JP2007008933A - リン脂質−ｐｅｇ−生体分子コンジュゲートの合成法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、標的診断または治療およびにおける診断用または治療用リポソーム／ミセルの成分としての使用に適当なリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの製造法、かつ具体的にはリン脂質生体分子、例えばペプチド、コンジュゲートの合成、精製および分析の単純な方法を提供すること。
【解決手段】ペグ化リン脂質と生体分子を共有結合的付着によりカップリングさせ、得られたコンジュゲートを精製する工程により解決される。
【選択図】なし
【解決手段】ペグ化リン脂質と生体分子を共有結合的付着によりカップリングさせ、得られたコンジュゲートを精製する工程により解決される。
【選択図】なし
Description
本発明は、標的診断または治療およびにおける診断用または治療用リポソーム／ミセルの成分としての使用に適当なリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの製造法に関し、かつ具体的にはリン脂質生体分子、例えばペプチド、コンジュゲートの合成、精製および分析の単純な方法に関する。本発明は、故に、腫瘍細胞へのリポソーム／ミセルのターゲッティングの改善に、腫瘍細胞によるリポソームの取り込みの促進に、および腫瘍細胞への化学療法剤の選択的なリポソームでの送達のために使用できる、ミセルペプチドを提供する。
化学療法において、薬剤の一部のみしか癌細胞に到達せず、残りの薬剤は正常組織を傷害し得る。リポソームに被包された癌の薬の投与により、副作用を軽減できる１。その安定性を増加させるためおよび循環中のそれらの寿命を延長するための、改善されたリポソーム組成物が、記載されている２。このような組成物中で、Searsが、カルボキシＰＥＧと精製ダイズ・ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)をアミド結合を介して結合させた１９８４年から、モノメトキシポリエチレングリコール(ＰＥＧ)とコンジュゲートしたリン脂質が広く使用されている３。ＰＥＧのリポソーム表面上への添加は、リポソームを囲む水の殻を引き寄せる。この殻は様々な血漿タンパク質(オプソニン)のリポソーム表面への吸着を妨げ、故に、リポソームは網内系に認識されず、取り込まれない。促進された選択性は、リポソームの表面に標的細胞の原形質膜抗原を認識する特異的抗体または小ペプチドを結合させ、細胞によるリポソームの取り込みを増加させることにより得ることができる４。ターゲッティング・リポソームの現在の認識は最近１０年で著しく増えている。最近の標的リポソームの利点が近年レビューされている５。
リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートを提供するための数種の合成法が存在している。該コンジュゲートは、２種の異なる方法で製造できる。第一に、適当に誘導体化されたリン脂質−ＰＥＧ分子を予め製造したリポソームに組み込み、次いでそれを生体分子(抗体、ペプチドなど)とインキュベートする。この方法において、生体分子は適当に官能化されてなければならず、これがこの方法の欠点の一つである。第２に、全構築物リン脂質−ＰＥＧ−生体分子を合成し、その後、それをリポソームに組み込む。この方法の利点は、コンジュゲートを組み込み前に分析できることを含み、これは先の方法ではできなかった。他方、該コンジュゲートはまたクロマトグラフィーで精製する必要がある。
リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの製造のために提示されている合成法は、また、使用する反応媒体に基づいて、２カテゴリーに分類できる。液相および固相法が存在する。液相法は有機溶媒(ハロゲン化されているまたはジメチルホルムアミド)または、緩衝化水中で行うことができる。反応相手(リン脂質−ＰＥＧおよび生体分子、例えばペプチド)は、望ましくない副反応を避けるために、適切な官能基を有しなければならない。一般的な反応相手は、活性化エステルと１級アミノ官能性(アミド結合の形成)６および電子吸引性基とコンジュゲートした二重結合とチオール官能性(ミカエル付加を介したチオエーテルの形成)７である。リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドの固相合成はほとんど例が存在しない８。それらは、一般に、対応する液相における反応よりも、固相中のＰＥＧの遅い反応性のために、より複雑で時間がかかる反応である。
リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートは、カップリング反応後に精製する必要がある。いくつかのクロマトグラフィー法が精製のために使用されている。リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートは、シリカゲル、逆相シリカまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製でき、透析もまた、生体分子／ペプチドの性質に依存して使用できる。シリカゲルクロマトグラフィーは、固定相と溶出物(elute)の間の親水性相互作用に基づき、逆相は疎水性相互作用に基づく。サイズ排除クロマトグラフィーは、最大分子が最初にカラムから出てくるように、サイズでの分子の解離に基づく。リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートは両親媒性であり、水溶液中でミセルを形成する傾向にあり、それらは最初にカラムから溶出される。
Lasic, D., Ceh, B., Stuart, M., Guo, L., Frederik, P., and Barenholz, Y. Biochim. Biophys. Acta 1239: 145-156, 1995 Tardi, P., Boman, N., and Cullis, P. J. Drug 標的. 4: 129-140, 1996 Sears, B. D. (1984). US Patent 4,426,330 a)Storm, G., and Crommelin, D. Pharm. Sci. & Tech. Today 1: 19-31, 1998. b)Dagar, S., Sekosan, M., Lee, B., Rubinstein, I., and Oenyueksel, H. J. of Contr. Rel. 74: 129-134, 2001. c)Penate Medina, O., Soederlund, T., Laakkonen, L., Tuominen, E., Koivunen, E., and Kinnunen, P. Cancer Res. 61: 2978-2985, 2001 Torchilin, V.P. Nat. Rew. Drug Disc.145-160, 2005 a)Torchilin, V.P., Rammohan, R., Weissig, V., Levchenko, T.S. Proc. Of Nat. Acad. Of Scien. 98: 8786-8791, 2001. b)Maeda, N., Takeuchi, Y., Takada, M., Namba, Y., Oku, N. Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 1015-1017, 2004. c)Decicco, C.P., Nelson, D.J., Barrett, J.A., Carpenter A.J., Duran, J.J., Rajopadhye, M. Patent WO 0160820 a)Tseng, Y-L., Liu, J-J., Hong, R-L. Mol. Pharm. 