that the procedure is simple and even a small amount of DNA can be analyzed. However, there is a fatal disadvantage that the reproducibility is poor and the results may differ between laboratories, and it is not necessarily an accurate and reliable individual identification method. Microsatellite is a DNA region in which sequences of 2 to 6 bases such as AC and TC are repeated several to several tens of times. It is scattered in the genomic DNA, and the variability due to the difference in the number of repeats is very high. I know it. Although a method for identifying individuals using this microsatellite has been developed, since it is necessary to analyze using a DNA sequencer, it is not necessarily a simple individual identification method.

特開２００２−２９１４７５号公報JP 2002-291475 A 特開２００２−３４５９７号公報JP 2002-34597 A

本発明の課題は、ユーカリ属植物の個体を確実に識別する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for reliably identifying an individual of a Eucalyptus plant.

本発明者らは前記状況にかんがみ、より優れたユーカリ属植物の個体識別方法を見いだすべく鋭意研究を重ねた結果、ユーカリ属植物から新規ＤＮＡを取得することに成功し、さらに該新規ＤＮＡを利用することによりユーカリ属植物の個体を識別できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 In view of the above situation, the present inventors have intensively studied to find a better individual identification method for Eucalyptus plants, and as a result, succeeded in obtaining new DNA from Eucalyptus plants, and further using the new DNA. As a result, it was found that an individual of the Eucalyptus plant can be identified, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡから選択される少なくとも１種のＤＮＡを検出することにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法：
（ａ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。
（２）検出しようとするＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるように設計されたオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして用いることによりＤＮＡを検出する（１）記載の方法。
（３）配列番号２９〜８４のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマーから選択される少なくとも１種のプライマーを用い、ユーカリ属植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法。
（４）ユーカリ属植物が、ユーカリ・ダニアイ（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｄｕｎｎｉｉＭａｉｄｅｎ．）、ユーカリ・グロブラス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｌｏｂｕｌｕｓＬａｂｉｌｌ．）、ユーカリ・カマルドレンシス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓＤｅｈｎｈ．）およびユーカリ・ナイテンス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｎｉｔｅｎｓＭａｉｄｅｎ．）からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。
（６）配列番号２９〜８４のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマー。
（７）（６）記載のプライマーを含むユーカリ属植物個体識別用キット。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for identifying an individual in a Eucalyptus plant by detecting at least one DNA selected from the following DNAs (a) and (b):
(A) DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 28,
(B) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 28, and a plant belonging to the genus Eucalyptus DNA having polymorphism among individuals in the genomic DNA of.
(2) The method according to (1), wherein DNA is detected by using as a primer a set of oligonucleotides designed to amplify all or part of the DNA to be detected.
(3) at least one primer selected from a primer comprising a base sequence comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 29 to 84 or a base sequence complementary to the base sequence A method for identifying individuals in Eucalyptus plants by performing an amplification reaction using genomic DNA of Eucalyptus plants as a template.
(4) Eucalyptus plant, Eucalyptus Daniai (Eucalyptus dunnii Maiden.), Eucalyptus globulus (Eucalyptus globulus Labill.), From Eucalyptus camaldulensis (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) And Eucalyptus Naitensu (Eucalyptus nitens Maiden.) The method according to any one of (1) to (3), which is selected from the group consisting of:
(5) DNA of the following (a) or (b):
(A) DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 28,
(B) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 28, and a plant belonging to the genus Eucalyptus DNA having polymorphism among individuals in the genomic DNA of.
(6) A primer comprising a base sequence comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 29 to 84 or a base sequence complementary to the base sequence.
(7) A eucalyptus plant individual identification kit comprising the primer according to (6).

本発明により、ＤＮＡを用いたより簡便で確実なユーカリ属植物の個体識別方法が提供される。 The present invention provides a simpler and more reliable individual identification method for Eucalyptus plants using DNA.

以下、本発明を具体的に説明する。 The present invention will be specifically described below.

