JP2006510373A - 細菌における形質の並列染色体スタッキング - Google Patents

Abstract

本発明は、ファージ形質導入システムを使用する、組み換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）宿主における形質のスタッキング方法を説明する。該方法は、遺伝因子の挿入および形質のスタッキングのために、宿主 染色体上の特異的部位と相同性を有する核酸組み込みカセットを使用する。該方法の繰り返しは、１つの遺伝因子上に、形質がスタッキングされる結果となる。

Description

関連出願との関係

本出願は、２００２年１２月１９日出願の米国仮出願第６０／４３４，７７３号の利益を主張する。

本発明は、微生物学の分野である。さらに具体的には、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ染色体操作と関係がある方法に関する。

発明の背景
完全な細菌ゲノム配列を入手でき、また代謝経路が解明された結果、微生物が産業上重要な化合物を産生するように操作するために、このような知識が使用されるに至った。微生物の産業用化合物の産生には、該生物の、ゲノムに対する変更を効率よく操作できることが必要である。変更操作たとえば遺伝因子の付加、除去、または修飾は、多くの場合、骨が折れ、また多くの時間を要する課題であった。１つのこのような修飾は、代謝経路における関連遺伝子の発現に対する、遺伝子工学的調節である。

遺伝子発現を調節するための、様々な方法がある。微生物代謝工学は、一般に、強力なプロモーターまたは条件プロモーターの制御下にある当該遺伝子を発現させるために、マルチコピーベクターを使用することを含む。工業的使用のための代謝工学のこの方法は、幾つかの欠点を有する。分離不安定性（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）のため、該ベクターを維持することが困難な場合がある。ベクター負荷（ｖｅｃｔｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）に起因する、細胞の生存能力および増殖に対する悪影響がしばしば認められる。ベクター上の所望の遺伝子の最適発現レベルを調節することもまた困難である。マルチコピーベクターを使用することの望ましくない影響を回避するために、バクテリオファージλ、トランスポゾン、または当該遺伝子を含む他の適当なベクターの単挿入による、相同組み換えを使用する一般手法が使用されてきた。しかし、この方法もまた、組み換えの前に、当該遺伝子を適当なベクターに入れるために、多数のクローニング工程を必要とする等の欠点を有する。もう１つの欠点は、挿入された遺伝子と関連した不安定性であり、これは、切除により失くすことができる。最後に、これらの方法には、多数の挿入および染色体上の挿入部位の位置を制御できないことと関連した制限がある。

以前の方法は、染色体に多数のＤＮＡ修飾を加えるために開発されたが、これらは、ランダムに組み込まれ、また当該遺伝子を挿入するためには多数のクローニング工程を必要とするトランスポゾン（非特許文献１）か、またはやはり多数のクローニング工程を必要とするベクター（特許文献１）を使用し、全遺伝子またはプロモーター配列の挿入、欠失、および組み込まれたトランスポゾンを含む、全てのタイプの染色体修飾に適用できるわけではなかった。さらに、染色体に指定された修飾を加えるための組合せ手法とは対照的に、これらの方法は、系統的手法を利用して、未定義の遺伝子座に多数の変更を加えてきた。

国際公開第０１／１８２２２号パンフレット パーデルチャク（Ｐｅｒｄｅｌｃｈｕｋ），Ｍ．Ｙ．およびベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ），Ｇ．Ｎ．、１９９７年、Ｇｅｎｅ、１８７：２３１−２３８

したがって、解決すべき問題は、細菌、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における最適レベルの産物形成への到達を促進する様式で、１菌株で、任意の数の染色体操作方法によって引き起こされる、染色体の修飾を容易に組み合せる方法および材料を明確にすることである。本発明は、直線的、段階的、および並列組み合わせ様式で、染色体の変化を組み合せるために、Ｐ１形質導入および部位特異的リコンビナーゼ仲介マーカー切除を使用する方法を提供することにより、この問題を解決した。本方法は、生合成経路最適化と関連した、容易でかつ能率的なｉｎ ｖｉｖｏ染色体操作を可能にする。

本方法は、標的ｉｎ ｖｉｖｏ染色体操作によって、生合成経路をデザインし直し、代謝フラックスを最適化し、新規な経路を創出するのに有用な遺伝学的ツールである。該方法は、相同的組み換えシステムを使用して、組み込みカセットを組み換え堪能宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）の染色体に導入し、次にファージ形質導入システムを使用して、多数の組み込みカセットを、並列組み合わせ様式で、１つの宿主細胞に移動させる。染色体の修飾を設計するために使用される「組み込みカセット」は、プロモーターおよび／または遺伝子、および部位特異的リコンビナーゼ配列に挟まれた選択マーカーを包含する。最適化された形質導入体の選択後、部位特異的リコンビナーゼを担持するヘルパープラスミドを細胞に導入して、部位特異的リコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカーを切除する。該方法の繰り返しは、生合成経路最適化に必要な、組み合わせ（多重遺伝子）形質スタッキングを容易にする。

該方法を使用して、生合成経路の特注設計において、プロモーターのほかにも、様々な遺伝因子を操作することができる。該手法は、特定の一遺伝子の単なる高発現というよりむしろ、工業的に有用な微生物菌株を構築するのに適当である。代謝バランス、生産性、制御、安定性、およびある特定の経路の遺伝子の最適発現に関して、該手法は、組み換えベクター手法のみに基づく代謝工学と比較するとき、多くの利点および利益を有する。例として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して、本方法を説明するが、本方法は、他の細菌株でも有用なことが分かるはずである。

本方法は、所望の遺伝子最終産物の最適産生のための、迅速な染色体の形質スタッキングを可能にする。多数の染色体修飾を容易にする方法は、工業目的で生合成経路を操作するときに不可欠である。細菌の生合成経路の操作における、本方法の有用性は、イソプレノイド生合成およびカロテノイド生合成を変えることにより実証される。イソプレノイド経路に含まれる律速酵素をコードする重要な遺伝子のプロモーター（図１）を、新規な方法で操作した。本発明によって遂行される遺伝子修飾は、結果としてβ−カロテン産生増加をもたらした。

したがって、本発明は、
ａ）（ｉ）核酸組み込み断片、
（ｉｉ）リコンビナーゼに敏感に反応する特異的リコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカー、
（ｉｉｉ）ドナー細胞染色体の異なる部分と相同性を有するホモロジーアーム、
を含んでなる、多数の組み込みカセットを提供し、
ｂ）少なくとも１つのドナー細胞を、その染色体の組み込みのために（ａ）の組み込みカセットで形質転換し、
ｃ）（ｂ）の形質転換されたドナー細胞を、ファージに感染させ、ここで該ファージは複製し、該ドナー細胞は溶解され、
ｄ）（ｃ）のドナー細胞の溶解によって放出されたファージを単離し、
ｅ）（ａ）の異なる組み込みカセットを担持する（ｃ）のドナー細胞の溶解によって放
出された、単離されたファージを混合し、
ｆ）受容細胞を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで組み込みカセットはそれぞれ、ホモロジーアームと相同な位置で受容細胞染色体に組み込まれて、形質導入された受容細胞を生じ、
ｇ）形質導入された受容細胞を、選択可能マーカーに基づいて、選択し、
ｈ）第１の過剰生産菌株を同定するために、遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｇ）の受容細胞をスクリーニングし、
ｉ）該染色体に組み込まれた組み込みカセットから選択可能マーカーを切除する、（ｈ）の第１の過剰生産菌株におけるリコンビナーゼを活性化し、
ｊ）（ｉ）の第１の過剰生産菌株を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで各組み込みカセットは、ホモロジーアーム上の相同点で受容細胞染色体に組み込まれ、
ｋ）第２の過剰生産菌株を同定するために、遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｊ）の感染した第１の過剰生産菌株をスクリーニングし、そして
ｌ）第１および第２の過剰生産菌株により産生された遺伝子最終産物のレベルを比較し、それによって遺伝子最終産物の産生が最適化されることを含んでなる、遺伝子最終産物の産生を最適化する方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、
ａ）（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）リコンビナーゼに敏感に反応する特異的リコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカー、
（ｉｉｉ）Ｐ１ドナー細胞染色体の異なる部分と相同な領域、
を含んでなる、多数の組み込みカセットを提供し、
ｂ）少なくとも１つのドナー細胞を、その染色体の組み込みのために（ａ）の組み込みカセットで形質転換し、
ｃ）（ｂ）の形質転換されたドナー細胞を、Ｐ１ファージに感染させ、ここで該ファージは複製し、該ドナー細胞は溶解され、
ｄ）（ｃ）のドナー細胞の溶解によって放出されたファージを単離する工程；
ｅ）（ａ）の異なる組み込みカセットを担持する（ｃ）の一組のドナー細胞の溶解によって放出された、同数の単離ファージを混合し、
ｆ）受容細胞を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで組み込みカセットはそれぞれ、ホモロジーアームと相同な位置で受容細胞染色体に組み込まれ、
ｇ）形質導入された受容細胞を、選択可能マーカーに基づいて選択し、
ｈ）第１の過剰生産菌株を同定するために、遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｆ）の受容細胞をスクリーニングし、
ｉ）該染色体に組み込まれた組み込みカセットから選択可能マーカーを切除する（ｈ）の第１の過剰生産菌株におけるリコンビナーゼを活性化し、
ｊ）（ｉ）の第１の過剰生産菌株を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで各組み込みカセットは、ホモロジーアーム上の相同点で受容細胞染色体に組み込まれ、
ｋ）第２の過剰生産菌株を同定するために、遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｊ）の感染した第１の過剰生産菌株をスクリーニングし、そして
ｌ）第１および第２の過剰生産菌株により産生された遺伝子最終産物のレベルを比較し、それによって遺伝子最終産物の産生が最適化され、
を含んでなる、遺伝子最終産物の産生を最適化する方法を提供する。

生物学的寄託
下記の生物学的寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の条項に従って行われてきた。

本明細書で使用されるとき、「ＡＴＣＣ」は、米国２０１１０−２２０９ バージニア州マナッサス・ユニバーシティ・ブルーバード１０８０１（１０８０１，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）のＡＴＣＣにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション国際寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を指す。「国際寄託名称（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ」は、ＡＴＣＣに寄託した際の該培養への受入番号である。

リストに記載されている寄託物は、表示された国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許が付与された時に、一般に公開される。政府の措置によって付与される特許権の特例で、寄託物の利用可能性は、主題の発明を実施する許諾の構成要素とならない。

下記の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の必要条件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」に従い、また、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ））基準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴ（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則の２０８条および付則Ｃ）の配列リスト必要条件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される符号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の法則に従う。

配列番号１〜１２は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）カロテノイド遺伝子群由来の遺伝子をコードする核酸およびアミノ酸配列である。

配列番号１３〜３２は、組み込み断片を創出するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。

配列番号３３〜３４は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来のカロテノイド遺伝子群を増幅するためにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーである。

配列番号３５〜３９は、染色体に組み込まれた断片の存在についてスクリーニングするために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。

配列番号４０は、プラスミドｐＰＣＢ１５のヌクレオチド配列である。

配列番号４１は、プラスミドｐＫＤ４６のヌクレオチド配列である。

配列番号４２は、プラスミドｐＳＵＨ５のヌクレオチド配列である。

配列番号４３は、バクテリオファージＴ５プロモーター「Ｐ_Ｔ５」のヌクレオチド配列である。

本発明は、本出願の一部を形成する、下記の詳細な説明および添付の配列記述から、さらに十分に理解することができる。

本発明は、所望の遺伝子最終産物の産生を最適化するために、微生物内に多数の染色体修飾を効率よく組み合わせる方法を提供する。該方法は、生合成経路と関係があることが分かっている個々の遺伝子に対する、染色体により操作する変更から始まる。この第１工程は、λ−Ｒｅｄ仲介相同的組み換えを使用して、天然遺伝子プロモーターを、強力なファージＴ５プロモーター（Ｐ_Ｔ５）と置換することにより、イソプレノイド生合成経路における遺伝子に対する変更を、染色体により操作することによって実証される。

λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムは、標的組み込み部位と相同の短い領域（１０〜１００塩基対）（「ホモロジーアーム」）を有する線状ＤＮＡ断片を使用して、能率的な相同的組み換えを容易にする。染色体の修飾を操作するために使用される、該組み込み断片は、「組み込みカセット」と呼ばれ、プロモーターおよび／または遺伝子、および部位特異的リコンビナーゼ配列に挟まれた選択マーカーを含む。形質転換体は、選択可能マーカーの組み込みにより、同定される。

