JP2006510374A - 染色体操作のための方法 - Google Patents
染色体操作のための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006510374A JP2006510374A JP2004561467A JP2004561467A JP2006510374A JP 2006510374 A JP2006510374 A JP 2006510374A JP 2004561467 A JP2004561467 A JP 2004561467A JP 2004561467 A JP2004561467 A JP 2004561467A JP 2006510374 A JP2006510374 A JP 2006510374A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- recombination
- promoter
- region
- site
- bacterial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
クローニングステップを必要とせずに、外来遺伝因子を細菌染色体内に組み込むための1つの方法が提供される。この方法は、組換えやすい細菌宿主内の、λ−Redリコンビナーゼ系の存在に依存する。少なくとも2つの直鎖状組み換え因子、もしくはコンストラクトが、相同的組み換えによって細菌染色体での配向補正でアセンブルされる、組換えやすい宿主へと同時形質転換される。形質転換体の選択に用いる選択マーカーは、後に部位特異的組み換えの作用によって切断される。
Description
本出願は、2002年12月19日に出願された米国仮特許出願第60/434,602号明細書の利益を主張するものである。
本発明は細菌学分野に関する。特に、本発明は生体内での染色体操作に関連した方法に関する。
細菌の全ゲノム配列を利用でき、かつ、その代謝経路が解明されたことで、工業的に関心が持たれている化合物の製造目的で微生物を操作するための知識を活用できるようになっている。細菌に工業用化合物を産生させるには、生物ゲノムに起こる変化を効率よく操作できる必要がある。遺伝因子の追加、欠如、修飾といった変化を操作することが、時間のかかる難題であることが立証されることも多かった。そのような修飾の1つに、代謝経路にあるしかるべき遺伝子の発現を遺伝的に操作して修飾することがあげられる。
遺伝子の発現を調節するには、さまざまな方法がある。細菌の代謝操作では、一般に、優勢または条件付きのプロモーターの制御下で多コピー型ベクターを用いて所定の遺伝子を発現させる。この工業用途での代謝操作法には欠点がいくつかある。分離が不安定であるがゆえにベクターを保持しにくいことがある。また、ベクターの負担が原因で、細胞の生存や成長に対する悪影響が認められることがある。ベクター上で所望の遺伝子の最適な発現レベルを制御することも困難である。多コピー型ベクターの使用に伴って望ましくない影響がおよぶのを避けるために、バクテリオファージλ、トランスポゾン、もしくは所定の遺伝子を含む他の適当なベクターの単独挿入による相同的組み換えを用いる染色体組み込みのアプローチがとられている。しかしながらこの方法にも、組み換えに先んじて所定の遺伝子を適当なベクターに入れるために、複数のクローニングステップを用いなければならないなどの欠点がある。もう1つの欠点は、挿入後の遺伝子が切断時に失われてしまう可能性があるという不安定性にある。最後に、この方法では、挿入できる数の点で限度がある上、染色体上にて挿入部位の位置を制御できない。
最近になって、λ−Red組換え系を用いて染色体遺伝子をPCRで不活性化することについての説明がなされている(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7)。
マーフィー(Murphy)ら(上掲、1998)は、λ−Red系を使用することと、それが細菌染色体と、エレクトロポレーションによって取り込まれた直鎖状2本鎖(ds)DNA分子との組み換えをどのように促進するのかを明らかにした。サルモネラ(Salmonella)や、腸管病原性大腸菌および腸管出血性大腸菌ををはじめとする細菌のいくつかの菌株は、この系を用いて首尾よく形質転換された(ポテーテ(Poteete),A.、上掲、2001)。しかしながら、マーフィー(Murphy)ら(上掲、1998)の方法では、組み換えの効率を最大にするのに、相同的にオーバーラップしている数百もの塩基を用いた。
スチュワート(Stewart)ら(特許文献1)は、細菌リコンビナーゼ、すなわちRecETおよび/またはλ−Red系を用いて、標的のDNAフラグメントをベクターにクローニング、かつサブクローニングすることについて教示している。この標的DNAには、ベクター上の対応するホモロジーアームと相同性が共通の末端が含まれる。この標的DNAをベクターに付加するにはリコンビナーゼによる相同的組み換えを利用する。特許文献1に記載されたこれらの方法は、標的DNAをベクターに付加することに限定されている。特許文献1には、2つのフラグメントを用いる染色体操作法について何ら教示されておらず、プロモーターと調節領域とを染色体的に操作して生合成経路にある所望の遺伝子および/またはオペロンの発現レベルを人為的に制御するのに有用な方法も教示されていない。シャベロシュ(Chaveroche)ら(上掲)による同様のアプローチでは、後に糸状菌のアスペリルスニドゥラス(Asperillus nidulas)ゲノムの相同的組み換えによる形質転換に用いられるコスミドの修飾に、λ−Red系を利用している。どちらの例も、λ−Red(または機能的に同等の)系を用いて、後に宿主のゲノムとの相同的組み換え、もしくは染色体上の形質転換に用いられるベクターを遺伝子修飾することについて使用を明らかにしている。
スチュワート(Stewart)ら(特許文献2)は、RecETおよび/またはλ−Red系遺伝子産物を用いて、2つのDNA分子(相同または「ホモロジーアーム」の2つの領域)間の相同的組み換えを触媒することについて教示している。特許文献2には、3回の相同的組み換え(2つの直鎖状DNA分子と細菌染色体との間の組み換え)に基づく方法は教示されておらず、宿主細菌の生合成経路を染色体的に操作するのに適した方法も教示されていない。スチュワート(Stewart)らの両特許に記載された方法では、発現可能なDNAフラグメントを選択マーカーと共に一斉に宿主細胞の染色体に組み込むために、相同的組み換えの前に1つもしくはそれ以上のクローニングステップがさらに必要になろう。
ザン(Zhang)ら(非特許文献8)は、sbcA陽性大腸菌株でのRecETリコンビナーゼ系を用いることについて教示し、標的のDNAフラグメントをベクターにクローニングおよびサブクローニングするための相同的組み換えを促進できることを明らかにした。ザン(Zhang)らは、λ−Redに関するデータを何ら提示していない上、事前のクローニングステップを必要とせずに、プロモーターもしくは遺伝子を選択マーカーと共にワンステップで組み込めるようにする、3回の相同的組み換え(2つのDNAフラグメントでの方法)を用いた染色体操作の方法も教示していない。
マーフィー(Murphy)ら(上掲、2000)は、λ−Red系を大腸菌で用いることについて教示しており、事前のクローニングステップを必要としない、遺伝子ノックアウトの作出時におけるこの系の有用性を明らかにしている。λ−Red系大腸菌のを組換えやすい菌株と比較したところ、組み換え率が約10〜100倍高くなる、はるかに効率的なものであることが明らかになった。しかしながら、当該文献に記載の方法で効率的な形質転換を行うには、1つの直鎖状dsDNAフラグメントの各末端に約1000bpの相同な塩基対を使用する必要があった。さらに、当該文献に記載の方法の目的は、遺伝子ノックアウトによるオープンリーディングフレーム(ORF)の機能的分析にあり、医薬品開発用の重要な未知の遺伝子を同定できはしたが、これはプロモーターおよび/または遺伝子の染色体組み込み用のものではなかった。
パティ(Pati)ら(特許文献3)は、目的とする相同的組み換えを用いて、遺伝子配列を生体内で変化させることについて教示している。彼らの複雑な多段階的方法は、精製された大腸菌RecAタンパク質によって生体外でコートされた2つの1本鎖ポリヌクレオチドを使用することに立脚するものである。パティ(Pati)らの方法による組み換えに好ましい標的は、RecA/1本鎖DNAに仲介された生体外で起こる反応を伴う、プラスミドまたは他のベクターなどの染色体上の配列である。この修飾後のベクターを処理し、標的を宿主細胞に導入する前にRecAタンパク質を取り除く。本発明の方法は、上記の方法よりも簡便かつ時間もかからずに、直接宿主細胞のゲノムを標的とするものである。
したがって、解決すべき課題は、大腸菌などの細菌のプロモーターおよび遺伝子を生体内で染色体操作する、手軽なワンステップの方法に有用な方法および材料を提供することである。相同的組み換えを用いて、染色体遺伝子、プロモーター、他の核酸調節因子を直接修飾できるようにする簡単なワンステップの機序は存在しない。
本発明は、大腸菌染色体の任意の標的遺伝子の前に位置する、任意のプロモーター/調節領域を安定的に組み込んで遺伝子の発現制御を可能にする、簡単で効率的なワンステップの方法(従来の方法で用いられているクローニングのステップを含まない)を提供するものである。さらに、本発明の方法は、PCRで生成された2つの直鎖状DNAフラグメントと宿主細胞の染色体との間で起こる3回の相同的組み換えによる、機能的DNA分子の目的とする付加および/または除去を利用して宿主細胞内の生化学的経路を生成および/または操作する目的で染色体修飾のサイクルを繰り返すことも可能にする。
細菌の生合成経路を操作するにあたって本発明の染色体組み込み方法が有用であることを、イソプレノイド/カロテノイド生合成を一例として用いて示す。イソプレノイド経路に関与する律速酵素をコードする鍵遺伝子のプロモーターを、本発明の方法で操作する。この遺伝子修飾によって、β−カロテンの産生量が増加した。大腸菌内では通常見られない、カロテノイドの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子も、本発明の方法で強力なプロモーターの制御下で宿主染色体上の特定の位置に付加される。この方法を用いることで、大腸菌内で複数の染色体を修飾することができるが、このことは生合成経路を工業的な目的で操作する際に時に重要である。このように、本発明の方法を、生合成経路の操作において有用な複数の染色体修飾に使用することができる。PCRで生成された2つの直鎖状フラグメントを用いた、ファージλ−Redリコンビナーゼ系の存在下での相同的組み換えの方法を、図1で説明する。この方法はまた、部位特異的リコンビナーゼを利用して選択マーカーを除去し、容易かつ効率的な生体内での染色体操作を可能にすることについても含む。
したがって、本発明は、選択マーカーを欠いた発現可能なDNAフラグメントの、細菌染色体への指向性組込みのための方法であって、
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
X−RR3
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達することであり、
(式中、(i)Xは、第2の組み換え領域に相同性を有する発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−X−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより発現可能なDNAフラグメントが、選択マーカーを欠いて、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
X−RR3
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達することであり、
(式中、(i)Xは、第2の組み換え領域に相同性を有する発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−X−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより発現可能なDNAフラグメントが、選択マーカーを欠いて、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
同様に、本発明は、選択マーカーを欠いた発現可能なDNAフラグメントの、細菌染色体への指向性組込みのための方法であって、
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−Y−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)Yは、第1の発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(v)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−X−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)Xは、第2の組み換え領域に相同性を有する、第2の発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)λ−Redリコンビナーゼ系を内在させ、かつ細菌染色体を有している、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−Y−RR2−X−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより第1、および第2の発現可能なDNAフラグメントは、選択マーカーを欠いて、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−Y−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)Yは、第1の発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(v)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−X−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)Xは、第2の組み換え領域に相同性を有する、第2の発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)λ−Redリコンビナーゼ系を内在させ、かつ細菌染色体を有している、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−Y−RR2−X−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより第1、および第2の発現可能なDNAフラグメントは、選択マーカーを欠いて、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
他の一実施形態では、本発明は、細菌染色体プロモーターに代わる外来のプロモーターの、組換えやすい宿主細胞内での組み込みのための方法であって、
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−FP−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)FPは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する細菌プロモーターの上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する上記細菌プロモーターの下流にある、第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−FP−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させ、選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーターが細菌プロモーターに代わって、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−FP−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)FPは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する細菌プロモーターの上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する上記細菌プロモーターの下流にある、第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−FP−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させ、選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーターが細菌プロモーターに代わって、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、連鎖していない外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームの、組換えやすい宿主細胞内にある細菌染色体への組み込みのための方法であって、
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FP−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)FPは、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−FO−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)FOは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する、上記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FP−RR2−FO−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームが、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FP−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)FPは、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−FO−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)FOは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する、上記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FP−RR2−FO−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームが、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、調節領域、および外来のオープンリーディングフレームを含んでなる外来遺伝子の、組換えやすい宿主細胞内にある細菌染色体への組み込みのための方法であって、
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FG−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)FGは、組換えやすい宿主細胞にとって外来の、調製領域を含んでなる遺伝子であり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−FO−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達することであり、
(式中、(i)FOは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する、上記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FG−RR2−FO−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームが、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
a)5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FG−RR2−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第1の組み換え因子を調達し、
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基の第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)FGは、組換えやすい宿主細胞にとって外来の、調製領域を含んでなる遺伝子であり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基の第2の組み換え領域である)
b)5’から3’方向に、
5’−FO−RR3−3’
の一般的な構造を有する、少なくとも1つの第2の組み換え因子を調達することであり、
(式中、(i)FOは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基の第3の組み換え領域である)
c)細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
(i)上記第1の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)上記第3の組み換え領域に相同性を有する、上記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第2の染色体領域と、
を含んでなり、
d)第1、および第2の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
5’から3’方向に、
5’−RR1−RS−SM−RS−FG−RR2−FO−RR3
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第1と第2の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
f)(e)の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームが、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明ならびに添付の配列の説明から、本発明についてなお一層深く理解することができよう。
下記の配列は、米国特許法施行規則第1.821条〜1.825条(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に準拠し、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)、欧州特許庁(EPO)および特許協力条約(PCT)の配列表要件(施行規則第5.2および49.5(a−bis)ならびに実施細則第208号および附属書C)に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のデータに用いる記号ならびに形式は、米国特許法施行規則第1.822条に記載の規則に準拠する。
配列の説明と生物学的寄託物
配列番号1は、「T1(dxs)」と表される、カナマイシン耐性遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲;ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048743)からPCRで増幅するのに用いられる、2つのプライマー配列の第1の配列であり、ispA終止コドンの上流領域にある配列にマッチするように選択された「h1」と表されるホモロジーアームを含む(図2)。
配列番号1は、「T1(dxs)」と表される、カナマイシン耐性遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲;ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048743)からPCRで増幅するのに用いられる、2つのプライマー配列の第1の配列であり、ispA終止コドンの上流領域にある配列にマッチするように選択された「h1」と表されるホモロジーアームを含む(図2)。
配列番号2は、「B1(T5)」と表される、カナマイシン耐性遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、プラスミドpKD4からPCRで増幅するのに用いられる、2つのプライマー配列の第2の配列であり、ファージT5プロモーター(PT5)のDNAフラグメントの5’−末端領域にある配列にマッチするように選択された「h2」と表されるホモロジーアームを含む(図2)。
配列番号3は、「T2(T5)」と表される、−10および−35コンセンサス配列、lacオペレーター(lacO)、リボソーム結合部位(rbs)を含んでなるPT5プロモーターを含む直鎖状DNAフラグメントを、プラスミドpQE30(キアゲン(Qiagen Inc.)、カリフォルニア州バレンシア(Valencia,CA))からPCRで増幅するのに用いられる、2つのプライマー配列の第1の配列である(図2)。このプライマーは、後に、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターのdxs遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅によって検証するのに用いられる(図6)。
