BR102014030638B1 - Uso da linhagem salmonella enterica typhimurium para preparar vacina contra salmonelose - Google Patents

Abstract

VETOR VACINAL COMPREENDENDO SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM ATENUADOS MUTANTES PARA O GENE fis, VACINA COMPREENDENDO O DITO VETOR E USO DO DITO VETOR O desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas contra salmonelose tem crescido nos últimos anos em decorrência da não existência de formulações vacinais totalmente efetivas, que permitam um controle mais eficaz das diferentes sorovariedades de S. enterica. O desenvolvimento de uma linhagem segura e capaz de induzir eficiente resposta imune envolve a obtenção de diferentes mutantes atenuados que possam ser testados clinicamente, ou que tenham características únicas que possam ser combinadas a outras mutações específicas, gerando linhagens cada vez mais seguras e eficientes. A presente invenção se refere a vetor vacinai compreendendo mutantes para o gene fis, cuja proteína resultante de sua expressão, Fis, se associa ao nucleóide bacteriano, regulando a expressão de diversos genes, muitos relacionados com o processo de patogenicidade bacteriana. Também se refere à vacina compreendendo as referidas linhagens mutantes que geram uma resposta capaz de induzir proteção eficiente contra salmonelose.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO”

[001] A presente invenção se refere ao desenvolvimento de vetor vacinal compreendendo S. enterica Typhimurium ou 4,[5],12:i:- atenuadas a partir da deleção do gene fis que codifica proteína reguladora global. A proteína Fis regula a expressão de diversas outras, inclusive de proteínas relacionadas à patogenicidade bacteriana e, quando o gene fis é deletado, é gerado um padrão de atenuação exclusivo, que pode ser alterado ao se combinar com outras mutações, induzindo diferentes tipos de respostas do hospedeiro. Ainda, a presente invenção se refere a uma vacina que compreende a referida linhagem vacinal e ao seu uso como vacina para proteção de humanos e animais como aves e suínos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O emprego de linhagens bacterianas atenuadas como abordagem vacinal tem sido bastante estudado nos últimos anos. Em especial, a busca por vacinas efetivas contra a febre tifoide humana e o controle da salmonelose em outros animais. Várias estratégias e formulações vacinais já foram testadas, tais como bacterinas, vacinas de subunidades e linhagens vivas atenuadas. O antígeno capsular Vi purificado de S. enterica Typhi, livre ou conjugado com proteínas carreadoras, é imunogênico quando administrado por via intramuscular ou subcutânea e tem se mostrado eficaz em alguns estudos. Contudo, devido às suas características e modo de administração, é incapaz de estimular de forma eficiente o sistema imune de mucosa (MALT, do inglês mucosal associated lymphoid tissue).

[003] Desta maneira, esforços foram canalizados no desenvolvimento de vacinas constituídas por linhagens vivas atenuadas, ideais para induzir esse tipo de resposta. De fato, a grande maioria dos microrganismos patogênicos inicia a infecção por colonizar ou invadir as mucosas orgânicas, o que torna a ativação do MALT uma prioridade na busca de vacinas efetivas.

[004] A primeira vacina viva atenuada desenvolvida contra a febre tifoide é composta pela linhagem S. enterica Typhi Ty21a, obtida por mutagênese química da linhagem parental Ty2. Esta vacina oral é segura, mas devido a sua grande atenuação, requer várias doses para induzir imunidade, a qual, frequentemente, é de curta duração. Não obstante, a linhagem Ty21a corresponde à vacina viva atenuada contra a febre tifoide licenciada para uso em humanos, comercializada com o nome de Vivitof pela Bernabiotech Ltd da Suíça.

[005] Os resultados obtidos com S. enterica Typhi Ty21a estimularam a construção de novas linhagens vacinais de S. enterica. Tais linhagens apresentam estabilidade da atenuação, uma vez que a mesma foi alcançada por deleção de um ou mais genes específicos, relacionados à virulência, característica esta fundamental para que possam ser utilizadas como vacinas vivas. Esses mutantes foram construídos inicialmente em S. enterica Typhimurium, devido à disponibilidade do modelo murino de infecção, sendo as mutações promissoras transferidas para linhagens de S. enterica Typhi. Sendo assim, linhagens ΔaroA, ΔaroC, ΔaroD de S. enterica, deficientes na via biossintética dos aminoácidos aromáticos, mutantes Acya Acrp, incapazes de expressar adenilato ciclase e o receptor para cAMP, dentre outros, foram construídos e demonstraram-se imunogênicos, apesar da atenuação da virulência. No entanto, é frequente a ocorrência de bacteremia e/ou a necessidade de várias doses para a indução de imunidade em voluntários humanos.

