JP2006518602A5 - - Google Patents
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Description
(発明の背景)
(発明の分野)
細胞および組織内の遺伝子発現が、細胞、組織または患者の生理学的および病理学的状態を指示し得ることは十分に認識されている。数十年間の間、蛋白質マーカーの免疫組織化学的分析により測定された遺伝子発現が、治療決定を行うために用いられてきた。例えば、この方法で測定されたエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体の濃度は、抗エストロゲン薬によって治療する乳癌患者を選択するために、現在ルーチン的に用いられている。
(発明の分野)
細胞および組織内の遺伝子発現が、細胞、組織または患者の生理学的および病理学的状態を指示し得ることは十分に認識されている。数十年間の間、蛋白質マーカーの免疫組織化学的分析により測定された遺伝子発現が、治療決定を行うために用いられてきた。例えば、この方法で測定されたエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体の濃度は、抗エストロゲン薬によって治療する乳癌患者を選択するために、現在ルーチン的に用いられている。
ごく最近の研究文献は、mRNA種の組織濃度が、診断的価値および予後的価値を有しているという証拠を提供している。複数のRT−PCRおよびDNAアレイプラットホームにより例示されているように、細胞RNA濃度を測定するための技術は、非常に高感度、特異的、定量的であり得るため、これは前途有望な開発である。RT−PCRは、一般にDNAアレイ技術よりも高感度であることが認められている。しかし、最適な実施に関して複数の基準が存在するため、RT−PCRプローブ/プライマーデザインおよび選択は魅力的であり得る。試験すべきサンプルRNAが、固定化ワックス埋め込み組織からのものである場合、このようなRNAは、高度に断片化されている傾向があるためこの魅力は特に大きい。(K.Spechtら、Am.J.Pathol 158:p.419−29[2001];T.E.Godfreyら、J.Mol.Diagnostics 2:p.84−91[2000])。
任意の所与の転写配列、スプライスされた配列、成熟mRNA配列(イントロン配列と対比的にエキソン配列)のいずれかの濃度をアッセイすることにより、所与の遺伝子発現を測定することは、容認された実践法である。理論的にエキソンは、成熟RNA産物において示される分断化された遺伝子の任意の区分として定義され、また、イントロンは転写されているが、転写物のどちらかの側のエキソンと共にスプライシングすることにより、転写物内部から除去されているDNAの区分として定義される[B.Lewin.Genes IV、Cell Press、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在、1990年]。エキソン配列を用いる容認されている実践法の根拠は理論的に分かり易い。なぜならば、成熟RNA類[mRNA類]は、細胞表現型を規定する蛋白質をコードするが、一方、イントロンRNAは、比較してみると細胞表現型に殆ど影響を及ぼさないと考えられる。さらに、イントロンは急速に分解され、したがって、エキソン配列より検出しにくいということが一般的見解である{以下の論文の序論を参照されたい:Thomasら、J.Virol.76:p.532−40[2002];Clementら、J.Biol.Chem.276:p.16919−30[2001];Sharpら、Ann.Rev.Biochem.55:p.1119−1150[1986]}。
本発明は、遺伝子発現を測定するためのイントロンRNAの使用に関する。イントロンRNA配列は、固定組織からの広範に分解されたRNAを使用しても、RT−PCRにより容易に検出される傾向があることが示されよう。さらに、イントロンRNA配列は、それら各々のエキソンによるそれらの発現に関連している傾向がある。転写されたイントロン配列およびエキソン配列の合成およびターンオーバーに関する全体の速度定数の比が同様であるという証拠は、殆どまたは全く存在しないため、後者の点は特に予期されていない。実際、科学論文は、前mRNAおよびスプライスされたイントロンのターンオーバーの複雑性に関する証拠を提供している。例えば、効率的にスプライスアウトされず「未成熟mRNA種」として細胞質に輸送され、そこで核イントロンRNA配列とは異なった速度で減衰する(Wangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4360−5[1997])イントロンRNA類を含有するサブ集団を有する前mRNAは、複数の速度論的プールに存在し得る(ElliottおよびRosbash、Exp.Cell Res.229:p.181−8[1996])。さらに、一定のスプライスされたイントロンRNAは、ラリアート構造において細胞質に入るようである(Clementら、RNA 5:206−20[1999])
(発明の要旨)
本発明は、定義によりヘテロ核RNA内には存在しているが、典型的にはmRNA内に組み込まれていない転写イントロン配列が、診断的および予後的な有用性を有するということを証明している実験的証拠に基づいている。これは、幾つかの理由で重要な発見である。典型的には、イントロン配列は、エキソン配列よりも20倍以上長い。したがって、イントロンは、それらの平均長がはるかに長いことを考慮に入れると、例えば、RT−PCRの場合、最適な遺伝子発現プローブデザインの機会の比例的増加、より良好な技術的性能を有するプローブ/プライマーセットの創製を提供する。それとは独立に、イントロン配列は、エキソン配列よりも速やかに展開するため、イントロンRNA類は、遺伝子ファミリーの種々の密接に関連したメンバーの発現をモニタリングするために十分に適合化される。
本発明は、定義によりヘテロ核RNA内には存在しているが、典型的にはmRNA内に組み込まれていない転写イントロン配列が、診断的および予後的な有用性を有するということを証明している実験的証拠に基づいている。これは、幾つかの理由で重要な発見である。典型的には、イントロン配列は、エキソン配列よりも20倍以上長い。したがって、イントロンは、それらの平均長がはるかに長いことを考慮に入れると、例えば、RT−PCRの場合、最適な遺伝子発現プローブデザインの機会の比例的増加、より良好な技術的性能を有するプローブ/プライマーセットの創製を提供する。それとは独立に、イントロン配列は、エキソン配列よりも速やかに展開するため、イントロンRNA類は、遺伝子ファミリーの種々の密接に関連したメンバーの発現をモニタリングするために十分に適合化される。
一態様において、本発明は、
(a)イントロンRNA配列の発現が、標的遺伝子内のエキソンmRNA配列の発現に関連している、標的遺伝子内のイントロンRNA配列に相補的なポリヌクレオチドを提供すること;
(b)前記ポリヌクレオチドをイントロンRNA配列にハイブリダイズして、ポリヌクレオチドイントロンRNA複合体を形成すること;および
(c)ポリヌクレオチドイントロンRNA複合体を検出すること、
を含んでなる生物学的サンプルにおける遺伝子発現のモニタリング法に関する。
(a)イントロンRNA配列の発現が、標的遺伝子内のエキソンmRNA配列の発現に関連している、標的遺伝子内のイントロンRNA配列に相補的なポリヌクレオチドを提供すること;
(b)前記ポリヌクレオチドをイントロンRNA配列にハイブリダイズして、ポリヌクレオチドイントロンRNA複合体を形成すること;および
(c)ポリヌクレオチドイントロンRNA複合体を検出すること、
を含んでなる生物学的サンプルにおける遺伝子発現のモニタリング法に関する。
特定の一態様において、標的遺伝子の発現は、RT−PCRによって測定され、その場合、上記の方法において、イントロンベースのプライマー/プローブのセットが使用できる。
他の態様において、本発明は、RT−PCR用のプライマー−プローブセットをデザインし、創製するためのイントロンベース配列の使用法に関する。そのようなプライマーとプローブは、高感度遺伝子発現分析のために、固定パラフィン埋め込み組織(FPET)検体におけるイントロンRNAの濃度を検出し、定量化する上で特に好適である。したがって、さらなる態様において、本発明は、種々の病態の診断および/または予後の予測のために、FPETサンプルの遺伝子発現分析などの遺伝子発現プロファイリングアッセイにおけるイントロンベースのプライマー−プローブセットの使用に関する。
特に本発明は、
(a)標的遺伝子内のイントロン配列の発現が、標的遺伝子内のエキソン配列の発現に関連している、標的遺伝子内の少なくとも1つのイントロン配列を同定すること;
(b)転写イントロン配列の少なくとも一部に対応する一本鎖ポリオリゴヌクレオチド分子を調製すること;および
(c)遺伝子発現を測定するために、オリゴヌクレオチド分子を使用すること、
を含んでなる標的遺伝子増幅のために一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製し、イントロ
ンRNA種の濃度を測定する方法に関する。
(a)標的遺伝子内のイントロン配列の発現が、標的遺伝子内のエキソン配列の発現に関連している、標的遺伝子内の少なくとも1つのイントロン配列を同定すること;
(b)転写イントロン配列の少なくとも一部に対応する一本鎖ポリオリゴヌクレオチド分子を調製すること;および
(c)遺伝子発現を測定するために、オリゴヌクレオチド分子を使用すること、
を含んでなる標的遺伝子増幅のために一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製し、イントロ
ンRNA種の濃度を測定する方法に関する。
先と同様、遺伝子発現は、例えば、RT−PCRによって測定することができ、この場合、遺伝子発現を測定するために、イントロンベースのプライマー/プローブセット(2種のプライマーおよび1種のプローブからなる)が使用される。
オリゴヌクレオチドがフォワードプライマーの場合、典型的には、転写イントロン配列内の標的配列の5’配列を含んでなるように、それがデザインされる。オリゴヌクレオチドがリバースプライマーの場合、典型的には、フォワードプライマーの下流に転写イントロン配列内の標的配列の5’配列に相補的になるように、それがデザインされる。PCR増幅のためには、十分に長い標的配列を同定し、使用することが重要である。標的配列は一般に、少なくとも約50のヌクレオチド塩基長、特に少なくとも55のヌクレオチド塩基長、幾つかの実施形態においては、少なくとも約60のヌクレオチド塩基長である必要がある。PCRプライマーとプローブは、周知の原理に従ってデザインされる。したがって、PCRプライマーは、典型には、17〜30のヌクレオチド塩基の長さであり、通常、約20%から80%のG+C塩基を含有する。融点(Tm)が、約50℃と約70℃との間のPCRプライマーをデザインすることが好ましい。
一本鎖オリゴヌクレオチド分子がPCRプローブである場合、それは、転写されたイントロン配列内に、標的配列の内部部分を含むか、またはそれと相補的であるように、通常デザインされる。TaqMan(登録商標)増幅では、PCRプローブは、レポーター蛍光色素および消光剤部分によって標識化される。
他の態様において、本発明は、
(a)イントロン配列の発現が、標的遺伝子内の対応するエキソン配列の発現に関連している、標的遺伝子内の少なくとも1つの標的イントロン配列を同定すること;および
(b)イントロン特異的PCRプライマー/プローブセットを用いて、転写された標的イントロン配列を増幅すること、
を含んでなるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的遺伝子の増幅によって、遺伝子の発現を測定する方法に関する。
(a)イントロン配列の発現が、標的遺伝子内の対応するエキソン配列の発現に関連している、標的遺伝子内の少なくとも1つの標的イントロン配列を同定すること;および
(b)イントロン特異的PCRプライマー/プローブセットを用いて、転写された標的イントロン配列を増幅すること、
を含んでなるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的遺伝子の増幅によって、遺伝子の発現を測定する方法に関する。
標的イントロン配列は、典型的には、少なくとも約50の塩基長であり、PCRのプライマーとプローブのセットは、転写された標的イントロン配列内のユニーク配列に対応するようにデザインされる。
さらに他の態様において、本発明は、
(a)サンプルを、PCRのプライマーとプローブの少なくとも1つのセットとを接触させる工程;および
(b)PCR増幅を実施する工程、
を含んでなる少なくとも1つの対象の遺伝子を表すサンプルにおけるRNA断片を増幅する方法に関するものであり、PCRのプライマーとプローブは、イントロン配列の発現が、関心対象の遺伝子内のエキソン配列の発現に関連している対象の遺伝子内に同定されたイントロン配列に基づいてデザインされる。
(a)サンプルを、PCRのプライマーとプローブの少なくとも1つのセットとを接触させる工程;および
(b)PCR増幅を実施する工程、
を含んでなる少なくとも1つの対象の遺伝子を表すサンプルにおけるRNA断片を増幅する方法に関するものであり、PCRのプライマーとプローブは、イントロン配列の発現が、関心対象の遺伝子内のエキソン配列の発現に関連している対象の遺伝子内に同定されたイントロン配列に基づいてデザインされる。
特定の実施形態において、PCRのプライマーとプローブは、典型的に同定されたイントロン内のユニーク配列に基づいてデザインされる。他の実施形態において、サンプルは、複数の対象遺伝子を表す断片化RNAを含んでなり、これを、対象遺伝子内に存在するイントロン内のユニーク配列に基づいてデザインされたPCRのプライマーとプローブのプールに接触させる。
好ましい実施形態において、前記増幅は、例えば、ヒト患者から得られた腫瘍生検由来であり得る固定パラフィン埋め込み組織(FPET)サンプルで実施される。前記腫瘍は、例えば、乳癌、肺癌、または結腸直腸癌などの任意の種類の固形腫瘍であり得る。前記腫瘍組織は、針生検、コア生検、または切除などの種々の方法によって採取することができる。
特定の一実施形態において、本発明は、初期乳癌を有する患者に対して疾患再発の可能性を予測するための遺伝子発現分析において、イントロンベースのPCRプライマー−プローブセットを使用する方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、対象の標的遺伝子にハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドを含んでなるアレイに関するものであり、前記ポリヌクレオチドの少なくとも70%がイントロン配列を含むことが好ましい。
さらなる他の態様において、本発明は、イントロンベースのアンプリコン配列および遺伝子発現分析におけるそれらの使用に関する。
特定の一実施形態において、本発明は、
他の実施形態において、本発明は、
さらなる実施形態において、癌は乳癌であり、分析される遺伝子(単数または複数)は、
また、さらなる実施形態において、本発明は、
別の一実施形態において、本発明は、
遺伝子発現分析は、アレイ形式において実施でき、前記アレイは、5〜10μセクションに少なくとも100配列、より好ましくは少なくとも150配列、さらに好ましくは200配列を含んでなる高密度アレイであることが好ましい。
(好ましい実施形態の詳細な説明)
(A.定義)
他に定義されない限り、本明細書に用いられている専門用語および科学用語は、本発明が属する通常の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。Singletonら著Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版、J.Wiley & Sons(ニューヨーク州ニューヨーク所在、1994年)は、本適用に用いられる多くの用語への一般的な指針を当業者に提供している。
(A.定義)
他に定義されない限り、本明細書に用いられている専門用語および科学用語は、本発明が属する通常の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。Singletonら著Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版、J.Wiley & Sons(ニューヨーク州ニューヨーク所在、1994年)は、本適用に用いられる多くの用語への一般的な指針を当業者に提供している。