配列番号4は、「B2(dxs)」と表される、−10および−35コンセンサス配列、lacオペレーター(lacO)、リボソーム結合部位(rbs)を含んでなるPT5プロモーターを含む直鎖状DNAフラグメントを、pQE30(キアゲン(Qiagen,Inc.))からPCRで増幅するのに用いられる、2つのプライマー配列の第2の配列であり、dxs開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「h3」と表されるホモロジーアームを含む(図2)。
配列番号5は、「T1」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターのdxs遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅によって検証するのに用いられるプライマーである(図6)。
配列番号6は、「T2」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターのdxs遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅によって検証するのに用いられるプライマーである(図6)。
配列番号7は、「T3」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターのdxs遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅によって検証するのに用いられるプライマーである(図6)。
配列番号8は、「T4」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターのdxs遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅によって検証するのに用いられるプライマーである(図6)。
配列番号9は、「T(idi)」と表される、カナマイシン耐性選択マーカーを含むDNAフラグメントを、プラスミドpKD4からPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第1のプライマーであり、ygfU終止コドンの上流領域にある配列にマッチするように選択された「h4」と表されるホモロジーアームを含む(図8)。
配列番号10は、「B(idi)」と表される、−10および−35コンセンサス配列、lacオペレーター(lacO)、リボソーム結合部位を含んでなるPT5プロモーターを含むDNAフラグメントを、pQE30(キアゲン(Qiagen,Inc.))からPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第2のプライマーであり、idi開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「h5」と表されるホモロジーアームを含む(図8)。
配列番号11は、「T5」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターの、idi遺伝子上流への染色体組み込みを確認する、PCR分析のために用いられるプライマーである(図9)。
配列番号12は、「T6」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびPT5プロモーターの、idi遺伝子上流への染色体組み込みを確認する、PCR分析のために用いられるプライマーである(図9)。
配列番号13は、「Tt5」と表される、−10および−35コンセンサス配列、lacO、リボソーム結合部位(rbs)を含んでなるPT5プロモーター因子を含むDNAフラグメントを、pQE30(キアゲン(Qiagen,Inc.))からPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第1のプライマーである。
配列番号14は、「Bt5」と表される、−10および−35コンセンサス配列、lacO、リボソーム結合部位(rbs)を含んでなるPT5プロモーター因子を含むDNAフラグメントを、pQE30(キアゲン(Qiagen,Inc.))からPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第2のプライマーである。
配列番号15は、ピルビン酸とD−グリセルアルデヒド3−リン酸の、D−1−デオキシキシルロース5−リン酸への縮合を触媒する、メチロモナス(Methylomonas) 16a由来のD−1−デオキシキシルロース−5−リン酸シンターゼ(DXS)酵素をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)のヌクレオチド配列である。
配列番号16は、「T1(dxs16a)」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターを含むDNAフラグメントを、pSUH5からPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第1のプライマーであり、大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域にある配列にマッチするように選択された「h6」と表されるホモロジーアームを含む(図11)。
配列番号17は、「B1(dxs16a)」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターを含むDNAフラグメントを、pSUH5からPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第2のプライマーであり、dxs(16a)開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「h7」と表されるホモロジーアームを含む(図11)。
配列番号18は、「T2(dxs16a)」と表される、メチロモナス(Methylomonas) dxs(16a)遺伝子を含むDNAフラグメントを、メチロモナス(Methylomonas) 16aゲノムDNAからPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第1のプライマーであり、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターの3’−末端領域にある配列にマッチするように選択された「h8」と表されるホモロジーアームを含む(図11)。
配列番号19は、「B2(dxs16a)」と表される、メチロモナス(Methylomonas) dxs(16a)遺伝子を含むDNAフラグメントを、メチロモナス(Methylomonas) 16aゲノムDNAからPCRで増幅するのに用いられる、1つのプライマー対の第2のプライマーであり、大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域にある配列にマッチするように選択された「h9」と表されるホモロジーアームを含む(図11)。
配列番号20は、「T7」と表される、融合kan−PT5プロモーターとdxs(16a)遺伝子の染色体組み込みを確認するPCR分析のために用いられるプライマーである(図12)。
配列番号21は、「T8」と表される、融合kan−PT5プロモーターとdxs(16a)遺伝子の染色体組み込みを確認するPCR分析のために用いられるプライマーである(図12)。
配列番号22は、「T9」と表される、融合kan−PT5プロモーターとdxs(16a)遺伝子の染色体組み込みを確認するPCR分析のために用いられるプライマーである(図12)。
配列番号23は、「T1(crtE)」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターを含むDNAフラグメントをpSUH5からPCRで増幅するのに用いられる1つのプライマー対の第1のプライマーであり、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列にマッチするように選択された「h10」と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号24は、「B1(crtE)」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターを含むDNAフラグメントを、pSUH5からPCRで増幅するのに用いられる1つのプライマー対の第2のプライマーであり、crtE開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「h11」と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号25は、「T2(crtE)」と表される、P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子を含むDNAフラグメントを、pPCB15(図5)からPCRで増幅するのに用いられる1つのプライマー対の第1のプライマーであり、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターの3’−末端領域にある配列に適合するように選らばれた「h8」と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号26は、「B2(crtE)」と表される、P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子を含むDNAフラグメントを、pPCB15からPCRで増幅するのに用いられる1つのプライマー対の第2のプライマーであり、大腸菌染色体上の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列に適合するように選らばれた「h12」と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号27は、「T10」と表される、融合カナマイシンマーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子の組み込み部位の上流領域にある162塩基に相当するプライマー配列(26bp)を含むDNAフラグメントを、大腸菌PT5−crtEからPCRで増幅するのに用いられるプライマーである(図13)。
配列番号28は、「B1(crtIB)」と表される、融合カナマイシンマーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子を、大腸菌PT5−crtEから増幅するのに用いる、1つのプライマー対の第2のプライマーで、crtI開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「h13」と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号29は、「T2(crtIB)」と表される、P.ステワルティ(stewartii) crtIBに結合した遺伝子対を、プラスミドpPCB15からPCRで増幅するのに用いる、1つのプライマー対の第1のプライマーであり、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtEのDNAフラグメントの3’−末端領域にある配列にマッチするように選択された「h14」と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号30は、「B2(crtIB)」と表される、P.ステワルティ(stewartii) crtIBに結合した遺伝子対を、プラスミドpPCB15からPCRで増幅するのに用いる、1つのプライマー対の第2のプライマーであり、大腸菌染色体上の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列にマッチするように選択された「h12」(「B2(crtE)」プライマーに使われたアームと同じ)と表されるホモロジーアームを含む(図13)。
配列番号31は、「T11」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE、P.ステワルティ(stewartii) crtIBオペロンの、大腸菌染色体上の81.2分に位置するオペロン間領域への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅で確認するのに用いるプライマーである(図14)。
配列番号32は、「T12」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE、P.ステワルティ(stewartii) crtIBオペロンの、大腸菌染色体上の81.2分に位置するオペロン間領域への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅で確認するのに用いるプライマーである(図14)。
配列番号33は、「T13」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE、P.ステワルティ(stewartii) crtIBオペロンの、大腸菌染色体上の81.2分に位置するオペロン間領域への組み込みの染色体コンストラクトを、PCR増幅で確認するのに用いるプライマーである(図14)。
配列番号34は、ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048743を有し、FRT部位特異的リコンビナーゼ認識配列によって隣接されたカナマイシン耐性遺伝子を含むDNAフラグメントを増殖するためのPCRテンプレートとして用いられた、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)のヌクレオチド配列である。
配列番号35は、ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048746を有する、プラスミドpKD46(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)のヌクレオチド配列である。プラスミドpKD46は、λ−Redリコンビナーゼ系の構成要素を発現する。
配列番号36は、融合カナマイシン耐性遺伝子−PT5プロモーターのPCR増殖のためのテンプレートとして用いられた、プラスミドpSUH5のヌクレオチド配列である。
配列番号37は、カロテノイド生合成に関与するいくつかの遺伝子を含むレポータープラスミドコンストラクトとして、またcrtEおよびcrtIB遺伝子のPCR増殖のためのテンプレートとして用いられた、プラスミドpPCB15のヌクレオチド配列である。
出願人らは、「特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条件の下、下記の生物学的寄託を行った。
本願明細書で使用する場合、「ATCC」とは、アメリカ合衆国、バージニア州20110−2209、マナサス、ユニバーシティーブールバード10801(10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110−2209)のATCCに所在する米国菌株保存機関の国際寄託当局(American Type Culture Collection International Depository Authority)を意味する。「国際寄託の表示」(International Depository Designation)は、ATCCでの寄託培養の受入番号である。
リストに載った寄託物は、指示された国際受託者のもとで、少なくとも30年間保存され、それを開示する特許の付与に基づいて、一般に公開されるであろう。寄託物の可用性は、政府の措置により付与される特許権の特例において、主たる発明を実行することの許諾を構成するものではない。
本発明は、プロモーターおよび/または発現可能なDNAフラグメントの、細菌染色体内への、1つのステップによる指向性組込みのための方法に関する。この方法は、プロモーター、外来遺伝子、もしくはオープンリーディングフレームといった、染色体組み込みされる、さまざまな、発現可能なDNA因子を運ぶ、少なくとも2つの直鎖状2本鎖(ds)の組み換え因子、もしくはコンストラクトを用いる。各々の組み換え因子は、他の組み換え因子、もしくは細菌染色体の部分のどちらか一方と相同な領域を有する組み換え領域を含んでなる。本発明の方法の類ない1つの特徴は、プロモーター、外来遺伝子、もしくはオープンリーディングフレームといった、さまざまな発現可能なDNA因子を、マーカーがもはや必要でない場合の簡単な切断を可能にする部位特異的組み換え部位に囲まれた他の組み換え因子上にある1つの選択マーカーと組み合わせて、1つの組み換え因子上に染色体組み込みするための、少なくとも2つの直鎖状2本鎖(ds)組み換え因子の使用である。本発明の方法のもう1つの特徴は、組換えやすい宿主内での、λ−Redリコンビナーゼ系の使用である。λ−Red系は、直鎖状組み換え因子と、比較的小さな相同領域上の染色体との間の効果的な組み換えを容易にすることによって、この方法の有用性を高める。本発明の方法は、未変性の細菌染色体プロモーターの、外来、もしくは人工プロモーターとの置換を容易にする。プロモーターの付加および/または置換は、外来遺伝子を調節プロモーターの制御化に置くことによる調節可能な発現のための、外来遺伝子の染色体組み込みと併用され得る。
本発明の方法は、1つもしくはそれ以上の外来遺伝子の染色体組み込みを含む、プロモーターの置換以外の付加的な染色体修飾を実施するために使用され得る。これら修飾の機能的な発現は、β−カロテン(オレンジ色)産生量の増加、もしくはリコピン(ピンク色)の産生量によって測定された。
この開示の中では、多数の専門用語と略語を使用する。これを以下のとおり定義する。
「オープンリーディングフレーム」をORFと省略する。
「ポリメラーゼ連鎖反応」をPCRと省略する。
「指向性組込み」、もしくは「標的組込み」という用語は、発現可能なDNAフラグメントの、細菌染色体への組み込みを意味し、それによって、発現可能なDNAおよび染色体を含んでなるカセット上の相当する相同的領域により組み込みが達成される。
「発現可能なDNAフラグメント」という用語は、宿主細胞の形質変化に影響を与える任意のDNAを意味する。すべての「発現可能なDNAフラグメント」には、例えば調節因子を含んでなるDNA、単離プロモーター、オープンリーディングフレーム、遺伝子またはそれらの組み合わせを含み得る。
「組み換え因子」という用語は、組換えやすい細菌宿主の形質転換に有用な、直鎖状の核酸コンストラクトを意味する。本発明の組み換え因子は、選択マーカー、発現可能なDNAフラグメントおよび細菌染色体上もしくは他の組み換え因子上の領域に相同性を有する組み換え領域といった、さまざまな遺伝因子を含んでもよい。
「組み換え領域」および「ホモロジーアーム」という用語は、同義的に使われ、2つの異なる核酸の特定の領域にある、実質的には同じヌクレオチド配列を有する2つの核酸間の相同的組み換えを可能にするヌクレオチド配列を意味する。ホモロジーアームのヌクレオチド配列の好ましいサイズの範囲は、約10〜約50ヌクレオチドである。
「リコンビナーゼ」という用語は、相同的組み換えを刺激するために、単独で、もしくは共同で働く、1つもしくはそれ以上の酵素を意味する。「λ−Redリコンビナーゼ」、「λ−Redリコンビナーゼ系」および「λ−Red系」は、バクテリオファージλ遺伝子のexo、bet、gamによってコードされる酵素群を説明するのに同義的に使われる。この3つの遺伝子によってコードされる酵素は、通常、また直鎖状の組み換え因子を使用する場合は特に、比較的低い相同的組み換え率を有すると見なされる生物である大腸菌での相同的組み換え率を高めるために共に働く。
「部位特異的リコンビナーゼ系」という用語は、特異的ヌクレオチド配列(組み換えの標的部位)を認識し、組み換えの標的部位間の組み換えを触媒する、1つもしくはそれ以上の酵素を含んでなる系を説明するのに使用される。部位特異的組み換えは、外来性DNAの再配列、削除、もしくは導入の方法を提供する。部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連した組み換え標的部位の例は、いくつか名前を挙げると、フリッパーゼ(FLP)/FRT、Cre/lox、Xer/dif、Int/attである。本発明は、選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼの使用を説明する。FRT組み換え標的部位によって両端が隣接されている抗生物質耐性マーカーは、FLP部位特異的リコンビナーゼの発現により除去される。選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼの使用は、微生物経路の操作に必要な複数の染色体修飾を可能にし、入手可能な選択マーカーの数に制限されない(ヒュアン(Huang)ら、J.Bacteriol.、第179巻(第19号)、6076ページ〜6083ページ、(1997年))。
「選択マーカー」という用語は、その存在下で、人が特定の細胞型を同定して優先的に増殖させるのを可能にする遺伝子産物を意味する。
「組換えやすい細菌宿主」という用語は、機能的組み換え系を含み、遺伝子操作に有用な度合いの相同的組み換えが可能な細菌宿主を説明するのに使用される。
組み換え領域および細菌染色体上の相当する領域に適用した「相同」という用語は、同一の、もしくはほとんど同一の配列を共有するヌクレオチド配列を意味する。細菌染色体上の領域と組み換え領域間の相補的配列は、リコンビナーゼ系の存在下で、共同して相同的組み換えを経験することができる。好ましい組み換え領域、もしくはホモロジーアームは、細菌染色体上の相当する領域と同一の配列を有する領域で、約10〜約50bpの長さである。
本願明細書で使用する場合、「上流」という用語は、DNAの領域に関して使用されるとき、特定の遺伝子、もしくはヌクレオチドの配列の5’側を意味する。
本願明細書で使用する場合、「下流」という用語は、DNAの領域に関して使用されるとき、特定の遺伝子、もしくはヌクレオチドの配列の3’側を意味する。
「オペロン間染色体組み込み部位」という用語は、この最新の発明を用いる外来性DNAの組み込みを目的とし、また外来性DNAの組み込みが、宿主内の内在性オペロン、もしくは遺伝子の機能性を破壊しない場所である、染色体の部位を意味する。
「調節回路」という用語は、転写を増加、もしくは減少させるために物質(信号伝達分子)と相互に作用することができる、機能的に組み込まれたDNAを意味する。例えば、その物質は、オペレーター部位(プロモーターのRNAポリメラーゼ結合部位に近接した、もしくはそれと重複した特異的なDNA配列)と結合したリプレッサータンパク質であり得る。リプレッサーの結合は、関連した遺伝子の転写を妨げ、あるいは阻止する。逆に言えば、その物質は、RNAポリメラーゼ結合を促進する特異的なDNA配列と結合し、関連した遺伝子の転写を「活性化させ」、もしくは増加させる活性化タンパク質であってもよい。本発明では、「ポジティブな調節部位」という用語は、(単独で、もしくは物質との相互作用に呼応して)関連するコード配列の転写を増進させる、機能的に組み込まれたDNAを意味する。「ネガティブな調節部位」という用語は、(単独で、もしくは物質との相互作用に呼応して)関連するコード配列の転写を減少、もしくは阻止する、機能的に組み込まれたDNAを意味する。
本願明細書で使用する場合、「単離された核酸フラグメント」は、自然ではない、もしくは変性された合成のヌクレオチド塩基を場合により含む、1本鎖、もしくは2本鎖のRNAまたはDNAのポリマーである。DNAポリマーの形をとる単離された核酸フラグメントは、1つもしくはそれ以上のcDNA、ゲノムDNA、もしくは合成DNAのセグメントを含んでなるかもしれない。
「イソプレノイド」、もしくは「テルペノイド」という用語は、炭素数10のテルペノイド類ならびに、カロテノイド、キサントフィルといったそれらの派生物を含む、イソプレノイド経路由来の組成物および任意の分子を意味する。
「メチロモナス(Methylomonas) 16a株」および「メチロモナス(Methylomonas) 16a」(ATCC、PTA−2402、2000年8月22日に寄託された)という用語は同義的に使われ、メタンを基質として利用するそれらの能力で類のない、メタノトローフとして知られる生理学的な細菌群の細菌を意味する。
「メタノトローフ」という用語は、メタンを基質として利用することが可能な原核生物を意味する。メタンの、二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解の経路によってもたらされる。メタノトローフの典型的な例は、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコックス(Methylococcus)、メチロシヌス(Methylosinus)を含むが、この属に限定されるものではない。
「dxs」という用語は、ピルビン酸とD−グリセルアルデヒド3−リン酸の、D−1−デオキシキシルロース5−リン酸への縮合の触媒となる大腸菌dxs遺伝子によってコードされる、酵素のD−1−デオキシキシルロース5−リン酸を意味する。
「dxs(16a)」という用語は、ピルビン酸とD−グリセルアルデヒド3−リン酸の、D−1−デオキシキシルロース5−リン酸への縮合の触媒となるメチロモナス(Methylomonas) 16a株dxs遺伝子によりコードされる、酵素のD−1−デオキシキシルロース5−リン酸を意味する。
「idi」という用語は、イソペンテニル二リン酸をジメチルアリール二リン酸に転換する大腸菌idi遺伝子によりコードされる、酵素のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼを意味する。
本発明中の「3回の相同的組み換え」という用語は、2つの直鎖状核酸フラグメントの標的染色体への染色体組み込みという結果をもたらす、2つの直鎖状DNAフラグメントと標的染色体との間の、それらの相同的配列を通しての遺伝子組み換えを意味する。
「pPCB15」という用語は、本発明の方法を通して遺伝子的に操作される大腸菌内での、β−カロテンの産生を監視するレポータープラスミドとして用いられる、β−カロテン合成遺伝子、パントエアcrtEXYIBを含むプラスミドを意味する。
