JP2006524691A - 心臓導電系の標的化された領域の遺伝子修飾 - Google Patents

Abstract

開示されたのは、心臓の導電系の目標とされた領域の細胞の遺伝子修飾により、心臓の機能不全、特に心臓のペーシングの機能不全を予防するか又は治療するための方法及び系である。一つの態様において、発明は、細胞のイオンチャネルの発現を修飾することができる遺伝子構築物中の一つ又はそれより多いコーディング配列を細胞に送達することにより、細胞を遺伝子修飾する方法を提供する。

Description

本発明は、心臓の機能不全の治療用治療法（curative therapy）を提供するための、組成物、装置及び方法に関し、特定すれば、不整脈及び心臓ペーシング機能不全のための治療用の治療剤及び系を寄与する（implementing）生物学上の系及び方法に関する。

正常で健康な心臓においては、右心房に位置する洞房（「ＳＡ」）結節の自発的な興奮により、心臓の萎縮が開始する。ＳＡ結節により生じた電気衝撃（impulse）は、房室間（「ＡＶ」）結節に移動し、Ｈｉｓ及びプルキニエのネットワークの束に送られて、多くの方向に枝分かれすることにより、右心室と左心室の刺激性萎縮を促進させる。

ある疾患状態においては、正確なペースを刻む心臓の能力が傷付けられる（compromised）。現在、そのような機能不全は移植可能なペースメーカーの移植により共通に処理される。多くの患者の生活を改善するが、移植可能なペースメーカーは、限定された寿命を有し、よって、移植可能なペースメーカーを置き換えるために患者を複数の外科手術にさらすかもしれない。さらに、移植可能なペースメーカーは、そのペーシング速度を増加させるか又は低下させるためにＳＡ結節上で作用する体の内生的シグナリングに直接応答することができないかもしれない。

最近、心臓の細胞のペーシング速度に影響を及ぼす生物学的方法が開発されたが、様々な薬剤と薬学組成物の使用を含む。遺伝子工学の進歩は、心臓細胞の固有のペーシング速度に影響を及ぼすために心臓細胞を遺伝子修飾するための方法をもたらしてきた。例えば、米国特許番号第６，２１４，６２０号は、特定のイオンチャネルを過剰発現する（例えば、Ｋ^＋チャネル）か又は過小発現する（例えば、Ｎａ^＋及びＣａ^＋チャネル）ことにより心室の細胞の興奮可能性を抑圧する方法を記載する。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０８７４１９は、無活動の心室細胞中のＫ^＋チャネル（Ｉ_Ｋ１）を内向きに整流する（inwardly rectifying）遺伝的修飾により心臓の細胞の電気的挙動を変調するための方法及び系を記載する。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９８２８６は、ＨＣＮ分子により心臓細胞のペースメーカー機能を制御する方法を記載する（ペースメーカー電流Ｉ_ｆのＨＣＮ１，２，又は４アイソフォーム）。

しかしながら、心臓の機能不全のための好結果の治療用の治療法を保証するため、移植可能な医学用装置（ＩＭＤ）と協同した、遺伝子修飾治療（バイオペーシング）の系を満たすための要求が残される。

本発明は、生理学上のシグナルに応答することができ、並びに心室の同調性萎縮を促進させて回復させることにより、即ち健康な心臓の機能を模倣するバイオロジカルペースメーカー（「バイオペースメーカー」）を提供する。バイオペースメーカーは、バイオペースメーカー組成物の細胞への送達により心臓の導電系の標的化領域において心筋細胞の遺伝子修飾を通して生成される。

発明の一つの側面において、一つ又はそれより多い分子をコードする二つ又はそれより多いコーディング配列を含むバイオペースメーカー組成物が心臓導電系の心筋細胞に送達されることにより、発明のバイオペースメーカーを生じさせる。望ましくは、導電系の細胞を遺伝的に修飾することにより、正常な心臓のＳＡ結節細胞の固有の心臓ペーシング速度に似せたレベルに、それらのペーシング速度を増加させる。バイオペースメーカー組成物は、望ましくは、発明のコーディング配列を含むポリヌクレオチド、分子、又は修飾された細胞を含み、そしてカテーテル、直接注入、又は均等な送達手段により細胞に送達される。

発明のバイオペースメーカー組成物は、心臓のペーシング機能不全を治療するか又は予防するための方法において有用かもしれない。望ましくは、発明のバイオペースメーカー組成物がプルキニエ繊維の心筋細胞に送達され、そして以下の修飾特性：１）増加した内部へのＣａ^２＋電流、２）低下したＮａ^＋電流；又は３）増加した外へのＫ^＋電流、の一つ又はそれより多くを含む細胞内でバイオペースメーカーを生じる。

一つの態様において、発明のバイオペースメーカーは、移植可能なペースメーカーと組み合わせて使用される。特定すれば、移植可能なペースメーカーは、心臓の機能不全を予防するか又は遺伝子操作されたバイオペースメーカーのペースメーキング作用を感作するために、遺伝子操作されたバイオペースメーカーと協同して働くようにプログラムされる。さらに、移植可能なペースメーカーは、バイオペースメーカーのペースメーキング作用が期待された程でない場合に心拍を調整する（pace）ように作動する。例えば、移植可能なペースメーカーに頼る（resorting）２つのあり得るきっかけ（triggers）は、１）一定の予め決定された閾値より低いペーシング速度のバイオペースメーカー、及び２）バイオペースメーカーの断続性ではあるがおそらくは正常な機能である。バイオペースメーカーの位置がＡＶ結節の場合、ＳＡ結節の先端部分はＡＶ結節から心房（atria）を隔離（isolate）するように除去されてよい。バイオペースメーカーがプルキニエネットワーク内に位置する場合、全結節を除去してよい。

本発明は、心臓の導電系の細胞、例えば心臓のプルキニエ繊維の固有のペースメーキング速度を遺伝子修飾により増加させる生物学上の方法に関する。
図１は、心臓の固有の導電系の部分及び右心房１６及び右心室（「ＲＶ」）１８の部屋（chamber）を見せるように剥がし取られた（peeled back）前外側の壁を有する心臓の右サイドの模式図である。図１に例示された心臓の固有の導電系の直接関係のある要素は、ＳＡ結節３０、ＡＶ結節３２、Ｈｉｓ ４０の束、右の束のブランチ４２、及びプルキニエ繊維４６である。ＳＡ結節３０は、上大静脈１４と右心房（「ＲＡ」）１６の間の接続部（junction）において示される。ＳＡ結節３０において開始した電気衝撃は、ＲＡ１６を通って迅速に移動し、そして右心房（示さず）はＡＶ結節３２に。ＡＶ結節３２においては、Ｈｉｓ ４０の束を通って移動する前に遅延を引き起こすように衝撃は遅くなり、心室間の隔壁１７内で、右の束のブランチ４２と左の束のブランチ（示さず）に枝分かれし、次に、先端で（apically）プルキニエ繊維４６に分かれる。遅延後に、衝撃はＲＶ１８及び左心室（示さず）を迅速に移動する。本明細書に記載された電気衝撃の電流は心臓から血液を有効に汲み上げるための心房と心室の萎縮と関係の順序正しい並びを創製する。心臓の固有の萎縮系の一部が機能不全になった場合、有効な汲み上げが危険にさらされる。

典型的には、ＳＡ結節３０が機能不全になった患者は、導線電極が心房の付属体（appendage）内に置かれた移植可能なペースメーカーを移植されて有するかもしれない。導線電極は機能不全のＳＡ結節３０の下流のＲＡ１６を刺激し、そして刺激するパルスがＡＶ結節３２、Ｈｉｓ ４０の束、及びプルキニエ繊維４６上に移動して、心臓の生理的萎縮を回復させる。しかしながら、患者が機能不全ＡＶ結節３２を有するなら、心房の付属体中のペーシングは有効にならず、何故ならばそれは損傷により誘導されたブロックの上流だからである。