当業者は、本明細書に記載された方法および材料と同様の、または等価な多くの方法および材料を、本発明の実践に使用し得ることを認識するであろう。実際、本発明は、記載された方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
用語の「スプライシング」および「RNAスプライシング」は、交換可能に用いられ、真核細胞の細胞質内に移動する連続的なコード配列を有する成熟mRNAを生成するためにイントロンを除去し、エキソンを繋げるRNAプロセッシングを言う。
理論的に用語の「エキソン」は、成熟RNA産物において示されている断続的遺伝子の任意の区分を言う(B.Lewin、Genes IV Cell Press、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在、1990年)。理論的に、用語の「イントロン」は、転写はされるが、そのいずれかの側のエキソンと一緒のスプライシングによって、転写物の内部から除去される任意のDNAの区分を言う。操作上、エキソン配列は、参照配列番号によって定義された遺伝子のmRNA配列に存在する。操作上、イントロン配列は、遺伝子のゲノムDNA内の介在配列であり、エキソン配列によって夾叉されており、それらの5’境界および3’境界にGTおよびAGスプライスコンセンサス配列を有している。
用語の「マイクロアレイ」とは、基質上のハイブリダイズ可能なアレイ要素の順序づけられた配列、好ましくはポリヌクレオチドプローブを言う。
用語の「ポリヌクレオチド」とは、単数または複数で用いられる場合、一般に非修飾のRNAもしくはDNAであっても、修飾されたRNAもしくはDNAであってもよい任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に言う。したがって、例えば、本明細書に定義されたポリヌクレオチドとしては、限定はしないが、一本鎖ならびに二本鎖DNA、一本鎖ならびに二本鎖領域を含むDNA、一本鎖ならびに二本鎖RNA、ならびに一本鎖ならびに二本鎖領域を含むRNA、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、もしくは一本鎖ならびに二本鎖領域を含み得るDNAならびにRNAを含んでなるハイブリッド分子が挙げられる。さらに、本明細書に用いられる用語の「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNA、またはRNAとDNAの双方を含んでなる三本鎖領域を言う。そのような領域における鎖は、同一の分子由来または異なる分子由来であり得る。前記領域は、1種以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つかの分子のただ1つの領域を含む。三重螺旋領域の分子の1つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。用語の「ポリヌクレオチド」は、具体的にはcDNA類を含む。前記用語は、1つ以上の修飾塩基を含有するDNA類(cDNA類を含む)およびRNA類を含む。したがって、安定性のため、または他の理由から修飾された主鎖を有するDNA類またはRNA類は、本明細書で意図されている用語の「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの特異的塩基またはトリチウム塩基などの修飾塩基を含んでなるDNA類またはRNA類は、本明細書に定義される用語の「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれる。一般に、用語の「ポリヌクレオチド」は、非修飾ポリヌクレオチドの全ての化学的に、酵素的に、および/または代謝的に修飾された形態、ならびにウィルスおよび単純型細胞および複雑型細胞を含む細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を含む。
用語の「オリゴヌクレオチド」は、限定はしないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、RNA:DNAハイブリッドおよび二本鎖DNA類などの比較的短いポリヌクレオチドを言う。一本鎖DNAプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド類は、例えば、商品として入手できる自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて、化学的方法により合成されることが多い。しかし、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組替えDNA媒介法および細胞および生体におけるDNAの発現によるなど、種々の他の方法によって作製できる。
用語の「差示的発現遺伝子」、「差示的遺伝子発現」およびそれらの同義語は交換可能に用いられ、その発現が、ある患者または試験被験体においては、他者に較べて、例えば、ある疾患、特に乳癌などの癌を患っている対象においては、正常な、または対照の被験体におけるその発現に較べて、より高い、またはより低いレベルである遺伝子を言う。また前記用語は、その発現が、同一の疾患の異なる病期において、より高い、またはより低いレベルへと活性化される遺伝子も含む。差示的に発現された遺伝子は、核酸濃度または蛋白質濃度において活性化できるか、もしくは阻害でき、または代替のスプライシングに供されて、異なるポリペプチド産物を生じ得る。このような差異は、例えば、mRNA濃度の変化、表面発現、分泌またはポリペプチドの他の区分化により証明できる。差示的遺伝子発現は、2つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物間の発現の比較、または2つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、またはさらに、正常な被験体と疾患、特に癌を患っている被験体との間で、または同一の疾患の種々の病期との間で異なる同一の遺伝子の2つの異なって処理された産物の比較を含み得る。差示的発現は、例えば、正常細胞と疾患細胞との間、または異なる疾患事象もしくは病期を経験した細胞間の遺伝子もしくはその発現産物における一時的な、または細胞の発現パターンにおける量的ならびに質的差異の双方を含む。本発明の目的のためには、正常被験体と疾患被験体において、またはある疾患被験体における疾患発症の種々の病期において、所与の遺伝子の発現間に、少なくとも約2倍、好ましくは、少なくとも約4倍、より好ましくは、少なくとも約6倍、最も好ましくは、少なくとも約10倍の差異がある場合に、「差示的遺伝子発現」が存在すると考えられる。
RNA転写物に関して用語の「過剰発現」は、検体中で測定された全転写物またはmRNA類の特定の参照セットであり得る参照mRNAの濃度に対する正規化によって決定された転写物濃度を言うために用いられる。
語句の「遺伝子増幅」とは、ある特定の細胞または細胞系において、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが形成される処理を言う。複製領域(増幅されたDNAのひと続き)は、しばしば「アンプリコン」と呼ばれる。生じたメッセンジャーRNA(mRNA)の量、すなわち、遺伝子発現レベルもまた、発現された特定の遺伝子によって作製されたコピーの数に比例して増大することが多い。
用語の「予後」は、本明細書において、乳癌などの新生物疾患の再発、転移性拡散および薬物耐性などの癌に起因する死亡または進行の可能性の予測を言う。用語の「予測」は、本明細書において、ある患者が、ある薬物または薬物のセットに対して、有利に、または不利に応答する可能性、およびそれらの応答の程度、またはある患者が外科手術による除去または原発腫瘍および/またはある一定期間の化学療法後に、癌が再発せずに生存する可能性を言う。本発明の予測法は、任意の特定の患者に対する最も適切な治療様式を選択することにより治療決定を行うために、臨床的に使用することができる。本発明の予測法は、ある患者が、外科的介入、所与の薬物または薬物の組合せによる化学療法および/または放射線療法などの治療法に有利に応答する見込みがあるかどうか、または、外科手術および/または化学療法の終結、または他の治療様式後にその患者が長期生存する見込みがあるかどうかを予測する上で貴重な手段である。
用語の「長期」生存とは、本明細書において外科手術または他の治療後の少なくとも3年間、より好ましくは少なくとも5年間、最も好ましくは少なくとも10年間の生存を言うために用いられる。
特定の薬物または任意選択治療に対する用語の「耐性増加」とは、本発明に従って用いられる場合、薬物の標準的用量または標準的治療プロトコルに対する応答低下を意味する。
特定の薬物または任意選択治療に対する用語の「感受性低下」とは、本発明に従って用いられる場合、薬物の標準的用量または標準的治療プロトコルに対する応答低下であって、それが、薬物用量の増加または治療強度の増加によって補償できる(少なくとも部分的に)応答低下を意味する。
「患者反応」は、限定はしないが、(1)遅速化および完全な増殖停止など、腫瘍増殖のある程度の阻害;(2)腫瘍細胞数の減少;(3)腫瘍サイズの減少;(4)隣接周辺器官および/または周辺組織内への腫瘍細胞湿潤の阻害(すなわち、減少、遅速化または完全な停止);(5)転移の阻害(すなわち、減少、遅速化または完全な停止);(6)腫瘍の退縮または阻止を生じ得るが、必ずしも生じるとは限らない抗腫瘍免疫応答の増強;(7)腫瘍に伴う1つ以上の症状のある程度の軽減;(8)治療後生存期間の延長;および/または(9)治療後の所与の時点における死亡率の低下など、患者にとっての利益を示すいずれかのエンドポイントを用いて評価できる。
用語の「治療」とは、目的が標的とされた病態または障害を予防するか、遅速化する(減少させる)ことである治療的処置および予防的処置の双方または予防測定を言う。治療を必要とする患者には、既に障害を有する患者ならびに障害を有する傾向がある患者、または障害を予防すべき患者が含まれる。腫瘍(例えば癌)治療において、治療因子は、腫瘍細胞の症状を直接減少させることができるか、または他の治療因子、例えば、放射線および/または化学療法による治療に対して、腫瘍細胞がより影響を受け易くできる。
本明細書に用いられている用語の「腫瘍」とは、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物性細胞の増殖ならびに前癌および癌細胞および組織を言う。
用語の「癌」および「癌性」とは、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的病態を言うか、または記述するものである。癌の例として、限定はしないが、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫および脳癌が挙げられる。
癌の「病理」は、患者の健康を損なう全ての現象を含む。これには、限定はしないが、異常な、または制御されていない細胞増殖、転移、近傍細胞の正常機能の妨害、サイトカイン類または他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症反応または免疫反応の抑制または増悪、腫瘍形成、前悪性疾患、悪性疾患、周辺のまたは遠隔の組織または器官(例えば、リンパ節)への湿潤などが含まれる。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、通常の当業者によって容易に決定でき、一般にプローブ長、洗浄温度および塩の濃度に依存する経験的算定である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのために、より高い温度を必要とし、一方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖が環境に存在する場合、それらの融解温度以下でリアニールする変性DNAの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用できる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向となり、一方、より低い温度は、ストリンジェンシーをより低くする傾向となる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細と説明に関しては、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience Publishers、(1995)を参照されたい。
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」は典型的に:(1)洗浄に低イオン強度と高温、例えば、50℃で0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを使用し;(2)ハイブリダイゼーション時に42℃で750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを有する0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/pH6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液と共に、ホルムアミド、例えば、50%(v/v)ホルムアミドなどの変性剤を使用するか、または(3)42℃で50%ホルムアミド、5xSSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5xデンハート液、音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDSおよび10%硫酸デキストランを使用し、42℃で0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および55℃で50%ホルムアミド中洗浄した後、55℃でEDTA含有0.1xSSCからなる高ストリンジェントな洗浄を行う。
「中程度ストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、ニューヨーク:Cold Spring Harbor Press、1989年に記載されたとおり確認でき、上記のハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度および%SDS)の使用を含む。中程度ストリンジェントな条件の一例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート液、10%硫酸デキストランおよび20mg/ml変性剪断サケ精子DNAを含んでなる溶液中、37℃にて一晩インキュベーション後、フィルタを約37〜50℃で1xSSCにおいて洗浄する。当業技術者は、プローブ長などの因子に適合させる上で必要な温度、イオン強度などの調整の仕方を認識するであろう。
本発明に関連して、何らかの特定の遺伝子セットに掲載された遺伝子の「少なくとも1つ」、「少なくとも2つ」、「少なくとも5つ」などの言及は、掲載された遺伝子のいずれか、またはそれらのいずれか1つの、および全ての組合せを意味する。
(B.詳細な説明)
他に指示されない限り、本発明の実践には、分子生物学(組換え法を含む)、微生物学、細胞生物学および生化学の従来技法が用いられ、それらは当業技術の範囲内にある。それらの技法は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版(Sambrookら、1989年);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編集、1984年);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編集、1987年);「Methods in Enzymology」(Academic Press社);「Handbook of Experimental Immunology」第4版(D.M.Weir & C.C.Blackwell編集、Blackwell Science社、1987年);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller & M.P.Calos編集、1987年);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら編集、1987年);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」、(Mullisら編集、1994年)などの文献において十分に説明されている。