「pSUH5」という用語は、ファージT5プロモーター(PT5)領域を、pKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)のNdeI制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングすることにより作成されたプラスミドを意味する。それは、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター直鎖状DNA分子のPCR増幅のためのテンプレートプラスミドとして用いられた。
「PT5プロモーター」および「ファージT5プロモーター」という用語は、ファージT5由来の−10および−35コンセンサス配列、ラクトースオペレーター(lacO)、pQE30(キアゲン(Qiagen,Ink.))由来のリボソーム結合部位(rbs)を含んでなるヌクレオチド配列を意味する。
「ヘルパープラスミド」という用語は、λ−Redリコンビナーゼ系をコードするpKD46、もしくはFLP部位特異的リコンビナーゼ(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)をコードするpCP20を意味する。
「大腸菌」という用語は、大腸菌K−12の派生物に適用する場合には、MG1655(ATCC 47076)およびMC1061(ATCC 53338)株を意味する。
「パントエアステワルティ亜種ステワルティ(Pantoea stewartii subsp. stewartii)」という用語は、「パントエアステワルティ(Pantoea stewartii)」(ATCC 8199)と省略され、エルウィニアステワルティ(Erwinia stewartii)(メルゲール(Mergaert)ら、Int J.Syst.Bacteriol.、第43号、162〜173ページ(1993))という用語と同義的に使われる。
「パントエアcrtEXYIBクラスター」という用語は、パントエアステワルティ(Pantoea stewartii) ATCC 8199から増幅されたカロテノイド合成遺伝子、crtEXYIBを含む遺伝子クラスターを意味する。この遺伝子クラスターは、遺伝子crtE、crtX、crtY、crtI、crtBを含む。このクラスターはまた、crtB遺伝子に隣接し、反対の方向に組織化されているcrtZ遺伝子を含む。本発明中では、この遺伝子クラスターは、レポータープラスミドpPCB15上に位置し、さまざまな染色体修飾のβ−カロテン産生への効果を監視するのに用いられる。
「CrtE」という用語は、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸+イソペンテニル二リン酸をピロリン酸+ゲラニルゲラニル二リン酸へ転換するcrtE遺伝子によってコードされる、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ酵素を意味する。
「CrtY」という用語は、リコピンをβ−カロテンへ転換するcrtY遺伝子によってコードされる、リコピンシクラーゼ酵素を意味する。
CrtI」という用語は、4つの二重結合の導入により、フィトフルエン、ζ−カロテン、ヌロスポレンの中間体を通して、フィトエンをリコピンへ転換するcrtI遺伝子によりコードされる、フィトエンデヒドロゲナーゼ酵素を意味する。
「CrtB」という用語は、プレフィトエン二リン酸(ゲラニルゲラニルピロリン酸)からフィトエンへの反応を触媒するcrtB遺伝子によってコードされる、フィトエンシンターゼ酵素を意味する。
「CrtX」という用語は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドへと転換するcrtX遺伝子によってコードされる、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素を意味する。
「CrtZ」という用語は、β−カロテンからゼアキサンチンへの水酸化反応、もしくはカンタキサンチンからアスタキサンチンへの水酸化反応両方を触媒するcrtZ遺伝子によってコードされる、β−カロテンヒドロキシラーゼ酵素を意味する。
「カロテノイド生合成酵素」という用語は、crtEXYIB遺伝子クラスターによってコードされる任意かつすべての酵素を意味する、包括的な用語である。これらの酵素は、CrtE、CrtY、CrtI、CrtB、CrtXを含む。
「コドン縮退」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響をあたえることなく、ヌクレオチド配列を変えることのできる遺伝コードの特性を意味する。所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用時に、特異的宿主細胞によって示される「コドンバイアス」に関して、当業者は十分理解している。したがって、宿主細胞での発現を亢進した遺伝子を合成するにあたり、コドン使用頻度がその宿主細胞での好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計すると望ましい。
「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手段を用いて化学的に合成される、オリゴヌクレオチドのビルディングブロックからアセンブル可能なものである。これらのビルディングブロックをライゲートおよびアニール処理して遺伝しセグメントを構成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして完全な遺伝子を構築する。DNAの配列に関して、「化学的に合成される」とは、構成要素であるヌクレオチドが生体外でアセンブルされたものであることを意味する。この場合、十分に確立された手順を用いてDNAの化学的合成を手作業で行ってもよいし、さまざまな市販の装置類のうちのいずれかを使って自動化学的合成を行うことも可能である。したがって、ヌクレオチド配列の最適化を踏まえた最適な遺伝子発現に遺伝子の方を合わせ、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることが可能である。当業者であれば、コドンの使用が宿主の好むコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を知ることができよう。好ましいコドンについては、配列情報を得られる宿主細胞に由来する遺伝子についての調査を行い、その結果に基づいて判断することが可能である。
「遺伝子」とは、コード配列に先行(5’非コード配列)および後続(3’非コード配列)する制御配列を含む、ある特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ、自然界に見られるような遺伝子である。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなる、あらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、それぞれ異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来ではあるが、自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて本来の位置にある天然遺伝子を意味する。「外来遺伝子」もしくは「外来性遺伝子」とは、宿主生物に通常は見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子には、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子あるいはキメラ遺伝子を含む場合がある。「導入遺伝子」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
細菌DNAの「オペロン」とは、多シストロン性mRNAをもたらす1つのプロモーターから転写された、隣接する遺伝子のクラスターである。
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を意味する。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流(5’非コード配列)、コード配列の範囲内もしくはコード配列の下流(3’非コード配列)に位置し、関連のコード配列の転写、RNAプロセッシングもしくは安定性、あるいは翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセッシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造があげられる。
「プロモーター」とは、コード配列または機能性RNAの発現を制御可能なDNA配列を意味する。一般に、コード配列はプロモーター配列の3’側に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来するさまざまな因子から構成されるものであってもよく、あるいは、合成DNAセグメントを含むものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型で、ほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるDNAフラグメントが同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。本願明細書で使用する場合、「外来プロモーター」とは、そのプロモーターが使用される細胞以外の起源に由来するプロモーターを意味する。本発明の目的のために、本発明の微生物系で用いられる外来プロモーターは、植物細胞および哺乳動物細胞などの真核生物の起源のみならず、細菌、イースト、真菌などの他の微生物に由来するものであってもよい。
「RNA転写産物」とは、DNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を意味する。そのRNA転写産物が、DNA配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写産物と呼び、一次転写産物の転写後プロセッシングで得られるRNA配列であれば成熟RNAと呼ぶ。「メッセンジャーRNA(mRNA)」とは、イントロンを持たず、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なRNAを意味する。「cDNA」とは、mRNAと相補であり、それに由来する2本鎖DNAを意味する。「センス」RNAとは、mRNAを含み、それゆえに、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なRNA転写産物を意味する。「アンチセンスRNA」とは、標的の一次転写産物またはmRNAの全体または一部に対して相補であり、標的遺伝子の発現を阻止する、RNA転写産物を意味する(米国特許第5,107,065号明細書;国際公開第9928508号パンフレット)。アンチセンスRNAの相補性は、5’非コード配列、3’非コード配列またはコード配列など、特定の遺伝子転写産物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的RNA」とは、アンチセンスRNA、リボザイムRNAまたは翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに影響を与える他のRNAを意味する。
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で1つの核酸フラグメント上に存在する、核酸配列のつながりを意味する。例えばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響を与えることが可能な場合、そのプロモーターはそのコード配列に作動的に結合している(すなわち、そのコード配列はプロモーターによる転写制御下にある)という。コード配列は、センスまたはアンチセンスの配向で制御配列への作動的な結合が可能なものである。
本願明細書で使用する場合、「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定した蓄積を意味する。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳を意味することもある。
「形質転換」とは、核酸フラグメントが宿主生物のゲノムへに導入され、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを意味する。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組み換え」もしくは「形質転換された」生物と呼ぶ。
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、通常は環状2本鎖DNAフラグメントの形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自律複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーターフラグメントおよびDNA配列を適切な3’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する、特定のベクターを意味する。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する、特定のベクターを意味する。
本発明は、発現可能なDNAの、細菌染色体への指向性組込みのための方法に関する。DNAは、そのDNAを含んでなるカセット上の相同領域と、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ組換えやすい細菌宿主内の染色体との間の相同的組み換えによって、細菌染色体へと導かれる。少なくとも2つの直鎖状カセット、もしくは組み換え因子が用いられる。通常、1つの組み換え因子は、部位特異的リコンビナーゼ部位によって囲まれた1つの選択マーカーを含んでなる。組み換え部位に向かう5’および3’の両方は、細菌染色体の部分、もしくは別の組み換え因子に相同性を有する組み換え領域(「ホモロジーアーム」)である。さらに、組み換え因子は、プロモーター、もしくは外来遺伝子、もしくはオープンリーディングフレームといった発現可能なDNAも含んでなるかもしれない。第2の組み換え因子は、通常、組み換え標的部位(部位特異的リコンビナーゼによって認識される)に囲まれた選択マーカーを除く、多くの第1の因子と同じ因子を含むだろう。
λ−Redリコンビナーゼ系
本発明で用いられたλ−Redリコンビナーゼ系は、ヘルパープラスミド(pKD46)上に含まれ、欠くことのできない3つの遺伝子、exo、bet、gamを含んでなる(図4)(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)。exo遺伝子は、2本鎖(ds)DNAの5’末端鎖を発展的に分解し、3’の1本鎖オーバーハングを作り出す、λ−エキソヌクレアーゼをコードする。Betは、λ−エキソヌクレアーゼと複合体をなし、上記1本鎖DNAと結合して相補鎖の復元を促進し、交換反応を仲介することが可能なタンパク質をコードする。Gamは、エンドヌクレアーゼ活性を抑制している、大腸菌RecBCD複合体と結合するタンパク質をコードする。
本発明で用いられたλ−Redリコンビナーゼ系は、ヘルパープラスミド(pKD46)上に含まれ、欠くことのできない3つの遺伝子、exo、bet、gamを含んでなる(図4)(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)。exo遺伝子は、2本鎖(ds)DNAの5’末端鎖を発展的に分解し、3’の1本鎖オーバーハングを作り出す、λ−エキソヌクレアーゼをコードする。Betは、λ−エキソヌクレアーゼと複合体をなし、上記1本鎖DNAと結合して相補鎖の復元を促進し、交換反応を仲介することが可能なタンパク質をコードする。Gamは、エンドヌクレアーゼ活性を抑制している、大腸菌RecBCD複合体と結合するタンパク質をコードする。
大腸菌での相同的組み換えは、非常に低い頻度で起こり、通常広範な相同領域を必要とするため、本発明ではλ−Red系が用いられる。λ−Red系は、相同的組み換えのための直鎖状dsDNAフラグメントに隣接している短い相同領域(10〜50bp)を利用する能力を手助けする。さらに、普通大腸菌内で発現されるRecBCD複合体は、その複合体のエキソヌクレアーゼ活性が効果的に直鎖状dsDNAを分解して、直鎖状dsDNAの形質転換への使用を妨げる。gamによるRecBCD複合体エンドヌクレアーゼ活性の抑制は、直鎖状dsDNAフラグメントを用いた効果的な相同的組み換えに、欠くことのできないものである。
本発明の1つの重要な態様は、PCRで生成された2つの直鎖状2本鎖DNAフラグメントを用いる、選択マーカーと組んでの染色体プロモーターの置換である。本発明は、PCRで生成された2つのフラグメントと大腸菌染色体との間の、3回の相同的組み換え現象の使用を含む(図1)。本発明の方法は、3回の相同的組み換えを通した、別個のクローニングステップの必要性がない、導かれた染色体操作を可能にする。本発明の適用範囲は、機能的DNA分子(プロモーター、遺伝子、調節因子、オペロン、その他)の指向性組込みを可能にする。本発明の方法は、染色体組み込み部位および数に関して制限を持たない。したがって、この方法は、生合成経路の再設計、代謝の流れの最適化および新規の経路の作成に適している。
本発明の方法の別の態様は、抗生物質耐性のような選択マーカーの、2つの直鎖状2本鎖DNAフラグメントの1つへの取り込みである。抗生物質耐性に影響を与えるような選択マーカーが、本発明を用いた3回の相同的組み換えを経験したコロニーを選択するために使用される。しかしながら、細菌の生合成経路を操作する際には、複数の染色体操作が必要となる。これを成し遂げるために、この方法は、選択マーカーに隣接した部位特異的組み換え配列の使用を含む。選択マーカーを取り除くための、このような部位特異的リコンビナーゼの使用は、当該分野で既知となっている(ボルゲス(Borges)ら、国際公開第01/18222 A1号パンフレット;ブーハッシラ(Bouhassira)ら、国際公開第00/63410号パンフレット;およびマルチネス・モラレス(Martinez−Morales)ら、J.Bacteriol、第181号、7143〜7148ページ(1999))。本発明でのフリッパーゼ(FLP)リコンビナーゼの使用のような、部位特異的リコンビナーゼ類は、特異的組み換え配列(すなわち、FRT配列)を認識し、選択マーカーの切断を可能にする。本発明のこの態様は、複数の染色体修飾のための、本発明の方法の反復的使用を可能にする。本発明は、FLP−FRTリコンビナーゼ系に限られたものではなく、部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連した特異的認識配列のいくつかの例が当該分野で既知となっている。その他の適当な部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの相当する認識配列の例は、これらに限られるものではないが、Cre/lox、Xer/dif、Int/attを含む。
本発明の別の態様は、続いて起こる遺伝子の組み込みによる、細菌染色体上でのオペロン組み立ての際の、その使用に関する。原核生物のオペロンは、本発明を用いて作成され得る。この態様の1つの例は、実施例13で説明されており、そこでは、3つのカロテノイド生合成遺伝子が、3回の相同的組み換えを通して1つの調節因子(図13)の制御下で、細菌染色体に組み込まれる。
本発明の方法は、大腸菌染色体中の任意の標的遺伝子前の、任意のプロモーター/調節領域の安定的な染色体組み込みを可能にするため、そのような遺伝子の発現が制御され得る。この方法はまた、生合成経路のカスタムデザインで、プロモーターに加えて、さまざまな遺伝因子を操作するのに使用され得る。このアプローチは、単に増加された特定の1つの遺伝子の発現よりは、むしろ産業的に有用な微生物株の構築に適している。代謝的なバランス、生産性、コントロール、安定性および特定の経路にある遺伝子の最良の発現という点では、組み換えベクターによるアプローチに基づく代謝操作と比較した場合、このアプローチは多くの利点および利益を持っている。この方法は、例として大腸菌を用いて説明される。しかし、この方法は、他の細菌株でも同様に有用であることを証明すべきである(ポテーテ、A.(Poteete,A.)、上掲、2001)。本発明を用いて遺伝子的に操作され得る、他の産業的に有用な株の例は、サルモネラ(Salmonella)、メチロモナス(Methylomonas)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)を含む。
カロテノイド生合成
大腸菌レポーター株でのβ−カロテン(カロテノイド)産生の増加操作によって、いくつかの例を用いながら、本発明の方法の有用性が説明される。カロテノイドは、自然の至るところにユビキタスに存在し、酸素を導き出すすべての光合成生物によって、また従属栄養性の成長する細菌および真菌で合成される色素である。カロテノイドの産業的用途は、いくつかを挙げると、医薬品、食品サプリメント、電気光学的適用、動物飼料添加物、化粧品中の顔料を含む。
大腸菌レポーター株でのβ−カロテン(カロテノイド)産生の増加操作によって、いくつかの例を用いながら、本発明の方法の有用性が説明される。カロテノイドは、自然の至るところにユビキタスに存在し、酸素を導き出すすべての光合成生物によって、また従属栄養性の成長する細菌および真菌で合成される色素である。カロテノイドの産業的用途は、いくつかを挙げると、医薬品、食品サプリメント、電気光学的適用、動物飼料添加物、化粧品中の顔料を含む。
動物は、カロテノイドを新たに合成することはできないため、彼らは食事と言う手段でそれらを得なければならない。そこで、植物、もしくは細菌でのカロテノイドの産生および組成の操作は、カロテノイドのための、新たな、もしくは改良されたソースを提供できる。
カロテノイドは、多くの異なった形態および化学的構造を呈してできあがる。最も自然に生じるカロテノイドは、8個のC5イソプレン単位(IPP)の連続的な縮合から誘導された、メチル基が枝分かれしたC40の炭化水素骨格を含む、疎水性のテトラテルペノイドである。さらに、より長い、もしくは短い骨格を有する新規のカロテノイドが、いくつかの非光合成細菌種で生じている。「カロテノイド」という用語は、実際にカロテンとキサントフィルとの両方を含む。ひとつの「カロテン」とは、炭化水素カロテノイドを意味する。ヒドロキシ、メトキシ、オキソ、エポキシ、カルボキシもしくはアルデヒド官能基の形をとるか、またはグリコシド、グリコシドエステルもしくは硫酸塩の中の、1つもしくはそれ以上の酸素原子を含むカロテン誘導体は、集合的に「キサントフィル」として知られている。カロテノイドはさらに、炭化水素骨格の末端が脂肪族構造または環式リング構造(G.アームストロング(G.Armstrong)、(1999)、Comprehensive Natural Products Chemistry中、エルゼビア出版(Elsevier Press)、第2巻、321〜352ページ)となるように環化されているかどうかにより、非環式、単環式もしくは二環式、と表される。
大腸菌は、イソプレノイド生合成経路に遺伝子を含む(図3)。イソプレノイド生合成は、dxs遺伝子にコードされた酵素を通してデオキシ−D−キシルロースを形成するための、グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P))を伴うピルビン酸の縮合によって始まる。次に、追加的酵素の宿主が、デオキシ−D−キシロースを、最終的なC5イソプレン生成物であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)に転換する、後に続く順次的反応で用いられる。IPPは、idi遺伝子によってコードされる酵素を通して、異性体であるジメチルアリールピロリン酸(DMAPP)に転換される。IPPは、DMAPPを伴って縮合され、C10ゲラニルピロリン酸(GPP)を形成し、次にこのGPPは伸長してC15ファルネシルピロリン酸(FPP)となる。
FPP合成は、カロテノジェニックおよびノンカロテノジェニックな細菌内の両方で共通である。大腸菌は普通、FPPのβ−カロテンへの転換に必要な遺伝子を含まない(図3)。このため、出願人は、β−カロテン産生に必要な付加的遺伝子を持つ、レポータープラスミドのpPCB15を含む大腸菌株を用いた(図5)。FPP前駆体からカロテノイド色素を生成するのに使われる、結果的に生じるカロテノイド経路にある酵素は、2つの種類に分けられる。すなわち、カロテン骨格の合成酵素および後発的な修飾酵素である。カロテン骨格の合成酵素は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(CrtE)、フィトエンシンターゼ、(CrtB)、フィトエンデヒドロゲナーゼ(CrtI)、リコピンシクラーゼ(CrtY/L)、その他を含む。修飾酵素は、ケトラーゼ、ヒドロキソラーゼ、デヒドラターゼ、グリコシラーゼ、その他を含む。
カロテノイド色素の生合成の遺伝的特性は周知となっている(アームストロング(Armstrong)ら、J.Bact.、第176号、4795〜4802ページ(1994)、Annu.Rev.Microbiol.、第51号、629〜659ページ(1997))。この経路は、以前はエルウィニア属として知られていたパントエア属のグラム陰性の着色された細菌内で、非常によく研究されている。E.ヘルビコラ(herbicola)EHO−10(ATCC 39368)およびE.ウレドボラ(uredovora)20D3(ATCC 19321)の両内で、crt遺伝子は2つのオペロン、crt Zとcrt EXYIBに集団化される(米国特許第5,656,472号明細書、米国特許第5,5545,816号明細書、米国特許第5,530,189号明細書、米国特許第5,530,188号明細書および米国特許第5,429,939号明細書)。オペロン構造の類似点にもかかわらず、E.ウレドボラ(uredovora)のDNA配列とE.ヘルビコラ(herbicola) crt遺伝子は、DNA−DNAハイブリダイゼーションで何の相同性も示さない(米国特許第5,429,939号明細書)。
