JP2007006799A - プラスミドｄｎａの精製方法及びプラスミドｄｎａ精製用キット - Google Patents

Abstract

【課題】 高純度のプラスミドＤＮＡを簡便に且つ短時間で、大量に精製することが可能なプラスミドＤＮＡの精製方法を提供する。
【解決手段】 細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファで懸濁し、さらに、ＮａＯＨと両イオン性界面活性剤である３−(ドデシルジメチル−アンモニオ)プロパンスルホン酸塩とを含んだ溶解バッファを加え、細胞を溶解する。次に、細胞溶解液にＴｒｉｓバッファを加えて遠心分離することにより、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一部のタンパク質が緩やかに結合したタンパク質凝集体を沈殿させる。そして、沈殿物をＴｒｉｓバッファで洗浄してタンパク質凝集体からＲＮＡを除き、さらに、沈殿物にＴＥバッファ又は水を加え、タッピング又はボルテックスミキサで撹拌することにより、タンパク質凝集体からプラスミドＤＮＡを溶出させる。最後に、遠心分離し、上清を回収することによりプラスミドＤＮＡを得る。
【選択図】 なし

Description

本発明は、細菌からプラスミドＤＮＡを単離して精製するプラスミドＤＮＡの精製方法及びプラスミドＤＮＡ精製用キットに関する。

細菌からのプラスミドＤＮＡの精製は、組換えＤＮＡ技術において最も重要な要素であり、研究室レベルはもとより産業レベルにおいても、不可欠な操作となりつつある。さらに、近年の遺伝子治療や遺伝子ワクチンの発展により、医薬品純度のプラスミドＤＮＡがキログラムオーダで必要とされている。

一般に、プラスミドＤＮＡを精製する際には、先ず細菌をＮａＯＨ及びＳＤＳによって溶解し、次にその溶液を酢酸ナトリウム等を含んだ酸性バッファで中和することにより、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一部のタンパク質を放出させる（例えば、非特許文献１を参照）。その溶液を遠心分離すると、殆どのタンパク質及びゲノムＤＮＡは、沈殿物として残る。

放出されたプラスミドＤＮＡをＲＮＡやタンパク質から単離するには、様々な方法が提案されている。例えば、細菌を溶解する前又は後でＲＮａｓｅを加えてＲＮＡを分解したり、塩化リチウムを加えてＲＮＡを選択的に沈殿させたりすることによりＲＮＡを除去する方法や、フェノールを加えることによりタンパク質を除去する方法が知られている。また、ポリエチレングリコール、スペルミジン若しくはスペルミン、カチオン性界面活性剤であるＣＴＡＢ（Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide）、又はリガンド結合型刺激反応性ポリマを加えることにより、ＤＮＡを選択的に除去する方法が知られている。しかしながら、その何れも加える物質に危険性又は毒性があるため、プラスミドＤＮＡを治療用途に用いる際には好ましくない。

さらに、陰イオン交換樹脂やシリカ膜（又はシリカビーズ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離するキットもＱＩＡＧＥＮ社等から販売されているが、精製に比較的長い時間を要する上、プラスミドＤＮＡを大量に精製することはできない。

Birnboim, H. C. and Doly, J.,"A rapid extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.", Nucleic Acids Res., 7 (1979), pp.1513-1523

このように、従来から数多くの精製方法が知られている反面、その殆どは先に開発された方法に基づいており、精製に要する時間や、得られるプラスミドＤＮＡの質、量を改善するには至っていないのが現状であった。

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、高純度のプラスミドＤＮＡを簡便に且つ短時間で、大量に精製することが可能なプラスミドＤＮＡの精製方法及びプラスミドＤＮＡ精製用キットを提供することを目的とする。

本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、細胞懸濁液にアルカリ及び両イオン性界面活性剤を含む溶解バッファを加えるとプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一部のタンパク質が緩やかに結合したタンパク質凝集体が形成され、このタンパク質凝集体からプラスミドＤＮＡを単離可能であることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明に係るプラスミドＤＮＡの精製方法は、細胞懸濁液にアルカリ及び両イオン性界面活性剤を含む溶解バッファを加えて細胞を溶解するステップと、溶解後の細胞溶解液に洗浄バッファを加えて遠心分離し、沈殿物をさらに上記洗浄バッファで洗浄するステップと、洗浄後の上記沈殿物に溶出バッファを加えて撹拌し、遠心分離して上清を回収する工程とを有することを特徴とする。

このように、細胞懸濁液にアルカリ及び両イオン性界面活性剤を含む溶解バッファを加えるとプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一部のタンパク質が緩やかに結合したタンパク質凝集体が形成され、このタンパク質凝集体からプラスミドＤＮＡを単離可能であることについては、これまで全く報告されたことがなく、本件発明者等によって初めて見出されたものである。