好ましい実施形態では、該バクテリオファージＰ１形質導入システムが使用される。従来のＰ１形質導入は、遺伝形質（すなわち遺伝子）を一度に１つだけ、ある宿主から別の宿主に移動させることができる。本発明は、選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼと組み合せて、プールしたバクテリオファージＰ１混合物を使用して、並列組み合わせ様式で、多数の遺伝形質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に移動させる方法を提供する（図２）。

図２を参照すると、様々な形質転換体（ドナー細胞）を、ファージＰ１に感染させる。結果として生じる、様々な個々の形質転換体から作られるＰ１溶解産物を、混合する。組み込み断片を、ファージ粒子内にランダムに入れ、これを、次に、通常はドナー細胞と同じ種の、受容細胞を感染させるのに使用する。形質導入および相同的組み換えが起こり、予め修飾されたプロモーターおよび／または遺伝子の様々な染色体組み込みを含むコロニーを生じさせる。抗生物質耐性について、形質導入された受容細胞をスクリーニングし、また所望の遺伝子最終産物の産生増加について分析する。最適化された形質導入体の選択後、抗生物質耐性マーカーを部位特異的リコンビナーゼで除去する。選択された形質導入体は、多数の染色体修飾を操作し、所望の遺伝子最終産物の産生を最適化するために、Ｐ１形質導入のさらなるラウンドで、受容細胞として再度使用することができる。

本開示では、多数の用語および略語が使用される。下記の定義を提供する。

用語「遺伝子最終産物」は、遺伝子産物の働きの結果として産生される、物質、化学物質または材料を意味する。一般に、遺伝子産物は、酵素であり、遺伝子最終産物は、特定の基質に対するその酵素活性の産物である。遺伝子最終産物は、単一の酵素活性の結果であってもよく、または多数の連関活性（すなわち酵素経路）の結果であってもよい。

用語「スタッキング」、「形質のスタッキング」、「並列染色体のスタッキング」、お
よび「形質スタッキング」は、同義的に使用され、選択マーカーを除去するための該部位特異的リコンビナーゼシステムと組合せて、バクテリオファージＰ１形質導入を使用して、多数の遺伝形質を１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に並列でスタッキングする反復処理を指す（図２）。

用語「並列組み合わせ様式」は、多数の遺伝形質を、並列で受容細胞に移動させることができるように、様々な遺伝形質を含む様々なドナー細胞から作られた、Ｐ１溶解産物混合物を用いたＰ１形質導入を指す。

用語「組み込みカセット」は、組み換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細菌宿主の形質転換に有用な線状核酸構築物を指す。本発明の組み込みカセットは、様々な遺伝因子たとえば選択可能マーカー、発現可能ＤＮＡ断片、および細菌染色体上または他の組み込みカセット上の領域と相同性を有する組み換え領域を含んでもよい。本発明の脈絡の中で、それぞれ、細菌染色体領域の一部に相同な１つの領域すなわち「ホモロジーアーム」を有する、一般に２つの組み込みカセットが、組み込みに使用される。

用語「発現可能ＤＮＡ断片」は、宿主細胞における表現型の変化に影響するあらゆるＤＮＡを意味する。「発現可能ＤＮＡ断片」は、たとえば、制御因子、単離プロモーター、オープンリーディングフレーム、遺伝子、またはそれらの組合せを含んでなるＤＮＡを含んでもよい。

用語「ホモロジーアーム」は、および「組み換え領域」は同義的に使用され、２つの異なる核酸のある特定の領域に、実質的に同じヌクレオチド配列を有する２つの核酸間の相同的組み換えを可能にするヌクレオチド配列を指す。該ホモロジーアームのヌクレオチド配列の好ましいサイズ範囲は、約１０〜約１００ヌクレオチドであり、約５０ｂｐが好ましい。一般に、ホモロジーアームと染色体上の相同領域との間の塩基同一性（本明細書では、各領域の塩基間の１対１対応と定義する）のレベルは、少なくとも約７０％であり、少なくとも約８０％が好ましく、少なくとも約９０％の同一性が最も好ましい。

用語「部位特異的リコンビナーゼ」は、特定のヌクレオチド配列（組み換え標的部位）を認識し、組み換え標的部位間の組み換えを触媒する、１つもしくはそれ以上の酵素からなる系を記述するために、本発明で使用される。部位特異的組み換えは、外因性ＤＮＡを、再配列、除去、または導入する方法を提供する。部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連組み換え標的部位の例としては、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、Ｒ／ＲＳ、Ｇｉｎ／ｇｉｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔ、ｐＳＲ１システム、ｃｅｒシステム、およびｆｉｍシステムなどが挙げられるが、この限りではない。本発明は、選択可能マーカーを除去するための、部位特異的リコンビナーゼの使用を説明する。ＦＲＴ組み換え標的部位が両側にある、抗生物質耐性マーカーは、ＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼの発現により除去される。

用語「ドナー細胞」は、バクテリオファージまたはウイルスに感染しやすい細菌株を指し、また形質導入性粒子内にパッケージされた核酸断片のソースの役割をする。一般に、ドナー細胞の遺伝子構造は、「受容細胞」と類似しているかまたは全く同じであり、ドナー細胞により産生される、形質導入ファージまたはウイルスを含む溶解産物を受け入れるのに役立つ。本明細書で使用されるとき、「Ｐ１ドナー細胞」は、Ｐ１バクテリオファージに感染しやすい細菌株である。

用語「受容細胞」は、バクテリオファージまたはウイルスに感染しやすい細菌株を指し、またドナー細胞により産生される、形質導入ファージまたはウイルスを含む溶解産物を
受け入れるのに役立つ。「Ｐ１受容細胞」は、Ｐ１バクテリオファージに感染しやすい細菌株である。

用語「選択可能マーカー」は、存在するとき、ある特定の細胞型を同定して、優先的に増殖させることを可能にする、遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。

用語「組み換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細菌宿主」は、遺伝子工学に有用な率で相同的組み換えができる細菌宿主を記述するために使用される。

用語「相同」は、組み換え領域および細菌染色体上の対応する領域に適用されるとき、同一またはほぼ同一の配列を共有するヌクレオチド配列を意味する。細菌染色体上の領域と組み換え領域との間の相補的配列は、会合することができ、またリコンビナーゼシステム（すなわちλ−Ｒｅｄリコンビナーゼ）の存在下で、相同的組み換えを受ける。

用語「λ−Ｒｅｄ組み換えシステム」、および「λ−Ｒｅｄシステム」は、バクテリオファージλ遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍによりコードされる一組のプラスミド上に存在する酵素群を記述するために同義的に使用される。特に、線状組み込みカセットを使用するとき、該３遺伝子にコードされる酵素は一緒に働いて、比較的低率の相同的組み換えを有すると一般に考えられる生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における相同的組み換えの率を高める。該λ−Ｒｅｄシステムは、線状ｄｓＤＮＡ断片の両側に位置する短い相同領域（１０〜５０ｂｐ）を相同的組み換えに使用できる能力を助長する（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、ＰＮＡＳ、９７：６６４０−６６４５（２０００年））。

本明細書で使用されるとき、用語「上流」（ＤＮＡの領域に関して使用されるとき）は、ある特定の遺伝子またはヌクレオチドの配列の５’側を意味する。

本明細書で使用されるとき、用語「下流」（ＤＮＡの領域に関して使用されるとき）は、ある特定の遺伝子またはヌクレオチドの配列の３’側を意味する。

「オープン・リーディング・フレーム」は、ＯＲＦと省略される。

「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。

本明細書で使用されるとき、「単離された核酸断片」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を場合により含んでもよい、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の、単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントで構成されていてもよい。

「遺伝子」は、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）および後続する制御配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、独自の制御配列と共に自然界で見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界で一緒に見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子ではない遺伝子を指す。本発明は、天然遺伝子のプロモーターと、ファージＴ５（「Ｐ_Ｔ５」）強力プロモーターとの置換を遺伝学的に操作できる能力を例示する。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または同一ソースに由来するが、自然界で見られるのとは異なる方法で配列されている、制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムの
、その自然の位置にある、天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、通常は、宿主生物に見られないが、遺伝子導入により宿主生物に導入される、遺伝子を指す。外来遺伝子は、非生来の生物に挿入された自然の遺伝子、すなわちキメラ遺伝子を含んでなってもよい。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。

細菌ＤＮＡにおける、「オペロン」は、多シストロン性ｍＲＮＡを生じさせる１つのプロモーターから転写される一群の隣接遺伝子群である。

「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適当な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。

「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般的に、コード配列は、３’からプロモーター配列までに位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、たとえ合成のＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型における、または発生の異なる段階における、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に反応して、遺伝子の発現を指令する可能性があることは、当業者に理解されている。異なる環境条件または生理学的条件に応答したときに限って、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの時に、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターは、そられの観察される発現パターンの相対的強さ（すなわち「弱い」、「中程度」、「強い」）によっても、分類することができる。さらに、ほとんどの場合に、制御配列の正確な境界は完全に確定されてはいないため、異なる長さのＤＮＡ断片が、全く同じプロモーター活性を有する可能性があることが認められている。

「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ｍＲＮＡプロセッシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる制御シグナルをコードする配列を含む。

用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方により影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列の関連性を指す。たとえば、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、該コード配列が、該プロモーターの転写調節下にある）とき、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向に、制御配列に作動可能に連結することができる。

用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指すことがある。

「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝に帰着する、核酸断片の、宿主生物のゲノムへの移動を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」、「組み換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。

用語「形質導入」、「普遍形質導入」および「Ｐ１形質導入」は、同義的に使用され、
細菌ＤＮＡを含むファージ粒子によって、細菌ＤＮＡが、一方の細菌細胞（ドナー）から他方（受容体）に移動される現象を指す。

用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、多くの場合、細胞の中枢代謝の部分ではなく、通常は円形の二本鎖ＤＮＡ断片の形をしている遺伝子を担持する染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、多数のヌクレオチド配列が連結されているか、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列とともに細胞に導入することができる独特の構築物に組み換えられている、任意のソースに由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状または円形の、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ該外来遺伝子に加えて、ある特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する、特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ該外来遺伝子に加えて、異質の宿主におけるその遺伝子の発現を増強することが可能なエレメントを有する特異的なベクターを指す。

用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」は、１０炭素テルペノイド類およびそれらの誘導体、たとえばカロテノイド類およびキサントフィル類を含む、イソプレノイド経路に由来する化合物およびあらゆる分子を指す。

用語「Ｄｘｓ」は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸との、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＯＸＰ）への縮合を触媒する、ｄｘｓ遺伝子によりコードされる酵素Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸を指す。

用語「Ｄｘｒ」または「ＩｓｐＣ」は、ＤＯＸＰの、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸への同時還元および異性化を触媒する、ｄｘｒまたはｉｓｐＣ遺伝子によりコードされる酵素ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼを指す。遺伝子の名称、ｄｘｒまたはｉｓｐＣは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称、ＤｘｒまたはＩｓｐＣは、本願では同義的に使用される。

用語「ＹｇｂＰ」または「ＩｓｐＤ」は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸の、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールへのＣＴＰ依存的シチジル化を触媒する、ｙｇｂＢまたはｉｓｐＤ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称、ｙｇｂＰまたはｉｓｐＤは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称、ＹｇｂＰまたはＩｓｐＤは、本願では同義的に使用される。

用語「ＹｃｈＢ」または「ＩｓｐＥ」は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸へのＡＴＰ依存的リン酸化を触媒する、ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＹｃｈＢまたはＩｓｐＥは、本願では同義的に使用される。

用語「ＹｇｂＢ」または「ＩｓｐＦ」は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸へ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートへの、ＣＭＰ損失を伴う環化を触媒する、ｙｂｇＢまたはｉｓｐＦ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称ｙｇｂＢまたはｉｓｐＦは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＹｇｂＢまたはＩｓｐＦは、本願では同義的に使用される。

用語「ＧｃｐＥ」または「ＩｓｐＧ」は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートの、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二
リン酸への変換に関与する、ｇｃｐＥまたはｉｓｐＧ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称ｇｃｐＥまたはｉｓｐＧは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＧｃｐＥまたはＩｓｐＧは、本願では同義的に使用される。

用語「ＬｙｔＢ」または「ＩｓｐＨ」は、ｌｙｔＢまたはｉｓｐＨ遺伝子によりコードされる酵素を指し、また１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸の、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換に関与する。遺伝子の名称ｌｙｔＢまたはｉｓｐＨは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＬｙｔＢまたはＩｓｐＨは、本願では同義的に使用される。

用語「Ｉｄｉ」は、イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換する、ｉｄｉ遺伝子によりコードされる酵素イソペンテニル二リン酸イソメラーゼを指す。

