JP2007001968A - 血小板、赤血球、無核細胞及び血小板を含む組成物が体外にて保存できる媒体と方法。 - Google Patents
血小板、赤血球、無核細胞及び血小板を含む組成物が体外にて保存できる媒体と方法。 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 本発明は、血小板が含まれる組成物を提供する。
【解決手段】 前記組成物が一種の媒体を用いて血小板と接触することで、血小板は長く保存することができる。前記媒体が抗凝血剤、クリオプレシピテート及び凝血酵素を含有する。本発明は、さらに血小板を長期的に保存する方法を提供し、以下の工程が含まれる。工程（ａ）：一般の生理食塩水に抗凝血剤、クリオプレシピテート（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）及び凝血酵素が入れており、一種の溶液となる、工程（ｂ）：血小板が含まれる媒体を、前記工程（ａ）における溶液に添加して静置すれば、血小板を有する溶液が形成される、そして工程（ｃ）：前記工程（ｂ）血小板溶液が凍結乾燥にかけられる。それで、本発明はさらに、一種の媒体を提供し、他の無核細胞を保存するためであることと特徴する。
【選択図】 図１
【解決手段】 前記組成物が一種の媒体を用いて血小板と接触することで、血小板は長く保存することができる。前記媒体が抗凝血剤、クリオプレシピテート及び凝血酵素を含有する。本発明は、さらに血小板を長期的に保存する方法を提供し、以下の工程が含まれる。工程（ａ）：一般の生理食塩水に抗凝血剤、クリオプレシピテート（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）及び凝血酵素が入れており、一種の溶液となる、工程（ｂ）：血小板が含まれる媒体を、前記工程（ａ）における溶液に添加して静置すれば、血小板を有する溶液が形成される、そして工程（ｃ）：前記工程（ｂ）血小板溶液が凍結乾燥にかけられる。それで、本発明はさらに、一種の媒体を提供し、他の無核細胞を保存するためであることと特徴する。
【選択図】 図１
Description
本発明は、粉状態で血小板、赤血球と他の無核細胞を長期的に保存する新たな方法及び媒体に関わっており、本発明も一種の血小板を含む組成物を提供し、該組成物は血小板が前記媒体と接触して製造されることと特徴する。
血小板は、ヒトの血液循環器における最も小さな細胞であり、血管が傷ついた時に、血液の漏れを防止するのに傷口を封じる役を演じるうえ、沢山の成長因子を放出することに伴え、細胞の成長が調節されるし、そして組織の修復と再生などの能力が促進される。１９６０年代から科学家が体外で血小板を保存する方法の研究に嵌まって開発することが始まったという。現在、血小板の体外保存といえば、温度２２℃の条件で、クエン酸塩が加えられており、且つ安定なｐＨ値（ｐＨ６．８−７．２）が持たす血漿内では５日間保存できることが知られている。さらに、試験管外での研究によると、 血小板の濃縮液（ｐ
ｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＰＣｓ）がポーリオレフィンで作られた容器に入れて置けば、室温で５〜７日間保存できることが発見された。だが、保存する間に、室温では細菌の繁殖次第に汚染される恐れがあるため、ＦＤＡは輸血用の血小板が保存期間の５日間までのものに限って使用制限されると規定する。しかし、献血に対する規範が多いことに基いては、献血者が厳格の条件で制限されたため、献血の人数が少なくなって血液の提供が欠乏状態のままで日々が続く。したがって、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板の代用品に関する研究や開発などが極めて切迫なことと言われる。
ｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＰＣｓ）がポーリオレフィンで作られた容器に入れて置けば、室温で５〜７日間保存できることが発見された。だが、保存する間に、室温では細菌の繁殖次第に汚染される恐れがあるため、ＦＤＡは輸血用の血小板が保存期間の５日間までのものに限って使用制限されると規定する。しかし、献血に対する規範が多いことに基いては、献血者が厳格の条件で制限されたため、献血の人数が少なくなって血液の提供が欠乏状態のままで日々が続く。したがって、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板の代用品に関する研究や開発などが極めて切迫なことと言われる。
出血多量の大勢の患者にとっては、特に血小板の輸血が必須となる。しかし、現在の保存技術では血小板が機能性の低下に至ったし、なお、血小板の活性を有効に持たす長期的な保存方法の開発は未だ成功していない。それで、血小板の欠ける問題が解決できないままである。一般的には、血小板が体外で保存される場合に、先ず、機能の維持と構造の無欠を確保することが重要である。つまり、保存過程中における血小板が正常な形態を維持し、活性分子の放出を避ける。そして、血小板の濃縮液となる血漿が精製や安定化される際、血小板細胞の会合を防止する。また、理想的な体外保存の要件とは、血小板の細胞膜における特定なタンパクであるＩｂ／ＩＸ及びＩＩｂ／ＩＩＩａの無欠を保つことで、それぞれはｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ分子と繊維素タンパク原（フィブリノゲン、ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）との受容体とすることができる。その上に、完全な代謝経路を維持するために、例えば、配位子（リガンド）と受容体（レセプター）が互いに結合した後、アルファ粒子などのメッセージ物質の放出、または生理的反応の過程などに関与することも必須である。
復元（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）後の血小板が凝血作用の機能を依然として持たすという目的に達成するためには、完全且つ正常な細胞膜、機能性のある酵素の活性、そして細胞の会合、粒子の放出及び食菌作用などの反応を維持することが必須となる。いわゆる、完全かつ活性がある血小板を製造する。