本発明者らは、試料となるユーカリ属植物からＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）法を用いてＤＮＡを抽出し、次ぎに該ゲノムＤＮＡに、例えばＧＧＧＣＧＧＴＴＴＡ（配列番号８５）、ＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣ（配列番号８６）、ＡＴＣＧＧＧＴＣＣＧ（配列番号８７）、ＴＡＧＣＣＣＧＣＴＴ（配列番号８８）、ＡＧＴＡＧＡＣＧＧＧ（配列番号８９）、ＧＴＡＧＡＣＧＡＧＣ（配列番号９０）、ＧＧＡＡＡＣＣＴＣＴ（配列番号９１）、ＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴ（配列番号９２）、ＡＴＣＣＴＧＴＴＣＧ（配列番号９３）、ＡＧＡＧＧＧＴＴＣＴ（配列番号９４）、ＡＴＧＴＧＴＴＧＣＧ（配列番号９５）、ＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴ（配列番号９６）、ＧＣＡＡＧＴＣＡＣＴ（配列番号９７）、ＣＧＡＣＡＧＴＣＣＣ（配列番号９８）、ＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡ（配列番号９９）、ＴＣＣＡＣＣＧＡＧＣ（配列番号１００）、ＧＴＴＣＣＣＧＡＧＴ（配列番号１０１）、ＡＡＡＣＡＧＣＣＣＧ（配列番号１０２）、ＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧ（配列番号１０３）、ＡＴＡＣＧＧＣＧＴＣ（配列番号１０４）、ＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣ（配列番号１０５）、ＣＡＣＡＡＣＧＧＧＴ（配列番号１０６）、ＣＴＣＴＣＧＴＧＣＧ（配列番号１０７）、ＣＴＣＡＣＡＴＧＣＣ（配列番号１０８）、ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＣ（配列番号１０９）、ＣＣＧＡＣＣＧＧＡＡ（配列番号１１０）、ＣＣＡＧＣＧＴＡＴＴ（配列番号１１１）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして作用させて、ＤＮＡを増幅させた。ＤＮＡの増幅はＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）法により行った（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｋｕｂｅｌｉｋ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．，Ｒａｆａｌｓｋｉ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄＴｉｎｇｅｙ，Ｓ．Ｖ．，（１９９０）ＤＮＡＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙａｒｂｉｔａｒｙｐｒｉｍｅｒｓａｒｅｕｓｅｆｕｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒ．Ｎｕｃｌ．ＡｓｉｄｓＲｅｓ．１８：６５３１−６５３５）。そして、このようにして得られた増幅ＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を用い増幅ＤＮＡを分離し、その後、ユーカリ属植物個体間で多型性を有する増幅ＤＮＡに対してクローニングを行い、該ＤＮＡの塩基配列を決定した。 The present inventors extracted DNA from Eucalyptus plants as samples using the CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) method, and then, for example, GGGCGGTTTA (SEQ ID NO: 85), CCCGCCTTTC (SEQ ID NO: 86). ), ATCGGGTCCG (SEQ ID NO: 87), TAGCCCCGCTT (SEQ ID NO: 88), AGTAGACGGGG (SEQ ID NO: 89), GTAGACGAGC (SEQ ID NO: 90), GGAAACCCT (SEQ ID NO: 91), GCTTCCCCTTT (SEQ ID NO: 92), ATCCTGTTCG (SEQ ID NO: 93) , AGAGGGTTCT (SEQ ID NO: 94), ATGTGTTGCG (SEQ ID NO: 95), CCAAGATGCCT (SEQ ID NO: 96), GCAAGTCACT (SEQ ID NO: 97), CGACAGTCCC (SEQ ID NO: 8), TGCAGTCGAA (SEQ ID NO: 99), TCCACCGAGC (SEQ ID NO: 100), GTTCCCGAGT (SEQ ID NO: 101), AAACAGCCCCG (SEQ ID NO: 102), ACAGGGAACG (SEQ ID NO: 103), ATACGGCGTC (SEQ ID NO: 104), GGTGGTTTCC (SEQ ID NO: 105) ), CACAACGGGT (SEQ ID NO: 106), CTCTCGTGCG (SEQ ID NO: 107), CTCACATGCCC (SEQ ID NO: 108), CCCGTATGTC (SEQ ID NO: 109), CCGACCGGGAA (SEQ ID NO: 110), CCAGCGGTATT (SEQ ID NO: 111) DNA was amplified by acting as a primer. Amplification of DNA was performed by the RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) method (Williams, JG, Kubelik, AR, Livak, KJ, Rafalski, JA, and Tingey, S. V.). (1990) DNA Polymorphisms amplified by arbitary primers area useful as genetic marker.Nucl. Acids Res. 18: 6531- 6535). The amplified DNA thus obtained is separated using agarose gel electrophoresis, and then the amplified DNA having polymorphism among Eucalyptus plant individuals is cloned. The base sequence was determined.

その結果、ユーカリ属植物個体間で多型性を有するＤＮＡとして、配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列を含む２８種のＤＮＡを特定した。従って、本発明は、配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、ならびに配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物の個体間で多型性を有するＤＮＡから選択される少なくとも１種のＤＮＡを検出することにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法に関する。 As a result, 28 types of DNA including the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 28 were identified as DNA having polymorphism among Eucalyptus plants. Therefore, the present invention includes DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-28, and all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-28. Detecting at least one kind of DNA selected from DNA having a polymorphism among individuals of the genus Eucalyptus, which hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to Thus, it relates to a method for identifying individuals in Eucalyptus plants.

本発明の方法によって個体を識別できる植物は、ユーカリ属植物であれば特に制限されない。本発明は、ユーカリ・ダニアイ（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｄｕｎｎｉｉＭａｉｄｅｎ）、ユーカリ・グロブラス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｌｏｂｕｌｕｓＬａｂｉｌｌ）、ユーカリ・カマルドレンシス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓＤｅｈｎｈ）およびユーカリ・ナイテンス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｎｉｔｅｎｓＭａｉｄｅｎ）における個体の識別に特に好適に用いられる。 The plant that can identify an individual by the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a Eucalyptus plant. The present invention, Eucalyptus Daniai (Eucalyptus dunnii Maiden), Eucalyptus globulus (Eucalyptus globulus Labill), particularly preferably used in the identification of individuals in Eucalyptus camaldulensis (Eucalyptus camaldulensis Dehnh) and Eucalyptus Naitensu (Eucalyptus nitens Maiden) It is done.