[006] Outro foco de estudos está no desenvolvimento de vacinas para o controle da salmonelose em aves e outros animais.

[007] A construção dessas linhagens é alcançada pela introdução de mutações em genes associados à patogenicidade, a vias biossintéticas ou em genes reguladores globais, cujo resultado é a atenuação da virulência sem, no entanto, comprometer a capacidade de colonização in vivo e, consequentemente, de indução do sistema imune de forma efetiva. Tais linhagens podem ser manipuladas geneticamente de forma a expressar antígenos heterólogos, permitindo o desenvolvimento de formulações vacinais multifatoriais.

[008] De fato, diversos estudos têm demonstrado a dificuldade de se ajustar o grau de atenuação da linhagem vacinal para, de um lado, não comprometer a resposta imune e de outro, ser livre de efeitos colaterais. A regulação dos fatores de patogenicidade em S. enterica é complexa e envolve tanto processos de regulação transcricional como pós- transcricional.

[009] Linhagens de S. enterica Typhimurium atenuadas já foram desenvolvidas, através da construção de mutantes nulos para o Fator de Integração do Hospedeiro A ou ihfB como pode ser visto nos documentos de patente WO2010096888 e BR200902944. Dados demonstram que tais linhagens são capazes de conferir proteção contra a salmonelose no modelo murino de infecção.

[010] A proteína IHF (Integration host factor) é uma proteína do nucleóide bacteriano que impõe ao DNA curvaturas de aproximadamente 180°, sendo essa atividade capaz de induzir importantes alterações topológicas no DNA, modulando a expressão de vários genes, assim como outros eventos celulares. A expressão de IHF é aumentada na fase estacionária de crescimento e vários genes estão sob seu controle positivo, incluindo genes de virulência em S. enterica Typhimurium.

[011] Seguindo este mesmo raciocínio, foram obtidos mutantes nulos para a proteína Fis (Factor for inversion). Trata-se de uma proteína do nucleóide descrita como a mais abundante na fase exponencial de crescimento em E. coli, com diminuição drástica de sua concentração durante a fase estacionária. Esta variação drástica de concentração sugere uma função importante de Fis na transição da fase exponencial para a fase estacionária de crescimento. De fato, a função biológica mais relevante de Fis é a ativação da expressão de genes envolvidos na maquinaria de tradução, tais como operons de RNA e de fatores de tradução.

[012] No documento de dissertação de mestrado intitulado “Construção de linhagens atenuadas de Salmonella enterica Enteritidis: avaliação do potencial imunogênico e protetor”, o silenciamento / deleção do gene fis na linhagem utilizada não produziu resultados significantes quanto a atenuação da virulência, desta forma o sorovar mutante é pouco atenuado e ainda apresenta um fenótipo virulento capaz de causar uma infecção fatal no modelo murino com uma quantidade de CFU similar a selvagem. O documento é uma evidencia de que a deleção do mesmo gene resulta em efeitos que variam de acordo com as sorovariedades de S. enterica.

[013] Dados de microarranjos indicaram papel importante de Fis na expressão de genes associados à patogenicidade, bem como de genes de manutenção em S. enterica Typhimurium.

[014] A seguir, destacam-se alguns documentos do estado da técnica que se referem à matéria da presente invenção:

[015] O documento US 8,101,168 descreve enterobactérias atenuadas compreendendo uma mutação atenuante no gene fnr, e, opcionalmente, compreendendo ainda um ácido nucleico heterólogo que codifica um antígeno estranho. Logo, este documento se refere a um gene diferente daquele proposto na presente invenção, como será exposto a seguir de modo a alcançar um fenótipo de atenuação semelhante. Ainda, o documento US mencionado não demonstra dados que confirmem que o referido mutante é capaz de induzir uma resposta imunogênica apropriada para proteger os animais imunizados frente a um desafio com bactéria selvagem.

[016] Já o documento US 8,703,153 se refere a um vetor de vacina de Salmonella atenuada que compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam peptídeos imunogênicos clamidiais. Este documento se refere a duas deleções sendo uma delas para genes da Ilha de Patogenicidade 2 (SPI2) e outra para um gene da via de biossíntese de aminoácidos aromáticos. Estas duas deleções levam a linhagem atenuada.

[017] E o documento WO 2011/079361 descreve um mutante de Salmonella enterica Gallinarum, que é defeituoso nos genes cobS e cbiA (SGCobSCbiA), que estão associados com a produção de cobalamina pela bactéria em condições anaeróbicas, para utilização como vacinas.