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、血小板を含む組成物であって、同組成物は保存のために血小板を媒体と接触させることにより生成され、前記媒体は、（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤と、（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート
と、（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血酵素とを含むことを要旨とする。
と、（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血酵素とを含むことを要旨とする。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記抗凝血剤は抗凝血性クエン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の組成物において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％の範囲であることを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の組成物において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％の範囲であることを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の組成物において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の組成物において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の組成物において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の組成物において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％であることを要旨とする。
請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％であることを要旨とする。
請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％であることを要旨とする。
請求項１０に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、前記組成物は溶媒をさらに含むことを要旨とする。
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の組成物において、前記溶媒は生理食塩水であることを要旨とする。
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の組成物において、前記溶媒は生理食塩水であることを要旨とする。
請求項１２に記載の発明は、請求項１に記載の組成物において、凍結乾燥技術がさらに用いられることを要旨とする。
請求項１３に記載の発明は、血小板を保存する方法であって、（ａ）抗凝血剤、クリオプレシピテート、及び凝血酵素を生理食塩水に添加し、振盪し、静置することにより、溶液を生成する工程と、（ｂ）血小板を含む媒体を工程（ａ）にて得た溶液に添加し、静置することにより、血小板を含有する溶液を生成する工程と、（ｃ）工程（ｂ）にて生成した血小板を含有する溶液を凍結乾燥する工程とを備えることを要旨とする。
請求項１３に記載の発明は、血小板を保存する方法であって、（ａ）抗凝血剤、クリオプレシピテート、及び凝血酵素を生理食塩水に添加し、振盪し、静置することにより、溶液を生成する工程と、（ｂ）血小板を含む媒体を工程（ａ）にて得た溶液に添加し、静置することにより、血小板を含有する溶液を生成する工程と、（ｃ）工程（ｂ）にて生成した血小板を含有する溶液を凍結乾燥する工程とを備えることを要旨とする。
請求項１４に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ａ）における抗凝血剤は抗凝血性クエン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項１５に記載の発明は、請求項１４に記載の方法において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項１５に記載の発明は、請求項１４に記載の方法において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項１６に記載の発明は、請求項１５に記載の方法において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項１７に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ａ）における抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項１７に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ａ）における抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項１８に記載の発明は、請求項１７に記載の方法において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項１９に記載の発明は、請求項１８に記載の方法において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項１９に記載の発明は、請求項１８に記載の方法において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項２０に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ａ）におけるクリオプレシピテートの濃度は０．０００１％〜３％であることを要旨とする。
請求項２１に記載の発明は、請求項２０に記載の方法において、前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％であることを要旨とする。
請求項２１に記載の発明は、請求項２０に記載の方法において、前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％であることを要旨とする。