他に指示されない限り、本発明の実践には、分子生物学(組換え法を含む)、微生物学、細胞生物学および生化学の従来技法が用いられ、それらは当業技術の範囲内にある。それらの技法は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版(Sambrookら、1989年);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編集、1984年);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編集、1987年);「Methods in Enzymology」(Academic Press社);「Handbook of Experimental Immunology」第4版(D.M.Weir & C.C.Blackwell編集、Blackwell Science社、1987年);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller & M.P.Calos編集、1987年);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら編集、1987年);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」、(Mullisら編集、1994年)などの文献において十分に説明されている。
(1.ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の目的は、さらなる使用に、より大量の核酸を提供するために遺伝子のコピーを作製することである。PCRは、4種のdNTP類(sATP、dCTP、dGTP、dTTP)および増幅すべき標的配列にフランキングしている2種のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する混合物中、所与のDNA鎖に対する相補鎖を合成できる特殊ポリメラーゼ酵素(例えば、Taq DNAポリメラーゼ)に基づく方法である。2種のオリゴヌクレオチドプライマーは、PCR反応に典型的なアンプリコンを生成させるために用いられる。第3のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、2種のPCRプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するためにデザインされる。プローブデザインは種々あるが、TaqMan(登録商標)PCR法では、プローブシグナルは、レポーター蛍光色素および消光剤蛍光色素の近接によって制御される。レポーター色素からのレーザー誘導発光は、2種の色素がプローブ上にある時に共に接近した位置にある場合、消光剤色素によって消光される。増幅反応時、ポリメラーゼ酵素(例えば、Taq DNAポリメラーゼ)は、温度依存様式でプローブを開裂する。生じたプローブ断片は、溶液中、脱会合し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、第2の蛍光発色団の消光作用を免れる。新たに合成された各分子に対し1分子のレポーター色素が遊離し、消光されないレポーター色素の検出によって、データの定量的解釈の基礎が提供される。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の目的は、さらなる使用に、より大量の核酸を提供するために遺伝子のコピーを作製することである。PCRは、4種のdNTP類(sATP、dCTP、dGTP、dTTP)および増幅すべき標的配列にフランキングしている2種のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する混合物中、所与のDNA鎖に対する相補鎖を合成できる特殊ポリメラーゼ酵素(例えば、Taq DNAポリメラーゼ)に基づく方法である。2種のオリゴヌクレオチドプライマーは、PCR反応に典型的なアンプリコンを生成させるために用いられる。第3のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、2種のPCRプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するためにデザインされる。プローブデザインは種々あるが、TaqMan(登録商標)PCR法では、プローブシグナルは、レポーター蛍光色素および消光剤蛍光色素の近接によって制御される。レポーター色素からのレーザー誘導発光は、2種の色素がプローブ上にある時に共に接近した位置にある場合、消光剤色素によって消光される。増幅反応時、ポリメラーゼ酵素(例えば、Taq DNAポリメラーゼ)は、温度依存様式でプローブを開裂する。生じたプローブ断片は、溶液中、脱会合し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、第2の蛍光発色団の消光作用を免れる。新たに合成された各分子に対し1分子のレポーター色素が遊離し、消光されないレポーター色素の検出によって、データの定量的解釈の基礎が提供される。
PCRの出発物質は、増幅される必要のあるDNA、cDNA、mRNAまたは任意の他のポリヌクレオチドであり得る。PCRは、テンプレートとして一本鎖DNAを必要とするため、出発物質が、二本鎖DNAである場合は、一本鎖DNAを生成するために変性される必要がある。
RNAは、PCRのテンプレートとして働くことができないため、出発物質がRNAの場合、第1の工程は、RNAテンプレートをcDNAへと逆転写することであり、引き続いて、PCR反応において指数関数的増幅が行われる。このPCR変法は、一般に逆転写酵素PCR(RT−PCR)と呼ばれる。最も一般的に用いられる2つの逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素(AMV−RT)およびモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素(MMLV−RT)である。逆転写工程は、状況に依存して典型的には、特異的プライマー、ランダム六量体、またはオリゴ−dTプライマーを用いて開始される。例えば、組織サンプル(例えば、FPET)から抽出されたRNAは、GeneAmp RNA PCRキット(Perkin Elmer、米国カリフォルニア州所在)を用いて製造元の取扱説明書に従って逆転写することができる。次いで誘導されたcDNAを、引き続くPCR反応において、テンプレートとして使用できる。
PCR工程には、種々の熱安定DNA依存DNAポリメラーゼが使用できるが、5’−3’ヌクレアーゼ活性を有するが、3’−5’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠いているTaq DNAポリメラーゼが典型的に使用される。したがって、TaqMan(登録商標)PCRでは、典型的にはTaqまたはTthポリメラーゼの5’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、それと等価な5’−ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素が使用できる。この場合、プローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸長できないようにデザインされる。TaqMan(登録商標)RT−PCRは、例えば、ABI PRISM 7700(商標)Sequence Detection System(商標)(Perkin−Elmer−Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティー所在)、またはLightcycler(Roche Molecular Biochemicals、独国マンハイム所在)などの、商品として入手できる装置を用いて実施することができる。好ましい一実施形態において、5’ヌクレアーゼ法は、ABI PRISM 7700(商標)Sequence Detection System(商標)などのリアルタイム定量的PCR装置上で行われる。前記システムは、サーモサイクラー、レーザー、荷電結合素子(CCD)、カメラおよびコンピュータから構成される。前記システムは、サーモサイクラー上、96ウェル型式でサンプルを増幅する。増幅時、レーザー誘導蛍光シグナルは、96ウェル全てに関して光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで回収され、CCDで検出される。前記システムは、器械を操作し、データを解析するためのソフトウェアを含む。
5’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初、Ctすなわち閾値サイクルとして表される。上記で検討したように、蛍光値は各サイクル時に記録され、増幅反応においてその時点までに増幅された産物量を示す。蛍光シグナルが、統計的に有意なものとして最初に記録された点が閾値サイクル(C t )である。
サンプルによる変化の誤差および効果を最小化するために、RT−PCRは通常、内標を用いて実施される。理想的な内標は、種々の組織間での一定のレベルにおいて表され、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現パターンを正規化するためにしばしば用いられるRNAは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)およびβ−アクチンに関するmRNA類である。
リアルタイム定量的PCRのさらなる詳細については、Heldら、Genome Research 6:p.986−994(1996)もまた参照されたい。PCRは、米国特許第4,683,202号、米国特許第4,683,195号;米国特許第4,965,188号;および米国特許第5,075,216号に記載されており、それらの開示の全体は、参照として本明細書に特に組み込まれている。
(2.イントロンおよびRNAスプライシング)
高等真核生物の多くの遺伝子は、10万ヌクレオチド対以上を含有し、200万ヌクレオチド対以上を含有しているものもある。これは、約1000ヌクレオチドの位数にある平均サイズの蛋白質(300〜400のアミノ酸)をコードするために必要とされるヌクレオチド配列よりも著しく長い。残りの長さの殆どは、その遺伝子配列内のコード化(エキソン)配列を分断している非コード化(イントロン)配列からなっている。mRNA、tRNAをコードしている多くの高等真核生物遺伝子およびrRNAをコードしている幾つかは、イントロン配列によって分断されている。mRNAに対する遺伝子は典型的に、0から60のイントロンを有し、一方、tRNAに対する遺伝子は典型的に、0または1つのイントロンを含む。
高等真核生物の多くの遺伝子は、10万ヌクレオチド対以上を含有し、200万ヌクレオチド対以上を含有しているものもある。これは、約1000ヌクレオチドの位数にある平均サイズの蛋白質(300〜400のアミノ酸)をコードするために必要とされるヌクレオチド配列よりも著しく長い。残りの長さの殆どは、その遺伝子配列内のコード化(エキソン)配列を分断している非コード化(イントロン)配列からなっている。mRNA、tRNAをコードしている多くの高等真核生物遺伝子およびrRNAをコードしている幾つかは、イントロン配列によって分断されている。mRNAに対する遺伝子は典型的に、0から60のイントロンを有し、一方、tRNAに対する遺伝子は典型的に、0または1つのイントロンを含む。
mRNAがDNAから翻訳される時、最初、エキソン配列とイントロン配列の双方が、いわゆるヘテロ核RNA(hnRNA)または未成熟RNAまたは前RNAへと翻訳される。しかし、RNAが核から出る前に、イントロン配列は、しばしばRNAスプライシングとして知られている処理の結果、翻訳mRNAから削除される。イントロン除去の過程には、エキソンに隣接した特定のヌクレオチド配列によって制御される正確なルーピング過程が含まれる。殆ど全てのイントロンは、特異的コンセンサス配列によって同定することができる。イントロンの最初の2つの塩基は常にGUであり、一方、最後の2つの塩基は常にAGであるが、5’および3’スプライス部位は、GUモチーフおよびAGモチーフを超えて伸長するコンセンサス配列を典型的に有する。mRNAのスプライシングは、スプライセオソームと呼ばれる粒子上で生じるが、一方、tRNAとrRNAは、スプライセオソームを伴わない機構によってスプライスされる。
イントロンは典型的には、エキソン(mRNAに存在する配列)よりもはるかに長い。真核生物の平均的エキソンは、約150ヌクレオチド長であり、一方、ヒトイントロン1つは、50万ヌクレオチド近い長さになり得るが、典型的には、約2000〜4000ヌクレオチドである。一般に、真核生物の遺伝子は、下表(Molecular Biology of the Cell、Bruce Albertsら編集、第3版、Garland Publishing社、ニューヨーク州ニューヨーク所在、1994年、p.340)に示されるように、エキソン配列よりはるかに多くのイントロン配列を含有している:
(表1)
(表1)
同じ遺伝子のmRNAと同時発現するイントロン配列を選択する代表的方法は以下のとおりである。簡略に述べると、対象の任意の遺伝子に関して、対象の患者集団の関連組織のセットをアッセイして、イントロン配列とmRNA配列のセットの濃度を測定する。次に、エキソンRNA(mRNA)配列との同時発現に関して、最高のピアソン相関係数を有することが判明したイントロン配列が選択される。この方法で試験される患者数は、少なくとも約50人以上であることが好ましく、少なくとも約100人であることがより好ましい。
特定の一実施例において、対象の生物医学的問題では、乳癌を有する患者が考慮されており、対象の遺伝子は、腫瘍増殖マーカーKi−67であり得る。この場合、Ki−67mRNA濃度および複数のKi−67イントロン配列の濃度を測定するために、50人以上の乳癌患者の腫瘍が用いられ、エキソンRNAとの同時発現に関し、最高のピアソン相関係数を有するイントロンが選択される。
この方法の利点は、好ましいイントロン配列の選択が、比較的容易に利用でき、豊富にある組織検体(例えば、高価な臨床記録が付随していない検体)によって実施できることである。このような組織は、スクリーニングするRNAを大量に提供できるため、例え至適以下のプローブからでも遺伝子発現シグナルを検出することが可能となる。次いで、選択されたイントロン配列に基づいた高感度で特異的なアッセイを用いて、貴重な組織検体、例えば、疾患の再発、死亡または規定された治療薬または治療法への応答などの重要な臨床的情報と結びついた検体をスクリーニングすることができる。
(3.イントロンベースのPCRプライマー/プローブセットを用いた遺伝子発現プロファイリング)
現在、PCRのプライマーおよびプローブは、イントロン配列を考慮することなく、mRNA配列またはcDNA配列に基づいてデザインされている。実際、イントロンは、通常スプライシング時に除去され、一般に急速に分解される「パッケージング」物質と見なされている。
現在、PCRのプライマーおよびプローブは、イントロン配列を考慮することなく、mRNA配列またはcDNA配列に基づいてデザインされている。実際、イントロンは、通常スプライシング時に除去され、一般に急速に分解される「パッケージング」物質と見なされている。
本発明は、例え固定パラフィン埋め込み組織検体の高度に分解されたRNAを用いても、イントロンRNA類がRT−PCRによって容易に検出できるという予期されなかった実験上の発見に基づいている。特に、所与の遺伝子に関する遺伝子発現プロファイリングにおいて、イントロンベースのプローブ/プライマーセットからのRT−PCRシグナルは、エキソンベースのRT−PCRシグナルと同じくらい、またはそれよりも大きくなり得ることが判明した。この発見は、一定のmRNA種による2,3の最近の発見によって支持されているが、イントロンは、スプライシング後に非常に急速に分解されるという一般的な見方(Thomasら、J.Virol.76:p.532−40[2002];Clementら、J.Biol.Chem.276:p.16919−30[2001];Sharpら、Ann.Rev.Biochem.55:p.1119−1150[1986])に合致しない。