[018] Assim, conclui-se que não é detectado no estado da técnica documento que sugira um vetor vacinai que compreende um mutante atenuado do sorovar Salmonella enterica Typhimurium pelo silenciamento / deleção do gene fis capaz de induzir resposta imune protetora no modelo murino de infecção, apresentando as características e consequentes vantagens descritas adiante.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[019] É objetivo da presente invenção prover um vetor vacinai compreendendo um mutante atenuado do sorovar Salmonella enterica Typhimurium e 4,[5],12:i:- (sorovar com grande similaridade genética a Typhimurium) pelo silenciamento / deleção do gene fis e capaz de induzir resposta imune protetora no modelo murino de infecção.

[020] É também objetivo da presente invenção prover vacina compreendendo referido vetor de obtenção relativamente simples, com baixo custo de produção e utilizável em vacinações de larga escala.

[021] É ainda objetivo da presente invenção prover desenvolvimento de linhagens atenuadas a partir da deleção de genes que codificam proteínas reguladoras globais.

[022] É também objetivo da presente invenção prover um mutante atenuado dos sorovares Salmonella enterica Typhimurium e 4,[5],12:i:- pelo silenciamento / deleção do gene fis com capacidade de proteger e gerar altos títulos de anticorpos específicos.

[023] É também objetivo da presente invenção prover vetor vacinal se referindo a apenas uma única deleção de gene sendo um regulador global, interferindo direta e indiretamente na expressão de diversos genes.

[024] É outro objetivo da invenção prover vacina para proteção de humanos e animais como aves e suínos.

[025] É ainda objetivo da invenção proporcionar vacina para produzir anticorpos específicos anti-salmonela.

[026] É outro objetivo da invenção prover um mutante de uma linhagem que pode ser utilizado em conjunto com outros mutantes conhecidos do estado da técnica de modo a aumentar a proteção da população vacinada.

[027] É objetivo da presente invenção a utilização de linhagens de Salmonella enterica Typhimurium / 4,[5],12:i:- mutantes nulos para o gene fis para carrear e expressar antígenos heterólogos no desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas multifatoriais.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[028] A presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de um vetor vacinal que compreende um mutante atenuado dos sorovares Salmonella enterica Typhimurium e 4,[5],12:i:- pelo silenciamento / deleção do gene fis e ainda que compreende a sequência de nucleotídeos de Seq Id no 01.

[029] Ainda, a presente invenção se refere à vacina que compreende o dito vetor vacinai.

[030] E, a presente invenção se refere também ao uso do vetor vacinai para preparação da referida vacina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031] A presente invenção será descrita a seguir com mais detalhes, com referência aos desenhos anexos, no qual:

[032] A Figura 1 se refere ao Contig montado a partir do sequenciamento do produto de amplificação gerado com primers FisDT para as duas linhagens mutadas. A região de homologia com S. enterica está sublinhada com texto em cinza e os sítios FRT estão destacados em cinza. A sequência codificante para a proteína Cloranfenicol Acetil Transferase (CAT) está sublinhada.

[033] A Figura 2 refere-se aos gráficos que representam a porcentagem de animais que sobreviveram ao inoculo. A sobrevivência de camundongos BALB/c inoculados com aproximadamente 105 (A), 104 (B) e 103 (C) UFC das linhagens selvagens de S. enterica Typhimurium LGBM01 ou 4,[5],12:i:- LGBM02, e com 101°(D), 108 (E) e 106 (F) UFC das respectivas linhagens mutantes para o gene fis. Os camundongos (n=8 por grupo) receberam 200 pL da suspensão bacteriana, por via oral, e foram monitorados quanto à sobrevivência ao longo de 30 dias.

[034] A Figura 3 refere-se a porcentagem de sobrevivência de animais imunizados, após desafio com as linhagens selvagens de S. enterica. Camundongos BALB/c (8 por grupo) que foram imunizados nos dias 0 e 14 com os mutantes LGBM01Δ/7S (A) ou LGBMO2Δ/7S (B). O desafio foi feito no 28° dia após a primeira imunização, com 105 UFC das linhagens selvagens de S. enterica.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[035] Anexo 1: Sequência nucleotídeos do gene fis de Seq Id no 01.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[036] A presente invenção se refere a vetor vacinai que compreende um mutante atenuado da sorovar Salmonella enterica Typhimurium ou 4,[5],12:i:- pelo silenciamento / deleção do gene fis obtidos, testados e descritos mais adiante. Além disso, foram capazes de induzir proteção frente ao desafio com linhagens virulentas no modelo murino de infecção, demonstrando uma boa capacidade de induzir resposta imunológica protetora contra S. enterica.

[037] Ainda, a presente invenção se refere a uma vacina que compreende o referido vetor vacinai e ao uso da vacina para proteção de humanos e animais como aves e suínos.

[038] Na presente invenção, foram utilizadas as linhagens selvagens de S. enterica sendo: S. enterica Typhimurium LGBM01 ou e S. enterica I 4,5,12:i LGBM02. Essas linhagens são patogênicas no modelo murino de infecção.

