JP2006514822A - トロンビンペプチド誘導体 - Google Patents

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Abstract

配列番号：２のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）を有するポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有する該ポリペプチドのＣ−末端切断フラグメントを含むトロンビンペプチド誘導体が開示される。Ｘａａはアラニン、グリシン、セリン、またはＳ−保護システインである。該ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント中の０、１、２、または３個のアミノ酸は、配列番号：２の対応する位置と異なる。トロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療する方法もまた、開示される。該方法は、上記のトロンビンペプチド誘導体の有効量を投与することを含む。

Description

発明の詳細な説明
関連出願
本出願は、２００２年７月２日出願の米国仮出願第６０／３９３，５８０号の利益を主張するものであり、その全教示が本明細書中に参考として援用される。
発明の背景
トロンビン、その血液凝固活性について既知の多機能酵素、は重要な細胞成長因子であることが近年報告されている。例えば、トロンビンが、血管形成を促進し、新たな血管を発達させ、内皮細胞増殖を刺激することが示されている。これらの過程は、創傷治癒の中枢部分である。
トロンビンペプチド誘導体は、少なくとも部分的にトロンビンのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する分子であり、一定のトロンビンレセプターに対して活性である。例えば、ヒトプロ−トロンビンのアミノ酸508〜530由来のトロンビンペプチド誘導体は、本発明者らによってトロンビンレセプターを媒介する細胞刺激の促進ならびに創傷の処置、および血管形成の刺激におけるそれらの使用について記載されている（例えば米国特許第5,500,412号または第5,352,664号参照、本明細書中においてその内容は参考としてその全体が援用される）。その生物学的活性のため、これらのトロンビンペプチド誘導体は医薬品としての多大なる可能性を示す。TP508は、係るトロンビンペプチド誘導体の例の一つであり、Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する。
医薬品として使用される場合は、食品医薬品局(FDA)による厳格な規制が、生物学的に活性な薬剤の高度な精製を要求する。従って、トロンビンペプチド誘導体がヒトを治療するために使用される場合、長期間に渡って純度を維持する活性なこれらの化合物を得る必要がある。残念ながら、トロンビンペプチド誘導体TP508の純度は、ジスフィルド結合形成に起因するダイマー化のために経時的に低下する。例えば、TP508は、中性pHの緩衝溶液中で約2〜約4時間の半減期を有する。ペプチドダイマーは減成産物であり、従って医薬組成物の汚染物質とみなされ得る。
従って、トロンビンペプチド誘導体の活性を有するが、溶液中でダイマーを形成しない新しいペプチドに対する需要がある。
発明の要旨
システインが類似のサイズの非反応性アミノ酸と置換されたトロンビンペプチド誘導体は、溶液中でダイマーにならず、トロンビンレセプターに対する活性を維持することが今日になって見出されている。例えば、配列番号：１中のシステインをアラニンと(TP508Cys→Ala)またはセリンと(TP508Cys→Ser)置換すると、TP508とほぼ同等のトロンビンレセプターに対する活性を有するトロンビンペプチド誘導体が生じる(実施例１および２参照)。さらに、TP508Cys→Alaは、食塩水溶液中で6ヵ月後においてダイマー化を示さなかった(実施例４参照)。この発見に基づいて、本発明は、新規ペプチド、これらのペプチドを含む医薬組成物、およびトロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療するための有用な方法を提供する。
本発明の一態様は、配列番号：２のアミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌを有するポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのポリペプチドのＣ−末端切断フラグメントを含むトロンビンペプチド誘導体である。該ペプチドまたはペプチドフラグメント中の０、１、２、または３個のアミノ酸は配列番号：２の対応する位置と異なり、ただしＸａａはアラニン、グリシン、セリン、またはＳ−保護システインである。好ましくは、該差異は保存的である。トロンビンペプチド誘導体は、任意にそのＣ−末端においてアミド化され、および/またはそのＮ−末端においてアシル化されている。
本発明の別の態様はまた、本明細書中に記載されるトロンビンレセプターアゴニストまたはトロンビンペプチド誘導体および薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明の別の態様は、さらにトロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療する方法に関する。該方法は、本明細書中に記載されるトロンビンペプチド誘導体の有効量を投与することを含む。
本発明のトロンビンペプチド誘導体の利点として、TP508と比較して溶液中におけるより長期の貯蔵寿命が挙げられる。さらに、これらのトロンビンペプチド誘導体は、酸化されにくい。従って、溶液中における長期の貯蔵後ですら、開示されるペプチドを用いた正確で再現性のある投薬を送達することが可能である。本明細書中に記載されるトロンビンペプチド誘導体はまた、生産するのに費用がかからない。該トロンビンペプチド誘導体は、血管形成および細胞増殖が有益となるであろう疾患および/または症状の治療および/または予防において使用され得る。該トロンビンペプチド誘導体は、例えば、糖尿病性潰瘍、骨折、軟骨損傷などの創傷治療を補助するために使用され得る。該トロンビンペプチド誘導体はまた、血管形成術後の患者における再狭窄を予防するためおよび心臓組織において血管を再生するために使用され得る。
発明の詳細な説明
出願人らは、本発明のペプチドが本質的にダイマー化せず、なお先行技術におけるトロンビンペプチド誘導体とほぼ同等の生物学的活性を有することを見出した。本発明のトロンビンペプチドのダイマー化を最小化するために、トロンビンペプチド誘導体中に通常見られるシステイン残基は、類似のサイズおよび電荷性質を有するアミノ酸と置換される。適切なアミノ酸の例としては、アラニン、グリシン、セリン、またはS-保護システインが挙げられる。好ましくは、システインはアラニンと置換される。
本明細書中で開示されるトロンビンペプチド誘導体は、C-末端アミドを有し得ることが理解されよう。「C-末端アミド」とは、αカルボン酸がアミドと置換されたC-末端アミノ酸残基におけるアミドである。例えば、アミド化C-末端アミノ酸残基は、式：-NH-CH(Ra)C(O)-NRbRcを有する。Raはアミノ酸側鎖である。アミノ酸側鎖は、水素、置換もしくは非置換C1〜C10脂肪族基、または置換もしくは非置換C1〜C10芳香族基でもよい。好ましくは、Raは、天然に存在するアミノ酸中の側鎖に対応するアミノ酸側鎖である。RbおよびRcは、独立して水素、C1〜C10置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはRbおよびRcは、それらが結合する窒素と共にC1〜C10非芳香族複素環基を形成する。好ましくは、C-末端アミドはカルボキサミド(-C(O)NH2)である。本明細書中で使用される場合、C-末端における「-NH2」は、C-末端カルボキサミドを指し；C-末端における「-OH」は、該ペプチドが遊離C-末端を有することを指し；C-末端の明示がないことは、該ペプチドがC-末端においてアミド化されているかまたは遊離C-末端を有することを指す。
本明細書で開示されるトロンビンペプチド誘導体は、アシル化N-末端を有し得ることもまた理解されよう。「アシル化N-末端」は、N-末端アミノ酸残基の窒素がアシル化されているN-末端である。例えば、アシル化N-末端アミノ酸残基は、式：RdC(O)-NH-CHRaC(O)-を有する。Rdは、水素、C1〜C10置換もしくは非置換脂肪族基、またはC1〜C10置換もしくは非置換芳香族基である。アセチルは好ましいアシル基である。N-末端における「-H」は、N-末端が非置換であることを指し；N-末端の明示がないことは、該末端がアシル化されているかまたは非置換であることを指す。
好ましくは、トロンビンペプチド誘導体のN-末端は遊離(すなわち、非置換)であり、C-末端は遊離(すなわち、非置換)であるかまたはアミド化されており、好ましくはカルボキサミド(すなわち、-C(O)NH2)である。