Ｈｉｓ ４０の束におけるペーシングは、心室の脱分極を実施するように、心臓の正常な導電系を利用する利点を提供する。換言すれば、Ｈｉｓの束において提供された刺激は、右の束４２、左の束（示さず）、及びプルキニエ繊維により心臓全体に素早く伝搬する。これは、シンクロナイズした有効な心室の萎縮を提供し、ペーシングが右心室の頂端から行われる時には複製されないが、何故ならば電気的な活性が、素早く導電するプルキニエネットワークとは対照的に、ゆっくりと導電する心筋の組織により伝搬するからである。

体内の他の興奮性組織のうち、心臓の細胞は、膜を通したイオンの制御された電流を可能にする。細胞膜を通したこのイオンの移動は、膜貫通ポテンシャルの変化をもたらし、それは細胞の萎縮のきっかけである。心臓の細胞はいくつかの細胞種に分類され（例えば、心房、心室等）、各細胞種は膜ポテンシャルにおいてそれ自身の特性的バリエーションを有する。例えば、心室細胞は〜−８５ｍＶの静止ポテンシャルを有する。入ってくる脱分極の波の最前線に応答して、これらの細胞は〜２０ｍＶのピーク値を伴う活動ポテンシャルを発火し（fire）、そして次に再分極し始め、完了まで〜３５０ｍｓかかる。対照的に、ＳＡ結節細胞は安定な静止ポテンシャルを有さず、代わりに、それらの膜ポテンシャルが〜−５０ｍＶに到達したときに、自発的に脱分極し始める。細胞、例えばＳＡ結節細胞は安定な静止膜貫通ポテンシャルを有さないが、代わりに閾値を自発的に増加させ、再生性で反復性の脱分極を引き起こし、自動能（automacity）を示すといわれる。

心臓の筋肉細胞は、狭間隙結合として知られる小さな孔様構造により互いに構造上結合している。僅かな心臓細胞が脱分極したとき、それらは隣の細胞に対して電流の源（current sources）として作用して、それらがなお脱分極することを誘導し；そして今度はこれらの細胞がさらに隣の細胞などなどを強要する。心臓細胞の塊の中で脱分極が始まったら、全塊が脱分極して心臓細胞の塊がユニットとして萎縮することを誘導するまで、細胞対細胞導電により素早く広がる。

ＳＡ結節中の細胞は特化されたペースメーカー細胞であり、もっとも高い発火（fire）速度を有する。これらの細胞からの脱分極は心房を通して広がる。心房の筋肉細胞は心室の筋肉細胞と密接に結合はしていないため、萎縮は直接心室には広がらない。代わりに、心房の脱分極がＡＶ結節に入り、そして僅かな遅延の後に、Ｈｉｓの束とプルキニエネットワークにより心室上へ通過して、心内膜に沿って細胞脱分極を開始する。次に、脱分極は、全心室塊を通して細胞対細胞導電により広がる。

ＳＡ結節の唯一の細胞は、その自動能によりそれを授けるイオンチャネルのコンビネーションを含む。心臓の電気的機能の特徴の総説及びイオン及び分子の根本原理の現在の理解の記載は、Ｓｃｈｒａｍらの「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａ Ｂａｓｉｓ」、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．９０，９３９−９５０ページ（２００２）の中に見いだすことができ、その教示は引用により本明細書に編入される。

ＳＡ結節細胞の独特の特徴の幾つかは、Ｎａ^＋チャネル（Ｉ_Ｎａ）及び内向き整流（inwardly rectifying）Ｋ^＋（Ｉ_Ｋ１）チャネルの不在を含む。ナトリウム電流の不在下では、ＳＡ結節の活動ポテンシャルの上昇運動がＬ−タイプのＣａ^２＋−チャネル（Ｉ_ＣａＬ）により主に媒介される。ＳＡ結節細胞はＩ_Ｋ１の欠如のために安定な静止ポテンシャルを有さず、そして再脱分極相が完了した直後に脱分極し始める。ＳＡ結節細胞に関しての最大の弛緩期ポテンシャルは、心房細胞及び心室細胞に関してのそれぞれ−７８ｍＶ及び−８５ｍＶに比較して、約−５０ｍＶである。ゆっくりとした脱分極相は、「おかしな電流（funny current）」（Ｉ_ｆ）とＴ−タイプのＣａ^２＋チャネルの活性化及び遅いカリウムと速いカリウム（それぞれ、Ｉ_Ｋｓ及びＩ_Ｋｒ）の不活性化により媒介される。正常に機能する心臓の中のＳＡ結節内のペースメーカーの放電（discharge）の速度は、１分あたり約６０から１００ビートの範囲に近い。

機能不全のＳＡ結節ペースメーカー機能を有する心臓においては、固有のペースメーキング活性をもつ心臓の他の構造は、ペーシング機能を支配（take over）し得る。しかしながら、増加した心拍数（heart rate）は、正常な循環を支持するには不十分である。本発明の方法は、心臓萎縮系の細胞、例えばプルキニエ繊維を遺伝子修飾して、電気生理学及びペーシング速度を修飾することにより、ＳＡ結節の特化されたペースメーカー細胞の電気生理学及びペーシング速度に、より近く似せることを含む。

図２は、図１に示されるのと類似の心臓の右サイドの模式図であり、ガイドカテーテル９０が発明の遺伝子構築物の送達のために配置される。カテーテル９０のための静脈アクセス部位は頭部又は鎖骨の静脈中にあってよく、そして静脈のアクセスのために使用される手段は当業界でよく知られており、標準の経皮導入キットを用いて実施されるセルジンガー（Seldinger）技術を含む。ガイドカテーテル９０は近位末端（示さず）から遠位末端９２に伸びるルーメン（示さず）を含み、スライドして送達系８０を受ける。ガイドカテーテル９０は約０．１１５インチと０．１７０インチの間の外部直径であり、構造は当業界でよく知られている。ガイドカテーテル８０の遠位末端９２は、遠位末端９２をＨｉｓ ４０の束の移植部位に向けるために、マッピング電気活性のための電極（示さず）を含んでよい。或いは、別のマッピングカテーテルをガイドカテーテル９０のルーメン内で用いることにより、遠位末端９２をＨｉｓ ４０の束の近くの移植部位に向けさせてよく、方法は当業界でよく知られている。

一つの態様において、遺伝子構築物又はベクターを含む十分な量のバイオペースメーカー組成物が導電系の細胞に送達され、遺伝子構築物は導電系の一つ又はそれより多い特性を修飾することにより、そのような細胞の固有のペースメーキング速度を増加させる。発明の一つの態様において、バイオペース組成物はプルキニエ繊維細胞に送達されて、１）内部のＴ−タイプのＣａ^２＋電流を増加させるか、２）Ｎａ^＋電流を低下させるか；又は３）おかしな電流（funny current）」（Ｉ_ｆ）を増加させるか、又は４）外へのＫ^＋電流を増加させる。

導電系の細胞を修飾することにより、これらの細胞の主たる（primary）ペースメーカーへの形質転換を最大にし、そして、ＳＡ結節のそれに似せたレベルまでそれら固有のペーシング速度を増加させてよい。望ましくは、修飾された細胞の固有のペーシング速度を、ＳＡ結節のそれに実質同一なレベルまで増加させる。本明細書に使用される「似せる（resembling）」又は「似せる（resembles）」は、心臓が正常に機能しているときの特定の患者のＳＡ結節細胞のペーシング速度の少なくとも約８５％のレベルまで修飾された細胞のペーシング速度を増加させることを意味し、そして「実質上同一の」は、心臓が正常に機能しているときの特定の患者のＳＡ結節細胞のペーシング速度の少なくとも約９５％のレベルまで修飾された細胞のペーシング速度を増加させることを意味する。