62:864-872, 2002. b)Schiffelers, R.M., Koning, G.A., ten Hagen, T.L.M., Fens, M.H.A.M., Schraa, A.J., Janssen, A.P.C.A., Kok, R.J., Molema, G., Storm, G. Jour. Of Controll. Rel. 91: 115-122, 2003 a)Jensen, T.V., Hu, B-H., Delatore, S.M., Garcia, A.S., Messersmith, P. B., Miller, W.M. J. Am. Chem. Soc. 126: 15223-15230, 2004. b)Wu, S-K. (2003)EＰ1319667 A2 Carpenter, A. P. (2001). WO 01/60416 A2 Zhu, Y. (2005)WO 2005/037862 A1 Koivunen, E., Ranti, T-M., Annila, A., Taube, S., Uppala, A., Jokinen, M., van Villigen, G., Ihanus, E., Gahmberg, C.G. J. Cell Biol. 153:905-915, 2001 Stefanidakis, M., Bjoerklund, M., Ihanus, E., Gahmberg, C.G. J. Biol. Chem. 278:34674-34684, 2003 Zhu, L., Parr, G.R., Fitzgerald, M.C., Nelson, C.M., Smith, L.M. J. Am. Chem. Soc. 117:6048-6056, 1995
Lasic, D., Ceh, B., Stuart, M., Guo, L., Frederik, P., and Barenholz, Y. Biochim. Biophys. Acta 1239: 145-156, 1995 Tardi, P., Boman, N., and Cullis, P. J. Drug 標的. 4: 129-140, 1996 Sears, B. D. (1984). US Patent 4,426,330 a)Storm, G., and Crommelin, D. Pharm. Sci. & Tech. Today 1: 19-31, 1998. b)Dagar, S., Sekosan, M., Lee, B., Rubinstein, I., and Oenyueksel, H. J. of Contr. Rel. 74: 129-134, 2001. c)Penate Medina, O., Soederlund, T., Laakkonen, L., Tuominen, E., Koivunen, E., and Kinnunen, P. Cancer Res. 61: 2978-2985, 2001 Torchilin, V.P. Nat. Rew. Drug Disc.145-160, 2005 a)Torchilin, V.P., Rammohan, R., Weissig, V., Levchenko, T.S. Proc. Of Nat. Acad. Of Scien. 98: 8786-8791, 2001. b)Maeda, N., Takeuchi, Y., Takada, M., Namba, Y., Oku, N. Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 1015-1017, 2004. c)Decicco, C.P., Nelson, D.J., Barrett, J.A., Carpenter A.J., Duran, J.J., Rajopadhye, M. Patent WO 0160820 a)Tseng, Y-L., Liu, J-J., Hong, R-L. Mol. Pharm. 62:864-872, 2002. b)Schiffelers, R.M., Koning, G.A., ten Hagen, T.L.M., Fens, M.H.A.M., Schraa, A.J., Janssen, A.P.C.A., Kok, R.J., Molema, G., Storm, G. Jour. Of Controll. Rel. 91: 115-122, 2003 a)Jensen, T.V., Hu, B-H., Delatore, S.M., Garcia, A.S., Messersmith, P. B., Miller, W.M. J. Am. Chem. Soc. 126: 15223-15230, 2004. b)Wu, S-K. (2003)EＰ1319667 A2 Carpenter, A. P. (2001). WO 01/60416 A2 Zhu, Y. (2005)WO 2005/037862 A1 Koivunen, E., Ranti, T-M., Annila, A., Taube, S., Uppala, A., Jokinen, M., van Villigen, G., Ihanus, E., Gahmberg, C.G. J. Cell Biol. 153:905-915, 2001 Stefanidakis, M., Bjoerklund, M., Ihanus, E., Gahmberg, C.G. J. Biol. Chem. 278:34674-34684, 2003 Zhu, L., Parr, G.R., Fitzgerald, M.C., Nelson, C.M., Smith, L.M. J. Am. Chem. Soc. 117:6048-6056, 1995
我々は、本明細書で、リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの改善された合成法を記載する。本発明の方法において使用された出発物質対反応速度加速剤の比率などの反応変数は、スクリーニング段階で定義している。最適反応条件は、大規模反応に変換できる。さらに、生成物の単純かつ有効な単離法が開発されている。生成物の誘導体化は、反応の進行のモニタリングおよび生成物の分析の両方のためのクロマトグラフィーによる分析を可能にする。
発明の詳細な記載
本発明は、リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートを製造するための改善された製造方法を記載する。リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートを製造するための該製造法は、下記工程を含み得る：
１. ペグ化リン脂質とペプチドの間のカップリング反応の小規模最適化工程。
２. リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの誘導体化による最適化データのクロマトグラフィーによる分析。
３. 大規模合成のための最適化パラメーターの挿入。
４. 沈殿法および必要であればＨＰＬＣによる、リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの精製。
５. リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの誘導体化による生成物純度のクロマトグラフィーによる分析。
本発明は、リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートを製造するための改善された製造方法を記載する。リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートを製造するための該製造法は、下記工程を含み得る：