請求項２２に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ａ）における凝血酵素の濃度は０．０００１％〜５％であることを要旨とする。
請求項２３に記載の発明は、請求項２２に記載の方法において、前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％であることを要旨とする。
請求項２３に記載の発明は、請求項２２に記載の方法において、前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％であることを要旨とする。
請求項２４に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ｂ）における血小板を含む媒体は血小板の濃縮液であることを要旨とする。
請求項２５に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ｂ）における血小板を含む媒体は血小板の濃縮血漿であることを要旨とする。
請求項２５に記載の発明は、請求項１３に記載の方法において、工程（ｂ）における血小板を含む媒体は血小板の濃縮血漿であることを要旨とする。
請求項２６に記載の発明は、医薬用の組成物であって、同組成物は請求項１に記載の血小板を含有する組成物と、医薬用に許容されるキャリアとを含むことを要旨とする。
請求項２７に記載の発明は、請求項２６に記載の医薬用の組成物において、凍結乾燥技術を用いて調製されることを要旨とする。
請求項２７に記載の発明は、請求項２６に記載の医薬用の組成物において、凍結乾燥技術を用いて調製されることを要旨とする。
請求項２８に記載の発明は、無核細胞を保存するための媒体であって、（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤と、（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテートと、（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血酵素とを含むことを要旨とする。
請求項２９に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記抗凝血剤は抗凝血性クエン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項３０に記載の発明は、請求項２９に記載の媒体において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項３０に記載の発明は、請求項２９に記載の媒体において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項３１に記載の発明は、請求項３０に記載の媒体において、前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項３２に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項３２に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースであることを要旨とする。
請求項３３に記載の発明は、請求項３２に記載の媒体において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％であることを要旨とする。
請求項３４に記載の発明は、請求項３３に記載の媒体において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項３４に記載の発明は、請求項３３に記載の媒体において、前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％であることを要旨とする。
請求項３５に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％であることを要旨とする。
請求項３６に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％あることを要旨とする。
請求項３６に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％あることを要旨とする。
請求項３７に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、溶媒をさらに含むことを要旨とする。
請求項３８に記載の発明は、請求項３７に記載の媒体において、前記溶媒は生理食塩水であることを要旨とする。
請求項３８に記載の発明は、請求項３７に記載の媒体において、前記溶媒は生理食塩水であることを要旨とする。
請求項３９に記載の発明は、請求項２８に記載の媒体において、前記無核細胞は血小板
または赤血球を含むことを要旨とする。
本発明は、今までの血小板の保存方法における欠点を改善するために、血小板を含む一種の組成物が提供される。前記組成物の製法には、一種の媒体があって血小板と接触して作成する。前記媒体は、以下の成分が含まれる：
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤；
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート（寒冷沈降物質、ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）；及び
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血剤、以上である。
または赤血球を含むことを要旨とする。
本発明は、今までの血小板の保存方法における欠点を改善するために、血小板を含む一種の組成物が提供される。前記組成物の製法には、一種の媒体があって血小板と接触して作成する。前記媒体は、以下の成分が含まれる：
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤；
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート（寒冷沈降物質、ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）；及び
