JP2006519979A - ホログラフィックセンサー - Google Patents

Abstract

シス形ジオール部含有検体を検出するためのセンサーであって、
媒体を含み、かつ、その媒体全体にホログラムを含むホログラフィック素子を有していて、
上記素子の光学特性は、媒体全体において物性が変化すると変化し、かつ、
上記媒体は、式（Ｉ）：

式中、
ｎは０、１、２、３又は４である；
Ｘ（が存在する場合）は、それぞれ独立して、電子的効果によって、ホウ素原子に対する四面体構造の形成を促進する原子又は基である；また、
Ｙは、ｎが０又は任意の値である場合において電子的効果によってホウ素原子に対する四面体構造の形成を促進する原子又は基であるようなスペーサーである：
の基を有するポリマーを含む
ことを特徴とするセンサー。
上記センサーはグルコースを検出するために使用できる。

Description

本発明はホログラフィックセンサーに関する。

特許文献１には、体積ホログラムを基盤とするホログラフィックセンサーが開示されている。このセンサーは、ホログラフィック素子、すなわち、光変換構造を全体に有する検体感受性ホログラフィック支持媒体を含む素子を有する。この変換構造の物理的配列により、上記センサーが発する光信号は、検体感受性マトリックスと検体とが相互作用又は反応した結果起こる検体感受性マトリックスの体積変化又は構造配列変化に対して非常に感度が高い。例えば、ゼラチンを基盤とするホログラフィック媒体を含むセンサーを使用してトリプシンを検出できる。トリプシンはゼラチン媒体に影響を及ぼし、整合性のあるホログラフィック支持媒体の構造を不可逆的に破壊する。

特許文献２には、ホログラフィックセンサーを使用して流体中の検体を連続的に検出する方法について記載されている。このセンサーの支持媒体は、検体と可逆的に反応できる基を含む。このため、流体がホログラフィック素子に対して通過する際に、存在する任意の検体を連続的に検出できる。

特に、特許文献２には、グルコースを検出するための、ビニルフェニルボロン酸を含むモノマーを重合することによって形成したホログラフィックセンサーの使用法について記載されている。ペンダント型フェニルボロン酸基はグルコースのシス形ジオール基と可逆的に反応し、その結果としてホログラフィック支持媒体を膨張させることができる。しかし、センサーの有効ｐＨ領域に制限があるため、この方法には限界がある。従って、（特に生理的）条件においてグルコースを連続的に検出できるセンサーが依然として要求されている。

本発明の要約
シス形ジオール含有種とボロン酸ＲＢ（ＯＨ）_２とが結合すると、三角形の平面型コンホメーションを有するエステルである、不安定なボロン酸エステルが生じる。通常、ボロン酸エステルは、電子供与基と結合して安定性の高い四面体構造を形成することによって安定となる。具体的には、この四面体構造は、ボロン酸とＯＨ⁻とが結合して負に荷電したボロン酸エステルが形成されることによって得られる。比較的高いｐＨにおいては、上記の機構は多少異なると考えられる。まずボロン酸がＯＨ⁻と結合して四面体構造のＲＢ（ＯＨ）_３ ⁻が形成され、その後このＲＢ（ＯＨ）_３ ⁻がシス形ジオールと反応すると考えられる。四面体構造のＲＢ（ＯＨ）_３ ⁻の方が、三角形の平面構造のボロン酸エステルよりも容易にシス形ジオールと反応する。
ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−９５／２６４９９ ＰＣＴ特許ＷＯ−Ａ−０３／０８７８９９

この仮説に拘束されることは意図しないが、本発明者らは、負に荷電したフェニルボロン酸エステルが形成されるとドナン電位（Ｄｏｎａｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）が生じ、その結果として支持媒体中に水が分配されるため、特許文献２のグルコースセンサーは「有用である」と考える。その後、媒体の拡大が、最大反射率の長波長側へのシフトとして観察される。低いｐＨにおいては、ボロン酸基は負に荷電したフェニルボロン酸エステルを形成できない可能性があり、その結果、検出できない可能性がある。おそらく、特許文献２のグルコースセンサーの有効なｐＨ領域に制限があるのはこのためであろう。

本発明は、グルコース及びその他のシス形ジオール含有検体を広いｐＨにおいて検出できるクラスのフェニルボロン酸誘導体の発見に基づく。本発明者らは、フェニルボロン酸を改変することによってより反応性の高い四面体型コンホメーションの形成を促進できることを示した。