また、本発明に係るプラスミドＤＮＡ精製用キットは、アルカリ及び両イオン性界面活性剤を含んだ細胞溶解用の溶解バッファを少なくとも有することを特徴とする。

本発明に係るプラスミドＤＮＡの精製方法及びプラスミドＤＮＡ精製用キットによれば、高純度のプラスミドＤＮＡを簡便に且つ短時間で、大量に精製することが可能とされる。

以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。

細胞培養液の調製
先ず、実験に用いる３種類の細胞培養液を調製した。具体的には、ｐＵＣ１１９（β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ、３．１６ｋｂ）、又はコントロールベクタとしてｐＧＬ３（ルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ、５．２５ｋｂ）を保持した大腸菌XL-1 Blueと、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（ＧＦＰ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ、４．７ｋｂ）を保持した大腸菌ＤＨ５αとを準備し、ＬＢ培地を用いて細胞濃度が約１×１０^９個／ｍｌ（Ａ_６００＝１〜１．５）になるまで培養した。

プラスミドＤＮＡの単離
次に、調製した細胞培養液からプラスミドＤＮＡを単離した。基本的なプロトコルは以下の通りである。

先ず、各１ｍｌの細胞培養液をプラスチック製チューブに入れて１００００ｒｐｍで２分間遠心分離した。そして、上清を完全に除いた後、沈殿物を２００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファ（５０ｍＭ−１０ｍＭ、ｐＨ＝８）で懸濁し、さらに、０．２Ｍ ＮａＯＨと両イオン性界面活性剤である１〜２０μＭの３−(ドデシルジメチル−アンモニオ)プロパンスルホン酸塩（3-(dodecyldimethyl-ammonio)propane sulfonate）とを含んだ溶解バッファを２００μｌ加え、１〜５分間静置することにより、細胞を溶解した。次に、この細胞溶解液に０〜１００ｍＭ ＮａＣｌと１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓとを含んだ洗浄バッファ（ｐＨ＝７〜９）を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一部のタンパク質が緩やかに結合したタンパク質凝集体を沈殿させた。そして、上清の殆どを除いた後、上述の洗浄バッファを加えては遠心分離して上清を除くという操作を数回（１〜３回）繰り返すことにより、タンパク質凝集体からＲＮＡを除いた。最後に、沈殿物であるタンパク質凝集体に５０μｌのＴＥバッファ又は水を加え、タッピング又はボルテックスミキサで撹拌することにより、タンパク質凝集体からプラスミドＤＮＡを溶出させ、４℃、１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収することによりプラスミドＤＮＡを得た。

この本実施の形態における精製方法のうち、洗浄バッファを加える段階以降の部分の意義を検討した実験を以下に示す。この実験では、細菌の懸濁液２００μｌに０．２Ｍ ＮａＯＨ及び１％ ＳＤＳを含んだ溶解バッファを２００μｌ加えて細胞を溶解した後に、本実施の形態における精製方法（洗浄バッファを加える段階以降の部分に限る）に従ってプラスミドＤＮＡを単離した場合と、同じく細胞の溶解後に従来の精製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した場合とを比較した。なお、洗浄バッファとしては、１０ｍＭ ＮａＣｌを含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ＝９）を用いた。また、従来の精製方法とは、細胞溶解液４００μｌに３Ｍ 酢酸カリウム溶液（ｐＨ＝５．５）を２００μｌ加え、その溶液を４℃、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清に４２０μｌのイソプロパノールを加えてプラスミドＤＮＡを沈殿させ、沈殿物に５０μｌのＴＥバッファ又は水を加えるもの、又は上清に４２０μｌのイソプロパノールを加えてプラスミドＤＮＡを沈殿させた後、沈殿物を１０００μｌの７０％ エタノールで洗浄し、５０μｌのＴＥバッファ又は水を加えるものである。

本実施の形態における精製方法（洗浄バッファを加える段階以降の部分に限る）又は従来の精製方法に従って単離したプラスミドＤＮＡの各１０μｌのサンプルについて、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った結果を図１に示す。なお、図１では、細胞溶解液の１０μｌのサンプルについても、併せて電気泳動を行っている。分子量マーカとしては、λ-Eco T14I digestを用いた。

ここで、アルカリ性物質（ＮａＯＨ）と界面活性剤（ＳＤＳ）とを加えると、細胞の溶解が促進され、タンパク質凝集体が形成される。これは、アルカリ性物質による変性によってタンパク質が分子間でランダムに相互作用できるようになったためと考えられる。さらに、このタンパク質凝集体は、静電相互作用により十分な量のプラスミドＤＮＡを取り込むことができ、残った他のタンパク質やゲノムＤＮＡは、塩基性タンパク質と強く結合する。