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血剤、以上である。
本発明のもう一つの目的としては、 一種の血小板の保存方法が提供され、以下の工程
を包含する。工程（ａ）：一般の生理食塩水に抗凝血剤、クリオプレシピテート及び凝血酵素が加えられ、 揺らしてから静置すれば、一種の溶液となる；工程（ｂ）：血小板が
含まれる媒体を、前記工程（ａ）の溶液に添加して静かにおけば、血小板を有する溶液が形成される；そして工程（ｃ）：前記工程（ｂ）血小板溶液が凍結乾燥にかけられる。
を包含する。工程（ａ）：一般の生理食塩水に抗凝血剤、クリオプレシピテート及び凝血酵素が加えられ、 揺らしてから静置すれば、一種の溶液となる；工程（ｂ）：血小板が
含まれる媒体を、前記工程（ａ）の溶液に添加して静かにおけば、血小板を有する溶液が形成される；そして工程（ｃ）：前記工程（ｂ）血小板溶液が凍結乾燥にかけられる。
本発明は、また一種の媒体を提供して無核細胞を保存する。前記媒体は以下の成分を含有する。
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤；
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート；及び
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血剤、以上である。
本発明はさらに医薬レベルの組成物を提供し、中には血小板の有する組成物及び医薬に属す一種のキャリアが含まれる。
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤；
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート；及び
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血剤、以上である。
本発明はさらに医薬レベルの組成物を提供し、中には血小板の有する組成物及び医薬に属す一種のキャリアが含まれる。
本発明の発明者は、繊維素タンパク原及び凝血酵素を用いて、 凝血メカニズムにおけ
る最後の工程が模擬され、ある二段階にかける溶液が生成される。 先ずは、 保存効果のある媒体が生じられて、そして、血小板の有する組成物が形成される。 安定化するため
、前記組成物が凍結乾燥で血小板粉に形成し、長期的保存ができる。
る最後の工程が模擬され、ある二段階にかける溶液が生成される。 先ずは、 保存効果のある媒体が生じられて、そして、血小板の有する組成物が形成される。 安定化するため
、前記組成物が凍結乾燥で血小板粉に形成し、長期的保存ができる。
本発明においては、保存するためのカセット媒体（ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、血小板が保護性のあるゲル薄膜で包まれる。前記ゲル薄膜は、濃度の低い繊維素タンパク原と凝血酵素を生理食塩水の中に入れてから生じられたものである。本発明に開示された方法及び媒体は血小板を相当に長く保存することができ、元の血小板が持つべき機能と活性などが二年間も保持できると我々は発見した。
本発明の目的は、一種の血小板を含む組成物を提供することであり、その製造法は血小板が一種の媒体と接触して保存できることと特徴する。前記媒体には、（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤、（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート、及び（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血酵素、という成分から構成する。
前記抗凝血剤は、抗凝血性クエン酸デキストロース（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ；ＡＣＤ−Ａ）が含まれるが、それには限らない。または、ＡＣＤ−Ａのより適切な濃度範囲は５％〜３０％となり、ベスト濃度は１０％〜１２％である。前記抗凝血剤は、クエン酸リン酸デキストロース（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ；ＣＰＤ）が含まれるが、それには限らない。または、ＣＰＤのより適切な濃度範囲は５％〜３０％となり、ベスト濃度は１０％〜１２％である。前記クリオプレシピテートのより適切な濃度は０．００１％〜３％となり、前記凝血酵素のより適切な濃度は０．００１％〜５％となる。前記組成物は、さらに一種の溶媒、例えば一般の生理食塩水が含まれるが、 それには限らない。 本発明における組成物は、凍結乾燥技術を用いて粉状態に精製できる。また、この技術を熟練する人が他の方法で製造で
きる。
きる。
本発明は、 一種の血小板を保存する方法を提供する目的がある。第１図にしたがって
、前記方法は以下の工程を含む。工程（ａ）：一般の生理食塩水に抗凝血剤、クリオプレシピテート及び凝血酵素が加えられ、 揺らしてから静置すれば、一種の溶液となる；工
程（ｂ）：血小板が含まれる媒体を、前記工程（ａ）の溶液に添加して静かにおけば、血小板を有する溶液が形成される；そして工程（ｃ）：前記工程（ｂ）血小板溶液が凍結乾燥にかけられる。
、前記方法は以下の工程を含む。工程（ａ）：一般の生理食塩水に抗凝血剤、クリオプレシピテート及び凝血酵素が加えられ、 揺らしてから静置すれば、一種の溶液となる；工
程（ｂ）：血小板が含まれる媒体を、前記工程（ａ）の溶液に添加して静かにおけば、血小板を有する溶液が形成される；そして工程（ｃ）：前記工程（ｂ）血小板溶液が凍結乾燥にかけられる。
前記抗凝血剤は、抗凝血性クエン酸デキストロース（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ；ＡＣＤ−Ａ）が含まれるが、それには限らない。または、ＡＣＤ−Ａのより適切な濃度範囲は５％〜３０％となり、ベスト濃度は１０％〜１２％である。前記抗凝血剤は、クエン酸デキストロース（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ；ＣＰＤ）が含まれるが、それには限らない。または、ＣＰＤのより適切な濃度範囲は５％〜３０％となり、ベスト濃度は１０％〜１２％である。前記クリオプレシピテートのより適切な濃度は０．０００１％〜３％となり、ベスト濃度は０．００１％〜３％である。前記凝血酵素のより適切な濃度は０．０００１％〜５％となり、ベスト濃度は０．００１％〜３％である。前記工程（ｂ）における血小板の有する媒体は、血小板の濃縮液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、血小板の濃縮血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ−ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）或いは血小板を含有する何れの媒体とのことを指す。