本発明の基礎となっているやはり予想されなかった実験上の発見は、発現したイントロン配列とエキソン配列の組織量は、相関する傾向があるため、イントロンRNAが遺伝子発現プロファイリングに使用できることを示している。この結果は予期されないものである。なぜならば、転写されたイントロン配列およびエキソン配列の合成およびターンオーバーに関する全体的な速度定数比が同様であるという証拠は乏しいか、または全くないからである。実際、科学文献は、前mRNAとスプライスされたイントロンのターンオーバーの複雑さの証拠を提供している。例えば、効率的にスプライスアウトされず、「未成熟」なmRNA種において細胞質へと輸送され、そこで核イントロンRNA配列とは異なる速度で減衰し得る(Wangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:p.4360−5[1997])イントロンRNAを含有する副集団と共に、前mRNAは、複数の動態学的プールに存在し得る(ElliotおよびRosbash、Exp.Cell Res.229:p.181−8[1996])。一定のスプライスされたイントロンRNAがラリアート構造において細胞質に進入する証拠が存在している(Clementら、RNA 5:p.206−20[1999])。
最後に本明細書に提示されたデータは、イントロン配列が、診断的または予後的分子マーカーとして役立ち得ることを示す。以前、癌において予後的であることが実証されている4種のmRNAを調べると、それらの対応するイントロン配列もまた予後的であり、転写エキソン親配列と同じ方向(すなわち、正の予後的か、または負の予後的)であることが示される。
要するに、本発明のアプローチは、以下のとおり証明された。参照として、その全体の開示が、本明細書に特に組み込まれている、2002年9月18日に出願の同時係属出願第60/412,049号は、乳癌再発の可能性を予測する遺伝子のセットを記載している。その試験では、146人の患者の固定パラフィン埋め込み乳癌組織検体における転写エキソン配列の濃度が、エキソンベースのPCRプライマー/プローブセットを用いて、RT−PCRにより測定された。本明細書に記載された試験においては、先に同定されたマーカー遺伝子の4種の内部の転写イントロン配列の濃度を測定するために、RT−PCRアッセイが創製され、次いで60の固定パラフィン埋め込み生検検体(先の試験でサブセットが評価された60人の異なる患者を表す)からのRNAをスクリーニングするために用いられた。下記の実施例に提示されたデータは、各遺伝子に関して、イントロンとエキソンは同時発現し、イントロンは、先のエキソンベースのデータにより予測されたように疾病再発の危険性を予測するということを示している。
(3.イントロンベースのPCRプライマーおよびプローブのデザイン)
本発明の一態様によれば、PCRプライマーおよびプローブは、増幅すべき遺伝子内に存在しているイントロン配列に基づいてデザインされる。したがって、プライマー/プローブデザインの最初の工程は、遺伝子内部にあるイントロン配列の記述である。これは、Kent,W.J.、Genome Res.12(4):p.656−64(2002)によって開発されたDNABLATソフトウェアなどの一般に入手できるソフトウェアまたは、変型を含むBLASTソフトウェアによって実施することができる。その後の工程は、PCRプライマーおよびプローブデザインの十分に確立された方法が続く。
本発明の一態様によれば、PCRプライマーおよびプローブは、増幅すべき遺伝子内に存在しているイントロン配列に基づいてデザインされる。したがって、プライマー/プローブデザインの最初の工程は、遺伝子内部にあるイントロン配列の記述である。これは、Kent,W.J.、Genome Res.12(4):p.656−64(2002)によって開発されたDNABLATソフトウェアなどの一般に入手できるソフトウェアまたは、変型を含むBLASTソフトウェアによって実施することができる。その後の工程は、PCRプライマーおよびプローブデザインの十分に確立された方法が続く。
非特異的シグナルを避けるために、前記プライマーとプローブをデザインする際は、イントロン内部の反復配列をマスクすることが重要である。これは、Baylor医科大学を介してオンラインで利用できるRepeat Maskerプログラムを用いて、容易に達成できるが、このプログラムにより、反復要素のライブラリに対してDNA配列をスクリーンされ、反復要素がマスクされているクエリー配列が戻される。次に、Primer Express(Applied Biosystems);MGBアッセイ−バイ−デザイン(Applied Biosystems);Primer3(Steve RozenおよびHelen J.Skaletsky(2000)一般ユーザー用および生物学者プログラマー用にWWWに対するPrimer3.Krawetz S、Misener S(編集)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.Humana Press、ニュージャージー州トトワ所在、p.365−386において)などの商品として、または他に一般入手できるプライマー/プローブデザインパッケージを用いて、プライマー配列およびプローブ配列をデザインするために、マスクされたイントロン配列を使用することができる。
PCRプライマーデザインにおいて考慮される最も重要な因子としては、プライマー長、融解温度(Tm)、ならびにG/C含量、特異性、相補的プライマー配列および3’末端配列が挙げられる。一般に最適なPCRプライマーは、一般に17〜30の塩基長であり、例えば、約50〜60%など、約20〜80%のG塩基+C塩基を含有する。Tmは、50℃と80℃との間であり、例えば、約50℃から70℃が典型的に好ましい。
PCRプライマーおよびプローブのデザインに関するさらなる指針には、例えば、Dieffenbach,C.W.ら著、A Laboratory Manual、PCR Primerの「General Concepts for PCR Primer Design」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク所在、1995年、p.133−155;InnisおよびGelfand著、A Guide to Methods and Applications、PCR Protocolsの「Optimization of PCRs」、CRC Press、ロンドン所在、1994年、p.5−11;およびPlasterer,T.N.Primerselect:Primer and probe design.Methods Mol.Biol.70:p.520−527(1997)を参照されたく、それら全体の開示が参照として本明細書に特に組み込まれている。
(4.適用)
本発明の方法、具体的には、本明細書におけるイントロンベースのPCRプライマーおよびプローブ、遺伝子または遺伝子断片を表している核酸(RNA、DNA、ならびに一般に全てのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む)の増幅が必要とされている全ての分野における利用である。したがって、本発明によって、設計されたPCRプライマーおよびプローブは、限定はしないが、定量的PCR(例えば、定量的RT−PCR)およびマイクロアレイ分析ならびにビーズベースのアッセイによる遺伝子発現プロファイリングなど、任意の方法論による遺伝子発現プロファイリングを目的として、生物学的サンプルに存在する個々の遺伝子または複数の遺伝子を増幅するために使用することができる。
本発明の方法、具体的には、本明細書におけるイントロンベースのPCRプライマーおよびプローブ、遺伝子または遺伝子断片を表している核酸(RNA、DNA、ならびに一般に全てのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む)の増幅が必要とされている全ての分野における利用である。したがって、本発明によって、設計されたPCRプライマーおよびプローブは、限定はしないが、定量的PCR(例えば、定量的RT−PCR)およびマイクロアレイ分析ならびにビーズベースのアッセイによる遺伝子発現プロファイリングなど、任意の方法論による遺伝子発現プロファイリングを目的として、生物学的サンプルに存在する個々の遺伝子または複数の遺伝子を増幅するために使用することができる。
例えば、マイクロアレイ法の特定の一実施形態において、cDNAクローンのPCR増幅された挿入物が、高密度アレイにおける基質に適用される。少なくとも10,000のヌクレオチド配列が、基質に適用されることが好ましい。少なくとも各10,000の要素において、マイクロチップに固定されたマイクロアレイ遺伝子が、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにとって好適である。蛍光標識されたcDNAプローブは、対象組織から抽出されたRNAの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組込みによって創製できる。チップに適用された標識cDNAプローブは、アレイ上のDNAの各スポットに特異性を有してハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄により、非特異的に結合したプローブを除去した後、共焦点レーザー顕微鏡により、またはCCDカメラなどの他の検出法により、チップをスキャンする。各アレイ要素のハイブリダイゼーションの定量化では、対応するmRNAの存在量を考慮に入れる。二重色蛍光により、2つのRNA出所から生成された、別個に標識化されたcDNAプローブは、アレイに対して対になってハイブリダイズされる。したがって、特定の各遺伝子に対応する2つの出所の転写物の相対的存在量が同時に決定される。ハイブリダイゼーションのスケールを小型化することにより、多数の遺伝子発現パターンを簡便に、迅速に評価することができる。このような方法は、1つの細胞当たり2,3のコピーで発現される希少な転写物の検出、および発現レベルにおける少なくとも凡そ2倍の差異の再現性よい検出に必要とされる感度を有することが示されている(Schemaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2):p.106−149(1996))。マイクロアレイ分析は、商品として入手できる装置により、Affymetrix GenChip法またはAgilentマイクロアレイ法を用いるなど、製造元のプロトコルに従って実施できる。
本発明の重要な一態様は、患者に最良の薬剤、または薬剤の組合せをマッチさせ、予後の情報を提供するために、遺伝子発現プロファイリングの一部として、イントロンベースの遺伝子増幅を利用することである。例えば、癌組織(例えば、生検乳癌組織)内の遺伝子発現測定は、外科手術および/または他の癌療法後の患者における長期の疾患のない生存可能性を予測するために、またはある特定の治療法に対する患者の応答を予測するために使用できる。この目的のために、アッセイされたRNA量の違いおよび使用されたRNAの質のばらつきの双方を補正する(正規化する)ことが典型的に必要である。したがって、本発明のアッセイは、通常GAPDHやCyP1などの周知の参照遺伝子を含む一定の正規化遺伝子の発現を測定し、組み込んでいる。あるいは、正規化は、アッセイされた全遺伝子またはその多数のサブセットの平均シグナルまたは中央値シグナル(Ct)に基づくことができる(全体的な正規化アプローチ)。遺伝子ごとをベースにして、患者の腫瘍mRNAの測定された正規化量を、癌、例えば、乳癌の組織参照セットに見られる量と比較する。この参照セットにおける癌、例えば乳癌の組織の数(N)は、種々の参照セット(全体として)が、本質的に同じように挙動することを確認する上で十分に高いはずである。この条件に合えば、ある特定のセットに存在する個々の乳癌組織の身元は、アッセイされた遺伝子の相対量に有意な影響を及ぼさないであろう。通常、乳癌組織参照セットは、少なくとも約30、好ましくは、少なくとも約40の異なる固定パラフィン埋め込み(FPE)乳癌組織検体からなる。他に特記しない限り、各mRNA/試験腫瘍/患者の正規化した発現レベルは、参照セットにおいて測定された発現レベルのパーセンテージとして表される。より具体的には、十分に数の多い(例えば、40)腫瘍の参照セットにより、各mRNA種の正規化レベルの分布が得られる。分析すべき特定の腫瘍サンプルにおいて測定されたレベルは、この範囲内のあるパーセンタイルに入り、それを当業界で周知の方法により決定できる。
浸潤性乳癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現の第II相試験では、乳癌組織における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現が、外科手術後の癌再発を伴わない生存可能性の減少を示すことが判明している;FOXM1;PRAME;SKT15;Ki−67;CA9;NME1;SURV;TFRC;YB−1;RPS6KB1;Src;Chk1;CCNB1;Chk2;CDC25B;CYP3A4;EpCAM;VEGFC;hENT1;BRCA2;EGFR;TK1;VDR。
同じ試験で、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現が、外科手術後の癌再発を伴わない生存に関してより良好な予後を示している:Blc12;CEGP1;GSTM1;PR;BBC3;GATA3;DPYD;GSTM3;ID1;EstR1;p27;XIAP;IGF1R;AK055699;P13KC2A;TGFB3;BAGI1;pS2;WISP1;HNF3A;NFKBp65。
ER陽性乳癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現のこの同じ第II相試験で、以下の遺伝子の過剰発現が、外科手術後の癌再発を伴わない生存可能性の減少を示している;PRAME;FOXM1;EPHX1;HIF1A;VEGFC;Ki−67;VDR;NME1。また、これらの遺伝子(PRAME;FOXM1;VEGFC;Ki−67;VDR;およびNME1)の幾つかは、ER陽性乳癌に限定されず、先の分析において予後不良の指標としても確認されている。残りの遺伝子(EPHX1およびHIF1A)の過剰発現は、ER陽性乳癌のみにおいて疾患を伴わない生存の負の指標であることが判明している。ER陽性乳癌における以下の遺伝子の過剰発現は、外科手術後の癌再発を伴わない生存に関してより良好な予後を示すことが判明している:Bcl−2;DIABLO;IGF1R;GSTM3。後者の遺伝子のうち、Bcl−2;IGFR1;およびGSTM3は、ER陽性乳癌に限定されず、先の分析において良好な予後の指標としても確認されている。DIABLOの過剰発現は、ER陽性乳癌のみにおいて疾患を伴わない生存の正の指標のようであった。さらなる詳細に関しては、その開示全体が参照として本明細書に特に組み込まれている、2002年11月15日に出願の同時係属出願第60/427090号を参照されたい。
上記の試験は、遺伝子増幅が、エキソンベースのアンプリコンを用いて試験されたことを除いては、本質的に下記の実施例2に記載されたとおり実施された。さらなる詳細に関しては、その開示全体が参照として本明細書に特に組み込まれている、2002年3月13日に出願の同時係属出願第60/364,890号を参照されたい。実施例2において提示されたデータにより証明されたように、イントロンベースのアンプリコンを用いて得られたデータは、初期のデータと優れた相関性を示し、また、典型的に、感度の増大という追加利益を提供している。
湿潤性乳管癌の先の第II相試験の知見を、以下の等式を使用したコックス比例ハザードモデルを用いて、多変量段階的解析に供した:
RR=指数[係数(遺伝子A)x Ct(遺伝子A)+係数(遺伝子B)x Ct(遺伝子B)+係数(遺伝子C)x Ct(遺伝子C)+.....]。
RR=指数[係数(遺伝子A)x Ct(遺伝子A)+係数(遺伝子B)x Ct(遺伝子B)+係数(遺伝子C)x Ct(遺伝子C)+.....]。
この等式において、有益な結果を予測する遺伝子の係数は正の数であり、不利な結果を予測する遺伝子の係数は負の数である。等式中の「Ct」値は、ΔCtすなわち、ある集団に関する平均正規化Ct値と問題の患者に関して測定された正規化Ctとの間の差を表している。解析に用いられる慣例は、集団平均の上と、下のΔCtは、それぞれ正の符号と負の符号を有する(より多い、またはより少ないmRNA存在量を表している)。この等式を解くことによって算出された相対的危険度(RR)は、その患者が、癌の再発を伴わずに長期生存するチャンスが増大するか、減少するかを示した。