１. ペグ化リン脂質とペプチドの間のカップリング反応の小規模最適化工程。
２. リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの誘導体化による最適化データのクロマトグラフィーによる分析。
３. 大規模合成のための最適化パラメーターの挿入。
４. 沈殿法および必要であればＨＰＬＣによる、リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの精製。
５. リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの誘導体化による生成物純度のクロマトグラフィーによる分析。
最適化工程、分析工程および精製工程の情報を、より大きな工程規模に変換できる。
最適化工程において、小規模合成を、反応のいくつかの変数、例えば過剰のアシル化試薬および反応添加剤を使用して行った。これらの最適化反応は、リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの誘導体化後にＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により得た。最適化工程の分析から反応条件が得られた後、該反応をより大きな規模で行うことができた。反応の結果は、開発用(developed)ＨＰＬＣ法を使用して分析し、未反応リン脂質−ＰＥＧをリン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートから分離する有効な分離工程により精製する。
リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの製造のための本発明の方法は、ペグ化リン脂質と生体分子を、共有結合的付着によりカップリングし、そして得られたコンジュゲートを精製する工程を含み、ペグ化リン脂質を、生体分子の量と比較して過剰で使用する、カップリング工程を無機添加剤の添加により加速する、および得られたリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートを、沈殿法により精製することを特徴とする。
本発明の最も好ましい態様において、生体分子は、リン脂質−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのカルボキシ官能性と共有結合すべき遊離１級アミノ官能性を有するすべてのペプチドである。該ペプチドは第一にＰＥＧリン脂質、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端基に付着(結合)する。本発明の方法で使用する好ましいペプチドは、(Ｅ−シクロ−(ＲＧＤｆＫ)２)、ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２、Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２、Ａｃ−ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣＫ−ＮＨ２、ＹＱＧＤＡＨＧＤＤＤＥＬおよびＹＡＤＧＡＣ１−８ＰＣ３−９ＦＬＬＧＣＣペプチドである。
我々は、不溶性無機添加剤の反応混合物への過剰の添加が、カップリング反応を著しく加速することを発見した。例えば、反応が立体障害のために進行しないとき、無機添加剤を生成物の形成の加速に使用できる。等モル量のこれらの塩を類似の反応に使用する一つの例が文献中に存在するが、積極的な加速の効果は記載されていなかった９。反応速度の加速剤としてのこれらの不溶性添加剤の正確は役割は正確には知られていない。それらを、求核性塩基であり、エステルおよびアミドの合成に一般的に使用されるＤＭＡＰ(ジメチルアミノピリジン)のような有機添加剤と比較したとき、無機添加剤は類似の経路では働かない。反応活性化の一つの可能性のある理由は、ペプチドの三次元構造を開け、アミンとアシル官能性の間の反応を可能にする弱ルイス酸−塩基付加物の形成である。
本発明の方法で使用する無機添加剤は、最も好ましくは無機塩基および無機乾燥剤の混合物である。適当な無機塩基は、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属またはランタニドの炭酸塩または重炭酸塩であり、その中で、アルカリおよびアルカリ土類金属炭酸塩である炭酸リチウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムが好ましい。適当な無機乾燥剤は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の硫酸塩、好ましくは硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウムである。
出発物質の比率は、生体分子の量に対してリン脂質−ＰＥＧの等モル量から１０倍モル当量の間で変化し得る。無機添加剤の量は、生体分子の１０から１００モル当量であり得る。必要なとき、過剰のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳおよび無機添加剤を使用して、ペプチドを消費させることより最後まで反応をさせることができる。
過剰なＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳを、単純に沈殿法を繰り返すことにより生成物から除去する。最初の沈殿は、反応混合物に、下記に定義の適当な溶媒または溶媒混合物を添加することにより行う。反応の原料を次いで適当なアルコール、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノールまたはｔ−ブタノールに溶解する。非反応性リン脂質−ＰＥＧのリン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートからの分離を、次いで適当な溶媒または溶媒混合物、例えば適当なアルキルエーテルもしくはモル過剰のリン脂質−ＰＥＧが溶媒相に残っているとき、アルコールと１相を形成し、かつリン脂質−ＰＥＧ−ペプチドを沈殿させるのに適当に疎水性である任意の他の溶媒の添加により行い得る。適当な溶媒または溶媒混合物は、リン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートをアルコール溶液から沈殿させ、生成物を単離できる。この沈殿法により、生成物精製のために、費用も時間もかかるクロマトグラフィー法の使用を回避する。沈殿法により精製後、生成物を適当に緩衝化した水溶液に溶解し、凍結および凍結乾燥できる。
初期の反応混合物を、ジメチルホルムアミドからジエチルエーテルにより沈殿させ、残存固体物質をジメチルホルムアミドに再溶解し、ジエチルエーテル沈殿を繰り返した１０。本発明の新規改変沈殿法の一つの利点は、残存ジメチルホルムアミドを固体生成物から、再溶解工程においてアルキルアルコールにより除去できることである。また、アルコールがジメチルホルムアミドよりも目的のペプチドにとって悪い可溶化剤であるため、生成物沈殿のために小量のジエチルエーテルしか必要ではない。さらに、ジメチルホルムアミドが非揮発性であり、かつ凍結乾燥により除去できないとの事実により、揮発性アルキルアルコールの使用が本方法の利点となる。
ペプチドとＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのカップリング反応はモニタリングでき、生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣにより、沈殿反応混合物からの小量のサンプルの塩基性鹸化後に同定できる。我々は、ジアシルエステルの塩基性加水分解が化合物の疎水性を減少させ、従って、加水分解された残存ＰＥＧ化ペプチドが通常のＣ−１８逆相クロマトグラフィーを使用して分析できることを発見した。精製および分析工程のこの組み合わせは費用効率がよく、かつリン脂質−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートの正確な合成法である。これはすべてのリン脂質およびペプチドに適用できる。