トロンビンペプチド誘導体は、非タンパク質分解性活性化トロンビンレセプター(本明細書中において、以後「NPAR」)として公知の高親和性細胞表面トロンビンレセプターに結合することにより細胞を活性化すると考えられている(R.Horvatら、J.Cell Sci、108、1155〜1164、1995)。NPARを刺激する化合物は、トロンビンレセプターアゴニストであると言われる。米国特許第5,352,664号および第5,500,412号ならびにGlennら、J.Peptide Research、1：65、(1988)に開示されるように、NPAR活性化は、分裂促進(submitogenic)濃度のトロンビンまたはプロテインキナーゼCを活性化するかもしくはトロンビンレセプターへの高親和性結合に関して125I-トロンビンと競合する分子の存在下で線維芽細胞に添加された場合における細胞増殖を刺激する分子の能力に基づいて評価され得る。
トロンビンペプチド誘導体は、NPARを刺激し、約50個より少ないアミノ酸、好ましくは約33個よりも少ないアミノ酸を有する。トロンビンペプチド誘導体はまた、該ポリペプチドがNPARを活性化するようにプロトロンビンアミノ酸508〜530：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ(配列番号：３)に対応するヒトトロンビンのフラグメントに充分なホモロジーを有する。本明細書中に記載されるトロンビンペプチド誘導体は、典型的には少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは約12〜33個のアミノ酸、より好ましくは約12〜23個のアミノ酸を有する。
第一の好ましい態様において、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号：4のアミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌを有するポリペプチド、または少なくとも6個のアミノ酸を有するそのC-末端切断フラグメントを含む。より好ましくは、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号：5のアミノ酸配列：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌまたは配列番号：５のアミノ酸10〜18を含むそのフラグメントを有する。さらにより好ましくは、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号：6のアミノ酸配列：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ、または配列番号：6のアミノ酸10〜18を含むそのフラグメントを有する。Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはS-保護システインである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ１はＧｌｕであり、Ｘ２はＰｈｅであり、Ｘａａはアラニンである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ(配列番号：7)を有するポリペプチドである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体のさらなる例は、アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２(配列番号：8)を有するポリペプチドである。トロンビンペプチド誘導体中の0、1、2または3個のアミノ酸が配列番号：4、5、6、7または8の対応する位置のアミノ酸と異なり、ただしＸａａはアラニン、グリシン、セリンまたはS-保護システインである。好ましくは、その差異は保存的である。
第二の好ましい態様において、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号：９のアミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有するポリペプチド、またはアミノ酸6〜28を含むそのフラグメントを含む。より好ましくは、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号：10のアミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有するポリペプチド、またはアミノ酸6〜28を含むそのフラグメントを含む。ＸａａおよびＸｂｂは、独立してアラニン、グリシン、セリンまたはS-保護システインである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ１はＧｌｕであり、Ｘ２はＰｈｅであり、ＸａａおよびＸｂｂはアラニンである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ(配列番号：11)を有するポリペプチドである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体のさらなる例は、アミノ酸配列Ｈ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ２(配列番号：12)を有するポリペプチドである。トロンビンペプチド誘導体中の0、1、2または3個のアミノ酸は、配列番号：9、10、11または12の対応する位置のアミノ酸と異なり、ＸａａおよびＸｂｂは、独立してアラニン、グリシン、セリンまたはS-保護システインである。好ましくは、その差異は保存的である。
「保存的置換」は、あるアミノ酸の、同じ正味電荷ならびにだいたい同じサイズおよび形状を有する別のアミノ酸との置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖中の炭素およびヘテロ原子の合計数が約4個までしか違わない場合、だいたい同じサイズを有する。側鎖中の分枝数が1個しか違わない場合は、それらはだいたい同じ形状を有する。側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、およそ同じサイズおよび形状を有すると考えられる。アミノ酸の5つのグループが以下に列挙される。ポリペプチド中のアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸と置換すると、保存的置換となる：
グループI：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびC1〜C4脂肪族またはC1〜C4水酸基置換脂肪族側鎖(直鎖または一分枝)を有する天然に存在しないアミノ酸。
グループII：グルタミン酸、アスパルギン酸およびカルボン酸置換C1〜C4脂肪族側鎖(無枝または一分枝点)を有する天然に存在しないアミノ酸。
グループIII：リジン、オルニチン、アルギニンおよびアミンまたはグアニジン(guanidino)置換C1〜C4脂肪族側鎖(無枝または一分枝点)を有する天然に存在しないアミノ酸。
グループIV：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換C1〜C4脂肪族側鎖(無枝または一分枝点)を有する天然に存在しないアミノ酸。
グループV：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
「高度な保存的置換」は、あるアミノ酸の、側鎖に同じ官能基を有しほとんど同じサイズおよび形状を有する別のアミノ酸との置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖中の炭素およびヘテロ原子の合計数が2個までしか違わない場合、ほとんど同じサイズを有する。側鎖中に同数の分枝を有する場合は、それらはほとんど同じ形状を有する。高度な保存的置換の例としては、ロイシンの換わりにバリン、セリンの換わりにスレオニン、グルタミン酸の換わりにアスパラギン酸およびフェニルアラニンの換わりにフェニルグリシンが挙げられる。高度に保存的ではない置換の例としては、バリンの換わりにアラニン、セリンの換わりにアラニンおよびセリンの換わりにアスパラギン酸が挙げられる。