本明細書において使用される用語「コードする（encodes）」、「コードする（encoding）」、「配列をコードする（coding sequences）」及び類似の用語は、適切な制御配列の制御下に置かれたときに、インビトロ又はインビボにおいて、転写されて（ＤＮＡの場合）そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列を意味する。

多数の遺伝子修飾を本発明に従い実施してよい。例えば、内部のＣａ^２＋電流を増加させるために、バイオペースメーカー組成物をこれらの細胞に送達することにより、導電系の細胞を遺伝子修飾してよい。特定の実施例として、プルキニエ繊維に関して、上記組成物はＴ−タイプのＣａ^２＋チャネルの外因性発現をもたらすＴ−タイプのＣａ^２＋チャネルをコードするコーディング配列を含む。このチャネルの外因性発現は、それらの固有のペプチド速度を増加させるのに必要なプルキニエ繊維細胞の脱分極特性を容易にする。

発明の別の態様によれば、Ｉ_ｋを増加させるための遺伝子修飾を受ける。ＳＡ結節に関して、プルキニエ繊維細胞は、Ｉ_Ｋに必須のチャネルＩ_Ｋｒ又はＩ_Ｋｓを低レベルで発現する。Ｉ_Ｋｒチャネルは二つのサブユニット（αとβ）から構成されるが、それぞれｅｒｇ１とＭｉＲＰによりコードされ、共に集合することにより機能性チャネルを生じる。ｅｒｇ１の異種発現はＩ_Ｋｒに類似のカリウム電流を生じる。Ｉ_Ｋｓチャネルは、ＫｖＬＱＴ１によりコードされるαサブユニットと、ｍｉｎＫによりコードされるアクセサリーβサブユニットから構成される。これらの両サブユニットの集合は、Ｉ_Ｋｓを誘導するのに必要である。

ＳＡ結節においては、後期再分極化の間のＩ_ＫｒとＩ_Ｋｓの不活性化が、十分な心拍数を維持するのに十分な速度での脱分極を促進する。プルキニエ繊維の細胞内の弱いＩ_Ｋは、活動ポテンシャル期間（ＡＰＤ）を増加させる。延長されたＡＰＤは、プルキニエ細胞の固有のペースメーキング速度が比較的遅く、そして正常な循環を維持するには不十分であることを暗示する。プルキニエ繊維細胞のＡＰＤは、Ｉ_Ｋｒ及び／又はＩ_Ｋｓの外因性発現によりＩ_Ｋを増加させることにより、ＳＡ結節のＡＰＤにより密接に模倣するために短縮できる。Ｉ_Ｋｒ又はＩ_Ｋｓをコードする配列を含むバイオペースメーカー組成物をプルキニエ繊維細胞に送達することは、これらのチャネルの外因性発現を増加させ得る。Ｉ_Ｋｒの外因性発現に関して、上記組成物は、ｅｒｇ１コーディング配列を含んでよく、又は或いはｅｒｇ１とＭｉＲＰコーディング配列の両方を細胞に送達してよい。Ｉ_Ｋｓの外因性発現に関しては、上記バイオペースメーカー組成物は、ｍｉｎＫ及びＫｖＬＱＴ１コーディング配列を含む。

別の態様によれば、導電系の標的領域、例えばプルキニエ繊維細胞を修飾することにより、ナトリウム電流（Ｉ_Ｎａ）を低下させることができる。ＳＡ結節においては、Ｌ−タイプのＣａ^２＋チャネルが活動ポテンシャルの上昇運動（upstroke）を媒介する。しかしながら、野生型プルキニエ繊維細胞における活動ポテンシャルの上昇運動はＩ_Ｎａにより媒介される。Ｉ_Ｎａによる媒介は、ＳＡ結節のそれに比較して、より素早い上昇運動をもたらす。プルキニエ繊維のＡＰ’ｓの上昇運動は、外因性Ｉ_Ｎａの抑圧により遅くすることができる。外因性Ｉ_Ｎａ発現は、Ｉ_Ｎａの野生型の発現を干渉するポリヌクレオチド配列又は分子を導入することにより抑圧できる。

あらゆる心臓細胞種のペーシング速度は、細胞により発現されるチャネル、並びに隣接する細胞により及ぼされる電気緊張作用（electrotonic influences）の組成物の生成物である。例えば、証拠は、心室がプルキニエ−心室接続部においてプルキニエ細胞に対して電気緊張作用を及ぼし、それによりそのペーシング速度を阻害することを示唆する。即ち、有効にするには、提案された遺伝子修飾が、野生型チャネルの発現並びに隣接する細胞により及ぼされる作用を勘案しなければならない。

心室の電気緊張作用は、プルキニエ繊維を心室細胞から分離することにより低下させることができる。電気衝撃はギャップの接続部により心室を通して広がるから、遺伝子修飾の付近におけるギャップの接続部を分離することは、所定の量の細胞の修飾に関するペーシング速度における増加を増大させることにより修飾の効果をさらに増強するための助けとなり得る。これは、遺伝子修飾がプルキニエ繊維の、より遠い末端において起こる場合に、特に有用である。

ギャップの接続部はコネクソンの形成を干渉することにより分離することができる。心室のギャップの接続部は、プルキニエ細胞又は他の細胞のギャップ接続部を完全に残したまま、心室のギャップ接続部の優勢なコネクシン蛋白質であるコネクシン４３（ＣＸ４３）の標的化干渉により、選択的に分離することができる。従って、本発明は、プルキニエ−心室接続部のエリア内、より好ましくは前記の遺伝子修飾の何れかの隣接したエリア内の心室ギャップ接続部の選択的分離を提供する。

上記の遺伝子修飾の何れかの組み合わせ又は全てを実施してよい。例えば、導電系の細胞、例えば、プルキニエ細胞を修飾することにより、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネルの外因性発現を誘導してよい。或いは、導電系の細胞（例えば、プルキニエ繊維）がＴ−タイプのＣａ^２＋チャネル、Ｉ_ｆ，Ｉ_Ｋｒ，及びＩ_Ｋｓを発現するように、それらを修飾する。ＳＡ結節においては、これらのチャネルの全てはペースメーキング速度に寄与し、幾つかの場合には、従って、同時又は連続してプルキニエ繊維の４つの全ての特徴を修飾することを望んでよい。或いは、細胞を修飾することにより、外因性Ｎａ^＋の抑圧と同時に上記のチャネル一つ又はそれより多くを発現させてよい。

図３Ａ及び３Ｂの描写は、発明の遺伝子修飾の効果を例示する。図３Ａは、障害のあるＳＡ結節３０内で正常なペースメーカー機能を有する心臓を示す。図３Ｂは、遺伝子ベクター又は構築物３９を含むバイオペースメーカー組成物の、心臓導電系のプルキニエ繊維細胞４６への送達を示す。遺伝子ベクター又は構築物が宿主細胞に送達されて修飾された遺伝子の発現が起こった後で、心臓導電系の電気生理機能を有する細胞が、正常な機能のＳＡ結節のそれに、より密接に似せるように変更してよい。バイオペースメーカー組成物は、或いは、ＳＡ結節３０、ＡＶ結節３２、又は心室内の導電系へ送達されてよく、Ｈｉｓの近位の束、中間体の左及び右のブランチ、及び心室の心内膜中に完全に埋包された（embedded）遠位のプルキニエネットワーク／繊維を含む。

ＳＡ結節とＡＶ結節が遺伝子修飾に影響を受けない状況においては、心室内の導電系の上部領域、Ｈｉｓのｖｉｚの束又は左及び右の束のブランチの上部領域は、バイオペースメーカー形成のためのもっとも好ましい部位である。しかしながら、これらの構造は小さくて結合組織の層により設置されているため、それらを標的化することは、相対的に難しいかもしれない。対照的に、近位のプルキニエ繊維を標的化することは、心内膜上のそれらの豊富さと公知の極在性のために、容易である。近位のプルキニエ繊維内のペースメーカーに関しては、心室の導電系（即ち、Ｈｉｓの束、束のブランチ及びプルキニエネットワーク）内の活性化配列が正常な活性化配列とは異なるが、導電系内の導電速度が筋肉間導電速度よりも約１桁早いため（導電系内の２−４ｍ／ｓに対して心室筋肉内の０．３から１．０ｍ／ｓ）、なおも同期性心室萎縮をもたらす。