数を減少させた遺伝子を含む質問セットを用いた多変量解析において、以下の10遺伝子セットが、原発腫瘍の外科手術による除去後、癌再発を伴わない患者生存の特に強力な予測値を有することが確認されている。
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例から明らかとなろう。
(実施例1)
(イントロン特異的PCRプライマー/プローブセットのデザインおよび使用)
ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FPET)乳癌生検検体(Clinomics Bioscience社、マサチューセッツ州ピッツフィールド所在)から、以下のとおりRNAを抽出した。3つの10μM切片を切断し、1.5ml管に入れた。キシレン抽出(1ml、3回)に続いてエタノール洗浄(1ml、2回)により、パラフィンを除去した。MasterPure(商標)精製キット(Epicentre、ウィスコンシン州マジソン所在)を用いて、切片組織塊からRNAを単離した。RiboGreen蛍光法(Molecular Probes)によりRNAを定量化した。次いで20個のFRET RNAサンプルをプールし、以下のとおり使用した。
(イントロン特異的PCRプライマー/プローブセットのデザインおよび使用)
ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FPET)乳癌生検検体(Clinomics Bioscience社、マサチューセッツ州ピッツフィールド所在)から、以下のとおりRNAを抽出した。3つの10μM切片を切断し、1.5ml管に入れた。キシレン抽出(1ml、3回)に続いてエタノール洗浄(1ml、2回)により、パラフィンを除去した。MasterPure(商標)精製キット(Epicentre、ウィスコンシン州マジソン所在)を用いて、切片組織塊からRNAを単離した。RiboGreen蛍光法(Molecular Probes)によりRNAを定量化した。次いで20個のFRET RNAサンプルをプールし、以下のとおり使用した。
プールされたFRET RNA(400mg)を用い、プールされた遺伝子特異的プライマー(図2に示された逆プライマー)のランダム六量体およびRNアーゼ阻害剤により、Qiagenのオムニスクリプト逆転写酵素を用いて、第1鎖cDNAを合成した。150ngのプールされたFRET RNA、5ng/ウェルにおいてTaqman増幅を行う上で十分なRNAにより、非逆転写(RT)反応もまた実施した。
(表2)
1アッセイ当たり25μlの反応液容量および5ngのRNA投入量により、3とおりのウェルで、48遺伝子パネルに関してTaqManアッセイを実施した。DNAシグナルではなくてRNAシグナルが測定されていることを確認するために、1つのウェルにおいて、各遺伝子に関してコントロールとして「非RT」反応を実施した。以下のパラメータを用いて、ABI7700上で、リアルタイムの定量化を実施した:
サイクリング条件:95℃、10分で1サイクル、95℃、20秒に次いで、60℃、45秒で40サイクル。
反応容量:25μl
色素層設定:FAM(受動対照はROX)
(結果)
CEGP1、FOXM1、PRAMEおよびSTK15遺伝子のマスクされたイントロンに基づいて、イントロン特異的Taqmanプライマー−プローブセットをデザインした。遺伝子内のイントロン配列を記述するために、サンタクルーズ大学オンラインゲノム資源サイト(http://genome.ucsc.edu)で利用できるBLAST様配置手法(BLAT)プログラムを用いて、各mRNA(NM_XXXXXX)に関して、NCBI参照配列をヒトゲノムに対して配置した。次にベイラー医科大学を介してオンラインできる(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq−util/seq−util.html)Repeat Maskerプログラムを用いて、イントロン配列を反復配列に関して探索した。Alu反復などの反復配列は、このプログラムによって同定され、マスクされた。これらの配列は、強い非特異的シグナルを生じるため、プライマー−プローブをデザインする前に、これらを排除することが重要である。次に、Taqmanプライマー−プローブセットをデザインするため、Primer Express(ABI)を用いて、マスクされたイントロン配列(図1A〜M)を使用した。プライマー−プローブセットに好適な他のプログラムとしては、例えば、MGBデザインアッセイ(ABI)のための新規プライマー−プローブデザインプログラムが挙げられる。各プライマー−プローブセットに関するアンプリコンは、図1において太字で記載されている。各々の特異的プライマー−プローブセットは、図2に示されている。
色素層設定:FAM(受動対照はROX)
(結果)
CEGP1、FOXM1、PRAMEおよびSTK15遺伝子のマスクされたイントロンに基づいて、イントロン特異的Taqmanプライマー−プローブセットをデザインした。遺伝子内のイントロン配列を記述するために、サンタクルーズ大学オンラインゲノム資源サイト(http://genome.ucsc.edu)で利用できるBLAST様配置手法(BLAT)プログラムを用いて、各mRNA(NM_XXXXXX)に関して、NCBI参照配列をヒトゲノムに対して配置した。次にベイラー医科大学を介してオンラインできる(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq−util/seq−util.html)Repeat Maskerプログラムを用いて、イントロン配列を反復配列に関して探索した。Alu反復などの反復配列は、このプログラムによって同定され、マスクされた。これらの配列は、強い非特異的シグナルを生じるため、プライマー−プローブをデザインする前に、これらを排除することが重要である。次に、Taqmanプライマー−プローブセットをデザインするため、Primer Express(ABI)を用いて、マスクされたイントロン配列(図1A〜M)を使用した。プライマー−プローブセットに好適な他のプログラムとしては、例えば、MGBデザインアッセイ(ABI)のための新規プライマー−プローブデザインプログラムが挙げられる。各プライマー−プローブセットに関するアンプリコンは、図1において太字で記載されている。各々の特異的プライマー−プローブセットは、図2に示されている。
標準的Taqman遺伝子発現プロフィル実験においては、プールされたFPET RNAを用いて、イントロン特異的プライマー−プローブセット(試験遺伝子)が、それらの対応するエキソン特異的プライマー−プローブセット(参照遺伝子)と共に使用された。正規化発現を式2ΔCtによって算出したが、ここで、ΔCtは、試験遺伝子プライマー−プローブセットのCtと参照遺伝子プライマー−プローブセットのCtとの差[Ct(参照)−Ct(試験)]である。
(実施例2)
(前悪性および悪性乳房腫における遺伝子発現の第II相試験)
湿潤性乳管癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現を分子的に特性化することを第1の目標とし、また、そのような分子プロフィルと疾患を伴わない生存との間の相関性を探索するために、遺伝子発現試験をデザインし、実施した。
(前悪性および悪性乳房腫における遺伝子発現の第II相試験)
湿潤性乳管癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現を分子的に特性化することを第1の目標とし、また、そのような分子プロフィルと疾患を伴わない生存との間の相関性を探索するために、遺伝子発現試験をデザインし、実施した。
(試験デザイン)
乳癌と診断された60人の患者個々から得られたパラフィン埋め込みホルマリン固定乳房腫組織において分子アッセイを実施した。患者は全て、乳房の湿潤性癌と診断され外科手術を受けた。患者は、材料と方法の節で記載されたとおり実施された組織病理学的評価で、十分な腫瘍組織量と同種の病状を示した場合のみ、試験に含めた。
乳癌と診断された60人の患者個々から得られたパラフィン埋め込みホルマリン固定乳房腫組織において分子アッセイを実施した。患者は全て、乳房の湿潤性癌と診断され外科手術を受けた。患者は、材料と方法の節で記載されたとおり実施された組織病理学的評価で、十分な腫瘍組織量と同種の病状を示した場合のみ、試験に含めた。
(材料と方法)
各代表的腫瘍塊を、診断、腫瘍量の半定量的評価、および腫瘍グレードに関して、標準的な組織病理学によって特性化した。合計6切片(各10ミクロンの厚さ)を調製し、2本のCostarブランドのミクロ遠心管(ポリプロピレン、1.7mL管、透明;各管に3切片)に入れた。腫瘍が、総検体面積の30%未満を占める場合は、全体顕微解剖を用い、病理学者によって粗く切開し、その腫瘍組織を直接Costar管に入れておいてもよい。
各代表的腫瘍塊を、診断、腫瘍量の半定量的評価、および腫瘍グレードに関して、標準的な組織病理学によって特性化した。合計6切片(各10ミクロンの厚さ)を調製し、2本のCostarブランドのミクロ遠心管(ポリプロピレン、1.7mL管、透明;各管に3切片)に入れた。腫瘍が、総検体面積の30%未満を占める場合は、全体顕微解剖を用い、病理学者によって粗く切開し、その腫瘍組織を直接Costar管に入れておいてもよい。
外科手術操作の部分として、1つ以上の腫瘍塊が得られた場合は、全ての腫瘍塊を上記の同じ特性化に供し、その疾患の最も代表的な塊を分析に用いた。
(遺伝子発現分析)
固定パラフィン埋め込み組織サンプルからmRNAを抽出、精製し、遺伝子発現分析のために上記のとおり調製した。
固定パラフィン埋め込み組織サンプルからmRNAを抽出、精製し、遺伝子発現分析のために上記のとおり調製した。
ABI PRISM 7900(商標)Sequence Detection System(商標)(Perkin−Elmer−Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティー所在)を用いてRT−PCRにより定量的遺伝子発現の分子アッセイを行った。ABI PRISM 7900(商標)は、サーモサイクラー、レーザー、荷電結合素子(CCD)、カメラおよびコンピュータから構成されている。前記システムは、サーモサイクラー上、384ウェル型式においてサンプルを増幅する。増幅時、レーザー誘導蛍光シグナルは、384ウェル全てに関して光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで回収され、CCDで検出される。前記システムは、器械を操作し、データを解析するためのソフトウェアを含む。
(解析および結果)
37の異なる遺伝子産物を表す48の異なるRNA配列の発現に関して腫瘍組織を分析した。各患者の閾値サイクル(Ct)値を、その特定の患者に関する全遺伝子の中央値に基づいて正規化した。臨床結果のデータは、全ての患者に関して登録データのレビューおよび選択された患者カルテから入手できた。
37の異なる遺伝子産物を表す48の異なるRNA配列の発現に関して腫瘍組織を分析した。各患者の閾値サイクル(Ct)値を、その特定の患者に関する全遺伝子の中央値に基づいて正規化した。臨床結果のデータは、全ての患者に関して登録データのレビューおよび選択された患者カルテから入手できた。
結果は以下のとおり分類された:
0 乳癌もしくは原因不明により死亡または乳癌再発を伴って生存;
1 乳癌再発を伴わずに生存または乳癌以外の原因により死亡
解析は以下により実施された:
乳癌再発を伴わずに生存または乳癌以外の原因により死亡した患者の正規化遺伝子発現と結果(上記のとおり0または1)までの時間との間の相関解析を調べた。このアプローチは、個々の遺伝子および複数の遺伝子セットの予後的影響を評価するために用いられた。
0 乳癌もしくは原因不明により死亡または乳癌再発を伴って生存;
1 乳癌再発を伴わずに生存または乳癌以外の原因により死亡
解析は以下により実施された:
乳癌再発を伴わずに生存または乳癌以外の原因により死亡した患者の正規化遺伝子発現と結果(上記のとおり0または1)までの時間との間の相関解析を調べた。このアプローチは、個々の遺伝子および複数の遺伝子セットの予後的影響を評価するために用いられた。
各遺伝子に関して、再発または死亡までの時間を従属変数とし、その遺伝子の発現レベルを独立変数として、Cox Proportional Hazardsモデル(例えば、Cox,D.R.およびOakes,D.(1984)、Analysis of Survival Data、ChapmanおよびHall、ニューヨーク州ロンドンを参照)を規定した。Coxモデルにおいて、p値<0.05を有する遺伝子を同定した。各遺伝子に関し、Coxモデルは、遺伝子発現における単位変化に関する再発または死亡の相対的危険度(RR)を提供する。その遺伝子が、不良な(RR>1.01)予後の指標であるか、良好な(RR<1.01)予後の指標であるかによって、閾値以上の発現値を有する患者は全て危険度が高く、閾値以下の発現値を有する患者は全て危険度が低いか、またはその逆となる、測定された発現の任意の閾値(Ct基準で)で、患者を副集団に分けるために選択できる。したがって、何らかの閾値が、危険度がそれぞれ高いか、または低い患者の副集団を規定することになる。
下表3は、遺伝子CEGP1、FOXM1、PRAME、およびSTK15に関する被験イントロンとエキソンとの間の発現の対相関(相関係数として示される)を示している。4つの遺伝子のうちの2つ、CEGP1およびPRAMEに関して、イントロンは約0.90の相関係数[それらの各々のエキソンとの同時発現に関して]を生じることが判明した。STK15の場合は、1つのイントロンが、約0.80の相関係数でエキソン発現と相関している。FOXM1に関しては、イントロン:エキソン発現相関性は著しく低かった。しかし、この最後のケースでは、実際の発現の相関性は高いかもしれないが、技術上の理由から検出不可能であると思われる。多くの患者において、FOXM1エキソンの発現は、アッセイの検出閾値以下であり、そのことが、存在し得る高い相関性の検出を妨げている可能性がある。この仮定が正しければ、FOXM1イントロンは、先にFOXM1に関して証明したように、負の臨床予後マーカーとして依然として登録されると考えられる。後に示されるようにこの結果が生じる。
図3、図4、図5は、CEGP1、PRAMEおよびSTK15エキソンRNA類に対する試験RNA類発現の対相関を示している。示されているように、これら遺伝子個々のイントロンから高い相関性が得られた。我々が選択した遺伝子を含む48の遺伝子パネルは、幾つかのバイオインフォーマティックスに基づいた方法により、CEGP1、PRAME、STK15、およびFOXM1との発現に特に相関性がありそうなことは注目すべきである。それらの非イントロンベース法は、STK15の場合、幾つかの候補遺伝子が、0.6〜0.7の範囲の発現相関係数を有していたため、最も好結果となった。
(表3.4種の遺伝子に関するイントロン発現とエキソン発現との間の相関性)
(表4.乳癌患者60人に関するCoxモデルの結果)
実施例を含め、本開示を通して引用された全ての引用文献は、参照としてそれらの開示全体を本明細書に特に組み込まれている。
本明細書は、特定の実施例と考えられるものに関して記載されたが、本発明は、そのように限定されるものではないことを認識すべきである。それとは反対に、本発明は、添付の請求項の精神と範囲内に含まれる種々の修飾および等価物を含むことが意図されている。例えば、本開示は、種々の乳癌関連の遺伝子ならびに遺伝子セットを含むが、他のタイプの癌に関する同様な遺伝子ならびに遺伝子セットおよび方法が具体的に本明細書の範囲内にある。
Claims (89)
- 生物学的サンプルにおける遺伝子発現をモニタリングするための方法であって、該方法は、以下:
(a)標的遺伝子内のイントロンRNA配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する工程であって、該イントロンRNA配列の発現が、該遺伝子内のエキソンmRNA配列の発現と相関する、工程;
(b)該ポリヌクレオチドを該イントロンRNA配列にハイブリダイズしてポリヌクレオチド−イントロンRNA複合体を形成する工程;および
(c) 該ポリヌクレオチド−イントロンRNA複合体を検出する工程、