「S-保護システイン」は、チオール部分、-SH、の反応性が保護基によって妨げられているシステイン残基である。当該技術分野においては適切な保護基が公知であり、例えば、T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts、Protective Groups in Organic Synthesis 第3版、John Wiley&Sons、(1999)、454〜493(本明細書中においてその全教示が参考として援用される)中に開示されている。適切な保護基は、非毒性で医薬製剤において安定であり、トロンビンペプチド誘導体の活性を維持するための最低限の追加の機能性を有するべきである。遊離チオールは、チオエーテル、チオエステルとして保護され得るか、または非対称のジスフィルドへ酸化され得る。好ましくは、チオールはチオエーテルとして保護される。適切なチオエーテルとしては、これらに限定されるものではないが、S-アルキルチオエステル(例えばC1〜C5アルキル)、およびS-ベンジルチオエーテル(例えばシステイン-S-S-t-Bu)が挙げられる。好ましくは、保護基はアルキルチオエーテルである。より好ましくは、S-保護システインはS-メチルシステインである。代替的には、保護基は：1)システインもしくはジスフィルド結合によりトロンビンペプチド誘導体のシステインチオール基に連結されるシステイン含有ペプチド(「保護ペプチド」)；または2)アミノ酸もしくはトロンビンペプチド誘導体のシステインチオール基と保護ペプチド中のカルボン酸(例えばC-末端または側鎖におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸)との間のチオアミド結合により連結されるペプチド(「保護ペプチド」)であり得る。保護ペプチドは、生理学的に不活性であってもよく(例えば、システインによって任意に中断されるせいぜい約50個アミノ酸のポリグリシンまたはポリアラニン)、または所望される生物学的活性を有していてもよい。しかしながら、本発明はトロンビンペプチド誘導体ダイマーを予期しておらず、ここで、保護ペプチドは第二のトロンビンペプチド誘導体である。トロンビンペプチド誘導体ダイマーは、(THROMBIN PEPTIDE DERIVATIVE DIMERS)という表題の同時係属米国仮出願、2002年7月2日出願の仮出願第60/393,579号において開示されている(その全教示が本明細書中において参考として援用される)。
「N-末端切断フラグメント」は、N-末端からアミノ酸またはアミノ酸のブロック、好ましくは、せいぜい6個のアミノ酸のブロック、より好ましくはせいぜい3個のアミノ酸のブロックを取り除いた後に残るフラグメントを言う。任意に、N-末端切断フラグメントは、上記のとおりアシル化および/またはアミド化される。
「C-末端切断フラグメント」は、C-末端からアミノ酸またはアミノ酸のブロック、好ましくは、せいぜい6個のアミノ酸のブロック、より好ましくはせいぜい3個のアミノ酸のブロックを取り除いた後に残るフラグメントを言う。任意に、C-末端切断フラグメントは、上記の通りアミド化および/またはアシル化される。
「非芳香族複素環基」は、本明細書中で使用される場合、3〜10個の原子を有し、窒素、酸素または硫黄などの少なくとも1個のヘテロ原子を含む非芳香族炭素環式の環系である。非芳香族複素環基の例としては、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニルが挙げられる。
用語「アリール基」は、本明細書中で使用される場合、炭素環式および複素環式芳香環系の双方を含む。アリール基の例としては、フェニル、インドリル、フラニルおよびイミダゾリルが挙げられる。
「脂肪族基」は、直鎖、分枝または環式非芳香族炭化水素である。脂肪族基は、完全に飽和されてもよく、または1以上の不飽和単位(例えば、二重および/または三重結合)を含んでもよいが、好ましくは飽和されている、すなわち、アルキル基である。典型的には、直鎖または分枝脂肪族基は、1〜約10個の炭素原子、好ましくは1〜約4個を有し、環式脂肪族基は、3〜約10個の炭素原子、好ましくは3〜約8個を有する。脂肪族基としては、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソ-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、オクチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
脂肪族基、アリール基または非芳香族複素環基に対する適切な置換基は、トロンビンペプチド誘導体の治療的活性を有意に低下させない置換基であり、例えば天然に存在するアミノ酸に見出されるものである。例としては、-OH、ハロゲン(-Br、-Cl、-Iおよび-F)、-O(Re)、-O-CO-(Re)、-CN、-NO2、-COOH、=O、-NH2、-NH(Re)、-N(Re)2、-COO(Re)、-CONH2、-CONH(Re)、-CON(Re)2、-SH、-S(Re)、脂肪族基、アリール基および非芳香族複素環基が挙げられる。各Reは、独立してアルキル基またはアリール基である。置換脂肪族基は、1以上の置換基を有し得る。
「被験体」は、好ましくはヒトであるが、トロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする動物、例えば、伴侶動物(例えばイヌ、ネコなど)、農場動物(例えば乳牛、豚、馬など)および実験動物(例えばラット、マウス、モルモットなど)であってもよい。
トロンビンレセプターアゴニストを用いた「治療を必要とする」被験体は、有益な治療および/または予防結果を達成するためにトロンビンレセプターアゴニストおよびトロンビンペプチド誘導体を用いて処置され得る疾患および/または症状を伴う被験体である。有益な結果としては、病徴の重篤度の低減または病徴開始の遅延、延命および/またはより迅速なもしくはより完全な疾患または症状の消散が挙げられる。例えば、治療を必要とする被験体は、軟骨細胞を含む細胞増殖、血管形成、骨成長、心臓修復、創傷治癒または再狭窄の抑制を必要とする。
トロンビンペプチド誘導体は、内皮細胞、線維芽細胞、およびケラチン生成細胞の増殖を刺激することが示されている(例えば米国特許第5,500,412号または第5,352,664号参照、本明細書中においてその内容の全体が参考として援用される)。従って開示されたトロンビンペプチド誘導体は、例えば、火傷、真皮創傷、外科的創傷および骨折などの急性創傷の治癒を促進するために使用され得る。さらに、トロンビンペプチド誘導体は近年、糖尿病性潰瘍、静脈性潰瘍、および床ずれなどの慢性創傷の治癒の促進において特に効果的であることが示されている(例えばWO03/013569参照、本明細書中においてその内容の全体が参考として援用される)。トロンビンペプチド誘導体はまた、軟骨細胞の成長を刺激することが示されている(例えばWO02/07748参照、本明細書中においてその内容の全体が参考として援用される)。従って、本発明の化合物を含むトロンビンペプチド誘導体は、例えば、骨関節症または関節損傷を有する患者において軟骨細胞成長および修復を刺激するために使用され得る。本発明のトロンビンペプチド誘導体を含むトロンビンペプチド誘導体の他の使用としては、単純骨折、非癒合骨折、骨の空隙および間隙、ならびに骨移植の治癒を促進するための骨成長を刺激すること、血管形成後の患者における再狭窄を予防することならびに血管心臓組織の再生を促進することが挙げられる(例えばWO02/005836およびWO02/004008参照、本明細書中においてその内容の全体が参考として援用される)。
「有効量」は、トロンビンペプチド誘導体を用いて処置された症状に関して処置無しと比較して改善された臨床結果を生じるトロンビンペプチド誘導体の量である。投与されるトロンビンペプチド誘導体の量は、疾患または症状の程度、重篤度、およびタイプ、所望される治療量ならびに医薬製剤の放出特性に依存するであろう。被験体の健康状態、サイズ、体重、年齢、性別および薬剤耐性にもまた依存するであろう。典型的には、アゴニストは所望される治療効果を達成するために十分な期間投与される。典型的には約1μg/日〜約1mg/日のトロンビンペプチド誘導体(好ましくは約5μg/日〜約100μg/日)が、処置を必要とする被験体に投与される。
トロンビンペプチド誘導体は、局部的にまたは全身的に、例えば非経口投与を含む任意の適切な経路によって投与され得る。非経口投与としては、例えば、筋肉内、静脈内、皮下、または腹膜内注射が挙げられ得る。創傷処置のための局所投与としては、例えば、クリーム、ゲル、軟膏またはエアゾールが挙げられ得る。呼吸性投与としては、例えば、吸入または鼻腔内滴剤が挙げられ得る。骨成長の刺激、軟骨修復、心臓修復および再狭窄の処置などのある一定の適用のためには、トロンビンペプチド誘導体を処置部位へ直接注射または植込むことが有利である。トロンビンペプチド誘導体は、徐放性製剤において有利に投与され得る。
トロンビンペプチド誘導体は、医薬組成物の一部として許容され得る医薬担体と共に被験体に投与され得る。医薬組成物の製剤は、選択される投与経路によって変化するであろう。適切な医薬担体は、該化合物と反応しない不活性成分を含み得る。担体は生体適合性、すなわち非毒性、非炎症性、非免疫原性および投与部位において他の所望されない反応を生じない、であるべきである。薬学的に許容され得る担体の例としては、例えば食塩水、エアゾール、市販の不活性ゲル、またはアルブミン、メチルセルロースもしくはコラーゲンマトリックスを補充された液体が挙げられる。Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PA中に記載されるもののような標準的な医薬製剤化技術が使用され得る。