用語「ＩｓｐＡ」は、ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされる酵素ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼを指す。

用語「ＩｓｐＢ」は、ｉｓｐＢ遺伝子によりコードされる、イソプレノイドキノン類の側鎖の前駆物質を供給する、酵素オクタプレニル二リン酸シンターゼを指す（図１）。

用語「ｐＰＣＢ１５」は、発明された方法によって遺伝子操作される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ−カロテン産生をモニターするためのレポータープラスミドとして使用する、β−カロテン合成遺伝子パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む、プラスミド（図６；配列番号４０）を指す。

用語「ｐＫＤ４６」は、３つの必須遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍを含んでなるλ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムを発現するヘルパープラスミドを指す（図５；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲；配列番号４１）。

用語「ｐＣＰ２０」は、ＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドである（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４５５；チェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、Ｇｅｎｅ、１５８：９−１４（１９９５年）；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）。

用語「ｐＳＵＨ５」は、ファージＴ５プロモーター（Ｐ_Ｔ５）領域を、ｐＫＤ４（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングすることにより、本発明で構築されたプラスミド（図４；配列番号４２）を指す。これを、融合カナマイシン選択可能マーカー／ファージＴ５プロモーター線状ＤＮＡヌクレオチドのＰＣＲ増幅用鋳型プラスミドとして使用した。

用語「Ｐ_Ｔ５プロモーター」、「ファージＴ５プロモーター」、および「Ｐ_Ｔ５」は、ファージＴ５由来の−１０および−３５コンセンサス配列、乳糖オペレーター（ｌａｃＯ）、およびリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるヌクレオチド配列を指す（配列番号４３）。

用語「ヘルパープラスミド」は、λ−ＲｅｄリコンビナーゼをコードするｐＫＤ４６またはＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼをコードするｐＣＰ２０（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４５５）のいずれかを指す（チェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、上掲；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）。

用語「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）」は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ｋ−１２誘導体、たとえばＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ ５３３３８）を指す。

用語「パンテア・スチュワーティ亜種スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）」は、「パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）」と略され、エルウィニア・スチュワーティ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）と同義的に使用される（マーガート（Ｍｅｒｇａｅｒｔ）ら、Ｉｎｔ Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、４３：１６２−１７３（１９９３年））。

用語「パンテア・アナタス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔａｓ）」は、エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）と同義的に使用される（マーガート（Ｍｅｒｇａｅｒｔ）ら、上掲）。

用語「パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢ群」は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）ＡＴＣＣ ８１９９から増幅されたカロテノイド合成遺伝子ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む遺伝子群を指す。該遺伝子群は、遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢを含む。該遺伝子群はまた、反対方向に、かつｃｒｔＢ遺伝子に隣接して構築されたｃｒｔＺ遺伝子も含む。

用語「ＣｒｔＥ」は、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸を、ピロリン酸＋ゲラニルゲラニル二リン酸に変換する、ｃｒｔＥ遺伝子によりコードされるゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ酵素を指す。

用語「ＣｒｔＹ」は、リコペンをβ−カロテンに変換する、ｃｒｔＹ遺伝子によりコードされるリコペンサイクラーゼ酵素を指す。

用語「ＣｒｔＩ」は、４つの二重結合を導入することにより、フィトエンを、フィトフルエン、ζ−カロテンおよびニューロスポレンという中間体を経てリコペンに変換する、ｃｒｔＩ遺伝子によりコードされるフィトエンデヒドロゲナーゼ酵素を指す。

用語「ＣｒｔＢ」は、プレフィトエン二リン酸（ゲラニルゲラニルピロリン酸）からフィトエンへの反応を触媒する、ｃｒｔＢ遺伝子によりコードされるフィトエンシンターゼ酵素を指す。

用語「ＣｒｔＸ」は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換する、ｃｒｔＸ遺伝子によりコードされるゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素を指す。

用語「ＣｒｔＺ」は、β−カロテンからゼアキサンチンへのヒドロキシル化反応を触媒する、ｃｒｔＺ遺伝子によりコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素を指す。

用語「イソプレノイド生合成経路」は、図１に示されているような、本発明の上方および／または下方イソプレノイド経路のメンバーを含んでなる遺伝子を指す。本発明において、用語「上方イソプレノイド経路」および「上方経路」は、同義的に使用され、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸の、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への変換に関与する酵素を指す。これらの酵素は、Ｄｘｓ、Ｄｘｒ（ＩｓｐＣ）、ＹｇｐＰ（ＩｓｐＤ）、ＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）、ＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）、ＧｃｐＥ（ＩｓｐＧ）、ＬｙｔＢ（ＩｓｐＨ）、Ｉｄｉ、ＩｓｐＡ、および場合によりＩｓｐＢを含むが、この限り
ではない。本発明において、用語「下方イソプレノイド経路」、「カロテノイド生合成経路」および「下方経路」は、同義的に使用され、ＦＰＰをカロテノイド類、殊にβ−カロテンに変換する酵素を指す（図１）。この経路における酵素は、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＸ、およびＣｒｔＺを含むが、この限りではない。本発明において、「下方経路」遺伝子は、レポータープラスミドｐＰＣＢ１５上に発現される。

用語「カロテノイド生合成酵素」は、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢ群によりコードされるありとあらゆる酵素を指す総称である。該酵素は、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、およびＣｒｔＸを包含する。

用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販されていることもあり、または独立に開発されていることもある。代表的な配列分析ソフトウェアは、ＧＣＧプログラム一式（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０年）、およびＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ）（米国 ５３７１５ ウィスコンシン州セイント・マディソン Ｓ．パーク １２２８の、ＤＮＡスター・インク（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）（１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んだファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日程１９９２年、１１１−１２０、編集者：スハーイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、発行者：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ））を含むが、この限りではない。配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、特に明記されていない限り、分析の結果は、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことは、本願の脈略の中で、理解されるであろう。本明細書で使用されるとき、「デフォルト値」は、最初に初期化するときに、該ソフトウェアを最初にロードする任意の組の値またはパラメーターを意味する。

本明細書で使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルヘイビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．、遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；ならびにアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー・インターサイエンス（
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行（１９８７年）により記述されている。

組み込みカセット
本発明で使用されるとき、「組み込みカセット」は、図３に示されているように、２つのＰＣＲで生成された断片または１つのＰＣＲで生成された断片を使用することにより、相同的組み換えで染色体に組み込まれる線状二本鎖ＤＮＡ断片である。該組み込みカセットは、プロモーターおよび／または発現可能ＤＮＡ断片、および部位特異的リコンビナーゼによく反応するリコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカー、およびドナー細胞染色体の異なると相同性を有するホモロジーアームを含む核酸組み込み断片を含んでなる。一般的に、該組み込みカセットは、一般構造：５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−３’を有し、ここで、
（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜１００塩基の第１のホモロジーアームであり；
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼによく反応する組み換え部位であり；
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択可能マーカーをコードするＤＮＡ断片であり；
（ｉｖ）Ｙは、第１の発現可能ＤＮＡ断片であり；そして
（ｖ）ＲＲ２は、第２のホモロジーアームである。

本発明の発現可能ＤＮＡ断片は、経路の遺伝学的操作で有用なものである。たとえば、本発明の発現可能ＤＮＡ断片は、ある経路で、生来のプロモーターの代わりに強力プロモーターを操作するために有用な可能性がある。ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λＰ_Ｌ、λＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、Ｐ_Ｔ５、およびｔｒｃ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）における発現に有用）ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、およびたとえばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用な様々なファージプロモーターを含むがこの限りではない、実質的にあらゆるプロモーターが、本発明に適する。

一般に、本発明は、それぞれ、染色体の一部と相同な１つの領域すなわちホモロジーアームを有する、少なくとも２つの組み込みカセットを使用する。この形態での２つのカセットの使用は、図３に示されており、本明細書で「２断片法」と呼ばれる。該２断片法は、高率の組み込みをもたらし、さらなるクローニング工程の除去に有用である。

あるいは、既存の生来のプロモーターの下流に、異なるコード領域を導入してもよい。このようにして、標的生合成経路の所望の活性を付加、除去、減少、または強化する、生合成経路のメンバーをコードする新たなコード領域を導入することが可能である。該生合成経路は、宿主細胞にとって外来性または内在性のいずれであってもよい。好ましくは、該生合成経路の１つまたはそれ以上のメンバーが、宿主細胞に既に存在する。これらのコード領域は、それらの生来のプロモーターを保持する遺伝子であってもよく、標的生合成経路における該遺伝子の発現増強のために、誘導可能な強力プロモーターまたは構成的な強力プロモーターに作動可能に連結されたキメラ遺伝子であってもよい。本発明で好ましいのは、イソプレノイドおよび／またはカロテノイド生合成経路の遺伝子であり、上で定義され、また図１に示されているような、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｙｇｂＰ、ｙｃｈＢ、ｙｇｂＢ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡ、ｌｙｔＢ、ｇｃｐＥ、ｉｓｐＢ、ｇｐｓ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＸ、およびｃｒｔＺを包含する。該経路のある因子を下方制御することが望ましい場合、時として、発現可能ＤＮＡ断片は、アンチセンス方向であってもよい。

本発明では、該発現可能ＤＮＡ断片が、プロモーターか、または生合成経路の調節に有用なコード領域であれば、好ましい。本発明で例証されるのは、組み換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主におけるイソプレノイド生合成経路の調節に使用されるファージＴ５強力プロモーターである。

一般に、該ホモロジーアームの好ましい長さは、約１０〜約１００塩基対の長さであり、約５０ｂｐが好ましい。相同的組み換えのために本発明で使用される比較的短い長さのホモロジーアームを考えれば、能率的な組み換えのためには、好ましくは相同的組み換えの標的とされるものと全く同じ配列を使用して、許容し得る不適正配列のレベルを最低限に保つべきであると考えるであろう。２０〜４０塩基対の相同性により、相同的組み換えの能率は、４桁上昇する（ユー（Ｙｕ）ら、ＰＮＡＳ、９７：５９７８−５９８３（２０００年））。したがって、ホモロジーアーム内の多数の不適正は、相同的組み換えの能率を低下させる可能性がある；しかし、当業者は、許容し得る不適正のレベルを容易に確認することができる。

本発明は、２つの組み込みカセットの一方の上の選択可能マーカーを使用する（「２断片法」）。多数の選択可能マーカーが当業者に知られている。該選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカー、酵素マーカー（それによって、発現されたマーカーが、化学反応を触媒し、表現型出現、たとえば、β−ガラクトシダーゼの測定可能な差を引き起こす）、および通常は栄養要求性の細菌が、外的に供給されるアミノ酸なしで増殖することを可能にするアミノ酸生合成酵素からなる群から選択される。抗生物質耐性マーカーの例としては、数例を挙げると、アンピシリン（ａｍｐ^ｒ）耐性、カナマイシン（ｋａｎ^ｒ）耐性、およびテトラサイクリン（ｔｅｔ^ｒ）耐性などがある。本明細書で使用されるとき、該選択可能マーカーは、部位特異的リコンビナーゼ認識配列に挟まれている。選択および構築物検証の後、部位特異的リコンビナーゼを使用して、選択可能マーカーを除去する。次いで、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ染色体修飾のために、本方法の工程を繰り返してもよい。選択可能マーカーを最終的に除去するために、組み込みカセットは、部位特異的リコンビナーゼで結合されている。部位特異的リコンビナーゼ、たとえば本発明におけるフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼは、特異的組み換え配列（すなわちＦＲＴ配列）を認識して、選択可能マーカーを切除する。本発明のこの態様は、多重染色体修飾のための、本方法の反復使用を可能にする。数例の部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連した特異的認識配列が当該技術分野で知られているように、本発明は、ＦＬＰ−ＦＲＴリコンビナーゼシステムに限定されない。他の適当な部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの対応する認識配列の例は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、Ｒ／ＲＳ、Ｇｉｎ／ｇｉｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔ、ｐＳＲ１システム、ｃｅｒシステム、およびｆｉｍシステムを包含する。