しかしながら、従来の精製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した場合には、イソプロパノールを用いたサンプルについてもイソプロパノール及び７０％ エタノールを用いたサンプルについても、得られるプラスミドＤＮＡの量が元の量よりも大幅に減少している。これは、高濃度（３Ｍ）の酢酸バッファを加えることにより、他の多くのタンパク質やゲノムＤＮＡと共に、プラスミドＤＮＡが取り込まれたタンパク質凝集体も沈殿してしまったためと考えられる。

これに対して、本実施の形態における精製方法（洗浄バッファを加える段階以降の部分に限る）では、高濃度の酢酸バッファではなく低濃度のＴｒｉｓバッファを用いているため、従来の精製方法と比較して、得られるプラスミドＤＮＡの量が増加している。

次に、上述した洗浄バッファの組成及びｐＨを検討した実験を以下に示す。この実験では、本実施の形態における精製方法に従ってプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）を単離する際の洗浄バッファの組成（ＮａＣｌ濃度、Ｔｒｉｓ濃度）及びｐＨによる影響について検討した。

単離したプラスミドＤＮＡの１０μｌのサンプルについて、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った結果を図２に示す。分子量マーカとしては、λ-Eco T14I digestを用いた。図２から分かるように、高濃度（１００ｍＭ）のＮａＣｌを含む洗浄バッファでは、プラスミドＤＮＡの一部がタンパク質凝集体から除かれる結果、得られるプラスミドＤＮＡの量が減少しているように観察される。また、ｐＨが低く（ｐＨ＝７）、且つ高濃度（１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含む洗浄バッファでは、より多くのタンパク質が沈殿する結果、タンパク質凝集体が大きく且つ結合が強固となり、タンパク質凝集体から溶出するプラスミドＤＮＡの量が減少しているように観察される。

続いて、上述した洗浄バッファによる洗浄回数を検討した実験を以下に示す。この実験では、本実施の形態における精製方法に従ってプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３）を単離する際の洗浄バッファ（１０ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝９）を用いた洗浄回数による影響について検討した。また、この実験では、洗浄後のＴＥバッファによる溶出回数についても併せて検討した。具体的には、洗浄回数を０〜３回として得られたタンパク質凝集体に対して５０μｌのＴＥバッファを加え、タッピング又はボルテックスミキサで撹拌した後、遠心分離して得られた上清を１回目の溶出サンプルとし、その沈殿物に対して５０μｌのＴＥバッファを加え、同様の操作を行って得られた上清を２回目の溶出サンプルとし、さらにその沈殿物に対して５０μｌのＴＥバッファを加え、同様の操作を行って得られた上清を３回目の溶出サンプルとした。

単離したプラスミドＤＮＡの各１０μｌのサンプルについて、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った結果を図３に示す。分子量マーカとしては、λ-Eco T14I digestを用いた。図３から分かるように、洗浄バッファによる洗浄回数が増加するに従ってＲＮＡが除かれている。また、得られるプラスミドＤＮＡは主に会合体であり、このプラスミドＤＮＡは、ＴＥバッファにより複数回の溶出を行った溶出サンプルからも得られている。これは、プラスミドＤＮＡがタンパク質凝集体から溶出されていることを示している。

続いて、上述した本実施の形態における精製方法と、両イオン性界面活性剤である３−(ドデシルジメチル−アンモニオ)プロパンスルホン酸塩の代わりにＳＤＳを用いた場合とを比較した実験を以下に示す。この実験では、５％ ３−(ドデシルジメチル−アンモニオ)プロパンスルホン酸塩、又は１％ ＳＤＳを用い、静置時間を１，３，５分間とした場合に得られるプラスミドＤＮＡについて検討した。

単離したプラスミドＤＮＡの各１０μｌのサンプルについて、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った結果を図４に示す。従来の方法では、細胞を溶解しプラスミドＤＮＡを放出させるため、溶解バッファを加えた後に５分間静置することが推奨されているが（上記非特許文献１を参照）、図４から分かるように、両イオン性界面活性剤を用いた場合もＳＤＳを用いた場合も、１分間静置するのみで十分であるように観察される。

単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素による切断、及び機能の検証
続いて、単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素による切断の可否について検討した。具体的には、上述した本実施の形態における精製方法、又は両イオン性界面活性剤である３−(ドデシルジメチル−アンモニオ)プロパンスルホン酸塩の代わりに１％ ＳＤＳを用いた精製方法に従って単離されたプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断すると共に、本実施の形態における精製方法に従って単離されたプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１１９）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断した。

プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）の制限酵素処理前後の各１０μｌのサンプルについて、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った結果を図５（Ａ）に示す。分子量マーカとしては、λ-Eco T14I digestを用いた。また、プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１１９）の制限酵素処理前後の各１０μｌのサンプルについて、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った結果を図５（Ｂ）に示す。

図５（Ａ）から分かるように、１％ ＳＤＳを用いた精製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した場合、サンプル中に混在したＳＤＳにより制限酵素が変性してしまい、プラスミドＤＮＡは切断されなかった。これに対して、本実施の形態における精製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した場合には、サンプル中に両イオン性界面活性剤が混在していても制限酵素が作用するため、図５（Ａ）、（Ｂ）から分かるように、会合体状やスーパーコイル状のプラスミドＤＮＡ等に由来する複数のバンドは、直鎖状のプラスミドＤＮＡに由来する１本のバンドへと変化した。このように、両イオン性界面活性剤を用いる本実施の形態における精製方法によれば、精製後に界面活性剤を除去することなく、制限酵素を使用することが可能である。

また、単離したプラスミドＤＮＡの機能を検証するため、単離したプラスミドＤＮＡによる遺伝子発現効率を検証した。具体的には、本件発明者による論文「Chowdhury, E. H. and Akaike, T.“A bio-recognition device developed onto nano-crystal of carbonate apatite for cell-targeted gene delivery.”, Biotechnology and Bioengineering (in press)」に記載された方法に従って約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）と炭酸アパタイト粒子との複合体を作製し、この複合体を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞にＧＦＰ遺伝子を導入した。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＧＦＰ遺伝子の発現状況を図６に示す。図６から分かるように、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いただけで、ＧＦＰ遺伝子が高効率に発現している。これは、本実施の形態における精製方法で単離されるプラスミドＤＮＡは主に会合体であり、同一のプラスミドＤＮＡが多数存在するためであると考えられる（例えば、文献「Vob, C. et al.“Production of supercoiled multimeric plasmid DNA for biopharmaceuitical application.”, J. Biotechnology, 105 (2003), pp.205-213」を参照）。

以上説明したように、本実施の形態における精製方法によれば、高純度のプラスミドＤＮＡを簡便に且つ短時間で、大量に精製することが可能とされる。また、この精製方法を応用することで、アルカリ及び両イオン性界面活性剤を含んだ細胞溶解用の溶解バッファを少なくとも有するプラスミドＤＮＡ精製用キットを実現することができる。

なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。

本実施の形態における精製方法（洗浄バッファを加える段階以降の部分に限る）に従って単離したプラスミドＤＮＡと、従来の精製方法に従って単離したプラスミドＤＮＡとの電気泳動写真を示す図である。 本実施の形態における精製方法で用いる洗浄バッファの組成を変更した場合のプラスミドＤＮＡの電気泳動写真を示す図である。 本実施の形態における精製方法で用いる洗浄バッファによる洗浄回数と、ＴＥバッファによる溶出回数とを変更した場合のプラスミドＤＮＡの電気泳動写真を示す図である。 本実施の形態における精製方法に従って単離したプラスミドＤＮＡと、両イオン性界面活性剤の代わりにＳＤＳを用いて単離したプラスミドＤＮＡとの電気泳動写真を示す図である。 本実施の形態における精製方法に従って単離したプラスミドＤＮＡと、両イオン性界面活性剤の代わりにＳＤＳを用いて単離したプラスミドＤＮＡとに対して制限酵素処理を行う前後の電気泳動写真を示す図である。 ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＧＦＰ遺伝子の発現状況を示す図である。

Claims (4)

1. 細胞懸濁液にアルカリ及び両イオン性界面活性剤を含む溶解バッファを加えて細胞を溶解するステップと、
   溶解後の細胞溶解液に洗浄バッファを加えて遠心分離し、沈殿物をさらに上記洗浄バッファで洗浄するステップと、
   洗浄後の上記沈殿物に溶出バッファを加えて撹拌し、遠心分離して上清を回収する工程と
   を有することを特徴とするプラスミドＤＮＡの精製方法。
2. 上記洗浄バッファは、塩を含有したＴｒｉｓバッファであることを特徴とする請求項１記載のプラスミドＤＮＡの精製方法。
3. 上記両イオン性界面活性剤は、３−(ドデシルジメチル−アンモニオ)プロパンスルホン酸塩であることを特徴とする請求項１記載のプラスミドＤＮＡの精製方法。
4. アルカリ及び両イオン性界面活性剤を含んだ細胞溶解用の溶解バッファを少なくとも有することを特徴とするプラスミドＤＮＡ精製用キット。

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