骨成長、軟骨修復、心臓修復および再狭窄の抑制などの適用のためには、徐放性製剤でトロンビンペプチド誘導体を投与することが有利であり得る。ポリマーは、しばしば徐放性製剤を形成するために使用される。これらのポリマーの例としては、ポリ乳酸/ポリグリコール酸ホモポリマーおよびコポリマーなどのポリα-ヒドロキシエステル、ポリホスファゼン(polyphosphazene)(PPHOS)、ポリアンハイドライド(polyanhydride)、ならびにポリ(プロピレンフマレート)が挙げられる。
ポリ乳酸/ポリグリコール酸(PLGA)ホモポリマーおよびコポリマーは、徐放性ビヒクルとして当該技術分野において周知である。放出速度はポリ乳酸とポリグリコール酸の割合およびポリマーの分子量の変化により当業者によって調整され得る(Andersonら、Adv. Drug. Deliv. Rev.、28:5、(1997)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。微粒子担体を形成するためにポリマー中に混合物としてポリ(エチレングリコール)を混入すると、活性成分の放出プロフィールをさらに変化させる(Cleekら、J. Control Release、48:259、(1997)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスもまた、機械的な特性を改善するために製剤に組み込まれ得る。
PPHOSポリマーは、構造式(II)：
Figure 2006514822
において以下に示されるとおり、ポリマー主鎖において交互に窒素およびリンを含み、炭素を含まない。ポリマーの性質は、ポリマー主鎖に結合される側鎖基RおよびR'の適切な変化によって調節され得る。例えば、PPHOSの分解および薬剤放出は、加水分解的に不安定な側鎖基の量を変化させることで制御され得る。イミダゾリルまたはエチルグリコールのいずれかで置換されたPPHOSをより大量に混入すると、例えば分解速度の増加が観察され(Laurencinら、J Biomed Mater. Res、27:963、(1993)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)、それにより薬剤放出の速度が増加する。
構造式(III)に示されるポリアンハイドライドは、セバシン酸および1,3-ビス(p-カルボキシフェノキシ)プロパンなどの疎水性または親水性モノマーの量を変化させることを含むことにより制御され得る、かなり明確な分解および放出特徴を有する(Leongら、J Biomed Mater. Res、19:941、(1985)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。機械的強度を改善するために、無水物はしばしばイミドと共重合させられ、ポリアンハイドライド-コ-イミド(polyanhydride-co-imides)を形成する。整形外科の適用に適したポリアンハイドライド-コ-イミドの例は、ポリ(トリメリチルイミド-グリシン-コ-1,6-ビス(カルボキシフェノキシ)ヘキサン)(poly(trimellitylimido-glycine-co-1,6-bis(carboxyphenoxy)hexane)およびピロメリチイミドアラニン:1,6-ビス(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(pyromellityimidoalanine:1,6-bis(p- carboxyphenoxy)hexane)コポリマーである。
Figure 2006514822
次に、骨または軟骨成長を刺激するための担体は、骨および組織成長用の足場として働くことが出来、その中に骨前駆細胞および骨生成細胞が移動し付着出来る多孔性マトリックスを有利に含む。係る担体は、骨伝導性 (osteoconductive) であると言われる。ある一定の適用に対して、担体は好ましくは、その三次構造を維持するために充分な機械的強度を有し、共に接合または移植される骨または組織の分節の固定化を補助する。
適切な骨伝導性担体の例としては、コラーゲン(例えばウシコラーゲン)、フィブリン、リン酸カルシウムセラミックス(例えばヒドロキシアパタイトおよびリン酸三石灰)、硫酸カルシウム、グアニジン抽出同種異系骨およびその組合せが挙げられる。ヒドロキシアパタイト、リン酸三石灰および筋原線維性コラーゲンの混合物であるCOLLAGRAFT(登録商標)(Cohension Technologies Inc.、Palo Alto、CA) 、ならびに海産サンゴ炭酸カルシウムを結晶性ヒドロキシアパタイトに変換して形成したヒドロキシアパタイトバイオマトリックスであるPRO OSTEON500TM（Interpore Cross International、Irvine、CA）などの多くの適切な担体が市販されている。
徐放性特性を有する骨伝導性担体として働き得る合成生分解性ポリマーの記載は、Behraveshら、Clinical Orthopaedics、367:S118、(1999)および「Controlled Drug Delivery-Designing Technologies for the future」、ParkおよびMrsny編、American Chemical Society、Washington、DC、(2000)中のLichunら、Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors中に見出され得る。本明細書中においてこれらの参考文献の全教示が参考として援用される。これらのポリマーの例としては、上記で詳述されたポリ乳酸／ポリグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマーなどのポリα−ヒドロキシエステル、ポリホスファゼン（PPHOS）、ポリアンハイドライドおよびポリ（プロピレンフマレート）が挙げられる。
本発明の植込み可能な医薬組成物は、骨成長の必要がある部位に投与され得るので特に有用である。「植込み」または「部位に投与」とは、トロンビンペプチド誘導体が医薬組成物から放出されるときに該部位で骨成長が生じる(例えば薬剤の存在下における非存在下よりも良好な骨成長)ように、処置を必要とする部位に充分近接していることを意味する。これらの医薬組成物は、手術を見越して所望される形状にされるかまたは手術の間に医師もしくは専門技術者により形作られることが出来る。組織欠損部をまたいで新組織の所望する形状をとるようにマトリックスを形作ることが好ましい。非癒合欠損部の骨修復の場合は、例えば、非癒合部をまたぐ寸法を使用することが望ましい。骨形成の過程では、材料は身体にゆっくり吸収され、当該インプラントの形状または当該インプラントの形状に極めて近い形状の骨に置き換わる。あるいは、医薬組成物は微粒子またはマイクロスフェアの形態で部位に投与され得る。微粒子は、外科的に部位を露出させて微粒子を適用するか、または微粒子を該部位の近傍に塗布、ピペッティング、噴霧、注射などにより適用するかのいずれかにより、骨誘導の必要がある部位に接触または近接して配置される。微粒子はまた、内視鏡検査法または腹腔鏡検査法により部位に送達され得る。
ポリ（プロピレンフマレート）（PPF）は、注射可能で、インサイチュで重合可能で、生分解性の物質であるので骨欠損の修復における使用に関して非常に所望される生体適合性の植込み可能な担体である。「注射可能」とは、物質がペーストおよびゲルの注射に使用される標準的なニードルを介してシリンジによって注射され得ることを意味する。ビニルモノマー（N-ビニルピロリジノン）および開始剤（ベンゾイルペルオキシド）と組み合わせたPPFは、インサイチュで重合され得る注射可能溶液を形成する。それは、広範な種々のサイズおよび形状の骨格の欠陥を充填するのに特に適している(Suggsら、Macromolecules、30:4318、(1997)、Peterら、J.Biomater.Sci.Poly,.Ed.、10:363、(1999)およびYaszemskiら、Tissue Eng.、1:41、(1995)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。リン酸β−トリカルシウムおよび塩化ナトリウムなどの固相成分の添加は、PPFポリマーの機械的特性を改善し得る(Peterら、J.Biomed.Mater.Res.、44:314、(1999)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。