識別に使用するＤＮＡ種の数は識別しようとする個体数に基づいて、設定することができる。例えば５種類のＤＮＡ種を使用することにより、最大２^５＝３２個体の識別が可能となる。すなわち対象とするユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて、上記の多型性を有するＤＮＡを検出することにより、個体を識別することができる。 The number of DNA species used for identification can be set based on the number of individuals to be identified. For example, by using 5 types of DNA species, it becomes possible to identify a maximum of 2 ⁵ = 32 individuals. That is, an individual can be identified by detecting the DNA having the above polymorphism in the genomic DNA of the target Eucalyptus plant.

本発明において個体を識別するとは、遺伝的に異なる２個体以上の植物体を区別することを意味する。 In the present invention, to identify an individual means to distinguish two or more plants that are genetically different.

配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、及び配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物の個体間で多型性を有するＤＮＡの塩基長は、個体間の多型を識別できる長さであれば特に制限されないが、通常、５０〜２０００塩基、好ましくは１００〜１０００塩基、より好ましくは２００〜７００塩基である。 Complementary to DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-28, and DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-28 The base length of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a simple nucleotide sequence and has polymorphism among individuals of the genus Eucalyptus is particularly long as long as it can distinguish polymorphisms between individuals. Although not limited, it is usually 50 to 2000 bases, preferably 100 to 1000 bases, more preferably 200 to 700 bases.

本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。 In the present specification, stringent conditions refer to conditions in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed, that is, high homology to each gene (homology is 80% or more, preferably Is 90% or higher, more preferably 95% or higher). More specifically, such conditions include hybridization at 42-68 ° C. in the presence of 0.5-1 M NaCl, 42 ° C. in the presence of 50% formamide, or 65-68 ° C. in an aqueous solution. Thereafter, the filter is washed at room temperature to 68 ° C. with a SSC (saline sodium citrate) solution having a concentration of 0.1 to 2 times.

ここで、塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、各塩基配列において連続する少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。 Here, a part of the base sequence is a base sequence of a part of each base sequence, and has a sufficient base sequence length to hybridize under stringent conditions. The base sequence is a sequence of at least 50 bases, preferably at least 100 bases, more preferably at least 200 bases.

各塩基配列の一部としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列の２０６〜８６６位の配列、配列番号２で表される塩基配列の１１０〜８１７位の配列、配列番号３で表される塩基配列の１７２〜４８５位の配列、配列番号４で表される塩基配列の６２〜５８４位の配列、配列番号５で表される塩基配列の１８〜５８４位の配列、配列番号６で表される塩基配列の２１〜３３３位の配列、配列番号７で表される塩基配列の１５５〜７１５位の配列、配列番号８で表される塩基配列の７４〜４４６位の配列、配列番号９で表される塩基配列の９８〜６６０位の配列、配列番号１０で表される塩基配列の８〜６６４位の配列、配列番号１１で表される塩基配列の１０〜３６４位の配列、配列番号１２で表される塩基配列の８２〜６９８位の配列、配列番号１３で表される塩基配列の１〜４９３位の配列、配列番号１４で表される塩基配列の１５０〜３８８位の配列、配列番号１５で表される塩基配列の２７４〜５３２位の配列、配列番号１６で表される塩基配列の１５〜５７０位の配列、配列番号１７で表される塩基配列の２６６〜７４６位の配列、配列番号１８で表される塩基配列の１１〜３３７位の配列、配列番号１９で表される塩基配列の６〜６９７位の配列、配列番号２０で表される塩基配列の８６〜６９１位の配列、配列番号２１で表される塩基配列の２７０〜１０３１位の配列、配列番号２２で表される塩基配列の１０９〜６４７位の配列、配列番号２３で表される塩基配列の６８〜２２３位の配列、配列番号２４で表される塩基配列の１５６〜６４０位の配列、配列番号２５で表される塩基配列の２３４〜８２６位の配列、配列番号２６で表される塩基配列の１３１〜８０５位の配列、配列番号２７で表される塩基配列の１５８〜３６３位の配列、配列番号２８で表される塩基配列の１１〜３０８位の配列が挙げられる。 As a part of each base sequence, for example, the sequence of positions 206 to 866 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the sequence of positions 110 to 817 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the sequence represented by SEQ ID NO: 3 The sequence of positions 172 to 485 of the nucleotide sequence, the sequence of positions 62 to 584 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, the sequence of positions 18 to 584 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, The sequence of positions 21 to 333 of the base sequence represented, the sequence of positions 155 to 715 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, the sequence of positions 74 to 446 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the sequence number 9 A sequence at positions 98 to 660 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, a sequence at positions 8 to 664 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, a sequence at the positions 10 to 364 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, Arrangement at positions 82 to 698 of the base sequence represented by 12. , A sequence of positions 1 to 493 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, a sequence of positions 150 to 388 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, and a sequence of positions 274 to 532 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15. Sequence, sequence 15 to 570 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, sequence 266 to 746 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, position 11 to 337 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 The sequence of positions 6-697 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19, the sequence of positions 86-691 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20, and 270-1031 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 Sequence, positions 109 to 647 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, sequences of positions 68 to 223 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23, and 156 to 156 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24 640th sequence, sequence A sequence of positions 234 to 826 of the base sequence represented by No. 25, a sequence of positions 131 to 805 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, a sequence of positions 158 to 363 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, Examples thereof include a sequence at positions 11 to 308 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28.