実験
本実施例で使用するペプチドは、すべて、ファージディスプレイ法により元々発見された。それらを構造的に多様なペプチドをカバーするために選択する。ペプチドＫ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２およびＣＴＴ２−Ｋは、ＣＴＴ２ペプチドの誘導体である。それらを表１に示し、分子構造を図４に示す。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＣＴＴ２の分子構造を図３に示す。
本実施例で使用するペプチドは、すべて、ファージディスプレイ法により元々発見された。それらを構造的に多様なペプチドをカバーするために選択する。ペプチドＫ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２およびＣＴＴ２−Ｋは、ＣＴＴ２ペプチドの誘導体である。それらを表１に示し、分子構造を図４に示す。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＣＴＴ２の分子構造を図３に示す。
実施例１. ペプチドカップリング反応の最適化：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＲＧＤ
この方法において、無機添加剤および出発物質の比率の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングしたＲＧＤ(Ｅ−シクロ−(ＲＧＤｆＫ)２)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドとＰＥＧリン脂質であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳの等モル比率を反応１および２で使用した。反応３において、３当量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを反応２および３に添加した。
この方法において、無機添加剤および出発物質の比率の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングしたＲＧＤ(Ｅ−シクロ−(ＲＧＤｆＫ)２)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドとＰＥＧリン脂質であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳの等モル比率を反応１および２で使用した。反応３において、３当量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを反応２および３に添加した。
ＲＧＤペプチド１.１mg(１当量)およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ ６.１mg(１.６７当量)を、別々に６００μlのジメチルホルムアミドに溶解した。ＲＧＤペプチド溶液を各２００μlの３バイアルに分けた。バイアル１および２に、１５０μlのＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ溶液をおよび３００μlをバイアル３に添加した。無機添加剤を下記の通り添加した：バイアル２に７.５mgの炭酸ナトリウムおよび３.１mgの硫酸ナトリウムを添加した。バイアル３に８mgの炭酸ナトリウムおよび５.３mgの硫酸ナトリウムを添加した。反応物を室温で撹拌した。
サンプル２５μl容量をすべての反応物から反応開始後３０分、６０分および１８０分ならびに２１時間の時点で採取した。反応を２１時間後にクエンチした。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を−７０℃にした。
サンプルを１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ(図２ａ)で分析した。
実施例２. 大規模ペプチドカップリング反応：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＲＧＤ
この方法において、ＲＧＤ(Ｅ−シクロ−(ＲＧＤｆＫ)２)ペプチドを、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドとＰＥＧリン脂質の異なるモル比、ならびに反応時間を試験して、カップリング反応を最適化した。
この方法において、ＲＧＤ(Ｅ−シクロ−(ＲＧＤｆＫ)２)ペプチドを、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドとＰＥＧリン脂質の異なるモル比、ならびに反応時間を試験して、カップリング反応を最適化した。
ＲＧＤペプチド１０mg(１当量)、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ ９７.１mg(３当量)を２.５mlのジメチルホルムアミドに溶解した。反応混合物を一晩室温で振盪させた。
精製
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。４２００rpm、２０分遠心分離後、固体残渣をメタノール２mlに溶解した。ジエチルエーテル８mlメタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、２０分)後、上清を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後、固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物３３.４mgを白色固体として得た。
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。４２００rpm、２０分遠心分離後、固体残渣をメタノール２mlに溶解した。ジエチルエーテル８mlメタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、２０分)後、上清を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後、固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物３３.４mgを白色固体として得た。
生成物の純度のモニタリング
サンプル(２５μl容量)を、反応のクエンチの直前に全反応混合物から採取した。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。加水分解生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９８％であった。
サンプル(２５μl容量)を、反応のクエンチの直前に全反応混合物から採取した。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。加水分解生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９８％であった。
実施例３. ペプチドカップリング反応の最適化：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＣＴＴ２
この方法において、ＣＴＴ２(シクロ−ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドとＰＥＧリン脂質の異なるモル比、ならびに反応時間を試験して、カップリング反応を最適化した。