さらに別の選択肢では、医薬組成物は、骨成長の必要がある部位に投与する前に、メッシュ、ワイヤーマトリックス、ステンレススチールケージ、糸状椎体間融合ケージ(threaded interbody fusion cage)などの物理的支持構造体内に部分的に封入され得る。
注射可能な送達製剤は、静脈内にまたは処置の必要がある部位に直接投与され得る。注射可能な担体は、粘性溶液またはゲルであってもよい。
送達製剤としては、生理食塩水、静菌性食塩水（約0.9％mg/mLのベンジルアルコールを含む食塩水）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液、またはアルブミン、メチルセルロース、もしくはヒアルロン酸が補充された液体が挙げられる。注射可能なマトリックスとしては、ポリ(エチレンオキシド)のポリマーならびにエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマーが挙げられる(Caoら、J.Biomater.Sci、9:475、(1998)およびSimsら、Plast Reconstr. Surg.、98:843、(1996)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。
注射可能なマトリックスである他の組成物としては、上記のポリ（プロピレンフマレート）コポリマーの溶液およびリン酸カルシウムセラミックスのペーストが挙げられる(Schmitzら、J. Oral Maxillofacial Surgery、57:1122、(1999)参照、本明細書中においてその全教示が参考として援用される)。注射可能なマトリックスは、骨成長の必要がある部位に直接注射され得、侵襲性手術の必要なく空隙を充填し、骨を融合させるために簡便に使用され得る。
(硬いゼラチンまたはシクロデキストランの被覆内に入れるなど)組成物をカプセル化する方法は、当該技術分野において公知である(Bakerら、「Controlled Release of Biological Active Agents」、John Wiley and Sons、1986)。
軟膏は典型的には、例えば固定油または炭化水素を含む、白ワセリンもしくはミネラルオイルなどの油性ベース、あるいは、例えば１つまたは複数の吸湿性物質からなる、例として無水ラノリンのような吸湿性ベースを用いて調製される。以下のベースの製剤では、活性成分は所望される濃度で添加される。
クリームは一般的に、固定油、炭化水素などを典型的に含む、ワックス、ワセリン、ミネラルオイルなどの油相(内部相)、ならびに水および添加される塩などの任意の水溶性物質を含む、水相(連続相)からなる。二相は、例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤;アカシアコロイド状粘土、蜂の巣(beegum)などの親水性コロイドである乳化剤の使用により安定化される。エマルジョンの形成に際して、活性成分は所望される濃度で添加される。
ゲルは、前記のような油性ベース、水、またはエマルジョン懸濁ベースより選択されるベースからなる。ベース中にマトリックスを形成するゲル化剤をベースへ添加すると、粘性が半固体の硬さへ増加する。ゲル化剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーなどである。活性成分は、ゲル化剤の添加に先立つ時点で所望される濃度で製剤へ添加される。
例えば、創傷および血管形成部位である、トロンビンペプチド誘導体を用いて治療し得る疾患および病状はしばしば、痛みおよび感染などの病徴ならびに虚弱を伴う。特定の場合において、この課題に取り組むには、トロンビンペプチド誘導体に加えて1以上のさらなる薬理学的に活性な薬剤を共投与(co-administer)することが有利であるかもしれない。例えば、痛みおよび炎症を処理するには、鎮痛薬または抗炎症剤との共投与が要求され得る。感染を処理するには、抗菌性、抗生物質性または殺菌性薬剤との共投与が要求され得る。
トロンビンペプチド誘導体は固相ペプチド合成（例えばBOCまたはFMOC）法、液相合成、または前述の方法の組み合わせを含む他の適切な技術によって合成され得る。確立され、広く使用されているBOC法およびFMOC法は、Merrifield、J.Am.Chem.Soc.、88:2149、(1963); Meienhofer、Hormonal Proteins and Peptides、C.H.Li編、Academic Press、1983、48〜267;ならびにBarany およびMerrifield、in The Peptide、E.GrossおよびJ. Meienhofer編、Academic Press、New York、1980、3〜285に記載されている。固相ペプチド合成の方法は、Merrifield,R.B.、Science、232:341、(1986); Carpino,L.A.およびHan,G.Y、J. Org. Chem、37:3404、(1972); ならびにGauspohl,H.ら、Synthesis、5:315、(1992)に記載されている。本明細書中においてこれら６つの文献の教示はその全体が参考として援用される。
本発明は以下の実施例によって例証されるが、これはなんら限定を意図するものではない。
実施例１ 創傷閉鎖の促進におけるTP508-ALAの生物学的活性
方法および研究計画
TP508の521位のシステイン残基をアラニンに置換したトロンビンペプチド誘導体、TP508-Alaの創傷治癒活性を測定するために以下の実験を行った。
雄スプレイグーダウリー(Sprague-Dawley)ラットの背部の二箇所を充分深く、直径2cmで切開した。所定のラットの双方の創傷を、TP508-Alaを含む食塩水、TP508を含む食塩水(ポジティブコントロール)または食塩水のみ(ネガティブコントロール)のいずれかを用いて処置した。TP508-AlaおよびTP508を創傷1つあたり0.1μgの用量で投与した。創傷のサイズは、創傷後3、7、および10日にアセテートシート上で創傷の周囲長を記録し、各創傷の表面積を計算するためにデジタル分析を用いて測定した。
合計3つの処置群を生成し、TP508-AlaをTP508コントロールおよび食塩水コントロールと比較した。各群には6匹のラットが含まれる。結果から、トロンビンペプチド誘導体、TP508-Alaは、創傷閉鎖の促進において生物学的に活性であることが示唆された。
処置溶液の調製
約1mgの凍結乾燥したTP508を食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)1mL中に溶解した。該実験において、食塩水をビヒクルとして使用した。TP508のストック溶液(1mg/mL)をさらにビヒクル中に希釈し、2.5μg/mL のワーキング溶液を生じた。ワーキング溶液は、実験の間ずっと氷上で保持した。
約1mgのTP508-Alaを食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)1mL中に溶解した。TP508-Alaのストック溶液(1mg/mL)をさらに食塩水中に希釈し、2.5μg/mL のワーキング溶液を生じた。ワーキング溶液は、実験の間ずっと氷上で保持した。
創傷処置
所定の動物の双方の創傷に同じ処置：食塩水のみ、TP508含有食塩水(2.5μg/mL)、またはTP508-Ala含有食塩水(2.5μg/mL)を含む40μL容量の単回、局所適用を施した。
観察および創傷サイズ分析
ラットを創傷後10日間観察したが、異常行動、感染または毒性の臨床徴候は見られなかった。創傷後3、7、および10日に柔軟なアセテートシート上で創傷の周囲長を記録し、次にデジタル分析ソフトウェアを用いて創傷面積を測定することにより創傷を評価した。
結果を図１に示す。図１は創傷後7日および10日の創傷面積測定値を示す。創傷後3日では群間に創傷サイズの違いは無かった。各データポイントは、ラット6匹由来の創傷12個の平均および平均の標準誤差を表す。群間の統計学上の比較を分散の反復測定分析(a repeated measures analysis of variance)を用いて行った;群間の事後的検定(post hoc testing)にはフィッシャーの最小有意差法を用いた。
創傷後7日において、0.1μg用量で、TP508で処置された創傷面積がコントロールより20.3％小さい一方で、TP508-Alaで処置された創傷面積はコントロールより18.7％小さかった。10日目で同じ傾向が観察された。創傷後10日において、0.1μg用量で、TP508で処置された創傷面積がコントロールより34.５％小さい一方で、TP508-Alaで処置された創傷面積はコントロールより25.１％小さかった。これらのデータは、創傷治癒促進の効力および効能においてTP508-AlaがTP508と等価であることを示唆している。
実施例２ 創傷閉鎖の促進におけるTP508-SERの生物学的活性
方法および研究計画