図４Ａ及び４Ｂは、電気生理的特性の修飾により得られた導電系内のプルキニエ繊維のペーシング速度に対する遺伝子変化の効果を示す。図４Ａに示されるとおり、野生型のプルキニエ繊維細胞においては、Ｉ_Ｎａが脱分極を媒介する。しかしながら、図４Ｂに示されるとおり、Ｉ_Ｋｒ及びＩ_Ｋｓチャネル、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル、Ｉ_ｆチャネルを発現することができるコーディング配列、並びにＩ_Ｎａを抑圧できるポリヌクレオチド配列を含む一つ又はそれより多い遺伝子構築物の送達に関する本発明の方法を用いた遺伝子修飾後は、脱分極が、Ｌ−タイプＣａ^２＋及びＴ−タイプＣａ^２＋チャネルの両方により媒介され、そして修飾された心臓のプルキニエ繊維細胞の発火速度はＳＡ結節のレベルまで増加する。

心臓疾患はしばしば突然発症し、患者は早急なペースメーカー処置を必要とするかもしれない。よく知られるとおり、遺伝子又はポリヌクレオチド転移の効果は数日間の間では認識されないかもしれない。即ち、図５Ａにおいて描写されるとおり、移植可能なペースメーカー５０に発明のバイオペースメーカーを装具することにより、チャネル又は他の蛋白質の完全な発現又は抑圧が達成される前に、本発明の遺伝子処置後の数日間はブリッジとして作用する。この態様において、移植可能なペースメーカー５０は当業界でよく知られた方法と矛盾なく移植される。移植可能なペースメーカー５０は、幾つかの目的にかなうように適合されるか又はプログラムされてよい。例えば、移植可能なペースメーカー５０は、本発明のバイオペースメーカーに対するバックアップとして作用してよい。バイオペースメーカー５２が作動しなくなるか、機能しなくなるか、又はペーシング速度の遅延が感知されるような偶発事故においては、移植可能なペースメーカー５０が活性化されることにより、ペーシング機能を引き継いでよい。さらに、移植可能なペースメーカー５０は、バイオペースメーカー５２が十分な刺激を生じるように作動しなくなるような偶発事故において、バイオペースメーカー５２の活性を補ってよい。補うため又はプルキニエ繊維の遺伝子修飾と共に使用さるために移植可能なペースメーカーを用いる他の目的は、当業者に明らかとなる。

移植可能なペースメーカー５０とバイオペースメーカー５２の協同の作用を図５Ｂに記載する。特定すれば、移植可能なペースメーカー５０とバイオペースメーカー５２の間の作用ロジックの一つの側面を示す。コンピューターにより実行されるソフトウエアロジックシステム６０は、ロジックステップ６２を含み、遺伝子ベクターが心臓導電系の標的化領域に送達されて、ペースメーカーがロジックステップ６２下で移植される。ロジックステップ６４においては、バイオロジカルペースメーカーの成熟及び送達された遺伝子ベクターにおける治療の機会の数を断続的に監視しながら、ペースメーカーを使用して患者の心臓の心拍調整をする（pace）。決定ステップ６６においては、目標とされたか又はプログラム可能な心拍数がバイオロジカルペースメーカーにより達せられたとき、移植可能な医学用装置をロジックステップ６８下で監視様式にスイッチする。しかしながら、目標とされた心拍数がバイオロジカルペースメーカーにより達せられなかったときには、次に決定ステップ７０下で、終了したか否かについて、バイオロジカルペースメーカーの成熟の時間をチェックする。時間が終了したなら、次に、ロジックステップ８２下で移植可能なペースメーカーを主要ペースメーカーとするよう、ロジックが続く。他方、バイオロジカルペースメーカーの閾値時間が終了していなければ、システムは、バイオロジカルペースメーカーの成熟を断続的に監視しながら、ペーシングが当該装置により行われるロジックステップ６４に逆戻りする。今、ロジックステップ６６を参照すると、目標とされた心拍数がバイオロジカルペースメーカーにより達せられたなら、次に、ロジックステップ６８の下で、移植可能なペースメーカーを、バイオロジカルペースメーカーの作用を監視するためのみにスイッチする。次に、ロジックステップ７２の下で、適切な心拍数が保持されているか否かを観察するため、バイオロジカルペースメーカーをチェックする。適切なペーシング速度がバイオロジカルペースメーカーにより保持されていれば、移植可能なペースメーカーは監視様式にて維持されて、或いは、バイオロジカルペースメーカーが適切な速度を保持していなければ、継続の通院に患者を気づかせるように、患者の警戒態勢を誘発する。典型的には、装置の患者警報装置、又は他の均等な知覚可能手段により、警戒態勢を伝える。さらに、ロジックステップ７８の下で、遺伝子ベクターの別の用量が医師の意見に基づいて投与されるべきか否かを観察するために、上記システムは確かめる（look）。そのような用量が確認されたら、ロジックステップ８０の下で別の用量の遺伝子ベクターを投与し、そしてバイオロジカルペースメーカーの成熟を断続的に監視しながら上記装置を用いて心拍調整をするためにロジックステップ６４にロジックを逆戻りさせる。或いは、別の用量の遺伝子ベクターの投与が薦められないなら、システムをロジックステップ８２に逆戻りさせて、移植可能なペースメーカーを主要なペーサーとして作用させるようにする。さらに、移植可能なペースメーカーが本発明のバイオペースメーカーのバックアップとして作用してよい。バイオペースメーカーが作動しなくなるか、機能しなくなるか、又はペーシング速度の遅延が感知されるような偶発事故においては、移植可能なペースメーカーを活性化することにより、ペーサー機能を引き継いでよい。特定すれば、移植可能なペースメーカーは、バイオペースメーカーが十分な刺激を生じないような偶発自己においてバイオペースメーカーの活性を補ってよい。補うため又はＡＶ結節の遺伝子修飾と共に用いられるための移植可能なペースメーカーを用いる別の目的は、診断目的のための長期のデータの管理及び遺伝子ペースメーカーの長期間の性能を追跡して監視することを含む。

ＡＶ結節の上部領域の切除を、遺伝的処置及び移植可能なペースメーカーの移植と共に実施してよい。不愉快な関節の脈拍を経験した患者及び心房細動を患う患者において、ＡＶ結節から心房を電気的に分離するためには、切除が必要かもしれない。

遺伝子構築物を含むバイオペースメーカー組成物の送達は、当業界のあらゆる方法に従い実施することができる。遺伝子構築物が遺伝子操作のために標的化された細胞の小さな部分（例えば、プルキニエ繊維の細胞）に達することのみを必要とする。当該遺伝子構築物は、Ｒ．Ｊ．Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７３，１２０２−１２０７（１９９３）に記載されたとおりに、心筋へ直接注入してよい。送達ステップは、さらに、遺伝子構築物の送達の前又は間に少なくとも一つの透過剤を送達することを含む、日常の手法を用いて微小管透過性を増加させることを含んでよい。発明の方法により有用な潅流（perfusion）プロトコルは、哺乳類において心筋の少なくとも約１０％に遺伝子構築物を送達するのに普通は十分である。約０．５から約５００ｍｌの注入量が有用である。固形の器官、例えば、心臓に対して非ウイルスベクター遺伝子構築物を標的化するための方法は開発されており、米国特許第６，３７６，４７１号に記載された方法のようなものであり、その教示は引用により本明細書に編入される。