例えば、フェニル基が電子吸引性置換基を１個以上含んでいて、フェニル環を通じてその電子的効果を伝達することによって、ＲＢ（ＯＨ）_３ ⁻の形成を促進してもよい。別の例としては、置換基とホウ素原子とが分子内結合を形成できるためにボロン酸エステルが実質的に四面体型コンホメーションとなってもよい。置換基を適切に選択することによって、特定の検出条件におけるセンサーの反応性を最適化することができる。

従って、本発明の第一の態様は、
シス形ジオール部含有検体を検出するためのセンサーであって、
媒体を含み、かつ、その媒体全体にホログラムを含むホログラフィック素子を有していて、
上記素子の光学特性は、媒体全体において物性が変化すると変化し、かつ、
上記媒体は、式（ｉ）の基を有するポリマーを含む
ことを特徴とするセンサー
である。

式中、
ｎは０、１、２、３又は４である；
Ｘ（が存在する場合）は、それぞれ独立して、電子的効果によって、ホウ素原子に対する四面体構造の形成を促進する原子又は基である；また、
Ｙは、ｎが０又は任意の値である場合において電子的効果によってホウ素原子に対する四面体構造の形成を促進する原子又は基であるようなスペーサーである。

このようなセンサーは、流体中のシス形ジオール部含有検体を検出する方法であって、流体とホログラフィック素子とを接触させること、及び、素子の光学特性の任意の変化を検出することを含む方法において使用できる。上記検体は、シス形ジオール部を複数含んでいてもよい；このような検体の例としては、グルコース及び酒石酸（酒石酸塩（ｔａｒｔａｒａｔｅ））を含むものが挙げられる。

式（Ｉ）の化合物を含むモノマーを重合することによって、重合体の媒体を得ることができる。

式中、
Ｘ、Ｙ及びｎは上記に定義する；また、
Ｚは重合可能な基である。

本発明の別の態様は、
流体中のシス形ジオール部含有検体を感知するための装置であって、
入口と出口とを有する流体管、及び、流体が流れることができる上記ホログラフィック素子を有し、
非電離放射線を上記ホログラフィック素子に照射することができる窓を更に有する
ことを特徴とする装置
である。流体が静止していても、検体の濃度が変化する可能性がある。また、流体は上記素子に対して連続的に通過できる。

上記変化は媒体と検体のシス形ジオール部との反応によって生じ、上記反応及び上記変化は可逆的である。上記反応と上記逆反応の両方が生じることにより、グルコース等の検体種を連続的に、恐らくはリアルタイムで感知できる。

本発明のセンサーを、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける反応、例えば発酵槽中の反応を監視するために使用できる。本発明は反応速度を測定するために使用でき、また、制御システムとしても効果的に使用できる。本発明のセンサーを、例えば、高血糖又は低血糖症を感知するために使用してもよい。

好ましい実施形態の記載
本発明は、ホログラフィックセンサーにおける使用以外にも、新規のフェニルボロン酸化合物自体をも包含する。特定の化合物及び置換基の組み合わせが好ましい；具体的には下位クレームを参照する。

本明細書中で使用される「アルキル基」という用語は、炭素原子を１〜６個有する直鎖又は分岐鎖のアルキル部を指す。この用語は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基等を含む。

本明細書中で使用される「アルコキシ基」という用語は、炭素原子を１〜６個有する直鎖又は分岐鎖のアルコキシ部を指す。この用語は、例えば、メトキシ基、エトキシ基及びプロポキシ基等を含む。

本明細書中で使用される「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。

本明細書中で使用される「電子的効果」という用語は、フェニルボロン酸においてホウ素原子に対する四面体型コンホメーションの形成を促進するという、ボロン酸基に及ぼす直接的又は間接的な効果を指す。上記原子又は基は、例えば電子求引性効果、電子供与性効果、共鳴効果又はメソメリー効果を式（ｉ）及び（Ｉ）のフェニル環に、すなわちボロン酸基に及ぼす。

フェニル環は、１個以上の電子求引性基で置換されていることが好ましい。このようにしてＲＢ（ＯＨ）_３ ⁻の形成が促進されてもよい。ＲＢ（ＯＨ）_３ ⁻がグルコースのシス形ジオール基と反応すると、生成した負に荷電したフェニルボロン酸エステルによってドナン電位が生じ、その結果として支持媒体の中に水が分配される。その後、媒体の拡大が、最大反射率の長波長側へのシフトとして観察される。一般的に、本発明のセンサーの大部分は、上記のようにしてシス形ジオール基に基づく検体を検出できるであろう。