対象とするユーカリ属植物由来の試料における本発明のＤＮＡの検出は、当技術分野で通常用いられる方法によって実施できる。本発明においては、上記の配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、ならびに配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡのうち、検出しようとするＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるように設計されたオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして用いることにより検出を行うのが好ましい。 Detection of the DNA of the present invention in a sample derived from a eucalyptus plant of interest can be carried out by methods commonly used in the art. In the present invention, DNA containing all or part of the base sequence represented by any of the above SEQ ID NOs: 1 to 28, and all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 28 Among DNAs that hybridize under stringent conditions with DNA comprising a complementary base sequence to DNA comprising eucalyptus plants and have polymorphism among individuals in the genome DNA of the genus Eucalyptus, the DNA to be detected Detection is preferably performed by using as a primer a set of oligonucleotides designed to amplify all or part of it.

特定のＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるプライマーの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プライマーの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１１〜４５塩基、より好ましくは２０〜３０塩基である。また、プライマーの設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（ＮｅａｒｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒＭｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約４５〜５５℃であることが好ましい。 Design of a primer capable of amplifying all or part of a specific DNA can be performed by a method commonly used in the art. The length of the primer is usually 10 bases or more, preferably 11 to 45 bases, more preferably 20 to 30 bases. In designing the primer, it is preferable to confirm the melting temperature (Tm) of the primer. Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand. In order to anneal a template DNA or RNA and a primer to form a double strand, the annealing temperature must be Need to optimize. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible. Therefore, the Tm of the primer to be designed is an important factor in performing the amplification reaction. For confirmation of Tm, known primer design software can be used, and examples of software that can be used in the present invention include Amplify. Also, Tm can be confirmed by calculating by itself without using software. In that case, a calculation formula based on the nearest neighbor method, the Wallance method, the GC% method, or the like can be used. In the present invention, the average Tm is preferably about 45 to 55 ° C.

プライマーとして特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。また、プライマーは、設計時に鋳型として使用する配列に対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型配列に対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型配列に対し相補配列となることに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業者には周知である。 Other conditions that allow specific annealing or hybridization as a primer include GC content, and such conditions are well known to those skilled in the art. In addition, the primer may be homologous or complementary to the sequence used as a template at the time of design. Generally, the forward primer is a homologous sequence to the template sequence, and the reverse primer is complementary to the template sequence. It is necessary to design the primer in consideration of the sequence. The design of such primers is well known to those skilled in the art.

本発明においては、ＳＣＡＲ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅｇｉｏｎ）プライマーを用いるのが好ましい。ＳＣＡＲプライマーの設計方法は当業者に周知であり、例えば、Ｐａｒａｎ，Ｉ．ａｎｄＲ．Ｗ．Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ．（１９９３）ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｌｉａｂｌｅＰＣＲ−ｍａｒｋｅｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏｄｏｗｎｙｍｉｌｄｅｗｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｉｎｌｅｔｔｕｃｅ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８５ｆ：９８５−９９３に記載されている。 In the present invention, it is preferable to use a SCAR (sequence characterized amplified region) primer. SCAR primer design methods are well known to those skilled in the art, see, eg, Paran, I .; and R.R. W. Michelmore. (1993) Development of reliable PCR-markers linked to down Mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85f: 985-993.

本発明においては、さらに以下のプライマーセット１〜２８からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを用いるのが好ましい。 In the present invention, it is preferable to use at least one primer set selected from the group consisting of the following primer sets 1 to 28.

配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ又は配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡを増幅しうるプライマーセットとして、それぞれ、以下のプライマーセット１〜２８が挙げられる。
プライマーセット１：配列番号２９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２：配列番号３１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット３：配列番号３３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット４：配列番号３５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット５：配列番号３７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット６：配列番号３９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット７：配列番号４１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット８：配列番号４３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット９：配列番号４５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１０：配列番号４７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１１：配列番号４９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１２：配列番号５１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１３：配列番号５３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１４：配列番号５５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１５：配列番号５７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１６：配列番号５９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１７：配列番号６１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１８：配列番号６３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１９：配列番号６５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２０：配列番号６７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２１：配列番号６９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２２：配列番号７１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２３：配列番号７３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２４：配列番号７５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２５：配列番号７７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２６：配列番号７９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２７：配列番号８１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２８：配列番号８３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。 Complementary to DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-28 or DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-28 As primer sets capable of hybridizing with a DNA comprising a base sequence under stringent conditions and amplifying DNA having polymorphism among individuals in the genomic DNA of Eucalyptus plants, the following primer sets 1 to 28, respectively. Is mentioned.
Primer set 1: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 30.
Primer set 2: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32.
Primer set 3: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 34.
Primer set 4: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 36.
Primer set 5: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 38.
Primer set 6: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 40.
Primer set 7: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 42.
Primer set 8: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 44.
Primer set 9: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46.
Primer set 10: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 47 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 48.
Primer set 11: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50.
Primer set 12: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 51 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 52.
Primer set 13: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 54.
Primer set 14: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 55 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 56.
Primer set 15: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 58.
Primer set 16: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 59 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 60.
Primer set 17: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 61 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 62.
Primer set 18: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 63 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 64.
Primer set 19: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 65 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 66.
Primer set 20: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 67 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 68.
Primer set 21: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 69 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 70.
Primer set 22: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 71 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72.
Primer set 23: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 73 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 74.
Primer set 24: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 75 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 76.
Primer set 25: A set of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 77 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 78.
Primer set 26: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 79 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 80.
Primer set 27: a set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 81 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 82.
Primer set 28: A set of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 83 and a reverse primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 84.