発明の治療方法は、有効な量の発明の遺伝子構築物の、導電系の細胞、例えば、心臓のプルキニエ繊維細胞への送達により、これらの細胞の固有のペーシング速度を増加させて、正常に機能したときにＳＡ結節細胞のペーシング速度に似せることを含む。送達又は投与は、注入、カテーテル及び当業界で知られている他の送達手段により達成してよい。心臓の標的エリアにおいて遺伝物質を送達するための送達系は、本出願の譲受人に譲渡されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０２１５０に記載されており、その教示は引用により本明細書に編入される。

遺伝子構築物は、例えば、トランスフェクション又はトランスダクションの手法により、細胞へ送達することができる。トランスフェクション及びトランスダクションは、添加された核酸分子の取り込みによる新しい遺伝物質の細胞による獲得を意味する。トランスフェクションは、物理的又は化学的方法により起こり得る。多くのトランスフェクション技術が当業者には知られており、限定ではないが、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストリンＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、ネイキッドプラスミド吸着、及びカチオン性リポソーム−媒介性トランスフェクションを含む。トランスダクションは、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスを用いた、核酸の細胞への移動のプロセスを意味する。トランスデュース剤としての使用のための適当なウイルスベクターは、限定ではないが、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルスベクターを含む。

本発明のコンテクストにおいて、電気生理的アッセイ法により心臓の導電系の細胞の変調を検出するための方法は、心臓の活動ポテンシャルの特性、例えば、活動ポテンシャルの期間（ＡＰＤ）を決定するために使用されるあらゆる慣用の試験に関する。そのような試験を実施することに関連するそのような方法の例は、Ｊｏｓｅｐｈａｓｏｎ ＭＥ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｒｄｉａｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｓ，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ．（１９９３），ｐｐ．２２：７０により開示されており、その教示は引用により本明細書に編入される。簡単に言えば、標準の電気生理的アッセイは、以下の工程を含む：哺乳類の心臓を用意し（インビボ又はエクスビボ）、発明の遺伝子構築物又は修飾された細胞を心臓に送達し、コードされるアミノ酸配列の発現を許容する条件下で遺伝子構築物及び／又は修飾された細胞を心臓に移動させ；そして遺伝子構築物及び／又は修飾された細胞が送達される心臓の細胞内で少なくとも一つの電気的特性の増加を検出することを含み、但し、少なくとも一つの特性が基底値に関する細胞のペーシング速度である。基底値は導電系内で選択された特定の標的領域に関して変動する。さらに、発明の遺伝子構築物の投与の前及び後に慣用の心電図（ＥＣＧ）を実施し、そしてＥＣＧの結果を検査することにより、発明の方法を用いて得られた心臓の電気特性の変調を観察してよい。心臓の電気的興奮によるＥＣＧのパターンは、よく研究されている。心臓の筋肉を通した脱分極及び再分極の広がりに付随した心臓内の電気ポテンシャルの変化を測定するためにＥＣＧの記録を分析するための様々な方法が公知である。

発明においては、特定のイオンチャネルの発現を増加させることができるか、又はイオンチャネルの発現又は機能の全部又は一部を抑圧することができるポリヌクレオチドを含むバイオペースメーカー組成物を作成してよい。えり抜きのイオンチャネルをコードするポリヌクレオチドを、伝統のＰＣＲに基づく増幅技術及び公知のクローン化技術により作成することができる。或いは、発明のポリヌクレオチドを当業界公知の自動化手法により作成することができる。発明のポリヌクレオチドは、転写を開始させるための開始コドン及び翻訳を停止させるための停止コドンを含むべきである。

発明において使用するための適当なポリヌクレオチドは、様々な公的な源から得ることができ、限定ではないが、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））、ＥＭＢＬデータライブラリー、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（スイスのジュネーブ大学）、ＰＩＲインターナショナルデータベース；及びアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１０８１大学ブルバード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９）を含む。一般には、ＧｅｎＢａｎｋの記載に関して、Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５：１（１９９７）を参照。本発明において有用な特定のポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋからの呼び出し公的情報により容易に得られる。

あらゆるＤＮＡベクター又は送達媒体を利用することにより、所望の核酸を、心臓のプルキニエ繊維の細胞に送達することができる。例えば、α_１ＨｃＤＮＡ，ＨＣＮ１−ＨＣＮ４，ｅｒｇ１，ＭｉｎＫ，ＭｉＲＰ，ＫｖＬＱＴ１ ｃＤＮＡ、又は全てを、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）のようなウイルスベクターにクローン化してよい。或いは、他のウイルスベクター、例えば、ヘルペスベクター、及びレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを用いてよい。選択されるウイルスベクターの種類は、標的組織及び送達される配列の長さに依存する。ウイルスベクターの考察に関しては、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｕｒｒａｙ ｅｄ．，ｐｐ．１０９−２０６（１９９１）を参照。例えば、リポソーム：ＤＮＡ複合体、プラスミド：リポソーム複合体、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡコートされた粒子、又はポリマーに基づく系を用いることにより、所望の配列を細胞に送達してよい。上記の送達系及びプロトコルは、よって、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｋｍｅｉｃ ２ｅｄ．ｐｐ．１−３５（２００２）及びＧｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．７，Ｍｕｒｒａｙ ｅｄ．ｐｐ．８１−８９（１９９１）に見いだすことができる。ＡＡＶベクターは、当業界でよく知られた技術を用いて構築することができる。典型的には、ベクターを構築することにより、調節要素の作動可能なように結合した成分を提供する。例えば、典型的なベクターは、転写開始領域、発現される蛋白質のヌクレオチド配列、及び転写終結領域を含む。典型的には、そのような作動可能に結合された構築物に、必要なウイルスｃｉｓ要素であるＡＡＶ ＩＴＲ配列を有するその５’及び３’の領域を周囲に加える。調節配列は、ウイルス由来のプロモーター、例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０からしばしば提供され得る。ウイルスの制御配列は、様々な細胞において高いレベルの発現を達成するように選択することができる。或いは、偏在する発現プロモーター、例えば、初期サイトメガロウイルスプロモーターを利用することにより、あらゆる細胞種において発現を達成することができる。第３の別法は、組織特異的発現を推進するプロモーターの使用である。このアプローチは、非標的組織内の所望の蛋白質の発現が有害な効果を有するかもしれない場合に、特に有用である。即ち、別の好ましい態様によれば、上記ベクターは、心臓特異的プロモーターとして機能する遠位ヒト脳ナトリウム尿排泄亢進脳（ｈＢＮＰ）プロモーターを含む。そのようなベクターの構築に関する詳細に関しては、ＬａＰｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｂｙ Ｈｕｍａｎ ＢＮＰ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８３：Ｈ１４３９−４５（２００２）を参照。

ベクターは、心臓の導電系の標的化された領域内のトランス遺伝子の発現を増加させるために、心臓エンハンサーを含んでもよい。そのようなエンハンサー要素は、公開された米国特許出願２００２００２２２５９内に開示されたＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５制御領域由来の心臓特異的エンハンサー要素を含んでよく、その教示は引用により本明細書に編入される。

ＡＡＶベクターを適当な宿主、例えば酵母、細菌、又は哺乳類細胞に、当業界でよく知られた方法を用いて導入することにより、えり抜きの配列を運ぶＡＡＶウイルス粒子を生産することができる。

多数の異なる構築物を発明に従い生じさせることができる。例えば、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネルのα_１Ｈサブユニット、Ｉ_Ｋｒのα及び／又はβサブユニット、又はＩ_Ｋｓのα及び／又はβサブユニットのコーディング配列を含む構築物を生成できる。チャネル又はそのサブユニットの一つのコーディング配列を含む構築物を、単独遺伝子構築物と呼ぶ。これらの構築物は、たった一つのチャネル配列の導入を要求する態様を実施する場合、又は互いに関してトランス遺伝子の発現を評価することが望まれる場合に、有用である。そのようなチャネルの異なる発現は、変更されたプロモーター又は用量を異ならせる投与によりベクターを生じさせることにより、達成することができる。或いは、当業者には知られているとおり、化合物ベクターにより、複数のトランス遺伝子を同時に送達することができる。