この方法において、ＣＴＴ２(シクロ−ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドとＰＥＧリン脂質の異なるモル比、ならびに反応時間を試験して、カップリング反応を最適化した。
８.８mgのＣＴＴ２ペプチドを２mlのジメチルホルムアミドに溶解した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを２mlのジメチルホルムアミドに溶解した。ＣＴＴ２ペプチド溶液を各５００μlの４個の反応容器に分け、続いてＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ溶液を、４００μlの溶液を１および２に、ならびに６００μlを容器３および４に添加するように添加した。さらに２００μlのＤＭＦを反応容器１および２に添加し、反応容器中のペプチド濃度を等しくした。
２５μl容量のサンプルををすべての反応物から反応開始後３０分、６０分および１８０分の時点で採取した。反応１および２を３時間後、ならびに反応３および４を２１時間後にクエンチした。反応３および４からのさらなるサンプルもまた２１時間後に採取した。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を−７０℃にした。
サンプルを１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した(図２ｂ)。反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。遠心(４２００rpm、２０分)後、固体残渣を５００μl メタノールに溶解し、ＴＬＣ分析のための２μl サンプルを採取した。２mlのジエチルエーテルを、メタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心後、ＴＬＣ用の１０μl サンプルを上清から採取した。固体残渣をメタノールに溶解し、沈殿を繰り返した。
固体残渣を５００μlのメタノールに溶解し、続いて２.５mlの蒸留水を添加した。溶液を−７０℃で凍結し、一晩凍結乾燥させた。生成物を白色固体として得た。反応１、２、３および４の収量は５.１mg、５.６mg、５.６mgおよび５.９mgであった。
実施例４. ペプチドカップリング反応の最適化
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２
この方法において、無機添加剤の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングしたＫ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２(シクロ−Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドおよびＰＥＧリン脂質であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳの等モル比率を全反応で使用した。炭酸ナトリウムを反応２の添加剤として使用し、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを反応３に添加した。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２
この方法において、無機添加剤の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングしたＫ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２(シクロ−Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。ペプチドおよびＰＥＧリン脂質であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳの等モル比率を全反応で使用した。炭酸ナトリウムを反応２の添加剤として使用し、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを反応３に添加した。
シクロ−Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２ペプチド２.５mg(１当量)およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ ４.８mg(１当量)を、別々に６００μlのジメチルホルムアミドに溶解した。ペプチド溶液およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ溶液を、各々化合物あたり２００μlの３バイアルに分けた。無機添加剤を下記の通り添加した：バイアル２に３.３mgの炭酸ナトリウムを添加した。バイアル３に３.９mgの炭酸ナトリウムおよび９.４mgの硫酸ナトリウムを添加した。反応物を室温で撹拌した。２５μl容量のサンプルをすべての反応物から反応開始後１５分、３０分、６０分および１８０分ならびに２１時間の時点で採取した。反応を２１時間後クエンチした。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を−７０℃にした。
サンプルを１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した(図２ｃ)。
実施例５. 大規模ペプチドカップリング反応
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２
この方法において、Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２(シクロ−Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２
この方法において、Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２(シクロ−Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。
Ｋ(ＤＯＴＡ)−ＣＴＴ２ペプチド５.６mg(１当量)、ＤＳＰＥ−ｐｅｇ３４００−ＮＨＳ ４０.１mg(４当量)、炭酸ナトリウム１２.９mgおよび硫酸ナトリウム１０mgを１.０mlのジメチルホルムアミドに溶解した。反応混合物を一晩室温で振盪させた。
精製
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。３０００rpm、１５分遠心後、固体残渣を０.５ml メタノールに溶解した。ジエチルエーテル２.５mlメタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、１５分)後、溶媒相を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後、固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１１.８mgを白色固体として得た。加水分解生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９２.３％であった。
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。３０００rpm、１５分遠心後、固体残渣を０.５ml メタノールに溶解した。ジエチルエーテル２.５mlメタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、１５分)後、溶媒相を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後、固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１１.８mgを白色固体として得た。加水分解生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９２.３％であった。