組み換え堪能（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）宿主細胞
本発明は、２つの組み込みカセットおよび宿主細胞染色体との間の能率的な相同的組み換えを仲介することができる組み換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）宿主細胞を使用する。相同的組み換えを非常に効果的に仲介する生物（たとえば酵母）もあるが、遺伝学的介入を必要とする生物もある。たとえば、本来、相同的組み換えにより能率的な形質転換を受けないものと一般に考えらる宿主である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を変えて、組み換え堪能宿主にすることが可能である。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムを含むヘルパープラスミドを用いた形質転換は、相同的組み換え率を桁違いに上昇させる（マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、Ｇｅｎｅ、２４６：３２１−３３０（２０００年）；マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ），Ｋ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０：２０６３−２０７１；ポティート（Ｐｏｔｅｅｔｅ）およびフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２：２３３６−２３４０（２０００年）；ポティート（Ｐｏｔｅｅｔｅ），Ａ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．、２０１：９−１４（２００１年）；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲；ユー（Ｙｕ）ら、上掲；シャベロッシュ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：ｅ９７：１−６（２０００年）；米国特許第６，３５５，４１２号明細書；米国特許第６，５０９，１５６号明細書；および米国特許出願第６０／４３４６０２号明細書）。該λ−Ｒｅｄシステムはまた、宿主に
染色体的に組み込むことができる。該λ−Ｒｅｄシステムは、通常は組み換え欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、組み換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）宿主に変える３遺伝子（ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍ）を含む。

通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、そのＲｅｃＢＣＤエンドヌクレアーゼにより線状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを能率的に分解し、結果として染色体操作に有用ではない形質転換効率に帰着する。ｇａｍ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＢＣＤ複合体に結合して、望ましくないエンドヌクレアーゼ活性を阻害する、タンパク質をコードする。ｅｘｏ遺伝子は、二本鎖のｄｓＤＮＡの５’末端鎖を前進的に分解し、３’一本鎖オーバーハングを創出する、λ−エクソヌクレアーゼをコードする。ｂｅｔによりコードされるタンパク質は、λ−エクソヌクレアーゼと複合体を形成し、また一本鎖ＤＮＡオーバーハングに結合して相補鎖の再生を促進し、交換反応を仲介することができる。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムは、相同的組み換えにより形質転換することが困難と通常考えられている宿主におけるｉｎ ｖｉｖｏ染色体操作用ツールとしての、相同的組み換えの使用を可能にする。λ−Ｒｅｄシステムは、他の細菌でも機能する（ポティート（Ｐｏｔｅｅｔｅ），Ａ．、上掲、（２００１年））。λ−Ｒｅｄシステムの使用は、工業生産に一般的に使用される他の宿主に適用できるはずである。これらのさらなる宿主は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）を含むが、この限りではない。

λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステム
本発明で使用されるλ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムは、ヘルパープラスミド（ｐＫＤ４６）上に含まれ、３つの必須遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍで構成される（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）。該ｅｘｏ遺伝子は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの５’末端鎖を前進的に分解し、３’一本鎖オーバーハングを創出する、λ−エクソヌクレアーゼをコードする。ｂｅｔは、λ−エクソヌクレアーゼと複合体を形成し、一本鎖ＤＮＡに結合して相補鎖の再生を促進し、交換反応を仲介することができる、タンパク質をコードする。ｇａｍは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＢＣＤ複合体に結合して該複合体のエンドヌクレアーゼ活性を阻害するタンパク質をコードする。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における相同的組み換えは非常に低い頻度で起こり、また通常
、広範囲に及ぶ相同領域を必要とするため、λ−Ｒｅｄシステムが、本発明で使用される。該λ−Ｒｅｄシステムは、線状ｄｓＤＮＡ断片の両側に位置する短い相同領域（１０〜５０ｂｐ）を相同的組み換えに使用できる能力を助長する。さらに、通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるＲｅｃＢＣＤ複合体は、その複合体のエクソヌクレアーゼ活性が、線状ｄｓＤＮＡを効率よく分解するため、形質転換のための線状ｄｓＤＮＡの使用が妨げられる。ｇａｍによる、ＲｅｃＢＣＤ複合体のエンドヌクレアーゼ活性の阻害は、線状ｄｓＤＮＡ断片を使用する能率的な相同的組み換えに不可欠である。

組み合せＰ１形質導入システム
形質導入は、細菌ＤＮＡを含有するファージ粒子によって、細菌ＤＮＡが、１つの細菌細胞（ドナー）から別の細菌細胞（受容体）に移動される現象である。ドナー細菌の集団がファージに感染すると、ファージ溶菌サイクルの事象が開始される可能性がある。溶菌感染の間に、ウイルスＤＮＡのバクテリオファージ内へのパッケージに関与する酵素は、時には宿主ＤＮＡをパッケージすることがある。結果として生じる粒子は、形質導入性粒子と呼ばれる。該細胞が溶解されると、これらの粒子は正常なビリオンとともに放出される。この溶解産物は、正常なビリオンと形質導入性粒子の混合物を含む。この溶解産物を使用して、受容細胞の集団を感染させるとき、該細胞の大部分は、正常なウイルスに感染する。しかし、該集団のごく一部は、前の宿主細菌から受け取ったＤＮＡを注入する形質導入性粒子を受け取る。このＤＮＡは、次に、受容体宿主のＤＮＡとの遺伝子組み換えを遂げることができる。Ｐ１形質導入の従来の使用は、一度にただ１つの遺伝形質（すなわち遺伝子）を一方の宿主から他方に移動させることができる。

公知の形質導入ファージを有するもの、たとえばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）を含むが、この限りではない、多数の宿主システムを、本発明の目的のために使用できることは十分に理解されるであろう。本方法での使用に好適なファージの例は、Ｐ１、Ｐ２、λ、φ８０、φ３５３８、Ｔ１、Ｔ４、Ｐ２２、Ｐ２２誘導体、ＥＳ１８、Ｆｅｌｉｘ“ｏ”、Ｐ１−ＣｍＣｓ、Ｆｆｍ、ＰＹ２０、Ｍｘ４、Ｍｘ８、ＰＢＳ−１、ＰＭＢ−１、およびＰＢＴ−１を包含する。

本方法は、選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼシステムと組み合せてバクテリオファージＰ１溶解産物を使用して、並列組み合せ様式で、多数の遺伝形質
を１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に移動させるためのシステムを提供する（図２）。様々なドナー細胞から作られたＰ１溶解産物混合物による形質導入後、形質導入された受容細胞を、抗生物質耐性についてスクリーニングし、所望の遺伝子最終産物の増加した産生（すなわちカロテノイド産生）について分析する。最適化された形質導入体を選択した後、抗生物質耐性マーカーを部位特異的リコンビナーゼで除去する。選択された形質導入体は、多数の染色体修飾を操作し、所望の遺伝子最終産物の産生を最適化するために、Ｐ１形質導入のさらなるラウンドで、受容細胞として再度使用される。本組み合せＰ１形質導入方法は、所望の遺伝子最終産物の最適産生のための、迅速な染色体形質スタッキングを可能にする。本発明は、所望の産物を得るための、連続的菌株改良に非常に有用である。

生合成経路最適化
本方法の組み合わせＰ１形質導入は、数例を挙げると、イソプレノイド類、テルペノイド類、テトラピロール類、ポリケチド類、ビタミン類、アミノ酸、脂肪酸、タンパク質、核酸、炭水化物、抗菌薬、抗癌剤および生物代謝物を含む、任意の生合成経路の最適化に応用できる。

本発明の有用性を、イソプレノイド生合成経路およびカロテノイド生合成経路を最適化することにより具体的に例証する。具体的には、β−カロテンの産生に与える効果を測定することにより、ｉｓｐＢ遺伝子を同定するために、本方法を使用した。カロテノイド産生（すなわちβ−カロテン）は、ファージＴ５プロモーターを、該遺伝子のコード配列に作動可能に連結することにより増強された。

本方法による操作の影響を受けやすい別の経路は、ｈｅｍｅ生合成経路であることは、十分に理解されるであろう。当業者は、テトラピロールの合成に関与する遺伝子、たとえばｈｅｍｅ、のそれぞれのプロモーターが、本発明に記載の誘導プロモーターに置き換えられている一連の菌株を作製することができる。ｈｅｍｅ合成遺伝子の例としては、たとえば、ｈｅｍＡ、ｈｅｍＬ、ｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、ｈｅｍＧ、およびｈｅｍＨなどが挙げられる。第１工程は、λ−Ｒｅｄ仲介相同的組み換えを使用して、天然遺伝子プロモーターを外来プロモーターと置き換えることにより、ｈｅｍｅ生合成経路における遺伝子に、染色体操作する変更を加えることである。次に、増量したテトラピロールを産生する菌株を選択するために、Ｐ１混合物（図２）を使用する組み合わせＰ１形質導入を使用して、融合した外来プロモーター−ｈｅｍｅ遺伝子を、組み合せスタッキングする。当業者は、本法での使用に適切なプロモーターを選択して、所望の遺伝子最終産物の産生を最適化することができる。形質導入体を、ｈｅｍｅの産生について分析し、また、伝統的な分析方法、たとえば質量分析、紫外・可視（ＵＶ−ＶＩＳ）分光分析、バイオアッセイまたは酵素結合分析（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓｓａｙｓ）で分析する。各スタッキングサイクルの後、部位特異的組み換えシステム、たとえばＦＬＰ／ＦＲＴまたはＣｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼシステムを使用して、該マーカーを該菌株から除去することができる。該方法を繰り返して、所望のテトラピロール産物の最適産生に合った形質導入体を選択することができる。

カロテノイド産生に関与する遺伝子の調節
カロテノイド類の生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸を、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に変換する上方イソプレノイド経路、ならびにフィトエンおよびその後産生される全てのカロテノイド類を合成する下方カロテノイド生合成経路という、２つの部分で、便利に考えることができる（図１）。上方経路は、多くの微生物のいたる所に存在する。これらの場合、カロテノイド生合成のための下方経路を含んでなる遺伝子を導入しさえすればよい。２つの経路の主要な区分は、ファルネシルピロリン酸の合成に関する。ＦＰＰが本来存在する場合、下方カロテノイド経路
のエレメントのみが必要である。しかし、カロテノイドの産生において下方経路カロテノイド遺伝子が有効なためには、宿主細胞が、適当なレベルのＦＰＰを該細胞内に有することが必要なことは、十分に理解されるであろう。宿主細胞がにより適当なレベルのＦＰＰが合成されない場合、ＦＰＰの産生に必要な染色体修飾（プロモーター、遺伝子、等々）を導入することが必要であろう。本方法を使用して、これらの修飾を宿主に導入できる。これらの各経路を、以下で詳細に検討する。

上方イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、共通のＣ_５イソプレンサブユニット、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成する、２経路のいずれかによって起こる。第一に、周知の酢酸／メバロン酸経路を介して、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を合成することが可能である。しかし、最近の研究は、該メバロン酸依存的経路は、全ての生物で機能するとは限らないことを証明した。ＩＰＰ生合成のための代わりのメバロン酸非依存的経路は、細菌、ならびに緑藻類および高等植物で、特性決定されている（ホルバッハ（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１１１：１３５−１４０（１９９３年）；ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９５：５１７−５２４（１９９３年）；シュベンデル（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３１６：７３−８０（１９９６年）；およびアイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：６４３１−６４３６（１９９６年））。

メバロン酸非依存的イソプレノイド経路における多くの工程は、公知である（図１）。たとえば、ＩＰＰの産生につながる代替経路の初期段階は、コール（Ｃｏｌｅ）ら（Ｎａｔｕｒｅ、３９３：５３７−５４４（１９９８年））により、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で研究されている。該経路の第１工程は、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として知られる５炭素化合物を生じるための、２つの３炭素分子（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の縮合を含む。この反応は、ｄｘｓ遺伝子によりコードされる、ＤＸＳ酵素によって引き起こされる。次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元により、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を生じる。該異性化および還元工程に関与する酵素の１つは、遺伝子ｄｘｒ（ＩｓｐＣ）によりコードされる、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸は、次に、非存在注釈付き遺伝子ｙｇｂＰによりコードされる酵素によるＣＴＰ依存的反応で、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換される。該ｙｇｂＰ遺伝子は、最近、ｉｓｐ遺伝子群の一部として、ｉｓｐＤと改名された（スイスプロテイン受入番号（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃）Ｑ４６８９３）。

次に、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの第２位ヒドロキシ基は、ｉｓｐＥ（スイスプロテイン受入番号（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃）Ｐ２４２０９）と最近改名された、ｙｃｈＢ遺伝子によりコードされる酵素によるＡＴＰ依存的反応で、リン酸化することができる。この産物は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールをリン酸化し、その結果として４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸を生じる。ｙｇｂＢ遺伝子の産物は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸を、ＣＴＰ依存的方法で、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートに変換する。この遺伝子もまた、最近ｉｓｐと改名された（スイスプロテイン受入番号（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃）Ｐ３６６６３）。