TP508の521位のシステイン残基をセリンに置換したトロンビンペプチド誘導体、TP508-Serの創傷治癒活性を測定するために以下の実験を行った。
雄スプレイグーダウリーラットの背部の二箇所を充分深く、直径2cmで切開した。所定のラットの双方の創傷を、TP508-Serを含む食塩水、TP508を含む食塩水(ポジティブコントロール)または食塩水のみ(ネガティブコントロール)のいずれかを用いて処置した。TP508-SerおよびTP508を創傷1つあたり0.1μgの用量で投与した。創傷のサイズは、創傷後3、7、および10日にアセテートシート上で創傷の周囲長を記録し、各創傷の表面積を計算するためにデジタル分析を用いて測定した。
合計3つの処置群を生成し、TP508-SerをTP508コントロールおよび食塩水コントロールと比較した。各群には8匹のラットが含まれる。結果から、トロンビンペプチド誘導体、TP508-Serは、創傷閉鎖の促進において生物学的に活性であることが示唆された。
処置溶液の調製
約1mgの凍結乾燥したTP508を食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)1mL中に溶解した。該実験において、食塩水をビヒクルとして使用した。TP508のストック溶液(1mg/mL)をさらにビヒクル中に希釈し、2.5μg/mL のワーキング溶液を生じた。ワーキング溶液は、実験の間ずっと氷上で保持した。
約1mgのTP508-Serを食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)1mL中に溶解した。TP508-Serのストック溶液(1mg/mL)をさらに食塩水中に希釈し、2.5μg/mL のワーキング溶液を生じた。ワーキング溶液は、実験の間ずっと氷上で保持した。
創傷処置
所定の動物の双方の創傷に同じ処置：食塩水のみ、TP508含有食塩水(2.5μg/mL)、またはTP508-Ser含有食塩水(2.5μg/mL)を含む40μL容量の単回、局所適用を施した。
観察および創傷サイズ分析
ラットを創傷後10日間観察したが、異常行動、感染または毒性の臨床徴候は見られなかった。創傷後3、7、および10日に柔軟なアセテートシート上で創傷の周囲長を記録し、次にデジタル分析ソフトウェアを用いて創傷面積を測定することにより創傷を評価した。
結果を図２に示す。図２は創傷後7日および10日の創傷面積測定値を示す。創傷後3日では群間に創傷サイズの違いは無かった。各データポイントは、ラット8匹由来の創傷16個の平均および平均の標準誤差を表す。群間の統計学上の比較を分散の反復測定分析を用いて行った;群間の事後的検定にはフィッシャーの最小有意差法を用いた。
創傷後7日までに、0.1μg用量で、創傷面積がTP508-Serによって18.2％、TP508によって16.7％縮小した。10日目において同じ傾向が観察され、0.1μg用量で、創傷面積がTP508-Serによって43.3％、TP508によって27.0％縮小した。これらのデータは、創傷治癒促進の効力および効能においてTP508-SerがTP508と等価であることを示唆している。
実施例３ TP508-ダイマー形成
TP508を食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)中に5mg/mLで溶解し、4℃でインキュベートした。6ヵ月に渡って、溶液から時々三連のサンプルを採取した。TP508-モノマー、TP508-ダイマーおよび未同定物質(unknown)を分離するためにHPLCによってサンプルを分析した。
各HPLCピークの面積パーセントを図３に表示した。ピーク面積パーセントは、溶液中における物質のパーセントに直接対応する。TP508-ダイマーのピーク面積が経時的に増加するのに対して、TP508-モノマーのピーク面積は経時的に減少する。未同定ピーク(unknown peak)では増加は見られなかった。図３の結果は、TP508が経時的にダイマーに変換することを示す。
実施例４ TP508-ALAの安定性
TP508
TP508を食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)中に5mg/mLで溶解し、4℃でインキュベートした。1ヵ月に渡って、溶液から時々三連のサンプルを採取した。TP508-モノマー、TP508-ダイマーおよび未同定物質を分離するためにHPLCによってサンプルを分析した。各HPLCピークの面積パーセントを図４に表示した。ピーク面積パーセントは、溶液中における物質のパーセントに直接対応する。TP508-ダイマーのピーク面積が経時的に増加するのに対して、TP508-モノマーのピーク面積は経時的に減少する。未同定ピークでは増加は見られなかった。図４の結果は、TP508が経時的にダイマーに変換することを示す。
TP508-Ala
TP508-Alaを食塩水(滅菌した0.9％塩化ナトリウム注射可能溶液)中に5mg/mLで溶解し、4℃でインキュベートした。1ヵ月に渡って、溶液から時々三連のサンプルを採取した。TP508-Alaおよび未同定物質を分離するためにHPLCによってサンプルを分析した。各HPLCピークの面積パーセントを図５に表示した。ピーク面積パーセントは、溶液中における物質のパーセントに直接対応する。TP508-Alaのピーク面積は、経時的に減少しなかった。未同定ピークでは増加は見られなかった。この結果からTP508-Alaがダイマーに変換しないことが示される。
本発明は、その好ましい態様が参考文献と共に詳細に示され、記載されているが、ここで形式および詳細部分における種々の変化が、添付された特許請求の面積により包含される本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者によって理解されよう。
図１は、トロンビンペプチド誘導体、TP508-Ala、の創傷治癒活性がTP508のそれと類似していること示すグラフである。グラフは、創傷後7日および10日の雄スプレイグーダウリーラットの背部の創傷面積測定値(mm2で示される)を示す。食塩水のコントロールは「ビヒクル」として示され、TP508コントロールは「TP508」として示され、トロンビンペプチド誘導体TP508-Alaは「TP508-Ala」として示される。 図２は、トロンビンペプチド誘導体、TP508-Ser、の創傷治癒活性がTP508のそれと類似していること示すグラフである。グラフは、創傷後7日および10日の雄スプレイグーダウリーラットの背部の創傷面積測定値(mm2で示される)を示す。食塩水のコントロールは「ビヒクル」として示され、TP508コントロールは「TP508」として示され、トロンビンペプチド誘導体TP508-Serは「TP508-Ser」として示される。 図３は、TP508のダイマーへの経時的な変換を示すグラフである。グラフは、6ヶ月に渡って時々採取されたTP508食塩水溶液の試料(5mg/mL、4℃でインキュベートされた)中に見出されたTP508-モノマー、TP508-ダイマーおよび未同定物質のHPLCピーク面積測定値を示す。ピーク面積はパーセントとして示される。時間は日として示される。モノマーは(−●−)として示される。ダイマーは(…○…)として示される。未同定物質は(--▼--)として示される。 図４は、TP508のダイマーへの経時的な変換を示すグラフである。グラフは、1ヶ月に渡って時々採取されたTP508食塩水溶液の試料(5mg/mL、4℃でインキュベートされた)中に見出されたTP508-モノマー、TP508-ダイマーおよび未同定物質のHPLCピーク面積測定値を示す。ピーク面積はパーセントとして示される。時間は日として示される。モノマーは(−●−)として示される。ダイマーは(…○…)として示される。未同定物質は(--▼--)として示される。 図５は、TP508-Alaがダイマーへ変換しないことを示すグラフである。グラフは、1ヶ月に渡って時々採取されたTP508-Ala食塩水溶液の試料(5mg/mL、4℃でインキュベートされた)中に見出されたTP508-Alaおよび未同定物質のHPLCピーク面積測定値を示す。ピーク面積はパーセントとして示される。時間は日として示される。TP508-Alaは(−●−)として示される。未同定物質は(…○…)として示される。

Claims (51)

  1. 配列番号：２のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）からなるポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ−末端切断フラグメントを含むトロンビンペプチド誘導体であって、ここで、ペプチド中の０、１、２、または３個のアミノ酸は配列番号：２の対応する位置と異なり、ただしＸａａはアラニン、グリシン、セリン、またはＳ−保護システインであり；該トロンビンペプチド誘導体は任意にＣ−末端アミドを含み；該トロンビンペプチド誘導体は任意にアシル化Ｎ−末端を含む、トロンビンペプチド誘導体。