実施例６. ペプチドカップリング反応の最適化：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＬＬＧ
この方法において、無機添加剤および出発物質の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングさせたＬＬＧ(ビシクロ−ＹＡＤＧＡＣ１−８ＰＣ３−９ＦＬＬＧＣＣ)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。モル比率１：２および１：３のペプチドとＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを開始９０分後に反応混合物に添加した。
この方法において、無機添加剤および出発物質の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングさせたＬＬＧ(ビシクロ−ＹＡＤＧＡＣ１−８ＰＣ３−９ＦＬＬＧＣＣ)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。モル比率１：２および１：３のペプチドとＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを開始９０分後に反応混合物に添加した。
ＬＬＧペプチド２.２mg(１当量)およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ １７mg(２.５当量)を、別々に５００μlのジメチルホルムアミドに溶解した。ＬＬＧペプチド溶液を各２５０μlの２バイアルに分けた。バイアル１および２に、２００および３００μlのＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ溶液を添加した。無機添加剤を開始９０分後に添加した。バイアル１に４.６mgの炭酸ナトリウムおよび３mgの硫酸ナトリウムを添加した。バイアル２に６,５mgの炭酸ナトリウムおよび６,２mgの硫酸ナトリウムを添加した。反応物を室温で撹拌した。
サンプル２５μlをすべての反応物から反応開始後３０分、９０分、１２０分、２４０分ならびに２３時間および４７時間の時点で採取した。反応を２３時間後にクエンチした。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を−７０℃にした。
サンプルを１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した(図２ｄ)。
実施例７. 大規模ペプチドカップリング反応：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＬＬＧ
この方法において、ＬＬＧ(ビシクロ−ＹＡＤＧＡＣ１−８ＰＣ３−９ＦＬＬＧＣＣ)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。
この方法において、ＬＬＧ(ビシクロ−ＹＡＤＧＡＣ１−８ＰＣ３−９ＦＬＬＧＣＣ)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。
ＬＬＧペプチド５.４mg(１当量)、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ ５０.８mg(３当量)、炭酸ナトリウム１８.４mgおよび硫酸ナトリウム８.４mgを１.５mlのジメチルホルムアミドに溶解した。反応混合物を一晩室温で振盪させた。
精製
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。３０００rpm、１５分遠心後、固体残渣をメタノール０.５mlに溶解した。ジエチルエーテル３mlをメタノールフラクション含有生成物に添加し、生成物層は黄色油状物として分離した。遠心(１０００rpm、２０分)後、ジエチルエーテル層を捨て、残存黄色油状物をジエチルエーテルにより沈殿させた。ジエチルエーテルを捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後、固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１９.７mgを白色固体として得た。加水分解生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９２.５％であった。
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。３０００rpm、１５分遠心後、固体残渣をメタノール０.５mlに溶解した。ジエチルエーテル３mlをメタノールフラクション含有生成物に添加し、生成物層は黄色油状物として分離した。遠心(１０００rpm、２０分)後、ジエチルエーテル層を捨て、残存黄色油状物をジエチルエーテルにより沈殿させた。ジエチルエーテルを捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後、固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１９.７mgを白色固体として得た。加水分解生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９２.５％であった。
実施例８. ペプチドカップリング反応の最適化：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＤＤＤＥＬ
この方法において、無機添加剤および出発物質の比率の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングさせたＤＤＤＥＬ(ＹＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬ)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。モル比１：２および１：３のペプチドおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを開始９０分後に反応混合物に添加した。
この方法において、無機添加剤および出発物質の比率の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングさせたＤＤＤＥＬ(ＹＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬ)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。モル比１：２および１：３のペプチドおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを開始９０分後に反応混合物に添加した。
ＤＤＤＥＬペプチド２.２mg(１当量)およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ １６,７mg(２.５当量)を、別々に５００μlのジメチルホルムアミドに溶解した。ＤＤＤＥＬペプチド溶液を各２５０μlの２バイアルに分けた。バイアル１および２に２００および３００μlのＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＳＰＡ溶液を添加した。無機添加剤を開始９０分後に添加した。バイアル１に６,５mgの炭酸ナトリウムおよび６,２mgの硫酸ナトリウムを添加した。バイアル２に８mgの炭酸ナトリウムおよび３,２mgの硫酸ナトリウムを添加した。反応物を室温で撹拌した。