大腸菌dxsおよびidi遺伝子は、イソプレノイド生合成経路内で、律速のステップであると考えられる酵素をコードする(図3)。これら遺伝子の染色体コピーは、野生型大腸菌では、非常に低い発現レベルを有する。本発明の有用性は、結果としてイソプレノイド経路の流動性を高める、ファージT5強力プロモーター(PT5)をdxsもしくはidi遺伝子の前に組み込むことによって説明される。高められた流動性の結果は、β−カロテン産生の測定可能な増加として検出される(図7)。
組み換え因子
本発明で用いられているように、「組み換え因子」とは、PCRを用いて作成された、直鎖状2本鎖DNAフラグメント、もしくは「カセット」である。通常、組み換え因子は約25塩基〜約4000塩基に及ぶ。本発明の方法は、生体内での細菌染色体操作のために2つの組み換え因子を用いる。その直鎖状因子は、もし選択マーカーの事例のように後で取り除かれるとしたら、場合により部位特異的組み換え配列に隣接された、機能性DNA(調節因子、プロモーター、コード配列、遺伝子)を含む。組み換え因子の5’および3’末端は、組み換え領域(ホモロジーアーム)を含んでなる。一般に、約10〜50塩基対長のホモロジーアームは、細菌染色体上の特異的配列、もしくは別の組み換え因子上の特異的配列のどちらか一方に相同性を有するように選択される。
本発明で用いられているように、「組み換え因子」とは、PCRを用いて作成された、直鎖状2本鎖DNAフラグメント、もしくは「カセット」である。通常、組み換え因子は約25塩基〜約4000塩基に及ぶ。本発明の方法は、生体内での細菌染色体操作のために2つの組み換え因子を用いる。その直鎖状因子は、もし選択マーカーの事例のように後で取り除かれるとしたら、場合により部位特異的組み換え配列に隣接された、機能性DNA(調節因子、プロモーター、コード配列、遺伝子)を含む。組み換え因子の5’および3’末端は、組み換え領域(ホモロジーアーム)を含んでなる。一般に、約10〜50塩基対長のホモロジーアームは、細菌染色体上の特異的配列、もしくは別の組み換え因子上の特異的配列のどちらか一方に相同性を有するように選択される。
本発明は、2つの組み換え因子の使用を説明する。図1で説明されているように、「第1」の組み換え因子の5’末端は、細菌染色体上の標的とされる配列に配列相同性を有する、組み換え領域(「RR1」)を含む。第1の因子の3’末端はまた、「第2」の組み換え因子の5’末端に配列相同性を有する、組み換え領域(「RR2」)を含む。第2の組み換え因子(「RR3」)の3’末端は、細菌染色体上の標的とされる配列と相同性を共有する。λ−Redが相同的組み換えを仲介する間に、その2つの因子は結合され、ホモロジーアームの配列に基づいて、細菌染色体上の特異的部位に挿入される。トリプルな相同的組み換えの実際の配列は、さまざまであってもよい。
ホモロジーアームの好ましい長さは、約10〜約50塩基対長である。相同的組み換えのために本発明で用いられた比較的短いホモロジーアームを与えられた場合、人は、効果的な組み換えのために受け入れられるミスマッチな配列のレベルは、好ましくは相同的組み換えのための標的とされる配列と同一の配列を用いて、絶対最小値に留められるべきだと予想するだろう。相同の20〜40塩基対で、相同的組み換えの効率に、4オーダーの上昇がみられる(ユ(Yu)ら、PNAS、第97巻、5978〜5983ページ、(2000))。したがって、ホモロジーアームのうちの複数のミスマッチングは、相同的組み換えの効率を低めるかもしれない。大きいサイズ(約40K塩基対まで)の組み換え因子は、マスターアンプ(MasterAmp)(商標)エクストラロングPCR酵素(Extra−long PCR Enzyme)(エピセントレ(Epicentre,Inc.)、ウィスコンシン州マディソン(Madison,WI))などのTaq DNAポリメラーゼにより、PCRで正確に生成され得る。
本発明は、2つの組み換え因子のうちの1つにある、発現可能なDNAとしての選択マーカー(図1の「SM」)の使用を説明する。マーカーは、部位特異的リコンビナーゼ認識配列に隣接される(図1で「RS」と表示されている認識標的配列)。このマーカーを含む組み換え因子は、通常「第2」の組み換え因子と同時に正しい方向へ挿入されることなしに、細菌染色体には組み込まれない。遺伝子修飾された細菌内の選択マーカーの発現は、3回の相同的組み換え現象がおそらくは起こったことを示すものである。選択と構成の確認後、部位特異的リコンビナーゼが、マーカーを取り除くために使用される。そして、付加的な生体内での染色体修飾とともに、本発明のステップが繰り返され得る。選択マーカーの使用は、当該分野で既知となっており、限定されるものではないが、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性マーカーを含むことができる。選択マーカーはまた、アミノ酸生合成酵素(普通は、所定のアミノ酸の外的供給を求める栄養素要求株の選択のために)およびlac−細菌内のβ−ガラクトシダーゼ(Xgalの、容易に識別可能な青色色素への転換を触媒する)のような、外観の可視的変化を触媒する酵素を含んでもよい。
組換えやすい宿主
組換えやすい宿主とは、機能的組み換え系を含み、相同的組み換えによって、効果的に形質転換されることが可能な宿主である。ある好ましい実施形態では、相同的組み換えを通した形質転換は、細菌染色体を標的とする。別の好ましい実施形態では、形質転換プロセスの間に使用されたDNAは、PCRで生成された2本鎖DNAである。一般に、相同的組み換えを通しての効果的な形質転換を、当然ながら経験しないと考えられている宿主の大腸菌は、組換えやすい宿主とするために改造される。λ−Redリコンビナーゼ系を含むヘルパープラスミドを用いる形質転換は、相同的組み換え率を数オーダー上昇させる。λ−Red系もまた、宿主内に染色体組み込み可能である。このλ−Red系は、通常は組み換えに不完全である大腸菌を、組換えやすい宿主に変える、3つの遺伝子(exo、bet、gam)を含む。
組換えやすい宿主とは、機能的組み換え系を含み、相同的組み換えによって、効果的に形質転換されることが可能な宿主である。ある好ましい実施形態では、相同的組み換えを通した形質転換は、細菌染色体を標的とする。別の好ましい実施形態では、形質転換プロセスの間に使用されたDNAは、PCRで生成された2本鎖DNAである。一般に、相同的組み換えを通しての効果的な形質転換を、当然ながら経験しないと考えられている宿主の大腸菌は、組換えやすい宿主とするために改造される。λ−Redリコンビナーゼ系を含むヘルパープラスミドを用いる形質転換は、相同的組み換え率を数オーダー上昇させる。λ−Red系もまた、宿主内に染色体組み込み可能である。このλ−Red系は、通常は組み換えに不完全である大腸菌を、組換えやすい宿主に変える、3つの遺伝子(exo、bet、gam)を含む。
通常、大腸菌は自身のRecBCDエンドヌクレアーゼを通して、直鎖状dsDNAを効率よく分解する。このことは、形質転換の効率性は染色体操作にとって有用ではないという結果を示す。Gamは大腸菌RecBCD複合体と結合し、この複合体のエンドヌクレアーゼ活性を阻害するタンパク質をコードする。exo遺伝子は、2本鎖(ds)DNAの5’末端の鎖を発展的に分解し、3’の1本鎖オーバーハングを作成する、λ−エキソヌクレアーゼをコードする。bet遺伝子にコードされたタンパク質は、λ−エキソヌクレアーゼと複合体を成し、1本鎖DNAのオーバーハングと結合して相補鎖の再生を促進し、さらに交換反応の仲介が可能である。λ−Redリコンビナーゼ系は、通常相同的組み換えによる形質転換が困難と考えられる大腸菌などの宿主における生体内での染色体操作の道具として、相同的組み換えを個人が用いることを可能にする。λ−Red系は、他の細菌内でも働く(ポテーテ、A.(Poteete,A.)、上掲、2001)。大腸菌は、普通に使用される工業生産用宿主であるために、λ−Redの主要な焦点である。λ−Red系が、工業生産に一般に使用される他の宿主に適用可能であってはならないということの証拠はない。これらの付加的宿主は、限定されるものではないが、サルモネラ(Salmonella)、メチロモナス(Methylomonas)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)を含む。
形質転換および選択
本発明において説明する、クローニングを回避した簡単な方法では、細菌宿主で生体内での染色体操作を実施するができる。この方法では、標的とする染色体を繰返して修飾できるため、生合成経路の操作が可能になる。形質転換のプロセスは、いくつかの異なるステップに分けられる。
本発明において説明する、クローニングを回避した簡単な方法では、細菌宿主で生体内での染色体操作を実施するができる。この方法では、標的とする染色体を繰返して修飾できるため、生合成経路の操作が可能になる。形質転換のプロセスは、いくつかの異なるステップに分けられる。
最初に、組み換え因子は、これまでに説明したように、PCRで生成される。1組のdsDNA組み換え因子は、組換えやすい細菌宿主内へエレクトロポレートされる。本発明では、宿主は、アラビノース誘導型プロモーターの制御下で、λ−Redリコンビナーゼ系を含むヘルパープラスミドpKD46を内在させている、大腸菌MC1061である。エレクトロポレーションの後、宿主細胞は、アラビノースの存在下で培養される。λ−Red遺伝子が発現され、3回の相同的組み換えが、2つの組み換え因子と細菌染色体との間で起こる。2つの染色体組み込みされた組み換え因子のうちの1つは、選択マーカー(kanR、もしくはkanと表示される、カナマイシン耐性)を含む。
一定時間の後、3回の相同的組み換えを経験した細胞を選択する化合物(すなわち、本発明ではカナマイシン)を含む培地で、宿主細胞が選択される。本発明では、第2の耐性マーカーが、クロラムフェニコール耐性(CamR)遺伝子を含むpPCB15レポータープラスミドの存在を確認するために用いられた。選択培地の存在下で成長するコロニーは、通常、コンストラクトを確認するためのPCRフラグメントの分析によって配列決定、もしくは分析される。
コンストラクトの確認が起こった後、第2のヘルパープラスミドが宿主細胞にトランスフェクトされる。この第2の「ヘルパー」プラスミドは、染色体組み込みされた選択マーカーに隣接する部位特異的リコンビナーゼの標的配列(FRT)を認識する、部位特異的リコンビナーゼ(Flp)を含む。本発明では、両方のヘルパープラスミド上に発現された構成要素は、条件付のプロモーターの制御下で、宿主細胞への染色体組み込みが可能なものである。本発明では、部位特異的リコンビナーゼ、Flp(フリッパーゼ)が発現され、選択マーカーは切断される。選択マーカーを失ったコロニーを同定するために、選択化合物の存在/不在の下、コロニーが培養される。これらコロニーのコンストラクトは、配列分析、もしくはPCRフラグメント分析、または両方の組み合わせによって確認される。第2のヘルパープラスミドは、温度感受性複製開始点を用いて宿主から取り除かれる。上記に説明したプロセスは、産業的に有用な産生宿主の作成で繰り返されて、目的とする細菌経路の操作を可能にする。
細菌を用いた生体内での染色体操作の簡単なワンステップの方法は、PCRで生成された2つの直鎖状2本鎖(ds)DNAフラグメントを用いることで発達してきた。そのフラグメントは、フラグメントと宿主(大腸菌)染色体上の標的部位との間の相同性を持つ、短いフランキング領域を含むようにデザインされた。
アラビノース誘導型プロモーターの制御下で、ヘルパープラスミドpKD46(ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048746;配列番号35;図4)上で発現したファージλ−Redリコンビナーゼ系を用いた結果、制御可能で効率的な、生体内での3回の相同的組み換えが起こった。組み換え中に用いられたPCRで生成された2つの直鎖状dsDNAフラグメントの少なくとも1つは、部位特異的リコンビナーゼ配列(FRT)(実施例1)に隣接された選択マーカー(カナマイシン(kanamycin))を含むようにデザインされた。マーカーは、所望の組み換え現象を起こした細胞の同定と選択を可能にした。配列分析、もしくはPCRフラグメントの分析によって、いったん選択組み換え体のコンストラクトが検証されると、選択マーカーはλファージのPRプロモーターの制御下で、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む第2のヘルパープラスミドによって切断された(実施例3および4)。
一実施形態では、この方法は細菌プロモーターの操作のために用いられた。ひとつの強力プロモーター(ファージPT5)は、PCRで生成された2つの直鎖状dsDNAフラグメントと標的染色体のDNAとの間で起こる、3回の相同的組み換えを通して、大腸菌標的遺伝子dxs(実施例2)、もしくはidi(実施例6)どちらか一方の上流に置かれた(図2および8)。それぞれの実施例で、2つのフラグメントのうちの1つは、部位特異的FRTリコンビナーゼ配列に隣接されたカナマイシン抵抗マーカーを含んでいた。部位特異的リコンビナーゼ配列に隣接しているのは、短い(およそ10〜50bp)相同性領域を含むホモロジーアームだった。図2で説明されているように、第1の組み換え領域(「h1」)は、第1のフラグメントの5’−末端に連結していた。第2の組み換え領域(「h2」)は、第1のフラグメントの3’−末端に連結していた。第2のPCRで生成された直鎖状dsDNAフラグメントは、PT5強力プロモーターを含んでいた。第3の組み換え領域(「h3」)は、第2のフラグメントの3’−末端に連結していた。第1の組み換え領域(「h1」)は、置換を目的とした未変性の細菌染色体プロモーターの上流部分に相同性を有していた。第1のフラグメントの3’−末端上に位置する第2の組み換え領域(「h2」)は、第2のフラグメントの5’−末端部分に相同性を有していた。第3の組み換え領域(「h3」)は、置換を目的とした未変性の細菌染色体プロモーターの下流部分に相同性を有していた(図2)。
ヘルパープラスミドpKD46(図4)上にλ−Red組み換え系を含んでいる大腸菌宿主は、PCRで生成された2つのフラグメントで形質転換され、その結果、標的の未変性プロモーターと、第1のフラグメントのカナマイシン選択マーカーおよび第2のフラグメント上のPT5強力プロモーターを含むコンストラクトとの間で、染色体の置換が生じた(実施例4および7、図2および8)。このプロモーターの置換の結果、導入された変性プロモーターと作動的に結合した、増強された大腸菌染色体遺伝子(dxs、もしくはidi遺伝子のどちらか一方)が形成された。所望の組み換え現象を経験したこの細菌宿主細胞は、選択マーカーの発現、選択された媒体内でのそれらの成長力にしたがって選択された。その後選択された組み換え体は、選択マーカーを切断したフリッパーゼ(Flp)部位特異的リコンビナーゼを発現している第2のヘルパープラスミド、pCP20(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、受託番号PTA−4455;ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)で形質転換された(図2および8、実施例3および6)。コンストラクトは、PCRフラグメントの分析を通して確認された(図6および9、実施例4および7)。増強された遺伝子(dxs、もしくはidiのどちらか一方)およびカロテノイドレポータープラスミド(pPCB15;配列番号37)を含む組み換え細菌宿主細胞は、その後β−カロテンの増産を試験された。PT5強力プロモーターの制御下で、通常は非常に低いレベルで発現する、大腸菌dxs、もしくはidi遺伝子どちらか一方の置換の結果、β−カロテン産生の大幅な増加となった(実施例5、図7)。
別の実施形態では、大腸菌レポーター株が、β−カロテン産生をアッセイするために作成された。つまり、その大腸菌レポーター株は、パントエアステワルティ(Pantoea stewartii)由来の遺伝子クラスターcrtEXYIBを、後に大腸菌宿主株を形質転換するのに用いられるヘルパープラスミド(pPCB15)内にクローニングすることによって生成される(図5)。レポータープラスミドを含む宿主細胞の同定および選択は、クロラムフェニコール(chloramphenicol)(pPCB15はクロラムフェニコール抵抗遺伝子、CamRを含む)中で細胞を培養して成し遂げられる。上記クラスターは、通常形質転換された大腸菌内で産生されるβ−カロテンを有する、カロテノイドの合成に必要な遺伝子の多くを含んでいる(図7)。crtZ遺伝子(β−カロテンヒドロキシラーゼ)が上記遺伝子クラスターに含まれていたことは注目すべきことである。しかしながら、crtZ遺伝子(crtB遺伝子に隣接して、反対の方向に組織化している)を発現するプロモーターが存在しなかったために、ゼアキサンチン(zeaxanthin)は産生されなかった。このように、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素(遺伝子クラスター内に位置するcrtX遺伝子によってコードされている)は、反応のための基質を持っていなかった。β−カロテンの産生増加は、対照株の産生に比例した増加として報告された(図7)。
この一般的な方法は、PCRで生成された2つのフラグメント上に含まれた遺伝子情報に基づく、さまざまな染色体修飾に使用され得る。別の実施形態では、この方法は、外来遺伝子およびプロモーターを同時に加えるのに用いられた。PCRで生成された2つのフラグメントの第1のフラグメントは、選択マーカー(カナマイシン(kanamycin))およびプロモーター(PT5)の融合産物を含むようにデザインされた(実施例8、図10および11)。第2のPCRで生成されたフラグメントは、「dxs(16a)」と表示される外来遺伝子、メチロモナス(Methylomonas) 16a株dxs遺伝子を含んでいた。再度、ホモロジーアームは宿主の細菌染色体内への正確な取り入れが可能になるようにデザインされた。所定の遺伝子は、使用する選択ホモロジーアームに依存して、標的の天然遺伝子を置換するために、簡単に付加、もしくは使用され得る。所望の組み換え体は、すでに説明された方法によって選択された。そして選択マーカーは、すでに説明されたように、部位特異的リコンビナーゼによって除去された(図11、実施例9)。組み換えコンストラクトは、PCRフラグメントの分析によって確認された(図12、実施例10)。形質転換された大腸菌レポーター株内でのβ−カロテン産生への効果は、すでに説明された方法で測定された。PT5強力プロモーターの制御下で、メチロモナス(Methylomonas) 16a株dxs遺伝子(大腸菌dxs遺伝子と相同)を含む細胞は、β−カロテンの産生で大幅な増加を示した(図7)。相同的組み換えを用いる本発明のワンステップの方法は、外来プロモーターおよび遺伝子の同時付加に有用であった。最終的な結果が所望の産物の増産となるように、必要に応じて細菌の生合成経路を操作するには、プロセスの繰り返しを可能にする、後で行う選択マーカーの除去が必要とされる。
別の実施形態では、本発明の方法の適用性が、大腸菌オペロンの作成によって説明された。作成された原核生物のオペロンは、1つの強力プロモーター(PT5)に作動的に結合した3つのパントエアステワルティ(Pantoea stewartii)カロテノイド生合成遺伝子(crtE、crtI、crtB遺伝子)を含んでなるものだった。第1のPCRで生成された直鎖状dsDNAフラグメントは、カナマイシン選択マーカー、PT5強力プロモーター、PT5プロモーターに作動的に結合した所定の遺伝子(パントエアステワルティ(Pantoea stewartii) crtE)間の融合産物を含んでなるものだった(kan−PT5−crtE、図13)。カナマイシン選択マーカーは、すでに説明されているように、後で行う除去のための、部位特異的リコンビナーゼの部位に隣接されていた。第1のフラグメントは、5’および3’−末端で適当なホモロジーアームに隣接されていた。第2のPCRで生成された直鎖状dsDNAフラグメントは、合成されて外来のP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子を含み、さらに適当な3’−末端ホモロジーアームを含んだ(図13、実施例12)。すでに説明されたように起こった3回の相同的組み換えは、染色体の組み込みおよび第1のフラグメントのcrtE遺伝子を含むオペロンの形成という結果をもたらした。上記オペロンは、第2のフラグメントのcrtIB遺伝子に密接に関連し、これらすべての遺伝子を第1のフラグメント上のPT5プロモーターに作動的に結合させていた。再度、マーカーはすでに説明されているように適当な媒体内で選択の後で除去された。コンストラクトは、PCRフラグメントの分析で確認された(図14、実施例13)。機能的に発現したcrtEIBオペロンを含む形質転換された大腸菌株は、すでに例示されているようにpPCB15レポータープラスミドを含んでいなかった。pPCB15レポータープラスミドはまた、リコピン(ピンク色)をβ−カロテン(オレンジ色)に転換する原因となった、機能的に発現したcrtY遺伝子(リコピンシクラーゼ)を含んでいたことは注目すべきことである。形質転換された大腸菌株での、pPCB15ヘルパープラスミドを欠いたcrtEIBオペロンの発現は、ピンク色のコロニーの蓄積(リコピン蓄積を表示している)によって確認された(実施例13)。
別の実施形態では、細菌宿主株は、所望の最終的な産物の産生効率を上昇させるための、複数のプロモーターおよび遺伝子の付加もしくは置換といった複数の染色体修飾を含むように操作され得る。好ましい実施形態では、組み込まれた、もしくは増強された染色体遺伝子は、カロテノイドの産生に有用な酵素をコードする。さらに好ましい実施形態では、遺伝子の複数のコピーは、染色体操作されて、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。
本発明のワンステップの方法は、さまざまな、目標とされる生体内での細菌染色体の修飾に使用され得る。PCRで生成された2つのdsDNAフラグメント内(およびそれらが結合しているホモロジーアーム)に入れられた遺伝子情報は、所望の染色体修飾のタイプおよび位置を決定する。これまでの形質転換の方法で用いられたクローニングステップの除外により、実験室での多くの時間とそれに関連する経費を取り除いた。部位特異的リコンビナーゼを用いる選択マーカーの除去は、個人が、生合成経路の操作および産業的に有用な材料の産生を最適化するのに必要とされる複数の染色体修飾を実施することを可能にする。
下記の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、あくまでも一例にすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明ならびにこれらの実施例から、本発明の本質的な特徴を解明し、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明をさまざまに変更および改変し、さまざまな用途と条件に適合させることができる。
一般的方法
実施例で用いた、標準的な組み換えDNAおよび分子のクローニング技術は、当該分野で周知となっており、サンブルック,J.(Sambrook,J.)、フリッシュ,E.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティス,T.(Maniatis,T.)による、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)のコールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)から出版された「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(1989)(マニアティス(Maniatis))およびT.J.シルハビー(T.J.Silhavy)、M.L.ベナン(M.L.Bennan)およびL.W.エンクイスト(L.W.Enquist)による、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)にあるコールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)での「Experiments with Gene Fusions」(1984)および、オースベル,F.M.(Ausubel,F.M.)らによる、グリーンパブリッシングアソシエーション(Greene Publishing Assoc.)およびワイリーインターサイエンス(Wiley−Interscience)から出版された「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)で説明されている。
実施例で用いた、標準的な組み換えDNAおよび分子のクローニング技術は、当該分野で周知となっており、サンブルック,J.(Sambrook,J.)、フリッシュ,E.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティス,T.(Maniatis,T.)による、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)のコールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)から出版された「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(1989)(マニアティス(Maniatis))およびT.J.シルハビー(T.J.Silhavy)、M.L.ベナン(M.L.Bennan)およびL.W.エンクイスト(L.W.Enquist)による、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)にあるコールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)での「Experiments with Gene Fusions」(1984)および、オースベル,F.M.(Ausubel,F.M.)らによる、グリーンパブリッシングアソシエーション(Greene Publishing Assoc.)およびワイリーインターサイエンス(Wiley−Interscience)から出版された「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)で説明されている。