ｇｃｐＥ（ｉｓｐＧ）およびｌｙｔＢ（ｉｓｐＨ）遺伝子（およびおそらくその他）によりコードされる酵素は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピ
ロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の形成につながる反応に関与すると考えられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によりコードされる、ＩＰＰイソメラーゼによりＤＭＡＰＰに異性化される可能性がある。しかし、この酵素は、生き残るために不可欠ではなく、また２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）経路を使用する一部の細菌で、欠けていることがある。最近の証拠から、ＭＥＰ経路はＩＰＰの前に分岐し、ｌｙｔＢ（ｉｓｐＨ）遺伝子産物を介して、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを別々に産生することが示唆される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、ｌｙｔＢ（ｉｓｐＨ）ノックアウト突然変異は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの両者を加えた培地以外では致命的である。

ＦＰＰの合成は、ＩＰＰの、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への異性化を介して起こる。この反応の後に、ｉｓｐＡにより触媒される、一連の、２つのプレニルトランスフェラーゼ反応が続き、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ；１０炭素分子）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ；１５炭素分子）の生成につながる。

表１に示す通り、上方経路のエレメントをコードする遺伝子は、様々な植物、動物、および細菌起源から知られている。

下方カロテノイド生合成経路
上方イソプレノイド経路と下方カロテノイド経路との間の区分は、幾らか主観的である。ＦＰＰ合成は、カロテン産生性細菌（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）および非カロテン産生性細菌（ｎｏｎ−ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）の両者に共通であるため、下方カロテノイド生合成経路の第１工程は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に変換するプレニルトランスフェラーゼ反応から始まると考えられる。ＧＧＰＰシンセターゼをコードする、遺伝子ｃｒｔＥは、ＩＰＰをＦＰＰに付加して、２０炭素分子ＧＧＰＰを産生する、このプレニルトランスフェラーゼ反応に関与する。ＧＧＰＰ ２分子の縮合反応が起こり、下方カロテノイド生合成経路の最初の４０炭素分子である、フィトエン（ＰＰＰＰ）が生じる。この酵素反応は、フィトエンシンターゼをコードする、ｃｒｔＢにより触媒される。

「赤色」のスペクトルを与える、リコペンは、フィトエンから、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）により触媒されて８個の水素原子が除去されることによる４つの逐次的脱水素反応を経て、産生される。この反応における中間体は、フィトフルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンである。

リコペンサイクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、リコペンをβ−カロテンに変換する。

β−カロテンは、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ遺伝子によりコードされる）の活性によって生じるヒドロキシル化反応を介して、ゼアキサンチンに変換される。β−クリプトキサンチンは、この反応における中間体である。

β−カロテンは、ｃｒｔＷまたはｃｒｔＯ遺伝子によりコードされるβ−カロテンケトラーゼによりカンタキサンチンに変換される。エキネノンは、この反応における中間体である。次いで、カンタキサンチンは、ｃｒｔＺ遺伝子またはｃｒｔＲ遺伝子によりコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼによって、アスタキサンチンに変換することができる。アドンビルブリン（ａｄｏｎｂｉｒｕｂｒｉｎ）は、この反応における中間体である。

ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換することができる。この反応は、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＸ）により触媒される。

ゼアキサンチンは、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯまたはｂｋｔによりコードされるケトラーゼに
よりコードされるβ−カロテンケトラーゼによって、アスタキサンチンに変換することができる。ＢＫＴ／ＣｒｔＷ酵素は、β−カロテンおよび４−ケトゼアキサンチンから、エキネノンを経て、カンタキサンチンを合成した。アドニキサンチンは、この反応における中間体である。

スフェロイデンは、ｃｒｔＡによりコードされるスフェロイデンモノオキシゲナーゼにより、スフェロイデノンに変換することができる。

ニューロスポレンは、スフェロイデンに変換することができ、リコペンは、それぞれ、ｃｒｔＣ遺伝子、ｃｒｔＤ遺伝子およびｃｒｔＦ遺伝子によりコードされる、ヒドロキシニューロスポレンシンターゼ、メトキシニューロスポレンデサチュラーゼおよびヒドロキシニューロスポレン−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの逐次作用により、スピリロキサンチンに変換することができる。

β−カロテンは、ｃｒｔＵによりコードされるβ−カロテンデサチュラーゼにより、イソレニエラテンに変換される。

表２に示す通り、下方カロテノイド生合成経路のエレメントをコードする遺伝子は、様々な植物、動物、および細菌起源から知られている。

最も好ましいｃｒｔ遺伝子の大半は、主にパンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ
ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）に由来する。これらの好ましい遺伝子の配列は、下記の配列番号として示される。ｃｒｔＥ遺伝子（配列番号１）、ｃｒｔＸ遺伝子（配列番号３）、ｃｒｔＹ（配列番号５）、ｃｒｔＩ遺伝子（配列番号７）、ｃｒｔＢ遺伝子（配列番号９）およびｃｒｔＺ遺伝子（配列番号１１）。

宿主生物で、十分なＦＰＰ源が利用できるのであれば、表２に示されている遺伝子および本発明の好ましい遺伝子の様々な組合せを使用することにより、本発明の方法を使用して無数の異なるカロテノイド類およびカロテノイド誘導体を作ることが可能である。たとえば、遺伝子群ｃｒｔＥＸＹＩＢは、β−カロテンの産生を可能にする。ｃｒｔＺをｃｒｔＥＸＹＩＢに付加することにより、ゼアキサンチンの産生が可能になる。

本発明の有用な産物は、アンテラキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、キャプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、ジデヒドロリコペン、β−カロテン、ζ−カロテン、δ−カロテン、γ−カロテン、ケト−γ−カロテン、ψ−カロテン、ε−カロテン、β，ψ−カロテン、トルレン、エキネノン、ガンマ−カロテン、ゼータ−カロテン、α−クリプトキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクテュカキサンチン（ｌａｃｔｕｃａｘａｎｔｈｉｎ）、ルテイン、リコペン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリディニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、シホナキ
サンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ）、酢酸ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、およびＣ_３０−カロテノイド類等を含むが、この限りではない、本明細書で定義されているあらゆるカロテノイド化合物を包含することが想定される。さらに、本発明は、ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒド官能基、または配糖体エステル類、または硫酸エステル類を生じさせるための、これらの分子の誘導体化を含む。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、幾つかのイソプレノイド経路遺伝子の公的に入手可能な配列を使用して、λ−Ｒｅｄ仲介相同的組み換え用の組み込みカセットを合成した。１つまたは２つのＰＣＲで生成される断片を作製し、ファージＴ５プロモーターおよび選択マーカーを含むように操作した（実施例１、表１〜３）。およそ４０〜５０ｂｐの長さのホモロジーアームを、該ＰＣＲで生成された断片の両端に使用した。プラスミドｐＫＤ４６上にコードされたλ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムに助けられて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体と組み込みカセットとの間で、相同的組み換えが起こり、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｌｙｔＢ、ｄｘｒ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ（ｙｇｂＢＰ）、ｉｓｐＡ、ｙｃｈＢ、ｇｃｐＥ、およびｉｓｐＢ遺伝子の生来のプロモーターを、Ｐ_Ｔ５強力プロモーターとの効果的に置き換えた（図１、３、および５）。これらの各遺伝子の、形質転換体のコロニーが得られた。成功した組み換えを、選択可能マーカー（カナマイシン）の包含によって測定した。組み込みカセットの染色体組み込みは、実施例１（図８）に記載の通り、ＰＣＲ分析で確認した。λ−Ｒｅｄ仲介組み換えは、１つまたはそれ以上の組み込みカセットで起こる可能性があるが、しかし、少なくとも２つの、線状の、ＰＣＲで生成された、カセットの使用が好ましい（図３）。

別の実施形態では、β−カロテン産生を分析するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）レポーター菌株を構築した。簡単に記載すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）レポーター菌株は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来の遺伝子群ｃｒｔＥＸＹＩＢを、ヘルパープラスミド（ｐＰＣＢ１５；配列番号４０）にクローニングし、次にこれを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を菌株を形質転換することにより、創出した（図６）。該遺伝子群は、カロテノイド類（すなわちβ−カロテン）の合成に必要な遺伝子の多くを含んでいた。ｃｒｔＺ遺伝子（β−カロテンヒドロキシラーゼ）が該遺伝子群に含まれていたことに注目すべきである。しかし、ｃｒｔＺ遺伝子（反対方向にかつｃｒｔＢ遺伝子に隣接して構築されている）を発現させるためのプロモーターは存在せず、ゼアキサンチンは産生されなかったため、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素（該遺伝子群内に位置するｃｒｔＸ遺伝子によりコードされる）は、その反応のための基質を持たなかった。β−カロテン産生の増加は、対照株産生と比較した増加として報告された（図６）。

配列分析を実施して、遺伝子群の同一性を確認した（実施例４、表４）。ヘルパープラスミド上の様々なカロテノイド遺伝子の機能を確認するために、トランスポゾン突然変異誘発（実施例５）を使用した。この方法を使用して、トランスポゾン突然変異誘発の結果から、機能を各遺伝子に割り当てることができた（表５）。様々なパンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）ｃｒｔ遺伝子に割り当てられた機能は、当該技術分野で報告されたものと一致していた（国際公開第０２／０７９３９５ Ａ２号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６５０３号パンフレット）。

レポータープラスミド、ｐＰＣＢ１５、を使用して、イソプレノイド経路を通過するフラックス増加をモニターした。ＦＰＰの産生される量を変えた、イソプレノイド経路に対する修飾は、β−カロテンの産生によりモニターした。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
および様々な形質転換体で産生されたβ−カロテン量の比較を使用して、最適β−カロテン産生を示す菌株を選択した。

別の実施形態において、本方法は、Ｐ１形質導入を使用して、増加したβ−カロテン産生を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を創出できることを例証する。実施例１で創出された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ菌株を、バクテリオファージＰ１に感染させた。溶解産物を回収して、β−カロテン発現プラスミドｐＰＣＢ１５を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５を感染させるために使用した（実施例６、図６）。形質導入体は、カナマイシン選択マーカーにより選択した。部位特異的リコンビナーゼ（ＦＬＰ）をコードする、熱感受性ヘルパープラスミド（ｐＣＰ２０）を使用して、選択マーカー（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４５５；チェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、上掲；実施例６）を除去した。選択マーカーの除去後、該プラスミドを取り除いた。ＰＣＲ断片分析を使用して、該Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓカセットの組み込みおよびカナマイシンマーカーの除去を確認した（図８）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓは、レポータープラスミドを含む野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と比較して、およそ２．８倍のβ−カロテン産生増加を示した（実施例８、図９）。

イソプレノイド経路を通過するフラックスを最適化するために、多数の染色体修飾を含む形質転換体を創出した。バクテリオファージＰ１形質導入を使用して、多重形質転換体を創出した。各菌株を、実施例１に記載の通りに作製し、バクテリオファージＰ１に感染させた。溶菌サイクルを進めさせておいた。各菌株の溶解産物を回収した。Ｐ１溶解産物の混合物は、各菌株のそれぞれから等力価のＰ１溶解産物を混合することによって調製した（実施例２、図７）。該Ｐ１溶解産物混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ菌株を感染させた。形質導入体は、選択マーカーにより選択した。より濃い黄色の色素沈着を示す形質導入体を選択した。もう一度、該選択マーカーを除去した。ＰＣＲ断片分析を実施して、選択された形質導入体のそれぞれについて、挿入の位置およびタイプを特定し（実施例９）、また選択マーカーの除去を確認した（図８）。選択マーカーの除去により、選択された菌株は、次のラウンドのＰ１形質導入の受容細胞の役割を果たすことができた。該過程を繰り返し、対照株と比較して３．４倍のβ−カロテン産生増加を示す、最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢを創出した（図９）。この方法を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に多数の染色体修飾を効率よく施すことができた。イソプレノイド経路を最適化して、当該遺伝子最終産物である、β−カロテンの産生を増加させた。

別の実施形態では、ｉｓｐＢは、カーボンフローを、イソプレノイド経路からそらすと考えられていたため、上方制御の標的の１つとしてのｉｓｐＢの包含は予想外であった（図１および９；実施例９）。本方法は、β−カロテン産生を増加させるために、本方法を使用して変化させることが可能な遺伝子および遺伝子組み合わせの同定を可能にした。

別の実施形態では、本方法で使用される組み込みカセットは、破壊された遺伝子、たとえばトランスポゾン突然変異誘発により破壊されたものを含んでもよい。染色体操作により遺伝子を下方制御または完全に破壊することによって、カーボンフローを、競合する生合成経路からそらすことが可能になる。本方法は、染色体修飾の様々な組み合わせおよびそれらが標的生合成経路の所望の遺伝子最終産物に及ぼす影響の評価を容易にする。