また、本発明の目的としては、一種の媒体を提供し、無核細胞を保存する。前記媒体においては、以下の成分が含まれる。
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤；
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート；及び
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血剤、以上である。
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤；
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテート；及び
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血剤、以上である。
前記抗凝血剤は、抗凝血性クエン酸デキストロース（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ；ＡＣＤ−Ａ）が含まれるが、それには限らない。または、ＡＣＤ−Ａのより適切な濃度範囲は５％〜３０％となり、ベスト濃度は１０％〜１２％である。前記抗凝血剤は、クエン酸デキストロース（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ；ＣＰＤ）が含まれるが、それには限らない。または、ＣＰＤのより適切な濃度範囲は５％〜３０％となり、ベスト濃度は１０％〜１２％である。前記クリオプレシピテートのより適切な濃度は０．００１％〜３％となり、前記凝血酵素のより適切な濃度は０．００１％〜５％となる。注意すべきなのは、前記組成物にはさらに一種の溶媒、例えば一般の生理食塩水が使用されるが、それには限らない。 それに、前記無
核細胞とは血小板及び赤血球のことが含まれる。
核細胞とは血小板及び赤血球のことが含まれる。
本発明は、医薬レベルの組成物が提供され、中には血小板のある組成物及び医薬に属す一種のキャリアを含有する。前記医薬レベルの組成物は、さらに凍結乾燥技術を用いて製造できる。
一方、本発明は、水分補充により活性復元、そして刺激を与えることにより多種の成長因子が放出される、という粉状態の血小板だから持つ特性を上手く利用することで、再生医学領域における研究にも応用できる。それに、研究者が体外で血小板に関する特性の研究には役に立つ。したがって、本発明は実際に伝統的な血小板の保存方法を改良することができる。
本発明の詳細な実施態様は、実施方式に述べていた。本発明の他の実施態様の目的及び
優れた点については、前記特許請求の範囲及び以下の記述により詳しく了解できる。
本発明における血小板が保存及び水分補充による復元後の生物的活性測定を行う実施例を下に表示する。だが、本実施例は本発明には限らないし、この技術に詳しい何れの熟練者が本発明の精神や範囲を離さない内に、仕様の変更及び修飾ができる。その故に、本発明においては、特許の保護範囲が後付きの請求の範囲に従って準じられる。
優れた点については、前記特許請求の範囲及び以下の記述により詳しく了解できる。
本発明における血小板が保存及び水分補充による復元後の生物的活性測定を行う実施例を下に表示する。だが、本実施例は本発明には限らないし、この技術に詳しい何れの熟練者が本発明の精神や範囲を離さない内に、仕様の変更及び修飾ができる。その故に、本発明においては、特許の保護範囲が後付きの請求の範囲に従って準じられる。
以下には、幾つの実施例が図式付けの配合で本発明の実施様態として説明する。
血小板は一種の無核細胞であり、タンパク質を放出することがしたら、復元メカニズムに戻れない。血小板が活性化され、或いは該機能性が失われた時に、機能がない状態のままで維持される。血小板がタンパク質の合成ができないため、該細胞の成長や再生に対して有利ではないが、細胞の表面に沢山の受容体があるので、血小板の機能調節にいくつの役を演じることが分かる。また、血小板が活性化されるときに、細胞内にあるタンパク質は細胞表面に表現型を生じることが観察されるため、測定の探り針として血小板の活性を調べる。その外、凝血過程中では、血小板は付着、会合が発生され、且つ前凝血段階の官能基グループ反応が起こすため、凝血酵素及び繊維素タンパク原の生成に促進する。血小板は成長因子の貯蔵庫といい、中には血小板由来の成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ；ＰＤＧＦ）、転換成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ β；ＴＧＦ−β）、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）と上皮成長因子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、及びサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）などが含まれる。以下の実施例には上記述べた血小板の活性化特性を利用し、粉状態の血小板が水分補充にかけて細胞が復元した後の活性を測るためとする。
実施例一、血小板を含む組成物を製造する
血小板の含む組成物は、第１図における工程によって、粉状態の血小板（ここではＰＬＴと略語する）が製造される。以下には第１図の工程を説明する。
（１）先ず、２０ｍｌのＡＣＤ−Ａを１００ｍｌの生理食塩水中に入れて、２０％の抗凝血剤の溶液となる。前記溶液を揺らしてから５分間静置する；
（２）０．００１ｍｌのクリオプレシピテートが前記抗凝血剤の溶液に加えられ、 揺ら
してから５分間静置する；
（３）５ｍｌの凝血酵素を前記溶液に添加し、 揺らしてから５分間静置する；