特に、検体がシス形ジオール基を複数含んでいる場合、フェニル環は、ホウ素原子と共に分子内結合（例えば配位結合）を形成できる孤立電子対を有する原子を含み四面体型コンホメーションを導く基で置換されていることが好ましい。従って、ボロン酸基は反応性が高いものであってもよい。このような基の一例としては、以下が挙げられる。

上記の基はシス形ジオールに対して反応性が高いが、非荷電のフェニルボロン酸エステルを形成すると考えられる。非荷電である場合にはドナン電位の産生は不可能である。しかし、検体がシス形ジオール部を複数含む場合には、上記の反応性の高いフェニルボロン酸基の２個が結合して支持媒体を効果的に架橋できると考えられる。こうして支持媒体は架橋によって収縮し、その結果として再生波長がシフトする。上記のようにして検出できる検体の例としては、グルコース及び酒石酸塩（酒石酸）が挙げられる。

媒体と検体の相互作用は、非電離放射線を用いて間接的に感知できる。相互作用の程度は、光学特性の変化（好ましくは非電離放射線の波長のシフト）として検出される物性の変化の程度に反映される。

上記で変化するホログラフィック素子の特性は、電荷密度、体積、形、密度、粘度、強度、硬度、電荷、疎水度、膨張度、整合度、架橋密度等の任意の物性であってよい。上記各物性が変化すると、分極性、反射率、屈折率又は吸光度等のホログラフィック素子の光学特性が変化する。

ホログラムは、支持媒体の一部又は全体に付着、又は、その中に配置されていてよい。非電離放射線（例えば可視光）の光源を使用して、ホログラフィック素子の光学特性の変化を観察できる。

一種を超えるホログラムが、ホログラフィック素子に付着、又は、その中に支持されていてよい。ホログラムの光学特性が変化するとホログラムから発せられる放射線が変化するが、この変化を感知する方法がある。ホログラフィック素子を特定の大きさにして配置することより、独立する二つ以上の事象／種を感知して、上記放射線を異なる二つ以上の方向に同時に又は別々に放射させることができる。ホログラフィック素子は整然と配置されてもよい。

式（ｉ）の好ましい基は、以下を含む。

ホログラフィック支持媒体は、式（Ｉ）の化合物を含むモノマーを重合することによって得ることができる。好ましいモノマーは以下を含む：
２−（４−（アクリルアミドメチル）フェニルアミノ）メチル）フェニルボロン酸；
２−（（３−メタクリルアミドプロピルアミノ）メチル）フェニルボロン酸；
２−アクリルアミドフェニルボロン酸；
３−アクリルアミドフェニルボロン酸；及び、
３−アクリルアミド−６−フルオロフェニルボロン酸。

式（Ｉ）の化合物以外に、上記モノマーは（メタ）アクリルアミド及び／又は（メタ）アクリレート由来のコモノマーを含んでいてもよい。特にＨＥＭＡ（ヒドロキシエチルメタクリレート）モノマーは、容易に重合及び架橋できる。ＨＥＭＡポリマーは、膨張し、親水性で、生体適合性が広いため、支持媒体原料として広く用いられる。モノマーは、更に分子間電子供与の可能な基（例えば第三級アミンの２位）を有するコモノマーを含んでいてもよい。

変形するとボロン酸塩を含む可能性のあるホログラフィック支持媒体の別の例としては、ゼラチン、Ｋ−カラギーナン、寒天、アガロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、（大まかに分類した）ゾル−ゲル、（大まかに分類した）ヒドロゲル及びアクリレートが挙げられる。

ホログラフィック素子の反応性を測定するパラメーターの一種に、架橋度がある。モノマーの重合による架橋点の数は、ポリマーフィルムが硬くなり過ぎてポリマーと検体結合基との複合体形成が比較的少なくなる程に多くてはならない。多すぎると、支持媒体の膨張が妨げられる可能性がある。

以下の実施例と付随する図面とにより本発明を説明する。

３−アミノフェニルボロン酸と過剰量のアクリル酸クロリドとをアルカリ性水溶液中で反応させて、３−アクリルアミドフェニルボロン酸（「３−ＡＰＢ」）を合成した。この生成物をアセトン中で抽出し、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥させた。３−ＡＰＢの構造をＮＭＲで確認した。純度は約９０％であり、ＴＬＣから不純物がほとんどないことが示された。