目標とされた遺伝子抑圧は多数の技術により達成することができる。一般には、転写レベル又は翻訳レベルにおいてＩ_Ｎａ又はＣＸ４３の発現を干渉するポリヌクレオチドを、プルキニエ繊維の細胞に投与してよい。例えば、Ｉ_Ｎａチャネル又はＣＸ４３の優性阻害（dominant negative）形態の何れかをコードするか、おとりとして機能するか、又は三重鎖の形成により立体的に転写をブロックするポリヌクレオチドを用いてよい。或いは、アンチセンスアプローチを利用してよい。さらに、ヘテロダイマーのギャップ接続部を形成するための機能性ＣＸ４２サブユニットとＣｘ４３サブユニットの共集合体が、ギャップ接続部の導電性を低下させる助けとなるかもしれない。

野生型遺伝子に変異を導入して、野生型蛋白質を発現する細胞において変異した遺伝子を発現することにより、優性阻害遺伝子の抑圧を達成する。優性阻害蛋白質は、野生型蛋白質の集合体又は機能を干渉することにより、特定の蛋白質のレベルを低下させるように作用する。野生型遺伝子中の変異は、部位特異的変異導入により導入してよい。

Ｉ_Ｎａチャネル又はＣＸ４３の有効な優性阻害変異は、細胞表面への当該蛋白質の輸送のため、又は野生型蛋白質のフォールディングのために重要な残基に向けられた変異を含んでよく、それにより、細胞表面又はギャップ接続部における機能性蛋白質の数を低下させる。追加の優性阻害変異は、疎水性膜貫通領域における親水性アミノ酸の導入を含む。そのような変更は、チャネルの細胞膜への有効な集合を妨害する。好ましくは、優性阻害が標的とされた遺伝子に特異的であることにより、他の蛋白質の機能が変更されない。さらに、イオンチャネルの場合、変異をデザインすることにより、チャネルのイオン特異性を変更しないようにするべきである。

本発明における使用のための特定の構築物は、Ａ２５３Ｖ変異を有するＣＸ４３構築物である。この変異は、ＣＸ４３を有効に抑圧することが示された。Ｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｘｉｎ（ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ａｐｐｒｏａｃｈ ｗｉｔｈ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ，”Ｔｏｘ．Ｌｅｔｔ．，Ａｕｇ．，ｐ．１０５−１１０（１９９８）を参照。Ａ２５３Ｖ ＣＸ４３遺伝子を含むベクターを、既に記載された技術によりプルンキエ繊維の細胞に導入してよい。

Ｉ_Ｎａの優性阻害の抑圧に有用な構築物は、ＳＣＮ５Ａ Ｒ１４３２Ｇである。１４３２位におけるアルギニンのグリシンへの置換は、チャネルのプラズマ膜への輸送を干渉する。Ｂａｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｂｒｕｇａｄａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，８８：ｅ７３−ｅ８３（２００１）。細胞表面におけるチャネルの低下したレベルは、Ｉ_Ｎａを低下させる。

この発明の方法による心臓導電系の細胞中のＩ_Ｎａ及び／又はＣＸ４３の抑圧は、関連する遺伝子に関する転写因子のためのおとりとして作用するオリゴヌクレオチドの投与により達成することもできる。おとりは、天然の制御配列と競合することにより遺伝子の発現を抑圧するように機能する。当該オリゴヌクレオチドは、関連する遺伝子を制御する転写因子に特異的であるべきである。当該オリゴヌクレオチドは、当業界でよく知られた技術によりプルキニエ繊維の細胞に投与してよい。

発明は、Ｉ_Ｎａ及び／又はＣＸ４３発現を抑圧するための三重鎖技術を用いて実施してもよい。即ち、単鎖オリゴヌクレオチドを心臓導電系の標的化領域の細胞（プルキニエ繊維）に導入してよい。標的化された遺伝子の抑圧は、標的の二重鎖ＤＮＡ及び上記オリゴヌクレオチドから構成される三重鎖構造の形成による転写の阻害により達成される。有力な三重鎖部位は、１５塩基対のストレッチにわたる最低８０％のプリンを有する標的化遺伝子配列を検索するコンピューターソフトウエアを用いて同定してよい。当該オリゴヌクレオチドは、細胞中に存在する３’エキソヌクレアーゼに対する防御のために３’プロパノールアミンを伴って合成してよい。三重鎖技術の考察に関しては、Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｉｐｌｅｘ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｋｍｉｅｃ ２ｅｄ．ｐｐ．１８３−２００（２０００）を参照。

発明によれば、Ｉ_Ｎａ及び／又はＣＸ４３発現は、アンチセンス技術を用いて抑圧してもよい。アンチセンス治療は、アンチセンス配列の、ｍＲＮＡに結合して翻訳をブロックする能力に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非標的遺伝子発現の破壊を避けるために、標的遺伝子に関して高い特異性を有さなければならない。人工のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましいが、何故ならば、容易に合成することができ、リポソームを用いて心臓導電系細胞の細胞質に容易に輸送され、そしてヌクレアーゼ活性に耐性だからである。

本発明の構築物は、当業者に知られている方法により、プルキニエネットワークの細胞を標的化することができる。特定の細胞に唯一の細胞表面受容体の発現を利用することができる。例えば、プルキニエ細胞の表面上に選択的に発現される一つのそのような受容体は、システニルリューコトリエン２受容体（ＣｙｓＬ Ｔ_２）である。この受容体は、プルキニエ細胞を、隣りの細胞、例えば、心室細胞から識別し、そして発明の構築物を、プルキニエ細胞に選択的に標的化するために利用可能である。しかしながら、本発明の実施においては、プルキニエ細胞に特異的なあらゆる受容体を特異的標的化のために利用可能であることを理解するべきである。

標的化された送達は、構築物を送達する媒体の修飾を必要とする。ウイルスベクターの修飾のための幾つかの方法が可能である。例えば、ウイルス蛋白質キャプシッド又はウイルスエンベロープの蛋白質をビオチン化して、次に、特定の受容体に向けられたビオチン化抗体又はリガンド、即ちストレプトアビジンブリッジを通してカップリングさせてよい。

或いは、上記ウイルス送達媒体を遺伝子修飾することにより、特定の受容体のための蛋白質リガンドを発現するようにしてよい。リガンドの遺伝子は、リガンドを含む融合蛋白質がウイルスの表面上に発現されるように、例えば挿入型変異導入により、ウイルス表面のコーディング配列内に導入する。この技術に関する詳細に関しては、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：９７４７−９７５１（１９９５）を参照。ウイルス送達媒体は、標的受容体に対して向けられた抗体の抗原結合部位を最低でも示す融合蛋白質を発現するように遺伝子修飾されてもよい。例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｔｈａｔ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１０１４８−１０１５６（１９９８）を参照。

抗体−ウイルス抗体と、抗−標的細胞抗体の融合により産生された二種特異的抗体を利用して、構築物送達媒体を特定の細胞に標的化してもよい。この技術の詳細に関しては、Ｈａｉｓｍａ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒｈｅｒ．，７：９０１−９０４（２０００）及びＷａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ ’Ａｄｅｎｏｂｏｄｙ’Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｖｉｒａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：１００４−１０１２（１９９７）を参照。