（４）血小板濃縮液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）或いは血小板濃縮血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を前記工程（３）の溶液に添加して５分間静置する；
（５）最後に、前記工程（４）における溶液は、凍結乾燥にかけて粉状態で保存される。実施例二、血小板を含む組成物を製造する
実施例二に記述する血小板の含む組成物の製造については、実施例一の製造法とほぼ同じだが、前記工程（１）にＡＣＤ−Ａの添加する量は５ｍｌとなり、５％の抗凝血剤が作成される。そして、前記工程（２）には３ｍｌのクリオプレシピテートを加える。また、工程（３）に入れる凝血酵素は３ｍｌである。
実施例三、血小板を含む組成物を製造する
実施例三に記述する血小板の含む組成物の製造については、実施例一の製造法とほぼ同じだが、前記工程（１）にＡＣＤ−Ａの添加する量は１０ｍｌとなり、１０％の抗凝血剤が作成される。そして前記工程（２）には０．０２ｍｌのクリオプレシピテートを加える。また、工程（３）に入れる凝血酵素は０．０１ｍｌである。
実施例四、Ｐ−セレクチンを測定する
ある特別な細胞表面タンパク質が血小板の活性化度を推算する指標とすることができる。血小板がアゴニストによって刺激を受けて活性化された後、細胞質内におけるアルファ
顆粒（α−ｇｒａｎｕｌｅｓ）の膜組織にあるＰ−セレクチンは、血小板の細胞膜表面に発現することが分かる。Ｐ−セレクチンは一種の膜タンパク質であり、血小板が凝血酵素による活性化される前後に、Ｐ−セレクチン数の変化を測れば、血小板の活性化度が測定できる。
実施例一、血小板を含む組成物を製造する
血小板の含む組成物は、第１図における工程によって、粉状態の血小板（ここではＰＬＴと略語する）が製造される。以下には第１図の工程を説明する。
（１）先ず、２０ｍｌのＡＣＤ−Ａを１００ｍｌの生理食塩水中に入れて、２０％の抗凝血剤の溶液となる。前記溶液を揺らしてから５分間静置する；
（２）０．００１ｍｌのクリオプレシピテートが前記抗凝血剤の溶液に加えられ、 揺ら
してから５分間静置する；
（３）５ｍｌの凝血酵素を前記溶液に添加し、 揺らしてから５分間静置する；
（４）血小板濃縮液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）或いは血小板濃縮血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を前記工程（３）の溶液に添加して５分間静置する；
（５）最後に、前記工程（４）における溶液は、凍結乾燥にかけて粉状態で保存される。実施例二、血小板を含む組成物を製造する
実施例二に記述する血小板の含む組成物の製造については、実施例一の製造法とほぼ同じだが、前記工程（１）にＡＣＤ−Ａの添加する量は５ｍｌとなり、５％の抗凝血剤が作成される。そして、前記工程（２）には３ｍｌのクリオプレシピテートを加える。また、工程（３）に入れる凝血酵素は３ｍｌである。
実施例三、血小板を含む組成物を製造する
実施例三に記述する血小板の含む組成物の製造については、実施例一の製造法とほぼ同じだが、前記工程（１）にＡＣＤ−Ａの添加する量は１０ｍｌとなり、１０％の抗凝血剤が作成される。そして前記工程（２）には０．０２ｍｌのクリオプレシピテートを加える。また、工程（３）に入れる凝血酵素は０．０１ｍｌである。
実施例四、Ｐ−セレクチンを測定する
ある特別な細胞表面タンパク質が血小板の活性化度を推算する指標とすることができる。血小板がアゴニストによって刺激を受けて活性化された後、細胞質内におけるアルファ
顆粒（α−ｇｒａｎｕｌｅｓ）の膜組織にあるＰ−セレクチンは、血小板の細胞膜表面に発現することが分かる。Ｐ−セレクチンは一種の膜タンパク質であり、血小板が凝血酵素による活性化される前後に、Ｐ−セレクチン数の変化を測れば、血小板の活性化度が測定できる。
本実施例の実験工程は以下に述べる。
半年にかけて保存されてきた前記実施例三により製造したＰＬＴが０．００１ｇを取り出し、 生理食塩水（Ｐ）に加えて復元した後、凝血酵素を添加する。中において、Ｐ：
凝血酵素は１：１（ｖ／ｖ）である。最後に、ＥＬＩＳＡキットを使って、Ｐ−セレクチン（Ｃａｔ ＃ ＢＢＥ６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡから購入）の数を測定する。
半年にかけて保存されてきた前記実施例三により製造したＰＬＴが０．００１ｇを取り出し、 生理食塩水（Ｐ）に加えて復元した後、凝血酵素を添加する。中において、Ｐ：
凝血酵素は１：１（ｖ／ｖ）である。最後に、ＥＬＩＳＡキットを使って、Ｐ−セレクチン（Ｃａｔ ＃ ＢＢＥ６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡから購入）の数を測定する。
実験の結果については表１に示しており、１２名の中華民国血液銀行に健康な献血者という規定条件に合格した正常な献血者から、血小板の分離技術（ｐｌａｔｅｌｅｔｐｈｅｒｅｓｉｓ、アフェレーシス）を用いて採血し、血小板濃縮液を得た。前記血小板濃縮液中のＰ−セレクチン数を測定した結果は、０．３２８±０．０１ｎｇ／ｍｌであった。ところが、凍結乾燥の粉状態を復元したＰＬＴ（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ＰＬＴ）にはＰ−セレクチンが０．３４±０．０ｎｇ／ｍｌと検出されたが、復元した後のＰＬＴに凝血酵素を入れて混合してからＰ−セレクチン数を測定すれば、０．３５±０．０１７ｎｇ／ｍｌという結果が出た。以上の測定結果によっては、半年の保存を経って復元したＰＬＴは、血小板の分離技術によって得られた新鮮な血小板と同じ生物活性を持つことが明らかと示された。そのゆえに、本実験例により、本発明における組成物は血小板を長期的に保存することが可能となり、且つ完全な機能を保有することが分かった。
実施例五、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＧＦを測定する
実験材料：
成長因子の放出量を測定するのは、
ＥＬＩＳＡ ＆ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙキット、ＰＤＧＦキット、そしてＥＧＦキットなどはＲ＆Ｄ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡから購入し、
ＴＧＦ−β１キットはＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎｉｖｅｌｌｅｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍから購入する。