上記プライマーセットにおいて、各塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマーもまた上記プライマーセットに包含される。 In the primer set, a primer comprising a base sequence including all or part of each base sequence or a base sequence complementary to the base sequence is also included in the primer set.

ここで「一部」とは、各塩基配列のうち、通常１０塩基以上、好ましくは１５〜４５塩基、より好ましくは２０〜３０塩基、さらに好ましくは２２〜２９塩基の連続する塩基配列を意味する。上述したプライマーに付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に包含される。各塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列は、通常５０〜２０００塩基、好ましくは１００〜１０００塩基、より好ましくは２００〜７００塩基である。 Here, “part” means a continuous base sequence of usually 10 bases or more, preferably 15 to 45 bases, more preferably 20 to 30 bases, and even more preferably 22 to 29 bases among the base sequences. . What added the additional sequence to the above-mentioned primer is also included in the scope of the present invention. The base sequence including all or part of each base sequence is usually 50 to 2000 bases, preferably 100 to 1000 bases, more preferably 200 to 700 bases.

本発明はまた、本発明のプライマーを含むユーカリ属植物個体識別用キットに関する。本識別用キットは、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。 The present invention also relates to a eucalyptus plant individual identification kit comprising the primer of the present invention. The identification kit may further include a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (such as reverse transcriptase and RNase H), and a standard sample for calibration.

次にユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて多型性を有するＤＮＡを検出する方法について以下に述べる。試料は、ユーカリ属植物に由来するものであれば特に限定されず、例えば、葉、茎、根、樹皮、木材などが挙げられ、新鮮な葉を使用するのが好ましい。 Next, a method for detecting DNA having polymorphism in genomic DNA of Eucalyptus plants will be described below. The sample is not particularly limited as long as it is derived from a plant belonging to the genus Eucalyptus, and examples thereof include leaves, stems, roots, bark, and wood, and it is preferable to use fresh leaves.

通常、これらの試料から、被検核酸を調製する。被検核酸は、核酸であればＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法などを利用することができる。またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料又は被検核酸を用いて、以下に示す増幅反応を行う。 Usually, a test nucleic acid is prepared from these samples. The test nucleic acid may be either DNA or RNA as long as it is a nucleic acid. DNA or RNA can be extracted appropriately using a method well known in the art. For example, when DNA is extracted, a method of phenol extraction and ethanol precipitation, a method of using cetyltrimethylammonium bromide, a method of using glass beads, or the like can be used. When RNA is extracted, a guanidine-cesium chloride ultracentrifugation method, a hot phenol method, a guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method, or the like can be used. The amplification reaction shown below is performed using the sample or test nucleic acid prepared as described above.

本発明の識別方法は、上記プライマーを用いて被検核酸を鋳型とした増幅反応を行い、その個体間で特異的な増幅反応を検出することにより実施できる。 The identification method of the present invention can be carried out by performing an amplification reaction using a test nucleic acid as a template using the above-mentioned primers, and detecting a specific amplification reaction between the individuals.

増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（ＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。 The amplification method is not particularly limited, and a known method utilizing the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method can be mentioned. For example, the PCR method, the LAMP (Loop-Mediated Islamic Amplification) method, the ICAN (Isothermal and Chimeric Primer-Initiated Amplification of Nucleic Acids) method, the RCA (Rolling Amplification method) (Amplification) method and the like. Amplification is performed until the amplification product is at a detectable level.

例えば、ＰＣＲ法は、被検核酸であるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。 For example, in the PCR method, a base sequence between a pair of primers is synthesized by DNA polymerase using DNA as a test nucleic acid as a template. According to the PCR method, the amplified fragment can be amplified exponentially by repeating a cycle consisting of denaturation, annealing and synthesis. Those skilled in the art can easily determine the optimum conditions for PCR.

またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、被検核酸であるＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。 In the RT-PCR method, first, cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction using RNA as a test nucleic acid as a template, and then PCR is performed using the prepared cDNA as a template and a pair of primers. .

なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。例えば競合ＰＣＲ法は、同じプライマーを用いて、定量の内部標準となる競合的鋳型から得られる増幅産物と被検核酸から得られる増幅産物との量を比較することにより、被検核酸に含まれる検出対象を定量することができる。また、検出の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行ってもよく、そのような増幅手法はｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法として当技術分野で公知である。 In addition, quantitative detection is possible by adopting a quantitative PCR method such as a competitive PCR method or a real-time PCR method as an amplification method. For example, the competitive PCR method is included in the test nucleic acid by using the same primer and comparing the amount of the amplification product obtained from the competitive template serving as an internal standard for quantification with the amplification product obtained from the test nucleic acid. The detection target can be quantified. Moreover, in order to improve the specificity of detection, an amplification reaction may be performed twice or more using two or more sets of primers, and such an amplification method is known in the art as a nested PCR method.

本発明の識別方法においては、上記プライマーを用いて特異的な増幅反応が起こる条件下で増幅反応を行う限り、その増幅手法は特に限定されない。また、特異的な増幅反応が起こるような条件は、当業者であれば適宜設定することができる。 In the identification method of the present invention, the amplification method is not particularly limited as long as the amplification reaction is carried out under the conditions that cause a specific amplification reaction using the primers. Moreover, those skilled in the art can appropriately set conditions that cause a specific amplification reaction.

上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。 In order to detect whether or not a specific amplification reaction has occurred after the amplification reaction, a known means capable of specifically recognizing an amplification product obtained by the amplification reaction can be used. For example, a specific amplification reaction can be detected by confirming whether an amplified fragment of a specific size is amplified using agarose gel electrophoresis or the like.

増幅産物のサイズは設計したプライマー間の塩基配列に基づいて推測することが可能である。あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、^３２Ｐ、^１２９Ｉ、^３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。 The size of the amplification product can be estimated based on the base sequence between the designed primers. Alternatively, a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance is allowed to act on dNTP taken in during the amplification reaction, and this label can be detected. As a radioactive isotope, ³² P, ¹²⁹ I, ³⁵ S, or the like can be used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein (FITC), sulforhodamine (TR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used. As the luminescent substance, luciferin or the like can be used.

これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。 There are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used. For example, as a method for introducing a label, a random prime method using a radioisotope can be mentioned.

標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。 As a method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP, any method known in the art for detecting the above-described labeled body may be used. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured by, for example, a liquid scintillation counter or a γ-counter. In addition, when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.

以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によってなんら制限されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

＜材料＞
ユーカリ・ダニアイ（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｄｕｎｎｉｉＭａｉｄｅｎ．）１６個体、ユーカリ・グロブラス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｌｏｂｕｌｕｓＬａｂｉｌｌ．）８個体、ユーカリ・カマルドレンシス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓＤｅｈｎｈ．）４個体、ユーカリ・ナイテンス（ＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｎｉｔｅｎｓＭａｉｄｅｎ．）３個体を使用した。 <Material>
Eucalyptus Daniai (Eucalyptus dunnii Maiden.) 16 individuals, Eucalyptus globulus (Eucalyptus globulus Labill.) 8 individuals, Eucalyptus camaldulensis (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) 4 individuals, Eucalyptus Naitensu (Eucalyptus nitens Maiden.) The three individuals used.

＜ユーカリ属植物の全ＤＮＡの単離＞
全ＤＮＡは白石らの方法（白石進・渡辺敦史（１９９５）ｒｂｃＬ遺伝子多型を利用したアカマツとクロマツの葉緑体ゲノム識別．日林誌７７：４２９−４３６）に従って抽出を行った。得られたＤＮＡはＴＥ緩衝液に溶解した。 <Isolation of total DNA of Eucalyptus plants>
Total DNA was extracted according to the method of Shiraishi et al. (Susumu Shiraishi and Atsushi Watanabe (1995) Chloroplast genome identification of Pinus densiflora and Pinus densiflora using the rbc L gene polymorphism. Nihonbayashi 77: 429-436). The obtained DNA was dissolved in TE buffer.

＜ユーカリ属植物多型的ＤＮＡの取得＞
得られたユーカリ属植物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＲＡＰＤ分析を行った。ＲＡＰＤ分析はゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー５’−ＣＣＡＧＣＧＴＡＴＴ−３’（配列番号８５）終濃度１μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）０．１ユニット、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ各２００μＭを加えた増幅用緩衝液２０μｌ中で行った。ＰＣＲサイクルはサーマルサイクラー（ＭＰ、宝酒造社製）中で、鋳型ＤＮＡを９５℃で５分間変性させ、変性：９５℃で１分間、アニーリング：３６℃で３０秒間、伸長反応：７２℃で１分間を１サイクルとして４５回繰り返した後、さらに７２℃で５分間伸長反応を行った。 <Acquisition of Eucalyptus plant polymorphic DNA>
RAPD analysis was performed using the obtained genomic DNA of Eucalyptus plants as a template. For RAPD analysis, genomic DNA 10 ng, primer 5′-CCAGCGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 85) final concentration 1 μM, Taq DNA polymerase (Roche) 0.1 unit, dATP, dTTP, dGTP, dCTP 200 μM each were added. Performed in 20 μl of buffer. PCR cycle was performed in a thermal cycler (MP, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) by denaturing the template DNA at 95 ° C for 5 minutes, denaturation: 95 ° C for 1 minute, annealing: 36 ° C for 30 seconds, extension reaction: 72 ° C for 1 minute. After repeating 45 times as one cycle, an extension reaction was further performed at 72 ° C. for 5 minutes.