  2. 約１２〜約２３個のアミノ酸からなる請求項１記載のトロンビンペプチド誘導体。
  3. Ｃ−末端アミドを含み、任意にアシル化Ｎ−末端を含む請求項２記載のトロンビンペプチド誘導体であって、ここでＣ−末端アミドは−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ（式中、ＲｂおよびＲｃは独立して水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲｂおよびＲｃは、それらが結合している窒素と共にＣ１〜Ｃ１０非芳香族複素環基を形成する）で表され、Ｎ−末端アシル基は、ＲｄＣ（Ｏ）−（式中、Ｒｄは水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＣ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である）で表される、トロンビンペプチド誘導体。
  4. 非置換であるＮ−末端および非置換であるＣ−末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表されるＣ−末端アミドを含む、請求項３記載のトロンビンペプチド誘導体。
  5. 配列番号：２のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）からなるポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ−末端切断フラグメントを含み、ただし該ポリペプチド中の０、１、または２個のアミノ酸が配列番号：２中の対応するアミノ酸の保存的置換である、請求項４記載のトロンビンペプチド誘導体。
  6. Ｘａａがアラニンである請求項５記載のトロンビンペプチド誘導体。
  7. 配列番号：４のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ、ここでＸ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）からなるポリペプチドを含む請求項４記載のトロンビンペプチド誘導体。
  8. アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：５）、または配列番号：５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを有し、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、または２個のアミノ酸が配列番号：５の対応する位置のアミノ酸と異なる、請求項４記載のトロンビンペプチド誘導体。
  9. アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：５）、または配列番号：５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを有し、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、または２個のアミノ酸が配列番号：５の対応する位置のアミノ酸の保存的置換である、請求項４記載のトロンビンペプチド誘導体。
  10. アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｒ１（配列番号：６）、ここでＸ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）、または配列番号：６のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを有し、ここで、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり；Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨ２である、トロンビンペプチド誘導体。
  11. Ｘａａがアラニンである請求項１０記載のトロンビンペプチド誘導体。
  12. アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｒ１（配列番号：６）を有するトロンビンペプチド誘導体であって、ここで、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり；Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨ２である、トロンビンペプチド誘導体。
  13. Ｘａａがアラニンである請求項１２記載のトロンビンペプチド誘導体。
  14. Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである請求項１２記載のトロンビンペプチド誘導体。
  15. アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：８）からなるトロンビンペプチド誘導体。
  16. 約１２〜約３３個のアミノ酸を有する請求項１記載のトロンビンペプチド誘導体。
  17. Ｃ−末端アミドを含み、任意にアシル化Ｎ−末端を含む請求項１６記載のトロンビンペプチド誘導体であって、ここでＣ−末端アミドは−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ（式中、ＲｂおよびＲｃは独立して水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲｂおよびＲｃは、それらが結合している窒素と共にＣ１〜Ｃ１０非芳香族複素環基を形成する）で表され、Ｎ−末端アシル基は、ＲｄＣ（Ｏ）−（式中、Ｒｄは水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＣ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である）で表される、トロンビンペプチド誘導体。
  18. 非置換であるＮ−末端および非置換であるＣ−末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表されるＣ−末端アミドを含む、請求項１７記載のトロンビンペプチド誘導体。
  19. アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：９）、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを有する請求項１８記載のトロンビンペプチド誘導体であって、ここでＸａａおよびＸｂｂは独立してアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、２、３個のアミノ酸は配列番号：９中の対応するアミノ酸と異なる、トロンビンペプチド誘導体。
  20. アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：９）、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを有する請求項１８記載のトロンビンペプチド誘導体であって、ここでＸａａおよびＸｂｂは独立してアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、または２個のアミノ酸は配列番号：９中の対応するアミノ酸の保存的置換である、トロンビンペプチド誘導体。
  21. アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：９）、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを有し、ここでＸａａおよびＸｂｂは独立してアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインである、請求項１８記載のトロンビンペプチド誘導体。
  22. ＸａａおよびＸｂｂがアラニンである請求項２１記載のトロンビンペプチド誘導体。
  23. トロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療する方法であって、配列番号：２のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）からなるポリペプチドまたは少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ−末端切断フラグメントを含むトロンビンペプチド誘導体の有効量を投与することを含み、ここでＸａａはアラニン、グリシン、セリン、またはＳ−保護システインであり、ただし該ポリペプチド中の０、１、２、または３個のアミノ酸は配列番号：２の対応する位置と異なり；該トロンビンペプチド誘導体は任意にＣ−末端アミドを含み；該トロンビンペプチド誘導体は任意にアシル化Ｎ−末端を含む、方法。