ヒトＰＤＧＦ−ＡＢはＣａｔ ＃ ＤＨＤ００Ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．，
Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、 ＭＮ， ＵＳＡから購入）、
ヒトＴＧＦ−β１はＫＡＣ １６８８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎｉｖｅｌｌｅｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍから購入）、
ヒトＥＧＦはＣａｔ ＃ ＤＥＧ００（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡから購入）。
実験工程：
水分補充により復元した血小板の生物活性を観察するため、前記実施例三における半年保存したＰＬＴ粉は生理食塩水と混合する。混合の比例は、次に述べたとおりにする。ＰＬＴPL T 粉は０．０５ｇを生理食塩水（Ｐ）に混合比例１：３００（ｗ／ｖ）で混合す
る。そして、凝血酵素はＰ：凝血酵素が１：１の比例で添加される。
粉状態の血小板が復元にかけて形成されたＰＬＴ−生理食塩水溶液は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法、ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＰＤＧＦ試験、ＥＬＩＳＡ ＴＧＦ−β試験及びＥＬＩＳＡ ＥＧＦ試験で測定が行われる。
実験結果：
表２によって、対照組（凝血酵素）のＰＤＧＦは２６５７．１±８８７．３ｐｇ／ｍｌと検出されたが、ＴＧＦ−β１の測定値は８０１±２０．３ｐｇ／ｍｌとなったが、ＥＧＦの値は低すぎるので検出することができない。しかし、実験組におけるＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＥＧＦの測定値は対照組の値よりずっと高い結果が得られた。それで、血小板における成長因子の貯蔵庫の中にあるＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＥＧＦは、確かにＰＬＴ粉が復元されて凝血酵素と混合したときから、ＰＬＴから放出されたことと考えられる。表２に記述した結果にしたがって、本発明の方法によって保存した血小板は、復元した後、本来の機能を保つことが明らかと示された。
実験結果：
表２によって、対照組（凝血酵素）のＰＤＧＦは２６５７．１±８８７．３ｐｇ／ｍｌと検出されたが、ＴＧＦ−β１の測定値は８０１±２０．３ｐｇ／ｍｌとなったが、ＥＧＦの値は低すぎるので検出することができない。しかし、実験組におけるＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＥＧＦの測定値は対照組の値よりずっと高い結果が得られた。それで、血小板における成長因子の貯蔵庫の中にあるＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＥＧＦは、確かにＰＬＴ粉が復元されて凝血酵素と混合したときから、ＰＬＴから放出されたことと考えられる。表２に記述した結果にしたがって、本発明の方法によって保存した血小板は、復元した後、本来の機能を保つことが明らかと示された。
以上に記載したＥＬＩＳＡデーターから総合的な結論といえば、本発明における血小板の組成物が凍結技術と結合した結果は、血小板を長期的に保存することができる一方、血小板の生物活性まで維持できることと示した。
実施例六、再復元の血小板を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察する
実験工程：
血小板の形態を観察するために、実施例三における工程で製造して半年間保存にかけたＰＬＴ粉が取り出されて、水分補充により復元した後、ＳＥＭ（走査式電子顕微鏡、Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて血小板の観察を行っ
た。
先ず、０．１Ｍのリン酸バッファーが１ｍｌと５％のシュガー溶液（２．５％のグルタルアルデヒド（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、１，５−Ｐｅｎｔａｎ−ｄｉａｌ、Ｃ５Ｈ８Ｏ２）が含まれる；ｐＨ７．２）とカバーガラスの上に注がれて、ＰＬＴ粉と生理食塩水との混合液を０．５ｍｌ0.5 ml取って前記カバーガラスにドロップしてから、シェーカーの上に載せて３０分間緩和に振動させた。そして、カバーガラスが５０％〜１００％のエタノールを用いて脱水にかけられてから酢酸イソアミル（ｉｓｏａｍｙｌａｃｅｔａｔｅ）で処理し、臨界点乾燥機器（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｏｉｎｔ ｄｒｙｅｒ）を使って乾燥する。最後に、前記カバーグラスをめっき術（ｇｉｌｄｉｎｇ）による処理を経ってから走査式電子顕微鏡の下で観察する。
実験結果：
第２図に示したのはＳＥＭで撮った写真である。粉の血小板が水分補充により復元後、薄い円盤状のような形態となり、且つ艶のある滑らかな表面を持つことが観察された。第３図には、前記第２図血小板の単一細胞を拡大したものである。復元してこれらのような形態を持った血小板は、活性化されていない状態が維持されたままの特徴と示しており、且つ活性化される可能性が高く考えられる。
実験結果：
第２図に示したのはＳＥＭで撮った写真である。粉の血小板が水分補充により復元後、薄い円盤状のような形態となり、且つ艶のある滑らかな表面を持つことが観察された。第３図には、前記第２図血小板の単一細胞を拡大したものである。復元してこれらのような形態を持った血小板は、活性化されていない状態が維持されたままの特徴と示しており、且つ活性化される可能性が高く考えられる。
血小板の保存法には何れの方式があっても、ある程度の生物活性や機能を保つことが確保すべきことである。例えば、血小板の外形が良くて、活性化物質の放出が見られなく、会合もならないものという。本発明における保存方法によると、復元した血小板細胞は、それぞれ離れていており、多数の細胞は円盤状の外見形態を持つことが観察された。以上の記述を整えて、本発明の請求範囲における媒体、組成物及び方法は、血小板を長期的保存のできるより良い方式であり、血小板の機能喪失ことがないと特徴する。