その後、３−ＡＰＢをアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと共重合させ、ホログラムをポリマー原料中において記録した。その後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）溶液中におけるグルコース濃度を０．５ｍＭずつ増加させることによって、グルコースに対する反応を試験した。

図１は、ピーク回析波長の読み取り値に関して、ホログラムの反応を示す。この系を新しいバッファーで２回洗浄した後では、グルコースに対する反応は完全に可逆的であった。また、このセンサーは十分に感受性が高く、低いグルコース濃度（０．５ｍＭ（９ｍｇ％））を約６ｎｍのシフトで感知できた。この結果は、異なるホログラム及び器械類を使用した場合においても、誤差が約５％で再現性が高かった。

図２は検量線を示す。この検量線は、グルコース濃度２ｍＭ（３６ｍｇ％）未満においてほぼ直線状であった。

ｐＨ７．４のＰＢＳ中にホログラムを含む系にグルコースの代わりに２ｍＭのＫＣＩを添加して、対照試験を実施した。この試験は、浸透性の変化に対するホログラムの許容性を調べるために実施した：浸透性が増加するとポリマーが収縮する可能性があるからである。図３中に示すように、塩を添加してもホログラムには大きな影響はなかったことから、このホログラムは少々の塩濃度は容易に許容できる可能性があることが分かる。

実施例１中に記載するように合成した３−ＡＰＢを、エタノール水溶液から純度約９８％で再結晶させた：ＮＭＲ及びＴＬＣから不純物がないことが示された。

３−ＡＰＢをアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと共重合させ、精製３−ＡＰＢを約１５モル％及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（架橋剤）を約１．５５モル％含むポリマーを形成した。その後、ホログラムをポリマー中において記録した。

３０℃、ｐＨ７．４のＰＢＳ中におけるグルコースに対する反応についての検量線を、図４中に示す。精製３−ＡＰＢはグルコース１ｍＭ当たり約１４ｎｍの反応を示したが、実施例１の純度９０％の３−ＡＰＢは、３−ＡＰＢを同モル％含むホログラムについて、グルコース１ｍＭ当たり１１ｎｍの反応しか示さなかった。

溶媒の単位体積当たり同量の架橋剤（１．５５モル％）及び同量の固体を使用して、３−ＡＰＢモル分率が２５％のポリマーを合成した。ホログラムをポリマー中において記録した後、較正した。検量線を図５中に示す。

３−ＡＰＢの増分によって、グルコースに対するホログラムの感度の増大が７０％を超えた。このことによって、グルコース濃度の小さな変化も正確に検出することができる。

２−アミノフェニルボロン酸と過剰量のアクリル酸クロリドとをアルカリ性水溶液中で反応させて、２−アクリルアミドフェニルボロン酸（「２−ＡＰＢ」）を合成した。この生成物をアセトン中で抽出し、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥させた。２−ＡＰＢの構造をＮＭＲで確認した。純度は９０％より高かった。

その後、２−ＡＰＢをアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと共重合させ、２−ＡＰＢを２０％及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（架橋剤）を１．５％含むコポリマーを形成した。その後、ホログラムをポリマー媒体中において記録した。そして得られたホログラフィックセンサーを、グリセリン、エチレングリコール、乳酸塩、酒石酸及びグルコースに対する反応について試験した。試験は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して３０℃において実施した。

五種の検体に対するセンサーの反応を図６中に示す。このセンサーは、グリセリン、エチレングリコール及び乳酸塩の濃度変化に対して反応しないことが明らかである。しかし、このセンサーは、酒石酸及びグルコースの濃度変化に対して感受性があった；このことは、ピーク回析波長の青色側へのシフトとして観察され、従って支持媒体がこれらの検体の存在下で収縮したことが分かる。

酒石酸及びグルコースに対する上記の選択性は、これらの検体がそれぞれシス形ジオール基を２個ずつ含むことが原因であると考えられる：試験した別の検体はシス形ジオール基を１個しか含んでいない。従って、酒石酸及びグルコースは２個の２−ＡＰＢ基を結合させることができ、かつ、ホログラフィック支持媒体を効果的に架橋して収縮させることができる。