細菌培養菌のメンテナンスと増殖に適した材料および方法は、当該分野で周知となっている。下記の実施例での使用に適した技術は、「Manual of Methods for General Bacteriology」(フィリップ ジェルハード(Phillipp Gerhardt)、R.G.E.マリー(R.G.E.Murray)、ラルフ N.コスティロー(Ralph N.Costilow)、ユージン W.ネスター(Eugene W.Nester)、ウィリスA.ウッド(Willis A.Wood)、ノエルR.クリエ(Noel R.Krieg)、G.ブリッグ フィリップス(G.Briggs Phillips)編集、米国微生物学会(American Society for Microbiology)、ワシントンDC.(Washington,DC.)、1994)の中で、もしくはトーマスD.ブロック(Thomas D.Brock)により、マサチューセッツ州サンダーランド(Sunderland,MA)のシナウェアアソシエイツ(Sinauer Associates,Inc.)から出版された「Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology」、第2版(1989)の中に記載したように見出され得る。細菌細胞の増殖とメンテナンスのために用いたすべての試薬、制限酵素、材料は、特に定めのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキー(Milwaukee,WI)のアルドリッチケミカルス(Aldrich Chemicals)、ミシガン州デトロイト(Detroit,MI)のディフコラボラトリーズ(DIFCO Laboratories)、メリーランド州ガイツェルスバーグ(Gaithersburg,MD)のギブコ/BRL(GIBCO/BRL)、もしくはミズーリ州セントルイス(St.Louis,MO)のシグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Company)より入手した。
遺伝子配列の操作は、ジェネティクスコンピューターグループ(Genetics Computer Group Inc.)より入手可能なプログラム一式(ウィスコンシンパッケージバージョン9.0(Wisconsin Package Version 9.0)、ジェネティクスコンピューターグループ(GCG)、ウィスコンシン州マディソン(Madison,WI))を用いて達成した。GCGのプログラム「パイルアップ(Pileup)」を使用した場所では、ギャップ作成デフォルト値12とギャップ延長デフォルト値4を使用した。CGCのプログラム「ギャップ(Gap)」、もしくは「ベストフィット(Bestfit)」を使用した場所では、デフォルトギャップ作成ペナルティー50とデフォルトギャップ延長ペナルティー3を使用した。スミスウォーターマンアルゴリズム(Smith−Waterman algorithm)(W.R.ペアーソン、(W.R.Pearson)、コンピューターメソッズゲノムリサーチ(Comput.Methods Genome Res.)、「Proc.Int.Symp.」(1994)、会合日1992年、111−20、編集者:スハイ(Suhai)、サンドール(Sandor)、出版社:ニューヨーク州ニューヨークのプレナム(Plenum,New York,NY))を取り入れたプログラム、ファスタ(FASTA)を使用して複数のアラインメントを作成した。プログラムパラメーターが指示されなかった場合はどこでも、これらのプログラムもしくは他のいかなるプログラム内であっても、デフォルト値を使用した。
略語の意味は下記のとおりである。「h」は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「rpm」は毎分の回転数を意味する。
λ−Redリコンビナーゼプラスミド系
本発明で用いられたプラスミド(pKD4、pKD46、pCP20)は、これまでに文献(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)の中で説明されている。λ−Redリコンビナーゼ系の構成要素の配列は、ヘルパープラスミドpDK46(配列番号35、ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048746)に含まれている。本発明で用いられた、Flp/FRT部位特異的リコンビナーゼヘルパープラスミドは、pCP20(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)受託番号PTA−4455)であった。プラスミドpKD4(配列番号34、ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048743)を、FRTに隣接されたカナマイシン抵抗マーカーのPCR増幅のテンプレート分子として用いた。
本発明で用いられたプラスミド(pKD4、pKD46、pCP20)は、これまでに文献(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)の中で説明されている。λ−Redリコンビナーゼ系の構成要素の配列は、ヘルパープラスミドpDK46(配列番号35、ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048746)に含まれている。本発明で用いられた、Flp/FRT部位特異的リコンビナーゼヘルパープラスミドは、pCP20(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)受託番号PTA−4455)であった。プラスミドpKD4(配列番号34、ジェンバンク(GenBank)(登録商標)受入番号AY048743)を、FRTに隣接されたカナマイシン抵抗マーカーのPCR増幅のテンプレート分子として用いた。
実施例1
大腸菌染色体上のdxs遺伝子のプロモーター操作に用いられた、PCRで生成された2つの直鎖状DNAフラグメントの合成
部位特異的リコンビナーゼ標的配列(FRT)に隣接されたカナマイシン選択マーカーを含む直鎖状DNAフラグメント(1489bp)を、プライマー対、T1(dxs)(5’−TGGAAGCGCTAGCGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAACGTCTTGAGCGATTGTGTAG−3’)(配列番号1)を用いて、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)からPCRによって合成した。上記T1(dxs)は、ispA終止コドン、プライマー配列(20bp)およびB1(T5)(5’−CTCGAGGTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTACATATGAATATCCTCCTTAG−3’)(配列番号2)の上流領域にある配列にマッチするように選択されたh1ホモロジーアーム(下線部の41bp)を含む。上記B1(T5)は、プロモーターDNAフラグメントおよびプライマー配列(20bp)の5’−末端にある配列にマッチするように選択されたh2ホモロジーアーム(下線部の50bp)を含む(図2)。−10および−35コンセンサス配列と、lacオペレーター(lacO)とリボソーム結合部位(rbs)とを含んでなるファージプロモーター(PT5)を含む第2の直鎖状DNAフラグメント(154bp)を、プライマー配列(32bp)およびB2(dxs)(5’−GGAGTCGACCAGTGCCAGGGTCGGGTATTTGGCAATATCAAAACTCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号4)を含むプライマー対、T2(T5)(5’−TAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC−3’)(配列番号3)を用いて、プラスミドpQE30(キアゲン(Qiagen)、カリフォルニア州バレンシア(Valencia))からPCRによって合成した。上記B2(dxs)は、dxs開始コドンおよびプライマー配列(22bp)の下流領域にある配列にマッチするように選択されたh3ホモロジーアーム(下線部の48bp)を含む(図2)。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる2つのPCRフラグメントは、図2に示すように、ホモロジーアーム(h1およびh2)を含むカナマイシン選択マーカーと、ホモロジーアーム(h3)を含むPT5プロモーターであった。アンプリタックゴールド(登録商標)ポリメラーゼ(AmpliTaq Gold polymerase)、カリフォルニア州フォスターシティー(Foster City,CA)のアプライドバイオシステムス(Applied Biosystems)社製)を用いて直鎖状DNAフラグメントを増幅するためにとられた標準的PCRの条件は、下記のとおりである。
大腸菌染色体上のdxs遺伝子のプロモーター操作に用いられた、PCRで生成された2つの直鎖状DNAフラグメントの合成
部位特異的リコンビナーゼ標的配列(FRT)に隣接されたカナマイシン選択マーカーを含む直鎖状DNAフラグメント(1489bp)を、プライマー対、T1(dxs)(5’−TGGAAGCGCTAGCGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAACGTCTTGAGCGATTGTGTAG−3’)(配列番号1)を用いて、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)からPCRによって合成した。上記T1(dxs)は、ispA終止コドン、プライマー配列(20bp)およびB1(T5)(5’−CTCGAGGTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTACATATGAATATCCTCCTTAG−3’)(配列番号2)の上流領域にある配列にマッチするように選択されたh1ホモロジーアーム(下線部の41bp)を含む。上記B1(T5)は、プロモーターDNAフラグメントおよびプライマー配列(20bp)の5’−末端にある配列にマッチするように選択されたh2ホモロジーアーム(下線部の50bp)を含む(図2)。−10および−35コンセンサス配列と、lacオペレーター(lacO)とリボソーム結合部位(rbs)とを含んでなるファージプロモーター(PT5)を含む第2の直鎖状DNAフラグメント(154bp)を、プライマー配列(32bp)およびB2(dxs)(5’−GGAGTCGACCAGTGCCAGGGTCGGGTATTTGGCAATATCAAAACTCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号4)を含むプライマー対、T2(T5)(5’−TAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC−3’)(配列番号3)を用いて、プラスミドpQE30(キアゲン(Qiagen)、カリフォルニア州バレンシア(Valencia))からPCRによって合成した。上記B2(dxs)は、dxs開始コドンおよびプライマー配列(22bp)の下流領域にある配列にマッチするように選択されたh3ホモロジーアーム(下線部の48bp)を含む(図2)。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる2つのPCRフラグメントは、図2に示すように、ホモロジーアーム(h1およびh2)を含むカナマイシン選択マーカーと、ホモロジーアーム(h3)を含むPT5プロモーターであった。アンプリタックゴールド(登録商標)ポリメラーゼ(AmpliTaq Gold polymerase)、カリフォルニア州フォスターシティー(Foster City,CA)のアプライドバイオシステムス(Applied Biosystems)社製)を用いて直鎖状DNAフラグメントを増幅するためにとられた標準的PCRの条件は、下記のとおりである。
PCR反応を終えた後、QIAクイックゲルエクストラクションキット(QIAquick Gel Extraction Kit)(商標)(カタログ#28704、キアゲン(QIAGEN Inc.)、カリフォルニア州バレンシア(Valencia,CA))を用いて、PCR産物を精製した。簡単に説明すると、それぞれ50μLずつのPCR反応混合物を、1%アガロースゲル上に流した。増幅されたDNAフラグメントを含むバンドを、清潔で切れ味のよいスカルペルで、アガロースゲルから切り取った。ゲルスライスを無色のプラスチック管に入れて秤量した。1容量のゲルに3容量のバッファーQGを加えた後、その管を50℃で10分間(またはゲルスライスが完全に溶解するまで)インキュベートした。ゲルスライスが完全に溶解した後、試料にゲル容量と同量のイソプロパノールを加え、管を数回転倒混和した。DNAを結合させるため、試料をQIAクイックゲル抽出カラムに加えて、1分間遠心分離機にかけた。750μLのバッファーPEをカラムに加え洗浄した。1分間遠心分離機にかけ洗浄バッファーを取り除いた後、試料を1分間静置して1分間遠心分離機にかけ、PCRによるDNA産物を蒸留水(dH2O)10μLで溶出させた。DNAクリーンアンドコンセントレーター(DNA Clean&Concentrator)(商標)(ザイモリサーチ(Zymo Research)、カリフォルニア州オレンジ(Orange,CA))を用いて、PCRによるDNA試料をさらに精製した。それぞれの量のDNA試料に、2容量のDNA結合バッファーを加えた後、それら試料をザイモスピンカラム(Zymo−Spin Column)(ザイモリサーチ(Zymo Research))に仕込み、最高速度(>10,000g)で5〜10秒間遠心分離機にかけた。カラム内に残留したPCRによるDNA試料を、最高速度で5〜10秒間遠心分離機にかけながら、200μLの洗浄バッファーで2回洗浄した。最高速度で2回、回転を行いながら、6〜8μLの蒸留水でDNAを溶出した。PCRによるDNA試料の濃度は、約0.5〜1.0μg/μLであった。
実施例2
PCRで生成された2つの直鎖状DNAフラグメントの、λ−Redリコンビナーゼを発現している大腸菌株へのエレクトロトランスフォーメーション
λ−Redリコンビナーゼ発現プラスミド(図4)およびレポータープラスミド(図5)の両方を保有する大腸菌MC1061を、PCRフラグメントの形質転換のための宿主株として用いた。上記の株は、λ−Redリコンビナーゼ発現プラスミドのpKD46(ampR)(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)(図4)およびβ−カロテン生合成発現プラスミドのpPCB15(camR)(図5)を用いて、大腸菌株MC1061に同時形質転換することで作成した。プラスミドpPCB15は、パントエアステワルティ(Pantoea stewartii)(ATCC 8199)由来のカロテノイド遺伝子クラスター(crtEXYIB)を含む。pKD46中のλ−Redリコンビナーゼは、アラビノース誘導型プロモーターの制御下で発現した3つの遺伝子、exo、bet、gamを含んでなる。形質転換体は、100μg/mLのアンピシリンと25μg/mLのクロラムフェニコールを加えたLBプレート上、30℃で選択した。
PCRで生成された2つの直鎖状DNAフラグメントの、λ−Redリコンビナーゼを発現している大腸菌株へのエレクトロトランスフォーメーション
λ−Redリコンビナーゼ発現プラスミド(図4)およびレポータープラスミド(図5)の両方を保有する大腸菌MC1061を、PCRフラグメントの形質転換のための宿主株として用いた。上記の株は、λ−Redリコンビナーゼ発現プラスミドのpKD46(ampR)(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)(図4)およびβ−カロテン生合成発現プラスミドのpPCB15(camR)(図5)を用いて、大腸菌株MC1061に同時形質転換することで作成した。プラスミドpPCB15は、パントエアステワルティ(Pantoea stewartii)(ATCC 8199)由来のカロテノイド遺伝子クラスター(crtEXYIB)を含む。pKD46中のλ−Redリコンビナーゼは、アラビノース誘導型プロモーターの制御下で発現した3つの遺伝子、exo、bet、gamを含んでなる。形質転換体は、100μg/mLのアンピシリンと25μg/mLのクロラムフェニコールを加えたLBプレート上、30℃で選択した。
pKD46およびpPCB15を保有する大腸菌MC1061株の、エレクトロコンピテントセルを、下記のように調製した。pKD46およびpPCB15を保有する大腸菌MC1061細胞を、100μg/mLのアンピシリンと、25μg/mlのクロラムフェニコールと、1mMのL−アラビノースとの入ったSOB培地で、光学密度0.5OD600まで30℃で成長させた後、氷上で20分間冷やした。ソーバル(Sorvall)(登録商標)RT7プラス(RT7 PLUS)(ケンドロラボラトリープロダクツ(Kendro Laboratory Products)、コネチカット州ニュートン(Newton,CT))を用いて、細菌細胞を4,500rpm、4℃で10分間遠心分離機にかけた。上清をデカントした後、ペレットを氷水に再懸濁させ、再び遠心分離機にかけた。これを2度繰り返し、細胞ペレットを1/100容量の10%グリセロール氷水に再懸濁させた。
カナマイシンマーカーのPCR産物(1〜5μg)およびファージPT5プロモーターのPCR産物(1〜5μg)の両方を、50μLのコンピテントセルと混合し、氷上で予冷したエレクトロポレーション用キュベット(0.1cm)にピペットで入れた。バイオラッドジーンパルサーセット(Bio−Rad Gene Pulser set)(1.8kV、25μF)を、抵抗200オームのパルス制御装置とともに使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、SOC培地(1mL)を加えた。細胞を37℃で1時間インキュベートした。ダブルの抗生物質耐性形質転換体を選択するために、およそ半分の細胞を、25μg/mLのカナマイシンおよび25μg/mLのクロラムフェニコールの両方を含むLBプレート上に広げた。プレートを37℃で一晩インキュベートした後、ダブルの抗生物質耐性形質転換体を1つ選択した。
実施例3
FLPリコンビナーゼ発現プラスミドを用いた抗生物質選択マーカーの除去
温度感受性複製開始点を有するFlpリコンビナーゼ発現プラスミドpCP20(ampR)を、エレクトロポレーションで、カナマイシン耐性形質転換体へと一時的に形質転換した。バイオラッドジーンパルサー(バイオラッドラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュリーズ(Hercules,CA))セット(1.8kv、25μF)を、パルス制御装置(抵抗200オーム)とともに用いて、エレクトロトランスフォーメーションを行った。100μg/mLのアンピシリンと25μg/mLのクロラムフェニコールを加えたLBプレートに細胞を広げ、30℃で1日培養した。コロニーを採取し、アンピシリン抗生物質を含有しない、25μg/mLのクロラムフェニコールを加えたLBプレート上にストリークして、43℃で一晩インキュベートした(プラスミドpCP20は、温度感受性複製起点を持ち、43℃で細胞を培養することで宿主細胞から取り除かれた)。pCP20およびカナマイシン選択マーカーの損失を試験するために、100μg/mLのアンピシリンを加えたLBプレート、もしくは25μg/mLのカナマイシンを加えたLBプレート上にコロニーをストリークして、コロニーのアンピシリンおよびカナマイシン耐性を試験した。カナマイシン選択マーカーは、温度感受性複製開始点上にあるFlp発現プラスミドの一時的な形質転換による、FRTサイト内のFlp組み換えによって除去された。
FLPリコンビナーゼ発現プラスミドを用いた抗生物質選択マーカーの除去
温度感受性複製開始点を有するFlpリコンビナーゼ発現プラスミドpCP20(ampR)を、エレクトロポレーションで、カナマイシン耐性形質転換体へと一時的に形質転換した。バイオラッドジーンパルサー(バイオラッドラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュリーズ(Hercules,CA))セット(1.8kv、25μF)を、パルス制御装置(抵抗200オーム)とともに用いて、エレクトロトランスフォーメーションを行った。100μg/mLのアンピシリンと25μg/mLのクロラムフェニコールを加えたLBプレートに細胞を広げ、30℃で1日培養した。コロニーを採取し、アンピシリン抗生物質を含有しない、25μg/mLのクロラムフェニコールを加えたLBプレート上にストリークして、43℃で一晩インキュベートした(プラスミドpCP20は、温度感受性複製起点を持ち、43℃で細胞を培養することで宿主細胞から取り除かれた)。pCP20およびカナマイシン選択マーカーの損失を試験するために、100μg/mLのアンピシリンを加えたLBプレート、もしくは25μg/mLのカナマイシンを加えたLBプレート上にコロニーをストリークして、コロニーのアンピシリンおよびカナマイシン耐性を試験した。カナマイシン選択マーカーは、温度感受性複製開始点上にあるFlp発現プラスミドの一時的な形質転換による、FRTサイト内のFlp組み換えによって除去された。
実施例4
PCR分析による、ファージPT5プロモーターのdxs遺伝子前での染色体組み込みの確認
PCR分析にしたがって、カナマイシン選択マーカーおよびファージPT5プロモーター両方の、大腸菌染色体上のdxs遺伝子前部での染色体組み込みを実施した。形質転換体のコロニーは、200μMのdNTPs、2.5Uのアンプリタックゴールド(AmpliTaq Gold)(登録商標)(アプライドバイオシステムス(Applied Biosystems))および0.4μMの異なるプライマー対を含む50μLのPCR反応混合物中で再懸濁した。上記異なるプライマー対は、T1(5’−CGCCAGTCGCTGAAACAACTGGCTGA−3’)(配列番号5)とT2(5’−CAGTCATAGCCGAATAGCCT−3’)(配列番号6)、T3(5’−CGGTGCCCTGAATGAACTGC−3’)(配列番号7)とT4(5’−TGGCAACAGTCGTAGCTCCTGGGTGG−3’)(配列番号8)、T2(T5)とT4、T1とT4だった。テストプライマーを選択し、組み込み領域周辺、もしくはカナマイシンおよびファージPT5プロモーター領域内のどちらかに位置する領域を増幅した(図6)。T1とT2、T3とT4、T2(T5)とT4、T1とT4のプライマー対を用いたPCR試験を行ったところ、1%アガロースゲル上に、682bp、1116bp、229bp、1887bpという予想通りのサイズであることが明らかとなった(図6)。カナマイシン選択マーカーを除去した上で再度PCR分析を行ったところ、T1とT2、T3とT4でPCR産物は示されず、T2(T5)とT4、T1とT4では、それぞれ229bpおよび494bpの予想通りのサイズであることが明らかとなった(図6)。これらのPCRの結果から、染色体dxs遺伝子の前にPT5プロモーターフラグメントが正しく組み込まれ、大腸菌PT5−dxsを産生していることが分かった。
PCR分析による、ファージPT5プロモーターのdxs遺伝子前での染色体組み込みの確認
PCR分析にしたがって、カナマイシン選択マーカーおよびファージPT5プロモーター両方の、大腸菌染色体上のdxs遺伝子前部での染色体組み込みを実施した。形質転換体のコロニーは、200μMのdNTPs、2.5Uのアンプリタックゴールド(AmpliTaq Gold)(登録商標)(アプライドバイオシステムス(Applied Biosystems))および0.4μMの異なるプライマー対を含む50μLのPCR反応混合物中で再懸濁した。上記異なるプライマー対は、T1(5’−CGCCAGTCGCTGAAACAACTGGCTGA−3’)(配列番号5)とT2(5’−CAGTCATAGCCGAATAGCCT−3’)(配列番号6)、T3(5’−CGGTGCCCTGAATGAACTGC−3’)(配列番号7)とT4(5’−TGGCAACAGTCGTAGCTCCTGGGTGG−3’)(配列番号8)、T2(T5)とT4、T1とT4だった。テストプライマーを選択し、組み込み領域周辺、もしくはカナマイシンおよびファージPT5プロモーター領域内のどちらかに位置する領域を増幅した(図6)。T1とT2、T3とT4、T2(T5)とT4、T1とT4のプライマー対を用いたPCR試験を行ったところ、1%アガロースゲル上に、682bp、1116bp、229bp、1887bpという予想通りのサイズであることが明らかとなった(図6)。カナマイシン選択マーカーを除去した上で再度PCR分析を行ったところ、T1とT2、T3とT4でPCR産物は示されず、T2(T5)とT4、T1とT4では、それぞれ229bpおよび494bpの予想通りのサイズであることが明らかとなった(図6)。これらのPCRの結果から、染色体dxs遺伝子の前にPT5プロモーターフラグメントが正しく組み込まれ、大腸菌PT5−dxsを産生していることが分かった。
実施例5
大腸菌PT5−dxs内のβ−カロテン産生の測定
レポータープラスミドpPCB15を含む大腸菌PT5−dxsのβ−カロテン産生量を、同じくpPCB15を含む大腸菌対照株とともに測定することで、dxs遺伝子の前へのPT5プロモーターの染色体組み込みをさらに特徴付けた。大腸菌PT5−dxsと大腸菌対照株を25μg/mLのクロラムフェニコールを含む5mLのLBで24時間、37℃で培養した後、4000rpmで10分間遠心分離機にかけて収集した。細胞ペレットを、1mLのアセトン中で1分間ボルテックスして再懸濁させ、ロッキングプラットフォーム200(Rocking Platform 200)(VWRインターナショナル(VWR International)、ペンシルバニア州ウェストチェスター(West Cester,PA))を用いて試料を室温で1時間振とうさせ、β−カロテン色素を抽出した。試料を4000rpmで10分間遠心分離機にかけた後、β−カロテンを含むアセトン層の吸光スペクトラムを、ウルトロスペック3000(Ultrospec 3000)分光光度計(アマーシャムバイオサイエンシーズ(Amersham Biosciences)、ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway,NJ))を用いて、λ450nmで測定した。大腸菌PT5−dxs中のβ−カロテン産生量は、対照株の約3倍多かった(図7)。これらの結果から、大腸菌PT5−dxsでβ−カロテンの産生量が増えたのは、強力PT5プロモーターの制御下でdxs遺伝子の発現が増したのに起因することが分かる。PCR分析だけでなく、対照株との比較で大腸菌PT5−dsxのβ−カロテンを測定することでその機能を試験し、大腸菌PT5−dxsの構成が正しいことを示した。