本明細書に開示したすべての特徴においては、他の方法と結合する可能性があると考えられる。また、本明細書に開示したそれぞれの特徴が、同じ、相当な、或いは目的の似る特徴に取り替えられることがある。ということで、特に顕著である特徴以外には、本明細書に掲載されたすべての特徴はただの相当或いは似るものにおける一つの例であることが表示された。
Claims (39)
- 血小板を含む組成物であって、同組成物は保存のために血小板を媒体と接触させることにより生成され、前記媒体は、
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤と、
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテートと、
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血酵素とを含む組成物。 - 前記抗凝血剤は抗凝血性クエン酸デキストロースである請求項１に記載の組成物。
- 前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％の範囲である請求項２に記載の組成物。
- 前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％である請求項３に記載の組成物。
- 前記抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースである請求項１に記載の組成物。
- 前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％である請求項５に記載の組成物。
- 前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％である請求項６に記載の組成物。
- 前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％である請求項１に記載の組成物。
- 前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％である請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物は溶媒をさらに含む請求項１に記載の組成物。
- 前記溶媒は生理食塩水である請求項１０に記載の組成物。
- 凍結乾燥技術がさらに用いられる請求項１に記載の組成物。
- 血小板を保存する方法であって、
（ａ）抗凝血剤、クリオプレシピテート、及び凝血酵素を生理食塩水に添加し、振盪し、静置することにより、溶液を生成する工程と、
（ｂ）血小板を含む媒体を工程（ａ）にて得た溶液に添加し、静置することにより、血小板を含有する溶液を生成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）にて生成した血小板を含有する溶液を凍結乾燥する工程とを備える方法。 - 工程（ａ）における抗凝血剤は抗凝血性クエン酸デキストロースである請求項１３に記載の方法。
- 前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％である請求項１４に記載の方法。
- 前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％である請求項１５に記載
の方法。 - 工程（ａ）における抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースである請求項１３に記載の方法。
- 前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％である請求項１７に記載の方法。
- 前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％である請求項１８に記載の方法。
- 工程（ａ）におけるクリオプレシピテートの濃度は０．０００１％〜３％である請求項１３に記載の方法。
- 前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％である請求項２０に記載の方法。
- 工程（ａ）における凝血酵素の濃度は０．０００１％〜５％である請求項１３に記載の方法。
- 前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％である請求項２２に記載の方法。
- 工程（ｂ）における血小板を含む媒体は血小板の濃縮液である請求項１３に記載の方法。
- 工程（ｂ）における血小板を含む媒体は血小板の濃縮血漿である請求項１３に記載の方法。
- 請求項１に記載の血小板を含有する組成物、及び医薬用に許容されるキャリアを含む医薬用の組成物。
- 凍結乾燥技術を用いて調製される請求項２６に記載の医薬用の組成物。
- 無核細胞を保存するための媒体であって、
（ａ）５％〜３０％の抗凝血剤と、
（ｂ）０．０００１％〜３％のクリオプレシピテートと、
（ｃ）０．０００１％〜５％の凝血酵素とを含む媒体。 - 前記抗凝血剤は抗凝血性クエン酸デキストロースである請求項２８に記載の媒体。
- 前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％である請求項２９に記載の媒体。
- 前記抗凝血性クエン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％である請求項３０に記載の媒体。
- 前記抗凝血剤はクエン酸リン酸デキストロースである請求項２８に記載の媒体。
- 前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は５％〜３０％である請求項３２に記載の媒体。
- 前記クエン酸リン酸デキストロースの濃度は１０％〜１２％である請求項３３に記載の媒体。
- 前記クリオプレシピテートの濃度は０．００１％〜３％である請求項２８に記載の媒体。
- 前記凝血酵素の濃度は０．００１％〜５％ある請求項２８に記載の媒体。
- 溶媒をさらに含む請求項２８に記載の媒体。
- 前記溶媒は生理食塩水である請求項３７に記載の媒体。
- 前記無核細胞は血小板または赤血球を含む請求項２８に記載の媒体。
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