を包含する、方法。 - 前記イントロンRNA配列が、前記標的遺伝子のmRNAと同時発現するイントロン配列を同定する工程、および該同時発現に関して最も高い相関係数を有するイントロンRNA配列を選択する工程により選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンRNA配列が、少なくとも50ヌクレオチド塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンRNA配列が、少なくとも55ヌクレオチド塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンRNA配列が、少なくとも60ヌクレオチド塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、組織サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 前記組織が、腫瘍組織である、請求項6に記載の方法。
- 前記腫瘍が、癌である、請求項7に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳癌からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記組織サンプルが、固定された、ワックス包埋組織サンプルである、請求項6に記載の方法。
- 前記組織サンプルが、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルである、請求項10に記載の方法。
- 前記エキソンRNAが、断片化されている、請求項10に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、生体液である、請求項1に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションが、ストリンジェントな条件下で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンRNAの発現を定量化する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、PCRプローブである、請求項16に記載の方法。
- 前記PCRプローブが、前記イントロンRNA配列内の固有の配列に基づいて設計される、請求項17に記載の方法。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、PCRプライマーである、請求項16に記載の方法。
- 前記PCRプライマーが、前記イントロンRNA配列内の固有の配列に基づいて設計される、請求項19に記載の方法。
- 1種より多い標的遺伝子の発現が、モニタリングされる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも50個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項21に記載の方法。
- 少なくとも100個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項21に記載の方法。
- 少なくとも500個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項21に記載の方法。
- 少なくとも10,000個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項21に記載の方法。
- 複数の前記標的遺伝子に対応するイントロンRNA配列が、固体表面上に固定されたアレイとして提示される、請求項25に記載の方法。
- 前記標的遺伝子が、図6に列挙される遺伝子から選択される、請求項1に記載の方法。
- 標的遺伝子の増幅のために一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製する方法であって、該方法は、以下:
(a)前記標的遺伝子の発現が、該標的遺伝子内のエキソンmRNA配列の発現と相関する、該標的遺伝子内の少なくとも1つのイントロン配列を同定する工程;および
(b)転写されたイントロン配列の少なくとも一部に対応する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製する工程、
を包含する、方法。 - 前記一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製する前に前記イントロン配列内の反復配列を同定する工程を包含する、請求項28に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド分子を調製する前に前記反復配列がマスクされる、請求項29に記載の方法。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、PCRプライマーである、請求項28に記載の方法。
- 前記PCRプライマーが、前記転写されたイントロン配列内の標的配列の5’−配列を含むように設計されたフォワードプライマーである、請求項31に記載の方法。
- 前記PCRプライマーが、前記転写されたイントロン配列内のフォワードプライマーの下流の標的配列の5’−配列を相補するように設計されたリバースプライマーである、請求項31に記載の方法。
- 前記標的配列が、少なくとも50ヌクレオチド塩基長である、請求項32または33に記載の方法。
- 前記標的配列が、少なくとも55ヌクレオチド塩基長である、請求項32または33に記載の方法。
- 前記標的配列が、少なくとも60ヌクレオチド塩基長である、請求項32または33に記載の方法。
- 前記PCRプライマーが、17〜30ヌクレオチド塩基長である、請求項31に記載の方法。
- 前記PCRプライマーが、約20%から80%のG塩基+C塩基を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記PCRプライマーの融解温度(Tm)が、約50℃と約70℃との間である、請求項31に記載の方法。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、PCRプローブである、請求項28に記載の方法。
- 前記PCRプローブが、前記転写されたイントロン配列内の標的配列内の一部を含むか、または相補するように設計される、請求項40に記載の方法。
- 前記PCRプローブが、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素により標識される、請求項41に記載の方法。
- 前記標的遺伝子が、図6に列挙された遺伝子から選択される、請求項28に記載の方法。
- 少なくとも1種の目的の遺伝子を提示する固定されたパラフィン包埋組織サンプルにおけるイントロンRNAを増幅するための方法であって、該方法は、以下:
(a)対応するエキソンRNAの発現と相関する発現をするイントロンRNAの逆転写により得られたDNAを、該イントロンRNAに対応するPCRプライマーおよびプローブの少なくとも1セットと接触させる工程;ならびに
(b)PCR増幅を実施する工程;
を包含する、方法。 - 前記PCRプライマーおよびプローブが、前記イントロンRNA内の固有の配列に基づいて設計される、請求項44に記載の方法。
- 前記サンプルが、目的の複数遺伝子を呈示する断片化RNAを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記サンプルが、イントロン内の固有の配列に基づいて設計されたPCRプライマーおよびプローブのプールと接触され、該固有の配列の発現が、前記目的の遺伝子内に存在する対応するエキソンの発現と相関する、請求項46に記載の方法。
- 前記プールが、図2に示されたイントロンベースのプライマー/プローブセットの少なくとも1つを含む、請求項47に記載の方法。
- 前記プールが、図2に示された少なくとも1つのフォワードプライマーもしくはリバースプライマーまたはプローブセットを含む、請求項47に記載の方法。
- 前記組織サンプルが、腫瘍生検由来である、請求項46に記載の方法。
- 前記腫瘍生検が、ヒト患者から得られる、請求項50に記載の方法。
- 前記腫瘍が、乳癌である、請求項51に記載の方法。
- 前記腫瘍が、肺癌である請求項51に記載の方法。
- 前記腫瘍が、結腸直腸癌である請求項51に記載の方法。
- 前記目的の遺伝子のRNA転写物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程をさらに包含する、請求項51に記載の方法。
- 前記RNA転写物またはそれらの産物の差示的発現が、処置に対して予測される患者の反応または患者の生存と相関する、請求項55に記載の方法。
- 前記目的の遺伝子が、図6に列挙された遺伝子から選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記RNA転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全RNA転写物もしくはそれらの発現産物、またはRNA転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項58に記載の方法。
- 前記RNA転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全RNA転写物もしくはそれらの発現産物、またはRNA転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項60に記載の方法。
- 前記RNA転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全RNA転写物もしくはそれらの発現産物、またはRNA転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項62に記載の方法。
- 前記RNA転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全RNA転写物もしくはそれらの発現産物、またはRNA転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項64に記載の方法。
- 固体表面に固定されている目的の標的遺伝子にハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドを含むアレイを用いて遺伝子発現を測定するための方法であって、該ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、対応するエキソン配列の発現と相関する発現をするイントロンベースの配列を含む、方法。
- 前記ポリヌクレオチドの全てが、イントロン配列を含む、請求項66に記載の方法。
- 図1A〜Mに示されたアンプリコンの少なくとも1つまたはそれらの相補体を含む、請求項66に記載の方法。
- 図1A〜Mに示された2つ以上のアンプリコンまたはそれらの相補体を含む、請求項66に記載の方法。
- 図1A〜Mに示された全てのアンプリコンまたはそれらの相補体を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記遺伝子の少なくとも5個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項71に記載の方法。
- 前記遺伝子の少なくとも10個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項71に記載の方法。
- 前記遺伝子の全てにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項71に記載の方法。
- 前記遺伝子の少なくとも5個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項75に記載の方法。
- 前記遺伝子の少なくとも10個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項75に記載の方法。
- 前記遺伝子の全てにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項75に記載の方法。
- 図6に列挙された遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子に対応するイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項66に記載の方法。
- 図6に列挙された遺伝子から選択される複数の遺伝子に対応するイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項66に記載の方法。
- イントロンベースおよびエキソンベース両方のポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項66に記載の方法。
- 目的の同一の標的遺伝子にハイブリダイズするイントロンベースおよびエキソンベース両方のポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項66に記載の方法。
- 前記アレイが、少なくとも100個の遺伝子を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記アレイが、100μの切片に少なくとも100個の遺伝子を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記アレイが、100μの切片に少なくとも150個の遺伝子を含む、請求項87に記載の方法。
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WO2003078662A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-25 | Genomic Health | Gene expression profiling in biopsied tumor tissues |
AU2003295598B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-12-24 | Genomic Health, Inc. | Gene expression profiling of EGFR positive cancer |
US20040231909A1 (en) | 2003-01-15 | 2004-11-25 | Tai-Yang Luh | Motorized vehicle having forward and backward differential structure |
ATE412779T1 (de) * | 2003-02-20 | 2008-11-15 | Genomic Health Inc | Benutzung von intronischen rna sequenzen zur quantifizierung der genexpression |
CA2527285A1 (en) * | 2003-05-28 | 2004-12-23 | Genomic Health, Inc. | Gene expression markers for predicting response to chemotherapy |
ES2787475T3 (es) | 2003-06-24 | 2020-10-16 | Genomic Health Inc | Predicción de probabilidad de recurrencia del cáncer |
AU2012200431B2 (en) * | 2004-04-09 | 2013-06-27 | Fondazione Irccs Istituto Nazionale Dei Tumori | Gene expression markers for predicting response to chemotherapy |
EP2947160B1 (en) | 2004-04-09 | 2017-07-12 | Genomic Health, Inc. | Gene expression markers for predicting response to chemotherapy |
JP2009501531A (ja) * | 2005-07-15 | 2009-01-22 | アプレラ コーポレイション | Rnaプロファイリングのための方法 |
CA2620195A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators |
EP2412822A1 (en) * | 2006-01-11 | 2012-02-01 | Genomic Health, Inc. | Gene expression markers for colorectal cancer prognosis |