大腸菌PT5−dxs内のβ−カロテン産生の測定
レポータープラスミドpPCB15を含む大腸菌PT5−dxsのβ−カロテン産生量を、同じくpPCB15を含む大腸菌対照株とともに測定することで、dxs遺伝子の前へのPT5プロモーターの染色体組み込みをさらに特徴付けた。大腸菌PT5−dxsと大腸菌対照株を25μg/mLのクロラムフェニコールを含む5mLのLBで24時間、37℃で培養した後、4000rpmで10分間遠心分離機にかけて収集した。細胞ペレットを、1mLのアセトン中で1分間ボルテックスして再懸濁させ、ロッキングプラットフォーム200(Rocking Platform 200)(VWRインターナショナル(VWR International)、ペンシルバニア州ウェストチェスター(West Cester,PA))を用いて試料を室温で1時間振とうさせ、β−カロテン色素を抽出した。試料を4000rpmで10分間遠心分離機にかけた後、β−カロテンを含むアセトン層の吸光スペクトラムを、ウルトロスペック3000(Ultrospec 3000)分光光度計(アマーシャムバイオサイエンシーズ(Amersham Biosciences)、ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway,NJ))を用いて、λ450nmで測定した。大腸菌PT5−dxs中のβ−カロテン産生量は、対照株の約3倍多かった(図7)。これらの結果から、大腸菌PT5−dxsでβ−カロテンの産生量が増えたのは、強力PT5プロモーターの制御下でdxs遺伝子の発現が増したのに起因することが分かる。PCR分析だけでなく、対照株との比較で大腸菌PT5−dsxのβ−カロテンを測定することでその機能を試験し、大腸菌PT5−dxsの構成が正しいことを示した。
実施例6
大腸菌染色体上のidi遺伝子のプロモーター操作−(PCRで生成された)2つの直鎖状DNAフラグメントの調製、エレクトロトランスフォーメーション、抗生物質選択マーカーの除去
本発明を染色体プロモーターの置換に汎用的に適用することについて、大腸菌染色体上のidi遺伝子のプロモーターを操作することでさらに検討した。この大腸菌染色体の65.3分に位置するidi遺伝子に作動的に結合した内在性のプロモーターを、PCRで生成された2つのDNAフラグメントを用いてPT5強力プロモーターと置換した。異なるプライマーを用いたこと以外は実施例1に記載したように、PCRでDNAフラグメントを合成した。FRT配列に隣接されたカナマイシン選択マーカーを含む直鎖状DNAフラグメント(1489bp)を、プライマー対、T(idi)(5’−TCTGATGCGCAAGCTGAAGAAAAATGAGCATGGAGAATAATATGACGTCTTGAGCGATTGTGTAG−3’)(配列番号9)を用いて、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)からPCRで合成した。上記T(idi)は、ygfU終止コドンの上流領域にある配列と、プライマー配列(20bp)と、プロモーターDNAフラグメントの5’−末端領域にある配列およびプライマー配列(20bp)にマッチするように選択されたh2ホモロジーアーム(下線部の50bp)を含むB1(T5)とにマッチするように選択された、h4ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む(図8)。PT5プロモーターを含む第2の直鎖状DNAフラグメント(154bp)を、プライマー対、T2(T5)(5’−TAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC−3’)(配列番号3)を用いて、pQE30(キアゲン(QIAGEN,Inc.))からPCRで合成した。上記T2(T5)は、プライマー配列(32bp)およびidi開始コドンとプライマー配列(22bp)の下流領域にある配列にマッチするように選択されたh5ホモロジーアーム(下線部の46bp)を含むB(idi)(5’−TGGGAACTCCCTGTGCATTCAATAAAATGACGTGTTCCGTTTGCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号10)を含む(図8)。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる2つのPCRフラグメントは、図8に示すように、ホモロジーアーム(h2およびh4)を含むカナマイシン選択マーカーと、ホモロジーアーム(h5)を含むPT5プロモーターであった。
大腸菌染色体上のidi遺伝子のプロモーター操作−(PCRで生成された)2つの直鎖状DNAフラグメントの調製、エレクトロトランスフォーメーション、抗生物質選択マーカーの除去
本発明を染色体プロモーターの置換に汎用的に適用することについて、大腸菌染色体上のidi遺伝子のプロモーターを操作することでさらに検討した。この大腸菌染色体の65.3分に位置するidi遺伝子に作動的に結合した内在性のプロモーターを、PCRで生成された2つのDNAフラグメントを用いてPT5強力プロモーターと置換した。異なるプライマーを用いたこと以外は実施例1に記載したように、PCRでDNAフラグメントを合成した。FRT配列に隣接されたカナマイシン選択マーカーを含む直鎖状DNAフラグメント(1489bp)を、プライマー対、T(idi)(5’−TCTGATGCGCAAGCTGAAGAAAAATGAGCATGGAGAATAATATGACGTCTTGAGCGATTGTGTAG−3’)(配列番号9)を用いて、プラスミドpKD4(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)からPCRで合成した。上記T(idi)は、ygfU終止コドンの上流領域にある配列と、プライマー配列(20bp)と、プロモーターDNAフラグメントの5’−末端領域にある配列およびプライマー配列(20bp)にマッチするように選択されたh2ホモロジーアーム(下線部の50bp)を含むB1(T5)とにマッチするように選択された、h4ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む(図8)。PT5プロモーターを含む第2の直鎖状DNAフラグメント(154bp)を、プライマー対、T2(T5)(5’−TAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC−3’)(配列番号3)を用いて、pQE30(キアゲン(QIAGEN,Inc.))からPCRで合成した。上記T2(T5)は、プライマー配列(32bp)およびidi開始コドンとプライマー配列(22bp)の下流領域にある配列にマッチするように選択されたh5ホモロジーアーム(下線部の46bp)を含むB(idi)(5’−TGGGAACTCCCTGTGCATTCAATAAAATGACGTGTTCCGTTTGCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号10)を含む(図8)。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる2つのPCRフラグメントは、図8に示すように、ホモロジーアーム(h2およびh4)を含むカナマイシン選択マーカーと、ホモロジーアーム(h5)を含むPT5プロモーターであった。
PCR反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションを、実施例1および2に記載したように実施した。精製されたカナマイシンをカセットしたPCR産物(1〜5μg)およびPT5プロモーターのPCR産物(1〜5μg)を、λ−Redリコンビナーゼを発現している大腸菌に同時形質転換した。実施例1に記載したように、細胞をプレートし、かつスクリーニングして、抗生物質耐性形質転換体を得た。kanRとcamRのダブル耐性の形質転換体を14選択した。カナマイシン選択マーカーを、実施例3に記載した方法で除去した。
実施例7
idi遺伝子前部でのPT5プロモーターの染色体組み込みの確認
14のダブルの抗生物質耐性形質転換体の内の、5つの形質転換体を任意で選択し、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、T5(5’−TCATGCTGACCTGGTGAAGGAATCC−3’)(配列番号11)とT2、T2(T5)とT6(5’−TCATGCTGACCTGGTGAAGGAATCC−3’)(配列番号12)、T5とT6を用いてPCRで分析した(図9)。実施例4に記載したように、PCR反応を実施した。テストプライマーを、組み込み領域の付近、もしくはカナマイシンおよびPT5プロモーター領域のどちらか一方に位置している配列を増幅するために選んだ。5つの形質転換体すべてに対する、T5とT2、T2(T5)とT6、T5とT6のプライマー対を用いたPCR試験では、それぞれ1%アガロースゲル上で予想通りのサイズ627bp、274bp、1877bpが得られた。実施例3に記載したようにカナマイシン選択マーカーを除去した後、T5およびT2を用いてPCR分析を行ったところ、PCR産物は認められなかった。一方、T2(T5)とT6、T5とT6のプライマー対を用いて再度PCR分析を行ったところ、予想通りのサイズすなわちそれぞれ274bpと484bpのPCR産物が認められた。これらの結果から、カナマイシン選択マーカーとPT5プロモーターフラグメントとが、染色体idi遺伝子の前に正しく組み込まれ、大腸菌PT5−idiを産生していることが分かった。
idi遺伝子前部でのPT5プロモーターの染色体組み込みの確認
14のダブルの抗生物質耐性形質転換体の内の、5つの形質転換体を任意で選択し、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、T5(5’−TCATGCTGACCTGGTGAAGGAATCC−3’)(配列番号11)とT2、T2(T5)とT6(5’−TCATGCTGACCTGGTGAAGGAATCC−3’)(配列番号12)、T5とT6を用いてPCRで分析した(図9)。実施例4に記載したように、PCR反応を実施した。テストプライマーを、組み込み領域の付近、もしくはカナマイシンおよびPT5プロモーター領域のどちらか一方に位置している配列を増幅するために選んだ。5つの形質転換体すべてに対する、T5とT2、T2(T5)とT6、T5とT6のプライマー対を用いたPCR試験では、それぞれ1%アガロースゲル上で予想通りのサイズ627bp、274bp、1877bpが得られた。実施例3に記載したようにカナマイシン選択マーカーを除去した後、T5およびT2を用いてPCR分析を行ったところ、PCR産物は認められなかった。一方、T2(T5)とT6、T5とT6のプライマー対を用いて再度PCR分析を行ったところ、予想通りのサイズすなわちそれぞれ274bpと484bpのPCR産物が認められた。これらの結果から、カナマイシン選択マーカーとPT5プロモーターフラグメントとが、染色体idi遺伝子の前に正しく組み込まれ、大腸菌PT5−idiを産生していることが分かった。
実施例5に記載したように、idi遺伝子の前へのPT5プロモーターの染色体組み込みを、対照株に対する大腸菌PT5−idiのβ−カロテン産生量を定量化することでさらに確認した。それの未変性のプロモーターと結合しているidi遺伝子を含む対照株と比較した場合、大腸菌PT5−idiがβ−カロテン産生量の1.5倍増加した(図7)。
実施例8
融合した抗生物質選択マーカーとプロモーターとを保有するテンプレートプラスミドの作出
染色体操作を容易にするために、融合したカナマイシン選択マーカーとPT5プロモーターとを保有するプラスミドを作出した。PT5強力プロモーター領域をpKD4のNdeI制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングして、融合したカナマイシン選択マーカーとPT5プロモーターを含むプラスミドを作出した(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)(図10)。最初に、−10および−35コンセンサス配列とlacOとrbsとを含んでなるPT5プロモーター因子(154bp)を含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、TT5(5’−ATCATGACATTAACATATGAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC−3’)(配列番号13)およびBT5(5’−GATGCGATCCCATATGAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号14)を用いて、pQE30(キアゲン(QIAGEN,Inc.)からPCRで合成した。プライマー内の下線部の配列は、NdeI部位の配列を表している。PCR反応の条件については、実施例1に記載したものと同じとした。このようにして得られたPCR産物をNdeIで消化し、NdeIで消化したpKD4にクローニングして、pSUH5(配列番号36、図10)を産生した。融合カナマイシン選択マーカー−ファージPT5プロモーターを含む直鎖状PCR DNAフラグメントを生成するテンプレートとして、プラスミドpSUH5を利用した。pSUH5の構成については、DNA塩基配列決定法(デュポンCRアンドD、DNAシーケンスファシリティー(DuPont CR&D DNA sequence facility)、デラウェア州ウィルミントン(Wilmington,DE))で確認した。
融合した抗生物質選択マーカーとプロモーターとを保有するテンプレートプラスミドの作出
染色体操作を容易にするために、融合したカナマイシン選択マーカーとPT5プロモーターとを保有するプラスミドを作出した。PT5強力プロモーター領域をpKD4のNdeI制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングして、融合したカナマイシン選択マーカーとPT5プロモーターを含むプラスミドを作出した(ダツェンコ(Datsenko)とワーナー(Wanner)、上掲)(図10)。最初に、−10および−35コンセンサス配列とlacOとrbsとを含んでなるPT5プロモーター因子(154bp)を含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、TT5(5’−ATCATGACATTAACATATGAAAATAGGCGTATCACGAGGCCC−3’)(配列番号13)およびBT5(5’−GATGCGATCCCATATGAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号14)を用いて、pQE30(キアゲン(QIAGEN,Inc.)からPCRで合成した。プライマー内の下線部の配列は、NdeI部位の配列を表している。PCR反応の条件については、実施例1に記載したものと同じとした。このようにして得られたPCR産物をNdeIで消化し、NdeIで消化したpKD4にクローニングして、pSUH5(配列番号36、図10)を産生した。融合カナマイシン選択マーカー−ファージPT5プロモーターを含む直鎖状PCR DNAフラグメントを生成するテンプレートとして、プラスミドpSUH5を利用した。pSUH5の構成については、DNA塩基配列決定法(デュポンCRアンドD、DNAシーケンスファシリティー(DuPont CR&D DNA sequence facility)、デラウェア州ウィルミントン(Wilmington,DE))で確認した。
実施例9
メチロモナス(Methylomonas) 16A dxs遺伝子の大腸菌での染色体組み込み−2つの直鎖状DNAフラグメントの調製:(1)融合抗生物質選択マーカー−プロモーター、(2)外来遺伝子、エレクトロトランスフォーメーション、抗生物質選択マーカーの除去
本発明の適用性は、外来遺伝子を大腸菌へ組み込む、染色体組み込みへとさらに広がった。この実施例は、大腸菌染色体、2つの直鎖状DNAフラグメント、融合カナマイシン選択マーカー−ファージPT5プロモーターおよびメチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子(本発明では、「dxs(16a)」と表示される。配列番号15)間の相同的組み換えによって、メチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子を、大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域に組み込む、染色体組み込みについて説明する。dxs遺伝子は、大腸菌dxs遺伝子のメチロモナス(Methylomonas) 16a(ATCC受託番号PTA−2402)相同物である。相同的組み換えによる、メチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子の染色体組み込みのスキームを、図11に示す。
メチロモナス(Methylomonas) 16A dxs遺伝子の大腸菌での染色体組み込み−2つの直鎖状DNAフラグメントの調製:(1)融合抗生物質選択マーカー−プロモーター、(2)外来遺伝子、エレクトロトランスフォーメーション、抗生物質選択マーカーの除去
本発明の適用性は、外来遺伝子を大腸菌へ組み込む、染色体組み込みへとさらに広がった。この実施例は、大腸菌染色体、2つの直鎖状DNAフラグメント、融合カナマイシン選択マーカー−ファージPT5プロモーターおよびメチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子(本発明では、「dxs(16a)」と表示される。配列番号15)間の相同的組み換えによって、メチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子を、大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域に組み込む、染色体組み込みについて説明する。dxs遺伝子は、大腸菌dxs遺伝子のメチロモナス(Methylomonas) 16a(ATCC受託番号PTA−2402)相同物である。相同的組み換えによる、メチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子の染色体組み込みのスキームを、図11に示す。
融合カナマイシン選択マーカー−ファージPT5プロモーターを含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、T1(dxs16a)(5’−CACTAACGCCCGCACATTGCTGCGGGCTTTTTGATTCATTTCGCACGTCTTGAGCGATTGTGTAG−3’)(配列番号16)を用いて、pSUH5からPCRによって合成した。上記T1(dxs16a)は、大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域にある配列、プライマー配列(20bp)およびB1(dxs16a)(5’−AGTAGAGGGAAGTCTTTGGAAAGAGCCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号17)にマッチするように選択されたh6ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む。上記B1(dxs16a)は、dxs(16a)開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列(22bp)にマッチするように選択されたh7ホモロジーアーム(下線部の29bp)を含む(図11)。メチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、T2(dxs16a)(5’−ACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGCTCTTTCCAAAGAC TTCCCTC−3’)(配列番号18)を用いて、メチロモナス(Methylomonas) 16a((ATCC受託番号PTA−2402)ゲノムDNAからPCRによって合成した。上記T2(dxs16a)は、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターの3’−末端領域にある配列、プライマー配列(25bp)およびB2(dxs16a)(5’−AGGAGCGAAGTGATTATCAGTATGCTGTTCATATAGCCTCGAATTATCAAGCGCAAAACTGTTCGATG−3’)(配列番号19)にマッチするように選択されたh8ホモロジーアーム(下線部の30bp)を含む。上記B2(dxs16a)は、大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域にある配列およびプライマー配列(22bp)にマッチするように選択されたh9ホモロジーアーム(下線部の46bp)を含む(図11)。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。こうして得られる2つのPCRフラグメントは、図11に示すように、ホモロジーアーム(h6およびh7)を含むカナマイシン選択マーカーとホモロジーアーム(h8およびh9)を含むdxs(16a)遺伝子であった。
PCR反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションについては、実施例1および2で記載したように実施した。融合カナマイシン−ファージPT5プロモーターのPCR産物(1〜5μg)とメチロモナス(Methylomonas) 16a dxsのPCR産物(1〜5μg)の両方を、λ−Redリコンビナーゼ系を発現している大腸菌宿主細胞に同時形質転換した。形質転換体を上述したようにして選択し、7つのkanRおよびcamRのダブル耐性の形質転換体を選択した。カナマイシン選択マーカーを、実施例3に記載した方法で除去した。
実施例10
融合抗生物質選択マーカー−プロモーターおよびメチロモナス(Methylomonas) 16A由来の外来dxs遺伝子の染色体組み込みの確認
7つのダブルの抗生物質耐性形質転換体すべてを、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、T7(5’−ACCGGATATCACCACTTATCTGCTC−3’)(配列番号20)とT2、T7とT8(5’−ATGCTGACCGTGTGGGTCAGATAGC−3’)(配列番号21)、T2(T5)とT9(5’−GCGATATTGTATGTCTGATTCAGGA−3’)(配列番号22)、T7とT9を用いて、PCRで分析した(図12)。テストプライマーを選び、図12に示すように、カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター領域の組み込み領域付近、もしくはメチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子付近のどちらかに位置する配列を増幅した。PCR反応を、実施例4に記載したように実施した。T7とT2、T7とT8、T2(T5)とT9、T7とT9の対を用いたPCR分析から、7つの内2つの形質転換体が、1%アガロースゲル上で、それぞれ643bp、1908bp、2184bp、3803bpという予想通りのサイズであった。これらの結果から、2つの形質転換体では、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターフラグメントとメチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子が大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域にの正しく組み込まれていることが分かった。カナマイシン選択マーカーを除去した後、T7とT2のプライマー対を用いてPCR分析を行ったところ、PCR産物は認められなかった。T7とT8、T2(T5)とT9、T7とT9のプライマー対を用いたPCR分析では、1%アガロースゲル上に、それぞれ515bp、2184bp、2410bpという予想通りのサイズのフラグメントが示された。このようにして得られた大腸菌PT5−dxs(16a)の形質転換を、実施例5に記載したように、そのβ−カロテン産生について試験したところ、β−カロテン産生量が対照株よりも3.3倍高かった(図7)。
融合抗生物質選択マーカー−プロモーターおよびメチロモナス(Methylomonas) 16A由来の外来dxs遺伝子の染色体組み込みの確認
7つのダブルの抗生物質耐性形質転換体すべてを、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、T7(5’−ACCGGATATCACCACTTATCTGCTC−3’)(配列番号20)とT2、T7とT8(5’−ATGCTGACCGTGTGGGTCAGATAGC−3’)(配列番号21)、T2(T5)とT9(5’−GCGATATTGTATGTCTGATTCAGGA−3’)(配列番号22)、T7とT9を用いて、PCRで分析した(図12)。テストプライマーを選び、図12に示すように、カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター領域の組み込み領域付近、もしくはメチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子付近のどちらかに位置する配列を増幅した。PCR反応を、実施例4に記載したように実施した。T7とT2、T7とT8、T2(T5)とT9、T7とT9の対を用いたPCR分析から、7つの内2つの形質転換体が、1%アガロースゲル上で、それぞれ643bp、1908bp、2184bp、3803bpという予想通りのサイズであった。これらの結果から、2つの形質転換体では、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターフラグメントとメチロモナス(Methylomonas) 16a dxs遺伝子が大腸菌染色体の30.9分に位置する遺伝子間領域にの正しく組み込まれていることが分かった。カナマイシン選択マーカーを除去した後、T7とT2のプライマー対を用いてPCR分析を行ったところ、PCR産物は認められなかった。T7とT8、T2(T5)とT9、T7とT9のプライマー対を用いたPCR分析では、1%アガロースゲル上に、それぞれ515bp、2184bp、2410bpという予想通りのサイズのフラグメントが示された。このようにして得られた大腸菌PT5−dxs(16a)の形質転換を、実施例5に記載したように、そのβ−カロテン産生について試験したところ、β−カロテン産生量が対照株よりも3.3倍高かった(図7)。