標的化された構築物送達は多数の利点を提供し、増加したトランスダクション効率並びに修飾が患者に有害な作用を有するような細胞の遺伝子修飾の回避を含む。標的化された遺伝子治療のためのあらゆる技術を用いることにより、発明の構築物をプルキニエ細胞に
対して標的化してよい。当業者には理解されるとおり、本明細書で記載された遺伝子操作は、発明の範囲を逸脱することなしに、幹細胞に対して実施してよい。遺伝子修飾された幹細胞は、次に、ペースメーキング活性を誘発するように心臓導電系の細胞に投与することができる。例えば、幹細胞由来の心臓の心筋細胞を、本明細書に記載された遺伝学手法を用いて処理し、そしてカテーテルによるか又はプルキニエ繊維組織への直接の注入により、導電系（例えば、プルキニエ繊維）の領域へ移植してよい。

発明は、以下の非限定実施例を参照してさらに記載される。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく実施例に記載された態様において多数の変更がなされ得ることが明らかである。即ち、本発明の範囲は、この出願に記載された態様に限定されるべきでなく、特許請求の範囲により記載された態様及びそれらの態様の均等物のみによる。
実施例１：遺伝子修飾されたプルキニエ繊維の増加した固有のペースメーキング速度
ｒＡＡＶクローニングプラスミドの構築
構築物生成
発明のバイオペースメーカー組成物において有用な遺伝子構築物は、Ｓｃｈｎｅｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｍｏｒｇａｎ ２ｅｄ．ｐｐ．４９０−５１０（２００２）に記載された技術を用いて生成することができる。本発明の特定の構築物は、ｍｉｎＫ（米国特許第６，３２３，０２６号に掲載された配列），ＫｖＬＱＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ００６３４５），ｅｒｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ００９０５７），又はα_１Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０５１９４６）のｃＤＮＡをｒＡＶＶ生産型プラスミドｐＴＰ−Ｄ６ｄｅｌｔａＮｏｔにクローン化することにより生成される。図６に示されるこの三部からなるプラスミドは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＳＶ４０プロモーター並びにチミジンキナーゼポリアデニレーションシグナルを周囲に有するネオマイシン耐性遺伝子、及びＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲｓ）を周囲に有する遺伝子発現カセットを含み、そしてＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン、及びポリアデニレーションシグナル、二つの唯一のＮｏｔＩ制限部位を周囲に有するベータガラクトシダーゼ遺伝子を含む。えり抜きのチャネルのｃＤＮＡがベータガラクトシダーゼ遺伝子を置き換えるが、ＮｏｔＩ制限酵素を用いて当該遺伝子を切り出し、そして卵子遺伝子に関するｃＤＮＡ内にクローン化することによる。結果の生産型プラスミドを用いることにより、ｒＡＡＶ粒子を生産する。或いは、別のプロモーターを置き換えて他の構築物を生成することができる。例えば、別のプロモーターを含むｒＡＡＶ生産型プラスミドを利用してよい。トランス遺伝子配列を含む生産型プラスミドは、ＤＨ５−アルファのエシェリヒアコリの形質転換及びネオマイシ耐性によりスクリーンされたコロニーを生産することにより増幅する。次に、生産型プラスミドを耐性コロニーから単離し、そして野生型アデノウイルス５（Ｅ１欠失した）と共に適当な宿主細胞、例えば、ＨｅＬＡへ同時トランスフェクトする（ｒＡＡＶ粒子を生産するためのＨｅＬＡ細胞の使用に関する考察は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ，”Ｈｕｍａｎ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１（１９９５）を参照）。ベクターを含む宿主細胞は、硫酸アンモニウム、次に二重セシウムバンド形成を用いて精製する。ウイルス粒子を含むバンドを塩化セシウム調製物から単離し、そしてＴｒｉｓバッファー又は他の適切なバッファー中へ透析する。
優性阻害構築物の生成
優性阻害構築物は遺伝子をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより生成し、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩシステムズ（プロメガ、マジソン ＷＩ）において利用可能な部位特異的変異導入系を用いた優性阻害変異を含む。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、ハイブリッド遺伝子配列を含むプラスミドを生産する。変異原性遺伝子の増幅のためのハイブリッドプラスミドにより、エシェリヒアコリを形質転換する。上記のとおりに、変異配列をハイブリッドプラスミドから切り出して、クローニングプラスミドにクローン化する。

優性阻害Ａ２５３Ｖを用いたＣＸ４３の発現の抑圧は、プルキニエ細胞を修飾するための一つの方法である。上記のとおり、Ａ２５３Ｖ置換を含む合成オリゴヌクレオチドを合成することにより、優性阻害配列を生産する。野生型配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５１９８０にて寄託されている。内生のＩ_Ｎａの抑圧は、Ｒ１４３２Ｇ変異を含むコーディング配列を含む構築物の送達により達成される。ＳＣＮＡ５に関する野生型配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ０００３５にて寄託されている。優性阻害配列及び構築物は上記のとおりに生成する。
ＣｙｓＬ Ｔ_２特異的組換えベクターの生成
ＣｙｓＬ Ｔ_２受容体をそれらの表面中に選択的に発現するプルキニエ細胞に、組換えベクターを標的化するが、この受容体に対して向けられた抗体を含むようにウイルス蛋白質キャプシッドを修飾することによる。抗−Ｃｙｓ Ｔ_２ポリクローナル抗体（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ＭＩ）をビオチン−ストレプトアビジンブリッジによりｒＡＡＶ蛋白質キャプシッドに共有結合させることにより、修飾されたｒＡＡＶを生産する。

ビオチン化されたｒＡＡＶを生産するために、ｒＡＡＶ粒子を３Ｘ１０^９から５Ｘ１０^１０に濃縮し、そして５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．３及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＨＢＳバッファー中の１００−１０００ｕｇ／ｍｌの光活性化可能なビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）と共に氷の上でインキュベートする。インキュベーション後に、インキュベーション物を３５０ｎｍにおいて５分間照射する。未結合のビオチンを、ＨＢＳで平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍカラム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、ＭＯ）上で除去する。

ポリクローナル抗−ＣｙｓＬ Ｔ_２抗体（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３，ｐＨ８．４中で２ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＤＭＳＯ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、抗体のｍｇあたり８０ｕｇのビオチンの濃度にて、抗体に加える。ビオチンと抗体を、室温において３０分間インキュベートさせる。未結合のビオチンをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍカラム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上で除去し、そしてバッファーをＰＢＳで交換する。

ビオチン化された抗体及びビオチン化されたｒＡＡＶを５００ｕｇ／ｍｌニュートラビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）中で３０分間室温においてインキュベートすることにより、それらの蛋白質キャプシッド上で抗−ＣｙｓＬ Ｔ_２を提示するｒＡＡＶを生産する。過剰なアビジンをＳｅｐｈａｃｒｙｌ ３００カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上で除去し、そしてバッファーをＰＢＳで交換する。
インビボベクター投与
約３Ｘ１０^１０から３Ｘ１０^１４プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）のウイルス濃度範囲の塩溶液の筋肉間注射により（カテーテルにより）成体のモルモットを感染させる。心臓の右サイドへの標的化された注射のために、上大静脈又は静脈によりプルキニエ繊維を接近させ、そしてカテーテルを次に三尖弁（ｔｒｉｃｕｐｓｉｄ）バルブを通して右心房へ導き、そして右心室へ導く。心臓の左サイドは同じ様式にて標的化できる。左心房は、一次中隔（ｓｅｐｔｕｍ ｐｒｉｍｕｍ）を通して右心房から接近する。左心房から、二尖弁（ｂｉｃｕｐｓｉｄ）バルブから左心室へとカテーテルを導く。

本明細書に引用された全ての特許及び刊行物は、それらの全体を引用により本明細書に編入する。上記の好ましい態様の特定の上記の構造、機能及び操作は、本発明を実施するために必要ではなく、例示の態様の相補のための単なる記載に含まれることが理解される。さらに、上記の引用特許において記載された特定の構造、機能及び操作は本発明との関連において実施できるが、それらがその実施に必須でないことは、理解される。よって、特許請求の範囲内で、発明は、本発明の精神及び範囲から実際に逸脱することなく、特別に記載されたもの以外を実施してよいことが理解される。