サンプル２５μlをすべての反応物から反応開始後３０分、９０分、１２０分、２４０分および２３時間、４７時間の時点で全反応物から採取した。反応を２３時間後にクエンチした。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分で遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を−７０℃にした。サンプルを１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した(図２ｅ)。
実施例９. 大規模ペプチドカップリング反応：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＤＤＤＥＬ
この方法において、ＤＤＤＥＬ(ＹＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬ)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。
この方法において、ＤＤＤＥＬ(ＹＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬ)ペプチドをＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介して共有結合的に付着させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。
ＤＤＤＥＬペプチド５.３mg(１当量)、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ ５９mg(３当量)、炭酸ナトリウム２２.９mgおよび硫酸ナトリウム１４.１mgを１.５mlのジメチルホルムアミドに溶解した。反応混合物を一晩室温で振盪させた。
精製
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。３０００rpm、１５分遠心後、固体残渣をメタノール０.５mlに溶解した。ジエチルエーテル２mlを、メタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、１５分)後、溶媒相を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１３.２mgを白色固体として得た。加水分解した原生成物の純度は、Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して５７.６％であった。生成物の最終精製をＳＥ−ＨＰＬＣで行った。加水分解したＳＥ−ＨＰＬＣ精製生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９５.５％であり、生成物の収量は４.７mgであった。
反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。３０００rpm、１５分遠心後、固体残渣をメタノール０.５mlに溶解した。ジエチルエーテル２mlを、メタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、１５分)後、溶媒相を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１３.２mgを白色固体として得た。加水分解した原生成物の純度は、Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して５７.６％であった。生成物の最終精製をＳＥ−ＨＰＬＣで行った。加水分解したＳＥ−ＨＰＬＣ精製生成物の純度はＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣで測定して９５.５％であり、生成物の収量は４.７mgであった。
実施例１０. ペプチドカップリング反応の最適化：ＣＴＴ２Ｋ−ＰＥＧ３４００−ＤＳＰＥ
この方法において、無機添加剤の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングしたＣＴＴ２Ｋ(シクロ−Ａｃ−ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣＫ−ＮＨ２)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。モル比１：３のペプチドおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを反応混合物に添加した。
この方法において、無機添加剤の影響を、ＰＥＧリン脂質に、ペプチドの末端アミンとＰＥＧリン脂質のポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖の末端の官能性ＮＨＳ(ヒドロキシスクシンイミジル)基の化学反応を介してカップリングしたＣＴＴ２Ｋ(シクロ−Ａｃ−ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣＫ−ＮＨ２)ペプチドについて試験した。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性スクシンイミジルエステルの間の反応は、安定なアミド結合を形成する。モル比１：３のペプチドおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳを使用した。炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを反応混合物に添加した。
ＣＴＴ２Ｋペプチド１.８mg(１当量)およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ １１mg(３当量)を、別々に３００μlのジメチルホルムアミドに溶解した。ＣＴＴ２Ｋペプチド溶液を各２５０μlの２バイアルに分けた。バイアル１および２に、３００μlのＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ溶液を添加した。バイアル１に４.７mgの炭酸ナトリウムおよび５.８mgの硫酸ナトリウムを添加した。反応物を室温で撹拌した。
サンプル２５μlをすべての反応物から反応開始後３０分、６０分、１８０分および２３時間の時点で採取した。反応を２２時間後クエンチした。サンプルをジエチルエーテルの添加により沈殿させ、１３２００rpm、１０分遠心分離した。上清を捨て、固体残渣を−７０℃にした。サンプルを１００μlのメタノールに溶解し、２５μlの１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加した。２時間後、２５０μlの１％ＴＦＡ水溶液をサンプルに添加し、遠心分離後サンプルをＣ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した(図２ｆ)。
精製
バイアル１からの反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。遠心(３０００rpm、１５分)後、固体残渣を０.４ml メタノールに溶解した。ジエチルエーテル１.６mlメタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、１５分)後、上清を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１.４mgを白色固体として得た。
バイアル１からの反応混合物を、反応容量の１０倍のジエチルエーテルの添加により沈殿させた。遠心(３０００rpm、１５分)後、固体残渣を０.４ml メタノールに溶解した。ジエチルエーテル１.６mlメタノールフラクションおよび生成物沈殿物を含む生成物に添加した。遠心(１０００rpm、１５分)後、上清を捨て、沈殿工程を繰り返した。２回目の沈殿後固体残渣を水に溶解し、凍結および凍結乾燥した。生成物１.４mgを白色固体として得た。