実施例11
P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子の大腸菌での染色体組み込み−2つの直鎖状DNAフラグメントの調製:(1)融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターおよび(2)P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子
この実施例は、P.ステワルティ(stewartii) crtEおよびP.ステワルティ(stewartii) crtIBの組み込みによる、P.ステワルティ(stewartii) crtEおよびcrtIB遺伝子の、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域への染色体組み込みを説明する(図13)。crtE、crtIおよびcrtB遺伝子は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、フィトネンシンターゼをそれぞれコードする。これらの遺伝子は、カロテノイド生合成経路の部分である(図3)。
P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子の大腸菌での染色体組み込み−2つの直鎖状DNAフラグメントの調製:(1)融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターおよび(2)P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子
この実施例は、P.ステワルティ(stewartii) crtEおよびP.ステワルティ(stewartii) crtIBの組み込みによる、P.ステワルティ(stewartii) crtEおよびcrtIB遺伝子の、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域への染色体組み込みを説明する(図13)。crtE、crtIおよびcrtB遺伝子は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、フィトネンシンターゼをそれぞれコードする。これらの遺伝子は、カロテノイド生合成経路の部分である(図3)。
融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターを含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、T1(crtE)(5’−AGCCGTCGCAGGAGGAACAACTCATATCATCATTGCGATCTCGACCGTCTTGAGCGATTGTGTAG−3’)(配列番号23)を用いて、pSUH5からPCRによって合成する。上記T1(crtE)は、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列、プライマー配列(20bp)およびB1(crtE)(5’−TGAACGTGTTTTTTTGCGCAGACCGTCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATG−3’)(配列番号24)にマッチするように選択されたh10ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む。上記B1(crtE)は、crtE開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列(22bp)にマッチするように選択されたh11ホモロジーアーム(下線部の29bp)を含む(図13)。P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、T2(crtE)(5’−ACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACGGTCTGCGCAAAAAAACACG−3’)(配列番号25)を用いて、pPCB15(図5)からPCRで合成した。上記T2(crtE)は、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターの3’−末端領域にある配列、プライマー配列(25bp)およびB2(crtE)(5’−AGAATGACCAGCTGGATGCATTATCTTTATTTGGATCATTGAGGGTTAACTGACGGCAGCGAGTT−3’)(配列番号26)にマッチするように選択されたh8ホモロジーアーム(下線部の30bp)を含む。上記B2(crtE)は、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列およびプライマー配列(20bp)にマッチするように選択されたh12ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む(図13)。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分はPCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。2つの結果として生じたPCRフラグメントは、図13で説明されているように、ホモロジーアーム(h10およびh11)を含む融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターおよびホモロジーアーム(h8およびh12)を含むP.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子であった。
レポータープラスミドpPCB15の大腸菌株への形質転換を省略した以外は実施例2に記載したように、PCR反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションを実施した。上述したように、プラスミドpPCB15は、パントエアステワルティ(Pantoea stewartii)(ATCC受託番号8199)crtEXYIB遺伝子クラスターを含む。実施例12および13に記載したような染色体操作で大腸菌に組み込まれた遺伝子の機能的な発現を測定するには、レポータープラスミドを取り除く必要があった。融合カナマイシンマーカー−PT5プロモーターのPCR産物(1〜5μg)およびP.ステワルティ(stewartii) crtEのPCR産物(1〜5μg)の両方を、上述したようなレポータープラスミドを除外したこと以外は、実施例2で上述したようなエレクトロポレーションで、λ−Redリコンビナーゼ系を発現している大腸菌宿主株(MC1061)に同時形質転換した。形質転換体を、37℃で、25μg/mLのカナマイシンを加えたLBプレート上で選択した。プレートを37℃で一晩インキュベートした後、2つのkanR耐性形質転換体を選択した。
2つのkanR耐性形質転換体を、T10(5’−CCATGACCCTACATTGTGATCTATAG−3’)(配列番号27)およびT13(5’−GGAACCATTGAACTGGACCCTAACG−3’)(配列番号33)のプライマー対を用いて、PCRで分析した(図14)。実施例4に記載したPCR反応の条件と同様の条件下で、PCR分析を実施した。T10/T13を用いた、2つの形質転換体についてのPCR試験では、1%アガロースゲル上に、予想通りのサイズである2883bpが示された。この結果から、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーターのDNAフラグメントが、P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子とともに、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域に正しく組み込まれ、大腸菌PT5−crtEを産生していることが分かった。
実施例12
PT5−crtEIBを作成するための、大腸菌PT5−crtEでのP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子の染色体組み込み−2つの直鎖状DNAフラグメントの調製:(1)融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子、(2)P.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子、エレクトロトランスフォーメーションおよび抗生物質選択マーカーの除去
融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、大腸菌PT5−crtE遺伝子のゲノムDNAから、プライマー対、T10(配列番号27)を用いてPCRによって合成した。上記T10は、大腸菌内の、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−crtE遺伝子の組み込み部位の上流領域にある162塩基に相当するプライマー配列(26bp)およびB1(crtIB)(5’−TCCTCCAGCATTAAGCCTGCCGTCGCCTTTTAACTGACGGCAGCGAGTTTTTTGTC−3’)(配列番号28)を含む。上記B1(crtIB)は、crtI開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列(27bp)にマッチするように選択されたh14ホモロジーアーム(下線部の29bp)を含む(図13)。P.ステワルティ(stewartii) crtIBを含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、T2(crtIB)(5’−TTTGACAAAAAACTCGCTGCCGTCAGTTAAAAGGCGACGGCAGGCTTAATGCTG−3’)(配列番号29)を用いて、pPCB15(図5)からPCRで合成した。上記T2(crtIB)は、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−crtE遺伝子の3’−末端にある配列、プライマー配列(24bp)およびB2(crtIB)(5’−AGAATGACCAGCTGGATGCATTATCTTTATTTGGATCATTGAGGGCTAGATCGGGCGCTGCCAGA−3’)(配列番号30)にマッチするように選択されたh14ホモロジーアーム(下線部の30bp)を含む。上記B2(crtIB)は、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列およびプライマー配列(20bp)にマッチするように選択されたh12ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む(図5および13)。下線部の配列はそれぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる2つのPCRフラグメントは、図13に示すように、5’−末端の相同領域(162bp)とホモロジーアーム(h13)とを含む融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子およびホモロジーアーム(h14およびh12)を含むP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子であった。
PT5−crtEIBを作成するための、大腸菌PT5−crtEでのP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子の染色体組み込み−2つの直鎖状DNAフラグメントの調製:(1)融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子、(2)P.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子、エレクトロトランスフォーメーションおよび抗生物質選択マーカーの除去
融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子を含む直鎖状DNAフラグメントを、大腸菌PT5−crtE遺伝子のゲノムDNAから、プライマー対、T10(配列番号27)を用いてPCRによって合成した。上記T10は、大腸菌内の、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−crtE遺伝子の組み込み部位の上流領域にある162塩基に相当するプライマー配列(26bp)およびB1(crtIB)(5’−TCCTCCAGCATTAAGCCTGCCGTCGCCTTTTAACTGACGGCAGCGAGTTTTTTGTC−3’)(配列番号28)を含む。上記B1(crtIB)は、crtI開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列(27bp)にマッチするように選択されたh14ホモロジーアーム(下線部の29bp)を含む(図13)。P.ステワルティ(stewartii) crtIBを含む直鎖状DNAフラグメントを、プライマー対、T2(crtIB)(5’−TTTGACAAAAAACTCGCTGCCGTCAGTTAAAAGGCGACGGCAGGCTTAATGCTG−3’)(配列番号29)を用いて、pPCB15(図5)からPCRで合成した。上記T2(crtIB)は、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−crtE遺伝子の3’−末端にある配列、プライマー配列(24bp)およびB2(crtIB)(5’−AGAATGACCAGCTGGATGCATTATCTTTATTTGGATCATTGAGGGCTAGATCGGGCGCTGCCAGA−3’)(配列番号30)にマッチするように選択されたh14ホモロジーアーム(下線部の30bp)を含む。上記B2(crtIB)は、大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域にある配列およびプライマー配列(20bp)にマッチするように選択されたh12ホモロジーアーム(下線部の45bp)を含む(図5および13)。下線部の配列はそれぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、PCR反応のためのテンプレートDNA上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる2つのPCRフラグメントは、図13に示すように、5’−末端の相同領域(162bp)とホモロジーアーム(h13)とを含む融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子およびホモロジーアーム(h14およびh12)を含むP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子であった。
実施例11に記載したように、レポータープラスミドpPCB15を用いて宿主細胞を形質転換するステップを省略した以外は、実施例2に記載したように、PCR反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションを実施した。融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子のPCR産物(1〜5μg)およびP.ステワルティ(stewartii) crtIBのPCR産物(1〜5μg)を、実施例2で上述したように、エレクトロポレーションによって、λ−Redリコンビナーゼ系を発現している大腸菌宿主細胞に同時形質転換した。形質転換体を、37℃で、25μg/mLのカナマイシンを加えたLBプレート上で選択した。プレートを37℃で一晩インキュベートした後、kanR耐性形質転換体を1つ選択した。実施例3に記載した方法で、カナマイシン選択マーカーを除去した。
実施例13
大腸菌PT5−crtEIB内のP.ステワルティ(stewartii) crtEおよびcrtIB遺伝子の、染色体組み込みの確認
選択したkanR耐性形質転換体を、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、T10とT2、T2(T5)とT12(5’−CTAGATCGGGCGCTGCCAGAGATGA−3’)(配列番号32)、T11(5’−ACACGTTCACCTTACTGGCATTTCG−3’)(配列番号31)とT13、T10とT13を用いて、PCRで分析した(図14)。テストプライマーを選び、カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−ctrEフラグメントの組み込み領域付近、もしくはcrtIB遺伝子付近のどちらか一方に位置する配列を増幅した(図14)。実施例4に記載したPCR反応の条件と同様の条件下で、PCR分析を実施した。T10とT2、T2(T5)とT12、T11とT13、T10とT13を用いたPCR試験では、それぞれ676bp、3472bp、3478bp、5288bpという予想通りのサイズが1%アガロースゲル上で示された。カナマイシン選択マーカーが除去されていることを、PCRフラグメントの分析で確認した(図14)。プライマー対T10とT2を用いたPCRフラグメントの分析では、予想通り、産物が形成されている旨は示されなかった。プライマー対T2(T5)とT12、T11とT13、T10とT13を用いたPCR分析では、それぞれ3472bp、3478bp、3895bpという予想通りのサイズのPCR産物が1%アガロースゲル上に示された。これらの結果から、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子のDNAフラグメントとP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子が大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域に正しく組み込まれ、大腸菌PT5−crtEIBを産生していることが分かった。
大腸菌PT5−crtEIB内のP.ステワルティ(stewartii) crtEおよびcrtIB遺伝子の、染色体組み込みの確認
選択したkanR耐性形質転換体を、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、T10とT2、T2(T5)とT12(5’−CTAGATCGGGCGCTGCCAGAGATGA−3’)(配列番号32)、T11(5’−ACACGTTCACCTTACTGGCATTTCG−3’)(配列番号31)とT13、T10とT13を用いて、PCRで分析した(図14)。テストプライマーを選び、カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−ctrEフラグメントの組み込み領域付近、もしくはcrtIB遺伝子付近のどちらか一方に位置する配列を増幅した(図14)。実施例4に記載したPCR反応の条件と同様の条件下で、PCR分析を実施した。T10とT2、T2(T5)とT12、T11とT13、T10とT13を用いたPCR試験では、それぞれ676bp、3472bp、3478bp、5288bpという予想通りのサイズが1%アガロースゲル上で示された。カナマイシン選択マーカーが除去されていることを、PCRフラグメントの分析で確認した(図14)。プライマー対T10とT2を用いたPCRフラグメントの分析では、予想通り、産物が形成されている旨は示されなかった。プライマー対T2(T5)とT12、T11とT13、T10とT13を用いたPCR分析では、それぞれ3472bp、3478bp、3895bpという予想通りのサイズのPCR産物が1%アガロースゲル上に示された。これらの結果から、融合カナマイシン選択マーカー−PT5プロモーター−P.ステワルティ(stewartii) crtE遺伝子のDNAフラグメントとP.ステワルティ(stewartii) crtIB遺伝子が大腸菌染色体の81.2分に位置するオペロン間領域に正しく組み込まれ、大腸菌PT5−crtEIBを産生していることが分かった。
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(CrtE)、フィトエンシンターゼ(CrtB)およびフィトエンデヒドロゲナーゼ(CrtI)の各酵素の大腸菌PT5−crtEIBにおける機能的な発現を、ピンク色の色素が生成されることを利用するリコピンの合成によって確認した。実施例5に記載したように、リコピンをアセトンで抽出した後、大腸菌PT5−crtEIBによるリコピン産生を、リコピン特有の数値である444、470および502nmのλmaxピークを認めることで、分光光度的に確認した。
Claims (30)
- 選択マーカーを欠いた発現可能なDNAフラグメントを細菌染色体に指向性組込み(directed integration)するための方法であって、
a)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−3’
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基で構成される第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基で構成される第2の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第1の組み換え因子を提供し、
b)5’から3’方向への一般構造が
X−RR3
(式中、(i)Xは、第2の組み換え領域に相同性を有する発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基で構成される第3の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第2の組み換え因子を提供し、
c)(i)前記第1の組み換え領域に相同性を有する第1の染色体領域と、
(ii)前記第3の組み換え領域に相同性を有する第2の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい(recombination proficient)細菌宿主を提供し、
d)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−X−RR3
であるコンストラクトを形成しながら、第1および第2の組み換え因子を第1の染色体領域と第2の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
f)選択マーカーを染色体から切断することで、選択マーカーを欠いた状態で発現可能なDNAフラグメントを細菌染色体に挿入する、(e)の単離された宿主で、部位特異的リコンビナーゼを発現させること、
を含んでなる方法。 - 選択マーカーを欠いた発現可能なDNAフラグメントを細菌染色体に指向性組込みするための方法であって、
a)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−Y−RR2−3’
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基で構成される第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)Yは、第1の発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(v)RR2は、約10〜50塩基で構成される第2の組み換え領域である)
である、少なくとも1つの第1の組み換え因子を提供し、
b)5’から3’方向への一般構造が
5’−X−RR3−3’
(式中、(i)Xは、第2の組み換え領域に相同性を有する、第2の発現可能なDNAフラグメントであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基で構成される第3の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第2の組み換え因子を提供し、
c)(i)前記第1の組み換え領域に相同性を有する第1の染色体領域と、
(ii)前記第3の組み換え領域に相同性を有する第2の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
d)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−Y−RR2−X−RR3
であるコンストラクトを形成しながら、第1および第2の組み換え因子を第1の染色体領域と第2の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
f)選択マーカーを染色体から切断することで、選択マーカーを欠いた状態で第1および第2の発現可能なDNAフラグメントを細菌染色体に挿入する、(e)の単離された宿主で、部位特異的リコンビナーゼを発現させること、
を含んでなる方法。 - 第1の発現可能なDNAフラグメントと第2の発現可能なDNAフラグメントのいずれかが、調節因子、プロモーター、遺伝子、コード配列、およびオープンリーディングフレームよりなる群から選択される、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 部位特異的リコンビナーゼが、プラスミド上に存在する遺伝子によって発現される、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の染色体領域が、細菌プロモーターの上流にある、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の染色体領域が、オペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現可能なDNAフラグメントが、細菌プロモーターおよびファージプロモーターよりなる群から選択されるプロモーターである、請求項3に記載の方法。