一実施形態では、所望の遺伝子最終産物の産生効率を上昇させるために、多重プロモーター置換を含む、多数の染色体修飾を含むように、細菌宿主菌株が操作される。Ｐ１形質導入および選択可能マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼを使用して、多数の染色体修飾を１つの宿主菌株に組み込んだ。染色体修飾は、Ｐ１形質導入およびマーカー除去という一連のラウンドによって、１つの菌株に順次組み込まれた。

本発明は、様々な標的とされるｉｎ ｖｉｖｏ細菌染色体修飾を、１つの宿主菌株にスタッキングするために使用することが可能である。部位特異的リコンビナーゼを使用して選択可能マーカーを除去することにより、生合成経路を操作して、産業上有用な材料の産生を最適化するために必要な、多数の染色体修飾を実施することが可能になる。形質をスタッキングするための組み合わせ手法は、染色体修飾の組み込みを可能にし、併せて、個々の修飾を１つづつ課すことと比べて、所望の形質に対して最も大きい影響が、より迅速に得ることができる。

以下の実施例で、本発明をさらに明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、当然のことながら、実例として示すに過ぎない。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の必須特性を確認することができ、また本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修飾を加えて、様々な使用および条件に適合させることができる。

一般法
実施例で使用された標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにＴ．Ｊ．シルヘイビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）、ならびにアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行（１９８７年）により記述されている。

細菌培養の維持および増殖に適当な材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例での使用に適当な技術は、一般細菌学のための方法のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（フィリップ・ジェラール（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ）Ｎ．コスチロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ）Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４年））に、またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー：工業微生物学教科書（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）マサチュセッツ州サンダーランドのシナウワー・アソシエーツ・インク（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ
，ＭＡ．）により、明確に記載されている。細菌細胞の増殖および維持に使用された全ての試薬、制限酵素および材料は、特に明記されていない限り、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ））から入手した。

遺伝子配列の操作は、ジェネティクス・コンピューター・グループ・インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）から販売されているプログラム一式（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して行った。該ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用する場合、ギャップ・クリエーション・デフォルト値１２、およびギャップ・エクステンション・デフォルト値４を使用した。ＣＧＣ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムを使用する場合、デフォルト・ギャップ・クリエーション・ペナルティ５０およびデフォルト・ギャップ・エクステンション・ペナルティ３を使用した。スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んだファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日程１９９２年、１１１−１２０、編集者：スハーイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、発行者：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用して、多数のアラインメントを作成した。これらのプログラムまたは他のプログラムで、プログラムパラメーターが指示されていないいずれの場合にも、デフォルト値を使用した。

略語の意味は以下の通りである。「ｈ」は、時間を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｒｐｍ」は、１分当たりの回転数を意味する。

実施例１
イソプレノイド遺伝子の上流に、染色体に組み込まれたファージＴ５強力プロモーターを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の合成（プロモーター置換）
図３に記載の通りに、ＰＣＲ断片染色体組み込み方法を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソプレノイド遺伝子ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｄｘｒ、ｌｙｔＢ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ（ｙｇｂＢＰ）、ｉｓｐＡ、ｙｃｈＢ、ｇｃｐＥ、およびｉｓｐＢの生来のプロモーター（図１）を、ファージＴ５（Ｐ_Ｔ５）強力プロモーターと置換した。該置換方法は、ヘルパープラスミド上にコードされているλ−Ｒｅｄリコンビナーゼによる、相同的組み換えに基づく。組み換えは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体と、ＰＣＲ断片の両端に４０〜５０ｂｐの相同パッチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｐａｔｃｈ）を含む、１つまたは２つのＰＣＲ断片との間で起こる（図３）。２つのＰＣＲ断片法または１つのＰＣＲ断片法（図３）のいずれかを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソプレノイド遺伝子、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｌｙｔＢ、ｄｘｒ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ（ｙｇｂＢＰ）、ｉｓｐＡ、ｙｃｈＢ、ｇｃｐＥ、およびｉｓｐＢの最前部における、カナマイシン選択可能マーカーおよびファージＴ５プロモーター（配列番号４３）の染色体組み込みに使用した。２つのＰＣＲ断片法の場合、該２つの断片は、部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）に挟まれたカナマイシン選択可能マーカーを含む線状ＤＮＡ断片（１４８９ｂｐ）、ならびに−１０および−３５共通プロモータ
ー配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、およびリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるファージＴ５プロモーター（Ｐ_Ｔ５）を含む線状ＤＮＡ断片（１５４ｂｐ）を含んでいた。１つのＰＣＲ断片法の場合、融合した線状ＤＮＡ断片（１６４７ｂｐ）は、部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）で挟まれたカナマイシン選択可能マーカー、ならびに−１０および−３５共通プロモーター配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、およびリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるＰ_Ｔ５プロモーターを含む線状ＤＮＡ断片（１５４ｂｐ）を含んでいた。

２つのＰＣＲ断片法を使用することにより、該カナマイシン選択可能マーカーおよびＰ_Ｔ５プロモーター（ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５）が、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｌｙｔＢ、ｄｘｒ、およびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流に組み込まれ、それぞれの生来のプロモーターに取って代わって、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰを生じた。カナマイシン選択可能マーカーを含んでいた線状ＤＮＡ断片（１４８９ｂｐ）は、下記の通り、表３のプライマー対を用いて、プラスミドｐＫＤ４（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）からＰＣＲで合成された。

Ｐ_Ｔ５プロモーターを含む第２の線状ＤＮＡ断片（１５４ｂｐ）は、下記の通り、表４のプライマー対を用いて、ｐＱＥ３０（カリフォルニア州バレンシアのキアジェン・インク（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からＰＣＲで合成した。

１つのＰＣＲ断片法の場合、該カナマイシン選択可能マーカーおよびファージＴ５プロモーターは、ｉｓｐＡ、ｙｃｈＢ、ｇｃｐＥ、およびｉｓｐＢ遺伝子の最前部に組み込まれ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢを生じた。組み込みに使用された、Ｐ_Ｔ５プロモーターを含む融合したカナマイシン選択可能マーカー−ファージを含んでいた線状ＤＮＡ断片は、下記の通り、表５のプライマーを用いて、ｐＳＵＨ５からＰＣＲで合成された（図４）。

下記の通り、標準ＰＣＲ条件を使用して、アンプリタク・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ）（登録商標）ポリメラーゼ（カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で、該線状ＤＮＡ断片を増幅した。

ＰＣＲ反応の完了後、各ＰＣＲ反応混合物５０μＬを、１％アガロースゲル上を移動させ、製造業者の説明書に従ってキアクイック・ゲル・エクストラクション・キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（商標）（カタログ番号２８７０４、カリフォルニア州バレンシアのキアジェン・インク（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、該ＰＣＲ産物を精製した。該ＰＣＲ産物を、蒸留水１０μＬで溶出させた。製造業者の説明書に従って、ＤＮＡクリーン・アンド・コンセントレーター（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（商標）キット（カリフォルニア州オレンジのザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））を使用して、該ＰＣＲ産物断片をさらに精製した。該ＰＣＲ産物を、蒸留水６〜８μＬで、０．５〜１．０μｇ／μＬの濃度まで溶離させた。

λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＫＤ４６（ａｍｐ^Ｒ）（図５）を担持する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１菌株を、ＰＣＲ断片の染色体組み込みのための宿主菌株として使用した。該菌株は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミド、ｐＫＤ４６（ａｍｐ^Ｒ）を用いた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１の形質転換によって構築した。ｐＫＤ４６におけるλ−Ｒｅｄリコンビナーゼは、アラビノース−誘導プロモーターの制御下で発現される３つの遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍで構成される。形質転換体は、３０℃の１００μｇ／ｍＬアンピシリンＬＢプレートで選択した。

形質転換のために、カナマイシンマーカーおよびＰ_Ｔ５プロモーターを担持する精製ＰＣＲ産物１〜５μｇを使用して、エレクトロポレーションを実施した。抗生物質耐性形質転換体を選択するために、形質転換された細胞のおよそ半分を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上に塗布した。該プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、抗生物質耐性形質転換体が下記の通りに選択された。ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ １０コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ １２コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ １コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ ４７コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰ １０コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ １９コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ ７００コロニー、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ ２１コロニー、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ
３コロニー。

ＰＣＲ分析を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上の正確な位置におけるカナマイシン選択可能マーカーおよびファージＴ５プロモーター（Ｐ_Ｔ５）の両者の組み込みについて、選択されたｋａｎ−Ｐ_Ｔ５カナマイシン耐性形質転換体をスクリーニングした。ＰＣＲのために、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．５Ｕ アンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ）（商標）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ））、および０．４μＭ 特異的プライマー対を含有するＰＣＲ反応混合物５０μＬ中に、コロニーを再懸濁させた。テストプライマーは、カナマイシン（５’−プライマー）および各イソプレノイド遺伝子の初期コード領域（３’−プライマー）に位置する領域の配列と一致するように選択した。ＰＣＲ反応は、上述の通りに実施された。各イソプレノイド遺伝子のｋａｎ−Ｐ_Ｔ５上流への染色体組み込みは、ＰＣＲ分析で確認された。結果として得られた、染色体上に各ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−イソプレノイド遺伝子融合を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、実施例７および９に記載の組み合わせ手法で、染色体上に並列で多数のｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−イソプレノイド遺伝子融合をスタッキングするために使用した。

実施例２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ菌株を用いて作られるＰ１溶解産物混合物の調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ菌株のＰ１溶解産物は、増殖中の細菌培養を、Ｐ１ファージに感染させて、細胞を溶解させることによって調製した。Ｐ１感染のために、各菌株を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地４ｍＬに接種し、３７℃で一晩増殖させ、次いで、一晩培養の１：１００希釈物を、５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むＬＢ培地１０ｍＬで継代培養した。３７℃で２０〜３０分間増殖させた後、１０^７個のＰ１_ｖｉｒファージを加えた。該細胞−ファージ混合物に３７℃で２〜３時間、溶解するまで通気し、クロロホルム数滴を加え、該混合物を３０秒間渦巻攪拌し、室温でさらに３０分間インキュベートした。次いで、該混合物を４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を新しい試験管に移し、クロロホルム数滴を加えた。該溶解産物を４℃で保存した。

Ｐ１溶解産物の混合物は、等力価の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ、またはｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ菌株からのＰ１溶解産物を混合することにより調製した。Ｐ１溶解産物の力価測定値は、マニアティアス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）に記載の通りに決定された。

実施例３
パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来のβ−カロテン産生遺伝子のクローニング
ｃｒｔ遺伝子を含む断片をＰＣＲで増幅するために、エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）由来の配列を使用して、プライマーをデザインした。これらの配列は、５’〜３’を含んでいた。

染色体ＤＮＡは、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ８１９９）から精製し、Ｐｆｕターボ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ）ポリメラーゼ（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を、下記の条件で、ＰＣＲ増幅反応で使用した。９４℃、５分；２５サイクルの９４℃（１分）−６０℃（１分）−７２℃（１０分）、および７２℃ １０分間。ゲル電気泳動後、およそ６．５ｋｂの一産物が確認された。Ｔａｑポリメラーゼ（カリフォルニア州フォスター・シティのパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を１０分間７２℃の反応で使用して、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＴＯＰＯクローニングするための断片に、３’アデノシンヌクレオチドをさらに付加し、プラスミドｐＰＣＢ１３を創出した。エレクトロポレーションにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５a（メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））に形質転換後、数コロニーが、鮮黄色に見え、カロテノイド化合物を産生していることを示した。製造業者に指示された通りに、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））ミニプレップキットを使用して、プラスミドを単離した後
、ＧＰＳ−１ゲノム・プライミング・システム・キット（Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｉｍｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ）キット（マサチュセッツ州ベバリーのニューイングランド・バイオラブズ・インク（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用して、該６．５ｋｂの増幅された断片を含むプラスミドを、ｐＧＰＳ１．１と入れ替えた。多数の、これらの転位したプラスミドを、トランスポゾンの各末端から配列決定した。トランスポゾン特異的プライマーを使用し、ダイターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；ＥＰ２７２００７号）を使用して、ＡＢＩオートマティック・シークエンサー（ＡＢＩ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で、配列を作成した。シーケンチャー・プログラム（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ）（ミシガン州アナーバーのジーン・コーズ・コープ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を用いて、配列アセンブリを実施した。