図１は、ヒトの心臓の図である。 図２は、図１と類似のヒトの右サイドの模式図であり、ガイディングカテーテルが発明の遺伝子構築物の送達のために置かれている。 図３Ａ及び３Ｂは、発明の態様が如何にして作動するかを模式的に例示する。 図４Ａ及び４Ｂは、この発明による遺伝子修飾の前と後のプルキニエ繊維細胞の活動ポテンシャル（ＡＰ）の特性を示す。 図５Ａは導電系におけるＡＶ結節の細胞を形質転換することに基づく発明のバイオペースメーカーと協同して働く小さな移植可能なバックアップペースメーカーの使用を例示する。 図５Ｂは、発明の作動理論を描写する理論フロー図である。 図６は、三部からなるｒＡＡＶ生産性プラスミド、ｐＴＰ−Ｄ６ｄｅｌｔａＮｏｔの図である。

Claims (33)

1. 心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞中の、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニット；Ｉ_ｆを増加させる一つ又はそれより多い分子；Ｉ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子；及びナトリウム電流を生じさせる野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧する一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列から本質的になる群から選択される、少なくとも二つのコーディング配列を含むバイオペースメーカー組成物。
2. 細胞の固有のペーシング速度が正常に機能する心臓内の洞房結節細胞の固有のペーシング速度に似たレベルに増加された、請求項１記載のバイオペースメーカー組成物。
3. 一つのコーディング配列がＩ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子をコードする、請求項１記載のバイオペースメーカー組成物。
4. コーディング配列がｅｒｇ１，ＭｉＲＰ，ＭｉｎＫ，又はＫｖＬＱＴ１をコードする、請求項３記載のバイオペースメーカー組成物。
5. コーディング配列がＭｉＲＰをコードする、請求項３記載のバイオペースメーカー組成物。
6. コーディング配列がＭｉｎＫをコードする、請求項３記載のバイオペースメーカー組成物。
7. コーディング配列がＫｖＬＱＴ１をコードする、請求項３記載のバイオペースメーカー組成物。
8. コーディング配列がｅｒｇ１をコードする、請求項３記載のバイオペースメーカー組成物。
9. 一つのコーディング配列がＴ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニットをコードする、請求項１記載のバイオペースメーカー組成物。
10. 一つのコーディング配列がＴ−タイプのカルシウムチャネルのα_１Ｈサブユニットをコードする、請求項１記載のバイオペースメーカー組成物。
11. 一つのコーディング配列がナトリウム電流を生じさせる野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧する分子又は分子類をコードする、請求項１記載のバイオペースメーカー組成物。
12. コーディング配列が野生型のナトリウムチャネルの優性阻害形態をコードする、請求項１１記載のバイオペースメーカー組成物。
13. コーディング配列がおとりのポリヌクレオチドをコードする、請求項１１記載のバイオペースメーカー組成物。
14. コーディング配列が野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧するアンチセンスポリヌクレオチドをコードする、請求項１１記載のバイオペースメーカー組成物。
15. 心室細胞からのプルキニエ繊維の細胞を電気的にカップルする一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列をさらに含む、請求項１記載のバイオペースメーカー組成物。
16. コーディング配列がコネキシン４２をコードする、請求項１５記載のバイオペースメーカー組成物。
17. 心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞中の、Ｈｉｓの束及び／又は丈夫の束のブランチ、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニット、Ｉ_ｆ電流チャネル、Ｉ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子及びナトリウム電流を生じさせる野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧する一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列から本質的になる群から選択される、少なくとも二つのコーディング配列
    を含むバイオペースメーカー組成物。
18. 移植可能なペースメーカー及びバイオペースメーカー組成物を含むキットであって、バイオペースメーカー組成物が、心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞中の、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニット；Ｉ_ｆを増加させる一つ又はそれより多い分子；Ｉ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子；及びナトリウム電流を生じさせる野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧する一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列から本質的になる群から選択される少なくとも二つのコーディング配列を含み、そして移植可能なペースメーカーが、細胞の固有のペーシング速度が予め決定されたレベルよりも低いなら心臓の心拍を調製する手段を含む、キット。
19. 心臓のプルキニエ繊維心筋細胞に対する心室細胞の電気緊張作用を減じるための手段をさらに含む、請求項１８記載のキット。
20. 電気緊張作用を減じる手段が、心室細胞からのプルキニエ繊維の細胞を電気的にカップルする一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列を含む、請求項１９記載のキット。
21. 組成物のコーディング配列がコネキシン４２をコードする、請求項２０記載のキット。
22. 細胞の固有のペーシング速度を洞房結節のペーシング速度に似たペーシング速度に増加させるように、心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞を遺伝学的に形質転換することにより、心臓の機能を回復させるか又は心臓のペーシングの機能不全を予防するための方法。
23. Ｉ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子をコードする第１のコーディング配列、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニットをコードする第２のコーディング配列、Ｉ_ｆを増加させる一つ又はそれより多い分子をコードする第１のコーディング配列、及び野生型のナトリウム電流の発現を抑圧する一つ又はそれより多い分子をコードする第４のコーディング配列を、同時又は連続して細胞に送達することにより細胞を遺伝子修飾する、請求項２２記載の方法。
24. 第２のコーディング配列がＴ−タイプのカルシウムチャネルのα_１Ｈサブユニットをコードする、請求項２２記載の方法。
25. 心臓のプルキニエ繊維心筋細胞に対する心室細胞の電気緊張作用を減じることをさらに含む、請求項２２記載の方法。
26. コネキシン４２をコードするコーディング配列を、心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞に送達することにより心室細胞の電気緊張作用を減じる、請求項２５記載の方法。
27. 一つ又はそれより多いコーディング配列の送達の前又は同時に心臓内に移植可能なペースメーカーを移植することにより、心臓のペーシング速度が予め決定された閾値を下回るときに、遺伝子修飾された細胞による心臓のペーシングが移植可能なペースメーカーにより補完されるか又は置換されることを含む、請求項２２記載の方法。
28. 心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞に送達するための方法により作成されたバイオペースメーカーであって、バイオペースメーカー組成物が、心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞中の、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニット、Ｉ_ｆチャネル（ＨＣＮ−ＨＣＮ４）、Ｉ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子及びナトリウム電流を生じさせる野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧する一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列から本質的になる群から選択される少なくとも二つのコーディング配列を含む、バイオペースメーカー。
29. 移植可能なペースメーカー及び心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞にバイオペースメーカー組成物を送達するための方法により作成されたバイオペースメーカーを含む系であって、バイオペースメーカー組成物が、心臓のプルキニエ繊維の心筋細胞中の、Ｔ−タイプのＣａ^２＋チャネル又はそのサブユニット、Ｉ_ｆチャネル（ＨＣＮ−ＨＣＮ４）、Ｉ_Ｋを増加させる一つ又はそれより多い分子及びナトリウム電流を生じさせる野生型のナトリウムチャネルの発現を抑圧する一つ又はそれより多い分子をコードするコーディング配列から本質的になる群から選択される少なくとも二つのコーディング配列を含む、系。
30. 移植可能なペースメーカー及びバイオペースメーカーの一つが活動し、そして他方がスタンバイ中であるか又は活動していない、請求項２９記載の系。
31. 移植可能なペースメーカーが、バイオペースメーカーの性能を監視し、そして、バイオペースメーカーが作動しないときに、ペーシング機能を引き継ぐ、請求項２９記載の系。
32. 移植可能なペースメーカーが、バイオペースメーカーの性能を連続して監視し、そして、復帰のための情報及びデータを保存する、請求項３１記載の系。
33. 装置患者警告を用いて医師により継続した通院をするように、移植可能なペースメーカーが患者に警告する、請求項３１記載の系。

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