  24. 被験体が心臓修復を促進するための治療を必要とする請求項２３記載の方法。
  25. 被験体が軟骨成長または修復を促進するための治療を必要とする請求項２３記載の方法。
  26. 被験体が骨成長を必要とする請求項２３記載の方法。
  27. 前記部位が骨移植を必要とする請求項２６記載の方法。
  28. 前記部位が単純骨折、骨の分節間隙、骨空隙、または非癒合骨折である請求項２６記載の方法。
  29. 被験体が創傷の治癒を促進するための治療を必要とする請求項２３記載の方法。
  30. 被験体が再狭窄を抑制するための治療を必要とする請求項２３記載の方法。
  31. トロンビンペプチド誘導体が約１２〜約２３個のアミノ酸を有する請求項２３記載の方法。
  32. トロンビンペプチド誘導体がＣ−末端アミドを含み、任意にアシル化Ｎ−末端を含む請求項３１記載の方法であって、Ｃ−末端アミドは−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ（式中、ＲｂおよびＲｃは独立して水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲｂおよびＲｃは、それらが結合している窒素と共にＣ１〜Ｃ１０非芳香族複素環基を形成する）で表され、Ｎ−末端アシル基は、ＲｄＣ（Ｏ）−（式中、Ｒｄは水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＣ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である）で表される、方法。
  33. トロンビンペプチド誘導体が非置換であるＮ−末端および非置換であるＣ−末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表されるＣ−末端アミドを含む、請求項３２記載の方法。
  34. トロンビンペプチド誘導体が配列番号：２のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）からなるポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ−末端切断フラグメントを含み、ただし該ポリペプチド中の０、１、または２個のアミノ酸が配列番号：２中の対応するアミノ酸の保存的置換である、請求項３３記載の方法。
  35. Ｘａａがアラニンである請求項３４記載の方法。
  36. トロンビンペプチド誘導体が、配列番号：４のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ、ここでＸ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）からなるポリペプチドを含む、請求項３３記載の方法。
  37. トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：５）、または配列番号：５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを有し、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、２または３個のアミノ酸が配列番号：５の対応する位置のアミノ酸と異なる、請求項３３記載の方法。
  38. トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：５）、または配列番号：５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを有し、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、または２個のアミノ酸が配列番号：５の対応する位置のアミノ酸の保存的置換である、請求項３３記載の方法。
  39. トロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療する方法であって、アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｒ１（配列番号：６）、ここでＸ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）または配列番号：６のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを有するトロンビンペプチド誘導体の有効量を投与することを含み、Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨ２である、方法。
  40. Ｘａａがアラニンである請求項３９記載の方法。
  41. トロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療する方法であって、アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｒ１（配列番号：６）を有するトロンビンペプチド誘導体の有効量を投与することを含み、ここでＸ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり；Ｒ１は−ＯＨおよび−ＮＨ２である、方法。
  42. Ｘａａがアラニンである請求項４１記載の方法。
  43. Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである請求項４１記載の方法。
  44. アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：８）を有するトロンビンペプチド誘導体の有効量を投与することを含む、トロンビンレセプターアゴニストを用いた治療を必要とする被験体を治療する方法。
  45. トロンビンペプチド誘導体が約１２〜約３３個のアミノ酸からなる請求項２３記載の方法。
  46. トロンビンペプチド誘導体がＣ−末端アミドを含み、任意にアシル化Ｎ−末端を含む請求項４５記載の方法であって、ここでＣ−末端アミドは−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ（式中、ＲｂおよびＲｃは独立して水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲｂおよびＲｃは、それらが結合している窒素と共にＣ１〜Ｃ１０非芳香族複素環基を形成する）で表され、Ｎ−末端アシル基は、ＲｄＣ（Ｏ）−（式中、Ｒｄは水素、Ｃ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＣ１〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である）で表される、方法。
  47. トロンビンペプチド誘導体が非置換であるＮ−末端および非置換であるＣ−末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表されるＣ−末端アミドを含む、請求項４６記載の方法。
  48. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：９）、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを有する請求項４７記載の方法であって、ここでＸａａおよびＸｂｂは独立してアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、２、３個のアミノ酸は配列番号：９中の対応するアミノ酸と異なる、方法。
  49. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：９）、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを有する請求項４７記載の方法であって、ここでＸａａおよびＸｂｂは独立してアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインであり、ただし該トロンビンペプチド誘導体中の０、１、または２個のアミノ酸は配列番号：９中の対応するアミノ酸の保存的置換である、方法。
  50. トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：９）、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを有し、ここでＸａａおよびＸｂｂは独立してアラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインである、請求項４７記載の方法。
  51. ＸａａおよびＸｂｂがアラニンである請求項５０記載の方法。
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