実施例４
細菌遺伝子の同定および特性決定
ｃｒｔＥ、Ｘ、Ｙ、Ｉ、Ｂ、およびＺをコードする遺伝子は、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブン・プロテイン・データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）、スイス・プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースから導かれる配列を含んでなる）に含まれている配列との類似性を検索するブラスト（ＢＬＡＳＴ）（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９３年））を実施することにより同定した。実施例３で得られた配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、該「ｎｒ」データベースに含まれている全ての公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性について分析した。ＤＮＡ配列を、全てのリーディングフレームで翻訳し、ＮＣＢＩより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステイツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６−２７２（１９９３年））を使用して、該「ｎｒ」データベースに含まれている全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について比較した。

全ての比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを使用して行った。ＢＬＡＳＴ比較の結果は、最高の類似性有する配列をまとめてある表６に示す。表６は、ＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づいたデータを、期待値で報告される値とともに示す。期待値は、一致の統計学的有意性を予測し、全く偶然に、このサイズのデータベースの検索で予測される、一致の数を、所定の点数で、明確に示す。

実施例５
トランスポゾン突然変異誘発による遺伝子機能の分析
ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺを含む各コード領域内に挿入されたトランスポゾンを担持する幾つかのプラスミドを、実施例３で作成された配列データを使用して選択した。これらのプラスミド変異体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンの存在下、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス１００ｍＬで増殖させた。培養を、２６℃で１８時間増殖させ、細胞を遠心分離で回収した。アセトン１０ｍＬを使用して、カロテノイドを細胞ペレットから抽出した。アセトンを窒素下で乾燥させ、ＨＰＬＣ分析のために、カロテノイドをメタノール１ｍＬ中に再懸濁させた。ベックマン・ゴールド・ヌーヴォー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｏｌｄ Ｎｏｕｖｅａｕ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（メリーランド州コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ））を用いたベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ）（登録商標）ＨＰＬＣを試験に使用した。粗抽出液（０．１ｍＬ）を、対応する保護カラムが付いた１２５×４ｍｍのＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（カリフォルニア州サンフェルナンドのヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｓａｎ Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ））に添加した。流速は１ｍＬ／分であり、使用した溶媒プログラムは、０〜１１．５分 水４０％／メタノール６０％；１１．５〜２０分 メタノール１００％；２０〜３０分 水４０％／メタノール６０％であった。スペクトルデータは、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）光ダイオードアレイ検出器（モデル１６８）で収集した。

野生型ｃｒｔＥＸＹＩＢＺを有する野生型クローンでは、カロテノイドは、保持時間１５．８分および吸収スペクトル４２５、４５０および４７８ｎｍを有することが分かった。これらの値は、β−カロテン標準の値一致していた。このことから、反対方向に構築されたｃｒｔＺ遺伝子は、この構築物で発現されないことが示唆される。ｃｒｔＺにおけるトランスポゾン挿入は、予想通り、全く効果がなかった（データ示さず）。

ＨＰＬＣスペクトル分析はまた、ｃｒｔＸにトランスポゾン挿入を有するクローンも、β−カロテンを産生することを示した。このことは、β−カロテンの合成に続く、カロテノイド経路の後期工程における、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするｃｒｔＸの、提唱された機能と一致する。

ｃｒｔＹにおけるトランスポゾン挿入により、β−カロテンは産生されなかった。カロテノイドの溶出時間（１５．２分）および吸収スペクトル（４４３ｎｍ、４６９ｎｍ、５００ｎｍ）は、リコペン標準のそれらと一致した。リコペンがｃｒｔＹ突然変異体に蓄積したことにより、リコペンサイクラーゼコード化遺伝子としてのｃｒｔＹの役割が裏付けられた。

ｃｒｔＩ抽出液は、２８６ｎｍでモニターしたとき、保持時間１６．３分および吸収スペクトル２７６ｎｍ、２８６ｎｍ、２９７ｎｍを有するピークを示し、フィトエンに関して報告されたスペクトルと一致した。フィトエンがｃｒｔＩ突然変異体で検出されたことにより、フィトエンデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子としての、ｃｒｔＩ遺伝子の機能が裏付けられた。

ｃｒｔＥ突然変異体またはｃｒｔＢ突然変異体から抽出されたアセトンは、透明であった。これらの突然変異体における有色カロテノイドの喪失は、ｃｒｔＥ遺伝子およびｃｒｔＢ遺伝子の両者が、カロテノイド合成に不可欠であることを示す。いずれの突然変異体でもカロテノイドは全く確認されず、このことは、プレフィトエンピロリン酸シンターゼをコードするｃｒｔＢおよびゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼをコードするｃｒ
ｔＥの、提唱された機能と一致する。両酵素は、β−カロテン合成に必要である。

トランスポゾン突然変異誘発実験の結果を、下表７に示す。遺伝子群ｃｒｔＥＸＹＩＢ内へのトランスポゾン挿入部位を、ＬＢプレートで観察された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーの色、（ＨＰＬＣスペクトル分析で決定される）カロテノイド化合物の同一性、および各遺伝子の実験的に割り当てられた機能と共に記録する。

実施例６
β−カロテンを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓの構築
イソプレノイド産生に対するファージＴ５プロモーターの作用を特性化するために、イソプレノイド遺伝子から上流に、染色体に組み込まれたＴ５プロモーターを含む、β−カロテンを産生することができる、菌株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓを構築した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ菌株で作られたＰ１溶解産物を、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍ^Ｒ）（図６）を含む受容株である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に形質導入した。プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍ^Ｒ）は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ
８１９９）由来のカロテノイド生合成遺伝子群（ｃｒｔＥＸＹＩＢ）を含む。ｐＰＣＢ１５プラスミドを、ＳｍａＩ消化ｐＳＵ１８（バルトロメ（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ），Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ、１０２：７５−７８（１９９１年））ベクターと、ｐＰＣＢ１３（実施例３）由来のｃｒｔＥＸＹＩＢを担持する平滑末端化ＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片とのライゲーションにより構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ ｐＰＣＢ１５受容細胞を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地４ｍＬで、３７℃にて、中対数期（１〜２×１０^８細胞／ｍＬ）まで増殖させた。細胞を、４５００ｒｐｍで１０分間遠沈し、２ｍＬの１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４および５ｍＭ ＣａＣｌ_２に再懸濁した。受容細胞（１００μＬ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ菌株から作られたＰ１溶解産物貯蔵液（１０^７ｐｆｕ／μＬ）、１μＬ、２μＬ、５μＬ、または１０μＬと混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。受容細胞−溶解産物混合物を、６５００ｒｐｍで３０秒間遠沈し、１０ｍＭクエン酸ナトリムを含むＬＢ培地１００μＬに再懸濁し
、３７℃で１時間インキュベートした。抗生物質耐性形質導入体を選択するために、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールの両者を含むＬＢプレート上に細胞をプレーティングし、３７℃で、１日または２日間インキュベートした。１６の形質導入体を選択した。

カナマイシン選択可能マーカーを染色体から除去するために、熱感受性複製起点を有する、ＦＬＰリコンビナーゼ発現プラスミドｐＣＰ２０（ａｍｐ^Ｒ）（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４５５）（チェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、Ｇｅｎｅ、１５８：９−１４（１９９５年））を、エレクトロポレーションにより、カナマイシン耐性形質導入体の１つに一時的に形質転換させた。細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天および２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールＬＢプレート上に塗布し、３０℃で１日増殖させた。コロニーを採取して、アンピシリン抗生物質を含まない２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールＬＢプレート上に画線し、４３℃で一晩インキュベートした。プラスミドｐＣＰ２０は、熱感受性複製起点を有し、そのため、細胞を４３℃で培養することにより、宿主細胞から除去した。コロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンＬＢプレートまたは２５μｇ／ｍＬカナマイシンＬＢプレート上に画線することにより、該コロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン感受性についてテストし、ｐＣＰ２０およびカナマイシン選択可能マーカーの喪失をテストした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からのカナマイシン選択可能マーカーの除去は、ＰＣＲ分析で確認した（図８、レーン１および２）。選択されたコロニーを、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．５Ｕアンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ）（商標）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ））、および０．４μＭの特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎ（５’−ＡＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴ ＣＴＧＣＴＣ−３’）（配列番号３５）およびＢ−ｄｘｓ（５’−ＴＧＧＣＡＡＣＡＧＴＣＧＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧ ＴＧＧ−３’）（配列番号３６）、Ｔ−Ｔ５（５’−ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧ ＣＣＣ−３’）（配列番号３７）およびＢ−ｄｘｓ含むＰＣＲ反応混合物５０μＬ中に再懸濁した。テストプライマーは、カナマイシンまたはファージＴ５プロモーターのいずれかおよびｄｘｓ遺伝子の初期領域に位置する領域を増幅するように選択した（図８）。ＰＣＲ反応は、実施例１に記載の通りに実施した。ＰＣＲの結果（図８、レーン１および２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からの、カナマイシン選択可能マーカーの除去を示した。ｄｘｓコード配列の上流にＰ_Ｔ５プロモーター断片が存在することは、予想されるサイズ（２２９ｂｐ）のＰＣＲ産物の産生に基づいて確認された。このようにして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ菌株を構築した。

実施例７
並列での、多重ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−イソプレノイド遺伝子融合物の組み合わせスタッキング
高レベルのカロテノイド産生ができる細菌株を創出するために、多数のイソプレノイド遺伝子の最前部に、並列で、Ｐ_Ｔ５をスタッキングするための方法を考案した。この技術を使用して、最良のカロテノイド産生性菌株を選択することが可能になった。

実施例２に記載の通りに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ菌株に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ菌株で作られたＰ１溶解産物混合物を用いて形質導入し、これによって、多数のイソプレノイド遺伝子の最前部に、並列で、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５カセットをスタッキングすることが可能になった（図７）。形質導入のために、受容細胞を調製し、Ｐ１溶解産物混合物（１０^６ｐｆｕ／μＬ）を使用して、実施例６に記載の通りに形質導入を実施した。抗生物質耐性形質導入体を選択するために、２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの
両者を含有するＬＢプレート上に、細胞をプレーティングした。３７℃で１〜２日、インキュベートした後、独特の黄色いβ−カロテン色で最も濃く色素沈着した４３０のカナマイシン／クロラムフェニコール耐性形質導入体のうち６コロニーを選択した。これらの６菌株における、染色体上にスタッキングされたｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−イソプレノイド遺伝子融合物は、カナマイシン遺伝子の中間領域と相補的な５’−プライマー、および各イソプレノイド遺伝子（ｉｄｉ、ｌｙｔＢ、ｄｘｒ、ｙｇｂＢＰ、ｉｓｐＡ、ｙｃｈＢ、ｇｃｐＥ、またはｉｓｐＢ）の最初の数百ｂｐ以内の配列と相補的な３’−プライマーを用いたＰＣＲ分析で同定された。このＰＣＲスクリーニングは、実施例１に略述されている通りに実施した。ＰＣＲ分析は、Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓのほかにも、４コロニーが、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉを含み、１コロニーが、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢを含み、１コロニーが、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥを含むことを示した。これらの中で、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉを担持するコロニーは、３７℃で２日間増殖させた後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの両者を含有するＬＢプレート上で、最も濃い黄色を示し、より高い収量のβ−カロテン産生が示唆された。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉの染色体由来のカナマイシン選択可能マーカーを、実施例２に記載の通りに除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉを得た。カナマイシン選択可能マーカーの除去は、特異的プライマー対の異なる組み合わせ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ（５’−ＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号３８）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉを使用して、実施例１に記載の通りに、ＰＣＲ分析で確認した。テストプライマーは、カナマイシンまたはＰ_Ｔ５プロモーターのいずれかに位置する領域、およびｉｄｉ遺伝子の先端（図８）を増幅するように選択した。ＰＣＲの結果（図８、レーン３および４）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からのカナマイシン選択可能マーカーの除去を示した。前と同様、染色体のｉｄｉ遺伝子の最前部にＰ_Ｔ５プロモーター断片が存在することは、予想されるサイズ（２７４ｂｐ）のＰＣＲ断片の産生に基づいて確認された。

実施例８
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉにおけるβ−カロテン産生の測定
全て、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍ^Ｒ）を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照株のβ−カロテン産生を、分光分析法で定量化した。β−カロテン産生の定量分析は、β−カロテンに特有の、４２５、４５０および４７８ｎｍにおけるλ_ｍａｘピークのスペクトルを測定することによって実行した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照株は、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ ５ｍＬで、３７℃で２４時間増殖させ、次いで、４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収した。β−カロテン色素は、１分間、渦巻攪拌しながら、アセトン１ｍＬ中に細胞ペレットを再懸濁させることによって抽出し、次いで、室温で１時間、サンプルを揺り動かした。４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した後、ウルトロスペック（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ）３０００分光光度計（ニュージャージー州ピスカタウエイのアマーシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を使用して、β−カロテンを含有するアセトン層の吸収スペクトルを、λ４５０ｎｍで測定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉにおけるβ−カロテン産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照株のそれより、それぞれ、およそ２．８倍および３．１倍高かった（図９）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉにおけるβ−カロテン産生は、親菌株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓと比較したとき、およそ１２％増加した。