- 前記プロモーターが、調節回路を制御するためのポジティブな調節部位とネガティブな調節部位とを含んでなる、請求項7に記載の方法。
- 前記調節領域がlacオペレーター部位を含んでなる、請求項8に記載の方法。
- 前記プロモーターが、ファージT5プロモーター、ファージT7プロモーター、lacプロモーターよりなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記選択マーカーが、抗生物質耐性マーカー、酵素マーカー、およびアミノ酸生合成酵素よりなる群から選択される、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、前記組換えやすい宿主が、エシェリヒア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、アシネトバクター(Acinetobacter)、メチロモナス(Methylomonas)、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)よりなる群から選択される、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組み換え部位が、lox、frt、dif、およびattよりなる群から選択される、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部位特異的リコンビナーゼが、Cre、Flp、Xer、およびIntよりなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記組み換え因子がPCRによって生成される、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組み換え因子が、約25塩基〜約4000塩基である、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えやすい宿主細胞の細菌染色体プロモーターに代えて外来プロモーターを組み込みむための方法であって、
a)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−3’
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基で構成される第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基で構成される第2の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第1の組み換え因子を提供し、
b)5’から3’方向への一般構造が
5’−FP−RR3−3’
(式中、(i)FPは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基で構成される第3の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第2の組み換え因子を提供し、
c)(i)前記第1の組み換え領域に相同性を有する細菌プロモーターの上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)前記第3の組み換え領域に相同性を有する前記細菌プロモーターの下流にある、第2の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
d)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−RR2−FP−RR3
であるコンストラクトを形成しながら、第1および第2の組み換え因子を第1の染色体領域と第2の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
f)選択マーカーを染色体から切断することで、細菌プロモーターに代えて外来プロモーターを細菌染色体に挿入すること、
を含んでなる方法。 - 連鎖していない外来プロモーターと外来のオープンリーディングフレームとを組換えやすい宿主細胞の細菌染色体に組み込むための方法であって、
a)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−FP−RR2−3’
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基で構成される第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)FPは、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基で構成される第2の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第1の組み換え因子を提供し、
b)5’から3’方向への一般構造が
5’−FO−RR3−3’
(式中、(i)FOは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基で構成される第3の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第2の組み換え因子を提供し、
c)(i)前記第1の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)前記第3の組み換え領域に相同性を有する、前記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第2の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
d)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−FP−RR2−FO−RR3
であるコンストラクトを形成しながら、第1および第2の組み換え因子を第1の染色体領域と第2の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
f)選択マーカーを染色体から切断することで外来プロモーターと外来のオープンリーディングフレームとを細菌染色体に挿入すること、
を含んでなる方法。 - 調節領域と外来のオープンリーディングフレームとを含んでなる外来遺伝子を、組換えやすい宿主細胞の細菌染色体に組み込むための方法であって、
a)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−FG−RR2−3’
(式中、(i)RR1は、約10〜50塩基で構成される第1の組み換え領域であり、
(ii)RSは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
(iii)SMは、選択マーカーをコードするDNAフラグメントであり、
(iv)FGは、組換えやすい宿主細胞にとって外来の、調製領域を含んでなる遺伝子であり、かつ
(iv)RR2は、約10〜50塩基で構成される第2の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第1の組み換え因子を提供し、
b)5’から3’方向への一般構造が
5’−FO−RR3−3’
(式中、(i)FOは、第2の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
(ii)RR3は、約10〜50塩基で構成される第3の組み換え領域である)である、少なくとも1つの第2の組み換え因子を提供し、
c)(i)前記第1の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第1の染色体領域と、
(ii)前記第3の組み換え領域に相同性を有する、前記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第2の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
d)5’から3’方向への一般構造が
5’−RR1−RS−SM−RS−FG−RR2−FO−RR3
であるコンストラクトを形成しながら、第1および第2の組み換え因子を第1の染色体領域と第2の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
e)選択マーカーに基づいて、(d)のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
f)選択マーカーを染色体から切断することで外来プロモーターと外来のオープンリーディングフレームとを細菌染色体に挿入すること、
を含んでなる方法。 - 部位特異的リコンビナーゼが、プラスミド上に存在する遺伝子によって発現される、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、細菌プロモーターおよびファージプロモーターよりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記プロモーターが、調節回路を制御するためのポジティブな調節部位とネガティブな調節部位とを含んでなる、請求項21に記載の方法。
- 前記調節領域がlacオペレーター部位を含んでなる、請求項22に記載の方法。
- 前記プロモーターが、ファージT5プロモーター、ファージT7プロモーター、およびlacプロモーターよりなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- λ−Redリコンビナーゼ系を持つ、前記組換えやすい宿主が、エシェリヒア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、アシネトバクター(Acinetobacter)、メチロモナス(Methylomonas)、バシラス(Bacillus)および、シュードモナス(Pseudomonas)よりなる群から選択される、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組み換え部位が、lox、frt、dif、およびattよりなる群から選択される、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部位特異的リコンビナーゼが、Cre、Flp、Xer、およびIntよりなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記組み換え因子がPCRによって生成される、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組み換え因子が、約25塩基〜約4000塩基である、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)〜(f)を1回もしくはそれ以上繰り返す、請求項1、2、17〜19のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US43460202P | 2002-12-19 | 2002-12-19 | |
PCT/US2003/041810 WO2004056973A2 (en) | 2002-12-19 | 2003-12-19 | Method for chromosomal engineering |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006510374A true JP2006510374A (ja) | 2006-03-30 |
Family
ID=32682075
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004561467A Ceased JP2006510374A (ja) | 2002-12-19 | 2003-12-19 | 染色体操作のための方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040209370A1 (ja) |
EP (1) | EP1573007A4 (ja) |
JP (1) | JP2006510374A (ja) |
AU (1) | AU2003302276A1 (ja) |
CA (1) | CA2509199A1 (ja) |
WO (1) | WO2004056973A2 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0414832D0 (en) | 2004-07-01 | 2004-08-04 | Cobra Biolog Ltd | Process for the removal of selectable marker gene sequences |
CN101061214B (zh) | 2004-10-22 | 2012-12-05 | 诺维信公司 | 多个多核苷酸拷贝的稳定基因组整合 |
AU2006214064B2 (en) | 2005-02-18 | 2012-04-26 | J. Craig Venter Institute, Inc. | Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli |
MX291624B (es) | 2005-02-18 | 2011-11-04 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Inmunogenos de escherichia coli uropatogenica. |
US7700328B2 (en) | 2006-06-07 | 2010-04-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for producing an L-tyrosine over-producing bacterial strain |
JP2010500399A (ja) | 2006-08-16 | 2010-01-07 | ノバルティス アーゲー | 尿路病原性大腸菌由来の免疫原 |
EP2160469B1 (en) * | 2007-05-17 | 2018-02-28 | Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG | Method for producing a recombinant protein on a manufacturing scale |
WO2008153731A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-12-18 | Nature Technology Corporation | Processes for improved strain engineering |
BRPI1102019A2 (pt) * | 2011-04-19 | 2013-06-25 | Unicamp | processo de construÇço de linhagem atenuada mutante de uma bactÉria patogÊnica, vacina, vetor vacinal e uso da referida vacina |
BR102014030638B1 (pt) * | 2014-12-08 | 2022-12-06 | Universidade Estadual De Campinas - Unicamp | Uso da linhagem salmonella enterica typhimurium para preparar vacina contra salmonelose |
AU2022211795A1 (en) * | 2021-08-06 | 2023-02-23 | Syte.Bio Inc. | Hairpin loop ended self-complementary double-stranded covalently closed linear dna vector, manufacturing system and process, and uses of said resulting dna vector |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5122457A (en) * | 1989-10-19 | 1992-06-16 | Schering Corporation | Expression systems utilizing bacteriophage t7 promoters, gene sequences, and t7 rna polymerase |
ATE222289T1 (de) * | 1995-06-07 | 2002-08-15 | Invitrogen Corp | Rekombinatorische klonierung in vitro unter verwendung genmanipulierter rekombinationsorte |
AUPN631495A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(I) |
AU752105B2 (en) * | 1997-12-05 | 2002-09-05 | Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie (Embl) | Novel dna cloning method |
AU765703B2 (en) * | 1998-03-27 | 2003-09-25 | Bruce J. Bryan | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items |
WO1999066035A2 (en) * | 1998-06-17 | 1999-12-23 | Iconix Pharmaceuticals Inc. | Vector construction by host cell-mediated recombination |
US6355412B1 (en) * | 1999-07-09 | 2002-03-12 | The European Molecular Biology Laboratory | Methods and compositions for directed cloning and subcloning using homologous recombination |
US20020187544A1 (en) * | 2001-04-05 | 2002-12-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Uropathogenic E. coli D-serine detoxification operon |
US20040043003A1 (en) * | 2002-01-31 | 2004-03-04 | Wei Chen | Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions |
US20040219629A1 (en) * | 2002-12-19 | 2004-11-04 | Qiong Cheng | Increasing carotenoid production in bacteria via chromosomal integration |
-
2003
- 2003-12-12 US US10/734,936 patent/US20040209370A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 AU AU2003302276A patent/AU2003302276A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 JP JP2004561467A patent/JP2006510374A/ja not_active Ceased
- 2003-12-19 EP EP03810091A patent/EP1573007A4/en not_active Withdrawn
- 2003-12-19 CA CA002509199A patent/CA2509199A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 WO PCT/US2003/041810 patent/WO2004056973A2/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2509199A1 (en) | 2004-07-08 |
AU2003302276A1 (en) | 2004-07-14 |
WO2004056973A2 (en) | 2004-07-08 |
EP1573007A4 (en) | 2006-05-10 |
WO2004056973A3 (en) | 2005-02-24 |
US20040209370A1 (en) | 2004-10-21 |
EP1573007A2 (en) | 2005-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yuan et al. | Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production in E. coli | |
JP2006515174A (ja) | 染色体組込みにより細菌において増加するカロテノイド産生 | |
US7217537B2 (en) | Method to increase carotenoid production in a microbial host cell by down-regulating glycogen synthase | |
US20050287625A1 (en) | Process for expression of foreign genes in methylotrophic bacteria through chromosomal integration | |
EP2571991A1 (en) | Method of producing isoprenoid compounds in yeast | |
WO2020203496A1 (ja) | キメラプラスミドライブラリーの構築方法 | |
JP2006510374A (ja) | 染色体操作のための方法 | |
US7256014B2 (en) | Method to increase hydrophobic compound titer in a recombinant microorganism | |
US7232665B2 (en) | Mutations affecting carotenoid production | |
US7291482B2 (en) | Mutations affecting plasmid copy number | |
CN114008070A (zh) | 导致大肠杆菌赖氨酸产量增加的全基因组合理设计的突变 | |
US7132257B2 (en) | Production or aromatic carotenoids in gram negative bacteria | |
US7252942B2 (en) | Parallel chromosomal stacking of traits in bacteria | |
US7247467B2 (en) | Broad host range pBBR1-based plasmid mutant derivatives having altered plasmid copy number | |
US11142777B2 (en) | Method for preparing mutant strain having high producibility of phytoene and mutant strain prepared thereby | |
US7087403B2 (en) | Biological production of tetradehydrolycopene | |
US20070065900A1 (en) | Process for chromosomal expression of foreign genes in the cytochrome-C peroxidase (cytCP) region of a methylotrophic microbial host cell | |
US20070065903A1 (en) | Process for chromosomal expression of foreign genes in the hsdM region of a methylotrophic microbial host cell | |
US20070065902A1 (en) | Process for chromosomal expression of foreign genes in the fliC region of a methylotrophic microbial host cell | |
US20070065901A1 (en) | Process for chromosomal expression of foreign genes in the PAPS reductase (cysH) region of a methylotrophic microbial host cell | |
WO2022140493A1 (en) | Methods for producing biochemicals using enzyme genes derived from a strain of brevundimonas, and compositions made thereby |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A045 | Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A043 Effective date: 20060905 |