リン脂質−ＰＥＧ３４００−ペプチドの分子同一性の分析
カップリング反応の進行をＴＬＣ−プレートおよびＣ１８−ＲＰＨＰＬＣで追跡した。生成物の純度(カップリングしたペプチドの反応に元々入れたペプチドの量に対する比率)をＣ１８−ＲＰＨＰＬＣで測定した。リン脂質−ＰＥＧ３４００−ペプチドコンジュゲートの分子量を、ＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ ＭＳ分光光度計で、窒素レーザーを備え、３３７nmで作動するUltraflex TOF/TOF instrument(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)を使用したマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量飛行時間型(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)質量分光分析を使用して行った。質量スペクトルを、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして、かつペプチド較正基準(Bruker part # 206195)またはタンパク質較正基準Ｉ(Bruker part # 206355)の外部較正と共に使用して、陽イオンリニアモードおよび／またはリフレクターモードで獲得した。
カップリング反応の進行をＴＬＣ−プレートおよびＣ１８−ＲＰＨＰＬＣで追跡した。生成物の純度(カップリングしたペプチドの反応に元々入れたペプチドの量に対する比率)をＣ１８−ＲＰＨＰＬＣで測定した。リン脂質−ＰＥＧ３４００−ペプチドコンジュゲートの分子量を、ＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ ＭＳ分光光度計で、窒素レーザーを備え、３３７nmで作動するUltraflex TOF/TOF instrument(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)を使用したマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量飛行時間型(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)質量分光分析を使用して行った。質量スペクトルを、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして、かつペプチド較正基準(Bruker part # 206195)またはタンパク質較正基準Ｉ(Bruker part # 206355)の外部較正と共に使用して、陽イオンリニアモードおよび／またはリフレクターモードで獲得した。
全分子の分子量はＭＡＬＤＩ−ＭＳから得られなかった。リン脂質−ＰＥＧ３４００−ペプチドコンジュゲートの分子断片化が全サンプルで観察された。断片化は、グリセロールとホスホジエステルの間のＣ−Ｏ結合の開裂に対応する。形成された種１,２−プロピル−ジ−ステアリルカチオンが全スペクトルで観察された。生成物の均質性は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００−ＣＴＴ２ペプチドの加水分解により、ならびに、加水分解生成物がＴＬＣ−プレートでより遅く動くとの観察により証明された(図５)。これは、断片化がＭＡＬＤＩ ＭＳにおいて起こるとの観察を証明する。対応する断片化(ホスホジエステルの開裂)がまたＤＮＡのＭＡＬＤＩ ＭＳ分析で観察された１３。
Claims (15)
- ペグ化リン脂質と生体分子を共有結合的付着によりカップリングさせ、得られたコンジュゲートを精製する工程を含み、ここで
−ペグ化リン脂質を、生体分子の量と比較して過剰で使用する、
−カップリング工程を無機添加剤により加速する、そして
−得られたリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートを、沈殿法により精製するものである、
リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの製造法。 - 無機添加剤が無機塩基と無機乾燥剤の混合物である、請求項１記載の方法。
- 無機塩基がアルカリ金属、アルカリ土類金属およびランタニド金属の炭酸塩および重炭酸塩から成る群から選択される、請求項２記載の方法。
- アルカリ金属およびアルカリ土類金属の炭酸塩が炭酸リチウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムである、請求項３記載の方法。
- 無機乾燥剤が、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の硫酸塩から成る群から選択される、請求項２記載の方法。
- 硫酸塩が硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウムである、請求項５記載の方法。
- 無機添加剤を、生体分子の量と比較して過剰で使用する、請求項１記載の方法。
- 沈殿が
(ａ)適当な溶媒または溶媒混合物を反応混合物に添加し、
(ｂ)適当なアルコール中に反応物質を溶解し、
(ｃ)溶解した反応混合物を溶媒または溶媒混合物で処理して、リン脂質−ＰＥＧ−生体分子沈殿物を得て、
(ｄ)沈殿物を単離し、そして、所望により、溶媒で洗浄し、再単離し、
(ｄ)所望によりアルコール溶液からの沈殿法を繰り返し、そして
(ｅ)所望により、精製生成物を適当に緩衝化した水溶液に溶解し、凍結および凍結乾燥する
工程を含む、請求項１記載の方法。 - アルコール溶液からの沈殿工程を、アルコールと１相を形成し、かつリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートを沈殿させるのに適当に疎水性である溶媒または溶媒混合物により行う、請求項８記載の方法。
- 溶媒または溶媒混合物がアルキルエーテルを含む、請求項９記載の方法。
- 溶媒または溶媒混合物がジエチルエーテルを含む、請求項１０記載の方法。
- アルコールがメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノールまたはｔ−ブタノールから成る群から選択される、請求項８記載の方法。
- 生体分子が(Ｅ−シクロ−(ＲＧＤｆＫ)２)、ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２、Ｋ(ＤＯＴＡ)ＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−ＮＨ２、Ａｃ−ＧＲＥＮＹＨＧＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣＫ−ＮＨ２、ＹＱＧＤＡＨＧＤＤＤＥＬおよびＹＡＤＧＡＣ１−８ＰＣ３−９ＦＬＬＧＣＣから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
- 得られたリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの純度をリン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの誘導体化後にクロマトグラフィーで分析する、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
- リン脂質−ＰＥＧ−生体分子コンジュゲートの誘導体化が、加水分解された残存ペグ化生体分子を得るためのジアシルエステルの塩基性加水分解を含む、請求項１４記載の方法。
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