実施例９
より優れたβ−カロテンプロデューサーを創出するための、Ｐ１溶解産物混合物を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉの形質導入
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｌｙｔＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｄｘｒ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｇｂＢＰ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＡ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｙｃｈＢ、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｇｃｐＥ、およびｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ菌株で作られたＰ１溶解産物混合物を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ菌株を形質導入した（図７）。Ｐ１形質導入は、実施例７に記載の通りに実施した。１０００を超える形質導入体が生じた。これらの形質導入体中で、親菌株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉより濃い黄色を示した１０コロニーを選択し、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５の挿入位置を、実施例７に記載の通りにＰＣＲ分析で確認した。ＰＣＲ分析は、全１０コロニーが、Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓおよびＰ_Ｔ５−ｉｄｉはもとより、ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢも含んでいることを示した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ菌株は、３７℃で２日間増殖した後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの両者を含有するＬＢプレート上で、親菌株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉより濃い黄色を示し、より高収量のβ−カロテン産生を示唆した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ ｋａｎ−Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢの染色体からのカナマイシン選択可能マーカーを、実施例６に記載の通りに除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢを得た。カナマイシン選択可能マーカーの除去は、ＰＣＲ分析で確認された（図８、レーン５および６）。特異的プライマー対、Ｔ−ｋａｎ（配列番号３５）およびＢ−ｉｓｐＢ（５’−ＡＣＣＡＴＡＡＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴ ＧＴＴＣＡＣＡＧＴＡＡＧＧＴ ＡＡＴＣＧＧＧＧ−３’）（配列番号３９）、Ｔ−Ｔ５（配列番号３７）およびＢ−ｉｓｐＢ（配列番号３９）を使用した。テストプライマーは、カナマイシンまたはＰ_Ｔ５プロモーターのいずれかに位置する領域、およびｉｓｐＢ遺伝子の先端を増幅するように選択した（図８）。ＰＣＲ反応は、実施例１に記載の通りに実施した。ＰＣＲの結果（図８、レーン５および６）は、Ｐ１ Ｐ_Ｔ５プロモーター配列のサイズに相当する、予想されるサイズ（２０３ｂｐ）のバンド生成に基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からのカナマイシン選択可能マーカーの除去、および染色体のｉｓｐＢ遺伝子の最前部におけるＰ_Ｔ５プロモーター断片の存在を示した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照株のβ−カロテン産生は、実施例８に記載の分光分析法を使用して比較した（図９）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢにおけるβ−カロテン産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照株（図９）におけるそれより３．４倍高かった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉ Ｐ_Ｔ５−ｉｓｐＢにおけるβ−カロテン産生は、親菌株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐ_Ｔ５−ｄｘｓ Ｐ_Ｔ５−ｉｄｉと比較したとき、およそ１０％増加した。

本組み合わせＰ１形質導入方法は、強力プロモーターの制御下にある、β−カロテン産生を増加することができるｉｓｐＢ遺伝子の単離を初めて可能にした。イソプレノイドキノン類の側鎖の前駆体を供給した、ＩｓｐＢ（酵素オクタプレニル二リン酸シンターゼ）は、カロテノイド生合成経路（図１）から、ＦＰＰ前駆体を失わせると予想されるため、β−カロテン産生を増加させるためのｉｓｐＢの単離は、予想外であり、また自明ではない結果であった。ファージＴ５強力プロモーターの制御下にある、ｉｓｐＢ遺伝子の過剰
発現がいかにしてβ−カロテン産生を増加するかというメカニズムは、まだ明白ではない。しかし、結果から、ＩｓｐＢは、カロテノイド生合成経路のフラックスを増加できることが示唆される。組み合わせ形質導入は、生合成経路最適化における新しい遺伝子を同定するための強力なツールである。

図面の簡単な説明、配列記述、および生物学的寄託
イソプレノイド／カロテノイド生合成経路を示す図である。 スタッキング形質を、並列組み合わせ様式で、ｉｎ ｖｉｖｏ染色体操作するための、本発明の方法を示す図である。 １つまたは２つのＰＣＲ断片を使用して、線状ＤＮＡを染色体に組み込むための、本発明の方法を示す図である。 プラスミドｐＳＵＨ５の特徴を示す図である。 プラスミドｐＫＤ４６の特徴を示す図である。 プラスミドｐＰＣＢ１５の特徴を示す図である。 本発明の方法により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ−カロテンレベルを上昇させるためのスキームを示す図である。 カナマイシン耐性マーカーの、染色体からの除去、染色体組み込みを検証するアガロースゲルを示す図である。 本方法により操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で産生された、上昇したレベルのβ−カロテンを示す図である。

【配列表】

Claims (20)

1. ａ）（ｉ）核酸組み込み断片、
   （ｉｉ）リコンビナーゼに敏感に反応する特異的リコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカー、
   （ｉｉｉ）ドナー細胞染色体の異なる部分と相同性を有するホモロジーアームを含んでなる、多数の組み込みカセットを提供し、
   ｂ）少なくとも１つのドナー細胞を、その染色体の組み込みのために（ａ）の組み込みカセットで形質転換し、
   ｃ）（ｂ）の形質転換されたドナー細胞を、ファージに感染させ、ここで前記ファージは複製し、前記ドナー細胞は溶解され、
   ｄ）（ｃ）のドナー細胞の溶解によって放出されたファージを単離し、
   ｅ）（ａ）の異なる組み込みカセットを担持する（ｃ）のドナー細胞の溶解によって放出された、単離されたファージを混合し、
   ｆ）受容細胞を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで前記組み込みカセットはそれぞれ、ホモロジーアームと相同な位置で受容細胞染色体に組み込まれて、形質導入された受容細胞を生じ、
   ｇ）形質導入された受容細胞を、前記選択可能マーカーに基づいて、選択し、
   ｈ）第１の過剰生産菌株を同定するために、前記遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｇ）の受容細胞をスクリーニングし、
   ｉ）前記染色体に組み込まれた組み込みカセットから前記選択可能マーカーを切除する、（ｈ）の第１の過剰生産菌株におけるリコンビナーゼを活性化し、
   ｊ）（ｉ）の第１の過剰生産菌株を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで前記組み込みカセットはそれぞれ、前記ホモロジーアーム上の相同点で、前記受容細胞染色体に組み込まれ、
   ｋ）第２の過剰生産菌株を同定するために、前記遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｊ）の感染した第１の過剰生産菌株をスクリーニングし、
   ｌ）前記第１および第２の過剰生産菌株により産生された遺伝子最終産物のレベルを比較し、それによって前記遺伝子最終産物の産生が最適化されることを含んでなる、遺伝子最終産物の産生を最適化する方法。
2. 前記核酸組み込み断片は、プロモーター、遺伝子、突然変異した遺伝子、破壊された遺伝子、コード領域、および非コード領域からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記組み込みカセットは、一般構造５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−３’を有し、ここで
   （ｉ）ＲＲ１は、第１のホモロジーアームであり、
   （ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに敏感に反応する組み換え部位であり、
   （ｉｉｉ）ＳＭは、選択可能マーカーをコードするＤＮＡ断片であり、
   （ｉｖ）Ｙは、第１の発現可能ＤＮＡ断片であり、そして
   （ｖ）ＲＲ２は、第２のホモロジーアームである、
   請求項１に記載の方法。
4. 前記ドナー細胞および前記受容細胞は、細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 前記ドナー細胞および前記受容細胞は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈ
   ｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記ファージは、Ｐ１、Ｐ２、ラムダ、φ８０、φ３５３８、Ｔ１、Ｔ４、Ｐ２２、Ｐ２２誘導体、ＥＳ１８、Ｆｅｌｉｘ“ｏ”、Ｐ１−ＣｍＣｓ、Ｆｆｍ、ＰＹ２０、Ｍｘ４、Ｍｘ８、ＰＢＳ−１、ＰＭＢ−１、およびＰＢＴ−１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記遺伝子最終産物は、イソプレノイド類、テルペノイド類、テトラピロール類、ポリケチド類、ビタミン類、アミノ酸、脂肪酸、タンパク質、核酸、炭水化物、抗菌薬、抗癌剤および生物代謝物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記最適化を改良するために、前記ステップ（ｆ）〜（ｌ）が繰り返され、（ｆ）の受容細胞は、（ｋ）の第２およびその後の過剰生産菌株である、請求項１に記載の方法。
9. リコンビナーゼおよびリコンビナーゼ部位システムは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、Ｒ／ＲＳ、Ｇｉｎ／ｇｉｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔ、ｐＳＲ１システム、ｃｅｒシステム、およびｆｉｍシステムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記受容細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の方法。
11. 前記ホモロジーアームは、約５〜約１００塩基である、請求項１に記載の方法。
12. 前記ホモロジーアームは、前記ドナー細胞染色体の一部と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
13. ａ）（ｉ）プロモーター、
    （ｉｉ）リコンビナーゼに敏感に反応する特異的リコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカー、
    （ｉｉｉ）Ｐ１ドナー細胞染色体の異なる部分と相同な領域、
    を含んでなる、多数の組み込みカセットを提供し、
    ｂ）少なくとも１つのドナー細胞を、その染色体の組み込みのために（ａ）の組み込みカセットで形質転換し、
    ｃ）（ｂ）の形質転換されたドナー細胞を、Ｐ１ファージに感染させる工程であって、
    前記ファージは複製し、前記ドナー細胞は溶解され、
    ｄ）（ｃ）のドナー細胞の溶解によって放出されたファージを単離し、
    ｅ）（ａ）の異なる組み込みカセットを担持する（ｃ）の一組のドナー細胞の溶解によって放出された、同数の単離ファージを混合し、
    ｆ）受容細胞を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで前記組み込みカセットはそれぞれ、ホモロジーアームと相同な位置で受容細胞染色体に組み込まれ、
    ｇ）形質導入された受容細胞を、前記選択可能マーカーに基づいて、選択し、
    ｈ）第１の過剰生産菌株を同定するために、前記遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｆ）の受容細胞をスクリーニングし、
    ｉ）前記染色体に組み込まれた組み込みカセットから前記選択可能マーカーを切除する、（ｈ）の第１の過剰生産菌株におけるリコンビナーゼを活性化し、
    ｊ）（ｉ）の第１の過剰生産菌株を、（ｅ）の単離されたファージの混合物に感染させ、ここで前記組み込みカセットはそれぞれ、前記ホモロジーアーム上の相同点で、前記受容細胞染色体に組み込まれ、
    ｋ）第２の過剰生産菌株を同定するために、前記遺伝子最終産物の最高レベルについて、（ｊ）の第１の過剰生産菌株をスクリーニングし、
    ｌ）第１および第２の過剰生産菌株により産生された遺伝子最終産物のレベルを比較する工程であって、それによって前記遺伝子最終産物の産生が最適化されることを含んでなる、遺伝子最終産物の産生を最適化する方法。
14. 前記プロモーター領域は、ドナー細胞または受容細胞以外の細胞に由来する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記プロモーターは、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λＰ_Ｌ、λＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、Ｐ_Ｔ５、およびｔｒｃからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記プロモーターはＰ_Ｔ５である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記ドナー細胞および受容細胞は、前記イソプレノイド生合成経路を含む、遺伝子を有する、請求項１３に記載の方法。
18. 前記組み込みカセットは、プロモーターおよびイソプレノイド生合成経路の遺伝子を作動可能に連結するために、受容体染色体に組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
19. 前記イソプレノイド生合成経路の遺伝子は、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｙｇｂＰ、ｙｃｈＢ、ｙｇｂＢ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡ、ｌｙｔＢ、ｇｃｐＥ、ｉｓｐＡ、ｉｓｐＢ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、ｃｒｔＲ、およびｃｒｔＺからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記遺伝子最終産物は、アンテラキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、キャプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、ジデヒドロリコペン、β−カロテン、ζ−カロテン、δ−カロテン、γ−カロテン、ケト−γ−カロテン、ψ−カロテン、ε−カロテン、β，ψ−カロテン、トルレン、エキネノン、ガンマ−カロテン、ゼータ−カロテン、α−クリプトキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクテュカキサンチン（ｌａｃｔｕｃａｘａｎｔｈｉｎ）、ルテイン、リコペン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリディニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ）、酢酸ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、ビオラキ
    サンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、およびＣ３０−カロテノイドからなる群から選択されるカロテノイドである、請求項１８に記載の方法。