WO2007123772A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-11-01 | Genomic Health, Inc. | Genes involved in estrogen metabolism |
IL301804A (en) | 2006-05-18 | 2023-05-01 | Caris Mpi Inc | A system and method for determining a personalized medical intervention for a disease stage |
US8768629B2 (en) * | 2009-02-11 | 2014-07-01 | Caris Mpi, Inc. | Molecular profiling of tumors |
US8338109B2 (en) | 2006-11-02 | 2012-12-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Predicting cancer outcome |
AU2008289148A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-02-26 | Aventis Inc. | Gene expression markers of recurrence risk in cancer patients after chemotherapy |
EP2288727B1 (en) * | 2008-05-14 | 2013-07-10 | Genomic Health, Inc. | Predictors of patient response to treatment with egf receptor inhibitors |
CA2725978A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Genomedx Biosciences, Inc. | Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer |
US10407731B2 (en) | 2008-05-30 | 2019-09-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes |
US10359425B2 (en) * | 2008-09-09 | 2019-07-23 | Somalogic, Inc. | Lung cancer biomarkers and uses thereof |
US20100221752A2 (en) * | 2008-10-06 | 2010-09-02 | Somalogic, Inc. | Ovarian Cancer Biomarkers and Uses Thereof |
EP2347009A4 (en) * | 2008-10-14 | 2012-05-30 | Caris Mpi Inc | GENE AND GENE EXPRESSED TARGET PROTEINS FOR THE PRESENTATION OF BIOMARKERS AND SIGNATURES BY TUMOR TYPE |
JP2012508577A (ja) * | 2008-11-12 | 2012-04-12 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス | 表現型を決定するためのエキソソームの使用方法およびそのシステム |
US10236078B2 (en) | 2008-11-17 | 2019-03-19 | Veracyte, Inc. | Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue |
US9495515B1 (en) | 2009-12-09 | 2016-11-15 | Veracyte, Inc. | Algorithms for disease diagnostics |
US20120041274A1 (en) | 2010-01-07 | 2012-02-16 | Myriad Genetics, Incorporated | Cancer biomarkers |
US9074258B2 (en) | 2009-03-04 | 2015-07-07 | Genomedx Biosciences Inc. | Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease |
NZ596054A (en) * | 2009-05-01 | 2013-07-26 | Genomic Health Inc | Gene expression profile algorithm and test for likelihood of recurrence of colorectal cancer and response to chemotherapy |
US8669057B2 (en) | 2009-05-07 | 2014-03-11 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for diagnosis of thyroid conditions |
US10446272B2 (en) | 2009-12-09 | 2019-10-15 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for classification of samples |
CN103237901B (zh) | 2010-03-01 | 2016-08-03 | 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 | 用于治疗诊断的生物标志物 |
KR20130043104A (ko) | 2010-04-06 | 2013-04-29 | 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 | 질병용 순환 생물학적 지표들 |
EP3812469A1 (en) | 2010-07-07 | 2021-04-28 | Myriad Genetics, Inc. | Gene signatures for cancer prognosis |
SG186953A1 (en) | 2010-07-09 | 2013-02-28 | Somalogic Inc | Lung cancer biomarkers and uses thereof |
DE102010033575B4 (de) * | 2010-08-02 | 2016-01-14 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | ASPP2-Splicevariante |
MX341517B (es) | 2010-08-13 | 2016-08-24 | Somalogic Inc | Biomarcadores de cancer pancreatico y usos de los mismos. |
EP2611941A4 (en) | 2010-08-30 | 2014-01-22 | Myriad Genetics Inc | GENESIS OF CANCER DIAGNOSIS AND PROGNOSIS |
WO2012174203A2 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Anthony Albino | Methods and kits for the detection and treatment of recurring prostate cancer |
WO2013010074A1 (en) | 2011-07-13 | 2013-01-17 | Primeradx, Inc. | Multimodal methods for simultaneous detection and quantification of multiple nucleic acids in a sample |
GB201114919D0 (en) * | 2011-08-30 | 2011-10-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method |
EP2791359B1 (en) | 2011-12-13 | 2020-01-15 | Decipher Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using non-coding transcripts |
CA2881627A1 (en) | 2012-08-16 | 2014-02-20 | Genomedx Biosciences Inc. | Cancer diagnostics using biomarkers |
EP2920322B1 (en) | 2012-11-16 | 2023-01-11 | Myriad Genetics, Inc. | Gene signatures for cancer prognosis |
EP2968988A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-16 | Allegro Diagnostics Corp | METHOD FOR EVALUATING A COPD STATUS |
US11976329B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-05-07 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia |
EP3623482A1 (en) | 2014-05-13 | 2020-03-18 | Myriad Genetics, Inc. | Gene signatures for cancer prognosis |
EP3770274A1 (en) | 2014-11-05 | 2021-01-27 | Veracyte, Inc. | Systems and methods of diagnosing idiopathic pulmonary fibrosis on transbronchial biopsies using machine learning and high dimensional transcriptional data |
WO2018039490A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Genomedx Biosciences, Inc. | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
WO2018132916A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Genomedx Biosciences, Inc. | Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer |
AU2018230784A1 (en) | 2017-03-09 | 2019-10-10 | Decipher Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
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Family Cites Families (73)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4699877A (en) * | 1982-11-04 | 1987-10-13 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting human tumors |
USRE35491E (en) * | 1982-11-04 | 1997-04-08 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting human tumors |
CA1252046A (en) | 1982-11-04 | 1989-04-04 | Martin J. Cline | Methods for oncogenic detection |
US7838216B1 (en) * | 1986-03-05 | 2010-11-23 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Human gene related to but distinct from EGF receptor gene |
US5015568A (en) * | 1986-07-09 | 1991-05-14 | The Wistar Institute | Diagnostic methods for detecting lymphomas in humans |
US5202429A (en) * | 1986-07-09 | 1993-04-13 | The Wistar Institute | DNA molecules having human BCL-2 gene sequences |
US4968603A (en) * | 1986-12-31 | 1990-11-06 | The Regents Of The University Of California | Determination of status in neoplastic disease |
US5831066A (en) * | 1988-12-22 | 1998-11-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Regulation of bcl-2 gene expression |
US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
US5858678A (en) * | 1994-08-02 | 1999-01-12 | St. Louis University | Apoptosis-regulating proteins |
US5830753A (en) * | 1994-09-30 | 1998-11-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor dage and uses thereof. |
US6416635B1 (en) * | 1995-07-24 | 2002-07-09 | Tokyo Electron Limited | Method and apparatus for sputter coating with variable target to substrate spacing |
EP0868519B1 (en) * | 1995-12-18 | 2006-01-11 | Sugen, Inc. | Diagnosis and treatment of aur-1 and/or aur-2 related disorders |
US6716575B2 (en) * | 1995-12-18 | 2004-04-06 | Sugen, Inc. | Diagnosis and treatment of AUR1 and/or AUR2 related disorders |
US5670325A (en) * | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
US5741650A (en) * | 1996-01-30 | 1998-04-21 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting colon cancer from stool samples |
US5821082A (en) * | 1996-05-23 | 1998-10-13 | St. Louis University Health Sciences Center | Anti-proliferation domain of a human Bcl-2 and DNA encoding the same |
US6100029A (en) * | 1996-08-14 | 2000-08-08 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of chromosomal aberrations |