酒石酸塩の２個のシス形ジオール部位が同一であり、従って２−ＡＰＢに対する親和性が等しいため、酒石酸に対する反応はグルコースに対する反応よりも大きい。グルコースのシス形ジオール部位はわずかに異なる。グルコースの生理的濃度を調べるためにこのセンサーを使用する場合には、体液中では遊離の酒石酸はみられないため、酒石酸に対してより大きく反応するということは問題にはならないであろう。

実施例１におけるホログラムの反応。 実施例１における検量線。 実施例１における、塩の添加がホログラムに及ぼす影響。 実施例２における、グルコースに対する反応についての検量線。 実施例２における検量線。 五種の検体に対するセンサーの反応。

Claims (20)

1. シス形ジオール部含有検体を検出するためのセンサーであって、
   媒体を含み、かつ、その媒体全体にホログラムを含むホログラフィック素子を有していて、
   前記素子の光学特性は、媒体全体において物性が変化すると変化し、かつ、
   前記媒体は、式（ｉ）：
   

   

   式中、
   ｎは０、１、２、３又は４である；
   Ｘ（が存在する場合）は、それぞれ独立して、電子的効果によって、ホウ素原子に対する四面体構造の形成を促進する原子又は基である；また、
   Ｙは、ｎが０又は任意の値である場合において電子的効果によってホウ素原子に対する四面体構造の形成を促進する原子又は基であるようなスペーサーである：
   の基を有するポリマーを含む
   ことを特徴とするセンサー。
2. 前記の促進する原子又は基は電子求引性基である
   ことを特徴とする請求項１に記載のセンサー。
3. Ｘ（が存在する場合）は、それぞれ独立して、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルコキシ基である
   ことを特徴とする請求項２に記載のセンサー。
4. Ｘ（が存在する場合）はフッ素である
   ことを特徴とする請求項３に記載のセンサー。
5. Ｘ又はＹの少なくとも一つは、Ｂと共に分子内結合を形成できる孤立電子対を有する原子を含む
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載のセンサー。
6. Ｙは、Ｂと共に分子内結合を形成できる孤立電子対を有する原子を含む
   ことを特徴とする請求項５に記載のセンサー。
7. Ｘ及びＹがそれぞれ−Ｃ（Ｏ）−及び／又は−ＮＨ−を任意に含む
   ことを特徴とする請求項５又は６に記載のセンサー。
8. Ｙは、−Ｂ（ＯＨ）_２に対してｏ−又はｍ−の位置にある
   ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサー。
9. 式（ｉ）の基は、以下：
   

   

   ：から選択される
   ことを特徴とする請求項１に記載のセンサー。
10. 式（ｉ）の基は、以下：
    

    

    ：から選択される
    ことを特徴とする請求項１に記載のセンサー。
11. 媒体は、式（Ｉ）：
    

    

    式中、
    Ｘ、Ｙ及びｎは請求項１〜１１のいずれか１項に定義する；また、
    Ｚは重合可能な基である：
    の化合物を含むモノマーを重合することによって得ることができる
    ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のセンサー。
12. 式（Ｉ）の化合物は、以下、
    ２−（４−（アクリルアミドメチル）フェニルアミノ）メチル）フェニルボロン酸；
    ２−（（３−メタクリルアミドプロピルアミノ）メチル）フェニルボロン酸；
    ２−アクリルアミドフェニルボロン酸；
    ３−アクリルアミドフェニルボロン酸；及び、
    ３−アクリルアミド−６−フルオロフェニルボロン酸
    から選択される
    ことを特徴とする請求項１１に記載のセンサー。
13. 前記モノマーはヒドロキシエチルメタクリレートを含む
    ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載のセンサー。
14. 流体中のシス形ジオール部含有検体を検出する方法であって、
    流体と請求項１〜１３のいずれか１項に記載のホログラフィック素子とを接触させること、及び、素子の光学特性の任意の変化を検出することを含む方法。
15. 光学特性の任意の変化は色の変化として検出される
    ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記接触は、流体を前記素子に対して連続的に通過させることを含む
    ことを特徴とする請求項１４又は１５に記載のセンサー。
17. グルコースを検出するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 酒石酸を検出するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
19. 流体中のシス形ジオール部含有検体を感知するための装置であって、
    入口と出口とを有する流体管、及び、流体が流れることができる請求項１〜１３のいずれか１項に記載のホログラフィック素子を有し、
    非電離放射線を前記ホログラフィック素子に照射することができる窓を更に有する
    ことを特徴とする装置
20. 請求項１１又は１２に記載の式（Ｉ）の化合物。

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