次に、該ＰＣＲ反応液からＰＣＲ産物を分離させるために、１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行った。ＰＣＲ反応液９μｌとローディングバッファー１μｌを混合した後、１．５％アガロースゲルで、１００Ｖにて１時間電気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含むＴＡＥバッファー溶液に約３０分浸積し、アガロースゲル内のＤＮＡを染色した。その後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを検出した。 Next, in order to separate the PCR product from the PCR reaction solution, electrophoresis using a 1.5% agarose gel was performed. After 9 μl of the PCR reaction solution and 1 μl of the loading buffer were mixed, electrophoresis was performed on a 1.5% agarose gel at 100 V for 1 hour. After completion of the electrophoresis, the agarose gel was immersed in a TAE buffer solution containing 0.5 μg / ml ethidium bromide for about 30 minutes to stain the DNA in the agarose gel. Then, the ultraviolet-ray was irradiated in the dark place and the DNA band in a gel was detected.

複数増幅されるＤＮＡバンドの内、ユーカリ属植物個体間で多型的なバンドが１０３８ｂｐに観察された。このバンドをゲルごとカッターで切りだし、市販の精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、使用法に従い、ＤＮＡを回収、精製した。次にＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、使用法に従い、該ＰＣＲ産物をクローニングし、ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ社製のキャピラリーシーケンサーＣＥＱ８０００を用いて目的のＤＮＡ配列を決定し、配列番号１で表されるＤＮＡを得た。 Among a plurality of amplified DNA bands, a polymorphic band was observed at 1038 bp among Eucalyptus plant individuals. This band was cut out with a cutter together with the gel, and DNA was collected and purified using a commercially available purification kit (manufactured by QIAGEN) according to the method of use. Next, using the TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen), the PCR product is cloned according to the method of use, and the target DNA sequence is determined using the capillary sequencer CEQ8000 manufactured by BECKMAN COULTER. DNA was obtained.

同様にＲＡＰＤ分析において配列番号８６〜１１１のプライマーを用いることによって、２７本の多型的なＤＮＡバンドを検出した。さらに同様に該ＤＮＡバンドの塩基配列を決定し、配列番号２〜２８で表されるＤＮＡを得た。 Similarly, 27 polymorphic DNA bands were detected by using the primers of SEQ ID NOs: 86 to 111 in RAPD analysis. Further, the base sequence of the DNA band was determined in the same manner to obtain DNA represented by SEQ ID NOs: 2 to 28.

得られたＤＮＡ（配列番号１〜２８）を基に、該ＤＮＡの一部をＰＣＲ増幅可能なプライマーを設計し、配列番号２９〜８４で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを得た。 Based on the obtained DNA (SEQ ID NOs: 1-28), a primer capable of PCR amplification of a part of the DNA was designed to obtain oligonucleotide primers represented by SEQ ID NOs: 29-84.

＜配列番号１で表されるＤＮＡを利用したユーカリ属植物の個体識別＞
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を増幅するようなオリゴヌクレオチドＡＧＴＴＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧ（配列番号２９）とＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＡＣＣ（配列番号３０）（プライマーセット１）をプライマーとして用いるＰＣＲ法により、ユーカリ属植物３１個体の個体識別を行った。 <Individual identification of Eucalyptus plants using DNA represented by SEQ ID NO: 1>
By the PCR method using oligonucleotides AGTTAGGCCCAGGTCCATAAAGG (SEQ ID NO: 29) and TAGAAGCAAAACCCCCACCACC (SEQ ID NO: 30) (primer set 1) as primers to amplify a part of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, Individual identification of 31 plants was performed.

＜ＤＮＡ増幅＞
ＰＣＲ反応は全ＤＮＡ１０ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ各２００μＭ（最終濃度）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）０．５ユニットおよび添付の増幅反応用緩衝液２０μｌ中で行った。ＰＣＲサイクルは９５℃で２分間変性させた後、変性：９５℃で３０秒間、アニーリング：６５℃で３０秒間、伸長反応：７２℃で９０秒間のサイクルを３０回行った後、７２℃で５分間伸長反応を行った。 <DNA amplification>
The PCR reaction was performed in 10 ng of total DNA, 200 μM each of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP (final concentration), 0.5 unit of Taq DNA polymerase (Roche), and 20 μl of the attached amplification reaction buffer. The PCR cycle was denatured at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of denaturation: 95 ° C. for 30 seconds, annealing: 65 ° C. for 30 seconds, extension reaction: 72 ° C. for 90 seconds, and 5 cycles at 72 ° C. An extension reaction was performed for a minute.