US5952178A (en) * | 1996-08-14 | 1999-09-14 | Exact Laboratories | Methods for disease diagnosis from stool samples |
US6203993B1 (en) * | 1996-08-14 | 2001-03-20 | Exact Science Corp. | Methods for the detection of nucleic acids |
US5928870A (en) * | 1997-06-16 | 1999-07-27 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
US6143529A (en) * | 1996-08-14 | 2000-11-07 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for improving sensitivity and specificity of screening assays |
US6146828A (en) | 1996-08-14 | 2000-11-14 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor |
US6020137A (en) * | 1996-08-14 | 2000-02-01 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of loss of heterozygosity |
US5861278A (en) * | 1996-11-01 | 1999-01-19 | Genetics Institute, Inc. | HNF3δ compositions |
AU736587B2 (en) * | 1996-11-20 | 2001-08-02 | Yale University | Survivin, a protein that inhibits cellular apoptosis, and its modulation |
US5830665A (en) * | 1997-03-03 | 1998-11-03 | Exact Laboratories, Inc. | Contiguous genomic sequence scanning |
US6033893A (en) | 1997-06-26 | 2000-03-07 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human cathepsin |
WO1999002714A1 (en) | 1997-07-07 | 1999-01-21 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast |
US6020135A (en) * | 1998-03-27 | 2000-02-01 | Affymetrix, Inc. | P53-regulated genes |
EP1084273A1 (en) * | 1998-06-06 | 2001-03-21 | Genostic Pharma Limited | Probes used for genetic profiling |
US6696558B2 (en) * | 1998-09-09 | 2004-02-24 | The Burnham Institute | Bag proteins and nucleic acid molecules encoding them |
WO2000050595A2 (en) | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Ivan Gout | Nucleic acid molecules associated with melanoma and thyroid tumors |
AU3395900A (en) | 1999-03-12 | 2000-10-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides |
US20020039764A1 (en) * | 1999-03-12 | 2002-04-04 | Rosen Craig A. | Nucleic, acids, proteins, and antibodies |
US6960439B2 (en) * | 1999-06-28 | 2005-11-01 | Source Precision Medicine, Inc. | Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles |
US6692916B2 (en) * | 1999-06-28 | 2004-02-17 | Source Precision Medicine, Inc. | Systems and methods for characterizing a biological condition or agent using precision gene expression profiles |
US6326148B1 (en) | 1999-07-12 | 2001-12-04 | The Regents Of The University Of California | Detection of copy number changes in colon cancer |
US6710170B2 (en) * | 1999-09-10 | 2004-03-23 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US6271002B1 (en) * | 1999-10-04 | 2001-08-07 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | RNA amplification method |
CA2391805A1 (en) | 1999-10-06 | 2001-04-12 | The Regents Of The University Of California | Differentially expressed genes associated with her-2/neu overexpression |
AU2055401A (en) | 1999-12-01 | 2001-06-12 | Genentech Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6750013B2 (en) | 1999-12-02 | 2004-06-15 | Protein Design Labs, Inc. | Methods for detection and diagnosing of breast cancer |
US6248535B1 (en) * | 1999-12-20 | 2001-06-19 | University Of Southern California | Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens |
EP1276901A2 (en) * | 2000-01-13 | 2003-01-22 | Amsterdam Support Diagnostics B.V. | A universal nucleic acid amplification system for nucleic acids in a sample |
US6322986B1 (en) * | 2000-01-18 | 2001-11-27 | Albany Medical College | Method for colorectal cancer prognosis and treatment selection |
US6618679B2 (en) * | 2000-01-28 | 2003-09-09 | Althea Technologies, Inc. | Methods for analysis of gene expression |
CA2395816A1 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins and antibodies |
AU4592601A (en) | 2000-03-21 | 2001-10-03 | Millennium Predictive Medicine | Novel genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer |
US7157227B2 (en) * | 2000-03-31 | 2007-01-02 | University Of Louisville Research Foundation | Microarrays to screen regulatory genes |
WO2002000677A1 (en) | 2000-06-07 | 2002-01-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
MXPA03000575A (es) * | 2000-07-21 | 2004-12-13 | Global Genomics Ab | Metodos para analisis e identificacion de genes transcritos e impresion dactilar. |
AU2001278011A1 (en) | 2000-07-26 | 2002-02-05 | Applied Genomics, Inc. | Bstp-ecg1 protein and related reagents and methods of use thereof |
WO2002008282A2 (en) | 2000-07-26 | 2002-01-31 | Stanford University | Bstp-ras/rerg protein and related reagents and methods of use thereof |
AU2001277172A1 (en) | 2000-07-26 | 2002-02-05 | Applied Genomics, Inc. | Bstp-trans protein and related reagents and methods of use thereof |
US7795232B1 (en) | 2000-08-25 | 2010-09-14 | Genta Incorporated | Methods of treatment of a bcl-2 disorder using bcl-2 antisense oligomers |
US6602670B2 (en) * | 2000-12-01 | 2003-08-05 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression |
US6582919B2 (en) * | 2001-06-11 | 2003-06-24 | Response Genetics, Inc. | Method of determining epidermal growth factor receptor and HER2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates |
JP2004537261A (ja) | 2000-12-08 | 2004-12-16 | イプソゲン | 候補遺伝子のアレイを用いた原発性乳がんの遺伝子発現プロファイリング |
AU2002255478A1 (en) | 2001-01-10 | 2002-09-12 | Pe Corporation (Ny) | Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof |
JP4368110B2 (ja) * | 2001-01-12 | 2009-11-18 | エール ユニヴァーシティ | 癌患者の生物学的流体中のサバイビンの検出 |
US7776518B2 (en) * | 2001-01-12 | 2010-08-17 | Yale University | Detection of survivin in the biological fluids of cancer patients |
MXPA03006617A (es) | 2001-01-24 | 2004-12-02 | Protein Design Labs Inc | Metodos de diagnostico de cancer de pecho, composiciones y metodos de rastreo de moduladores de cancer de pecho. |
EP1373896A2 (en) * | 2001-03-12 | 2004-01-02 | MonoGen, Inc. | Cell-based detection and differentiation of disease states |
US7514209B2 (en) * | 2001-06-18 | 2009-04-07 | Rosetta Inpharmatics Llc | Diagnosis and prognosis of breast cancer patients |
US7125680B2 (en) | 2001-07-27 | 2006-10-24 | The Regents Of The University Of California | Methods and materials for characterizing and modulating interaction between heregulin and HER3 |
US7026123B1 (en) * | 2001-08-29 | 2006-04-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | UTR tag assay for gene function discovery |
AU2002343443A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-14 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Classification of lung carcinomas using gene expression analysis |
CN102402650A (zh) * | 2001-11-09 | 2012-04-04 | 生命技术公司 | 利用基因表达分布图识别、监控和治疗疾病以及鉴定生物学状态 |
US20030198972A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-10-23 | Erlander Mark G. | Grading of breast cancer |
AU2003215460A1 (en) | 2002-03-28 | 2003-10-13 | Qlt Inc. | Cancer associated protein kinases and their uses |
EP1900827A3 (en) | 2002-05-21 | 2008-04-16 | Bayer HealthCare AG | Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia |
ATE412779T1 (de) * | 2003-02-20 | 2008-11-15 | Genomic Health Inc | Benutzung von intronischen rna sequenzen zur quantifizierung der genexpression |
-
2004
- 2004-02-19 AT AT04712947T patent/ATE412779T1/de active
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- 2006-12-25 JP JP2006348657A patent/JP2007075127A/ja not_active Withdrawn
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