次に該ＰＣＲ反応液からＰＣＲ産物を分離させるために、１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行った。ＰＣＲ反応液９μｌとローディングバッファー１μｌを混合した後、１．５％アガロースゲルで、１００Ｖにて１時間電気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含むＴＡＥバッファー溶液に約３０分浸積し、アガロースゲル内のＤＮＡを染色した。その後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを検出した。結果を図１に示す。 Next, in order to separate the PCR product from the PCR reaction solution, electrophoresis on a 1.5% agarose gel was performed. After 9 μl of the PCR reaction solution and 1 μl of the loading buffer were mixed, electrophoresis was performed on a 1.5% agarose gel at 100 V for 1 hour. After completion of the electrophoresis, the agarose gel was immersed in a TAE buffer solution containing 0.5 μg / ml ethidium bromide for about 30 minutes to stain the DNA in the agarose gel. Then, the ultraviolet-ray was irradiated in the dark place and the DNA band in a gel was detected. The results are shown in FIG.

図１に示すように、ＤＮＡバンドが検出される個体と検出されない個体を識別することができた。 As shown in FIG. 1, it was possible to distinguish an individual from which a DNA band was detected from an individual from which a DNA band was not detected.

図１はオリゴヌクレオチドセット番号１をプライマーとしてＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動パターンの一部である。図中、Ｍは電気泳動マーカーを示す。 FIG. 1 is a part of an agarose electrophoresis pattern after performing PCR using oligonucleotide set number 1 as a primer. In the figure, M represents an electrophoresis marker.

同様に配列番号２〜２８で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を増幅するようなオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号２９〜８４、プライマーセット２〜２８）をプライマーとして用いるＰＣＲ法により、ユーカリ属植物３１個体の個体識別を行った。 Similarly, eucalyptus is obtained by a PCR method using oligonucleotides (SEQ ID NOs: 29 to 84 and primer sets 2 to 28, respectively) that amplify a part of DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 28 as primers. Individual identification of 31 genus plants was performed.

以下の表１〜３に、供試した３１個体についてプライマーセット１〜２８で表されるオリゴヌクレオチドのセット（配列番号２９〜８４）をプライマーとして用いるＰＣＲにおけるＤＮＡ増幅の有無を記した。供試した３１個体はそれぞれ異なるＤＮＡ増幅のパターンを示した。 Tables 1 to 3 below show the presence or absence of DNA amplification in PCR using the oligonucleotide sets (SEQ ID NOs: 29 to 84) represented by primer sets 1 to 28 as primers for the 31 individuals tested. The 31 individuals tested each showed a different pattern of DNA amplification.

上記、表１〜３は、供試した３１個体について、プライマーセット１〜２８であらわされるオリゴヌクレオチド（配列番号２９〜８４）をプライマーとして用いるＰＣＲにおけるＤＮＡ増幅の有無を示したものである。ＤＮＡ増幅が認められた場合は「１」、認められなかった場合は「０」で、表記している。 Tables 1 to 3 show the presence or absence of DNA amplification in PCR using the oligonucleotides (SEQ ID NOs: 29 to 84) represented by primer sets 1 to 28 as primers for the 31 individuals tested. When DNA amplification is recognized, “1” is indicated, and when DNA amplification is not recognized, “0” is indicated.

これらの結果より、配列番号１〜２８で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を増幅するようなオリゴヌクレオチド（配列番号２９〜８４、プライマーセット１〜２８）をプライマーとして用いたＰＣＲによる分析結果を複数比較して用いることによって、ユーカリ属植物の個体識別が可能であることが示された。 From these results, analysis by PCR using oligonucleotides (SEQ ID NOs: 29 to 84, primer sets 1 to 28) that amplify a part of the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 28 as primers. It was shown that it was possible to identify Eucalyptus plants by comparing the results.

供試した３１個体についてプライマーセット１（配列番号２９および３０）をプライマーとして用い、ＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動のパターンの一部を示す。A part of the agarose electrophoresis pattern after performing PCR using the primer set 1 (SEQ ID NOs: 29 and 30) as primers for the 31 individuals tested is shown.

Claims

A method for identifying an individual in a Eucalyptus plant by detecting at least one DNA selected from the following DNAs (a) and (b):
(A) DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 28,
(B) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 28, and a plant belonging to the genus Eucalyptus DNA having polymorphism among individuals in the genomic DNA of.

The method according to claim 1, wherein the DNA is detected by using as a primer a set of oligonucleotides designed to amplify all or part of the DNA to be detected.

Using at least one primer selected from a primer comprising a base sequence comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 29 to 84 or a base sequence complementary to the base sequence, A method for identifying individuals in Eucalyptus plants by performing an amplification reaction using genomic DNA of the genus plants as a template.

Eucalyptus plant, Eucalyptus Daniai (Eucalyptus dunnii Maiden.), Eucalyptus globulus (Eucalyptus globulus Labill.), From the group consisting of Eucalyptus camaldulensis (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) And Eucalyptus Naitensu (Eucalyptus nitens Maiden.) 4. The method according to any one of claims 1 to 3, which is selected.

The following DNA (a) or (b):
(A) DNA comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 28,
(B) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 28, and a plant belonging to the genus Eucalyptus DNA having polymorphism among individuals in the genomic DNA of.

A primer comprising a base sequence comprising all or part of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 29 to 84 or a base sequence complementary to the base sequence.

A kit for identifying an Eucalyptus plant individual comprising the primer according to claim 6.