[039] Os mutantes de S. enterica LGBMOlΔfc, LGBM02ΔA/S, objetos da presente invenção, foram construídos utilizando o sistema X Red, baseado no sistema de recombinação do bacteriófago X. Para tanto, foram desenhados primers específicos para deleção do gene fis (FisF: Seq. Id 02) e (FisR: Seq. Id. 03).

[040] Estes primers foram utilizados para amplificar o plasmídeo pKD3, pertencente ao grupo de plasmídeos do sistema X Red, para gerar um fragmento contendo um cassete de resistência ao cloranfenicol, cujas extremidades possuem homologia com as regiões que flanqueiam o gene fis.

[041] Os fragmentos gerados foram usados para transformar células das referidas linhagens LGBM01 e LGBM02 por eletroporação, ambas contendo plasmídeo pKD46 (previamente inserido, também por eletroporação).

[042] Os mutantes resultantes foram selecionados em meio de cultura acrescido de cloranfenicol, confirmados por PCR utilizando primers específicos de detecção da região deletada (FisDT F: Seq. Id 04) e (FisDT_R: Seq. Id 05) e utilizados como doadores para transdução generalizada usando o fago P22HT, para passar as mutações para células selvagens da mesma linhagem.

[043] Os mutantes isolados, após a transdução, foram testados quanto à presença de P22 em meio de cultura Mintgreen (que detecta presença de lise celular, decorrente da presença do fago P22) e somente colônias negativas para a presença do fago foram mantidas. Estas foram sequenciadas (Seq Id no. 01) e estocadas a uma temperatura de -80°C.

[044] As referidas colônias foram testadas para verificação de atenuação e desempenho como vacina viva atenuada e os resultados dos testes são apresentados adiante.

Exemplos da presente invenção

[045] Para testar a atenuação das linhagens representadas por Seq Id no 01, foram feitos ensaios utilizando modelo murinho.

I este 01

[046] Grupos de 8 camundongos BALB/c foram infectados com diferentes doses das linhagens selvagens LGBM01 (Typhimurium) e LGBM02 (I 4,[5], 12:i:-) de Salmonella enterica em 200 μL de suspensão bacteriana por via oral, como forma de determinação das taxas de mortalidade e, posteriormente, compará-las às encontradas nos grupos de animais inoculados com as linhagens mutantes.

[047] Foram monitorados quanto à sobrevivência ao longo de 30 dias.

[048] A Figura 2 apresenta a porcentagem de animais que sobreviveram ao inoculo. Os dados aqui demonstrados são representativos de dois experimentos com resultados similares.

[049] Os resultados obtidos e ilustrados na Figura 2 demonstraram que todos os camundongos que haviam recebido doses equivalentes a 105 e 104 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de ambas as linhagens selvagens foram a óbito até o 16° e 23° dia após infecção, respectivamente. Em contrapartida, altos índices de sobrevivência foram observados quando os camundongos receberam até 1010 UFC das linhagens LGBM01 e LGBM02 de S. enterica deletadas para o gene fis.

[050] Todos os animais (8 por grupo) sobreviveram a dose de 106 UFC de cada linhagem, 100% e 80% dos animais sobreviveram a doses de 108 UFC de S. enterica LGBMO2Δ/7s e LGBM01Δ//S, respectivamente. Com a dose maior (1010 UFC), taxas de sobrevivência de 80 e 60% foram observadas para LGBM02Δf/'s e LGBM01Δf/s, respectivamente, como ilustrado na Figura 2.

Teste 03

[051] O maior desafio a ser enfrentado no desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas é a manutenção do balanço entre segurança e imunogenicidade. Após imunização oral, as linhagens recombinantes devem ser capazes de resistir às defesas do hospedeiro, se manter avirulentas, além de induzir resposta imune efetiva.

[052] Tendo isto em mente, foi avaliado se as linhagens atenuadas em processos de imunização seriam capazes de gerar respostas imunológicas protetoras em camundongos BALB/c frente a posterior infecção com as linhagens selvagens de S. enterica selvagens.

[053] Para tanto, camundongos BALB/c (8 por grupo) foram imunizados com duas doses das linhagens atenuadas (aproximadamente 107 UFC), nos dias 0 e 14, e desafiados com dose letal de S. enterica (104 UFC), 28 dias após a primeira dose. Todos os animais imunizados com a linhagem LGBM01Δf/s e desafiados com LGBM01 ou LGBM02 sobreviveram ao desafio, enquanto que em animais imunizados com c com LGBM02Δf/s, taxas de sobrevivência de 100 e 75% foram observadas após desafio com LGBM02 e LGBM01, respectivamente, como ilustrado na Figura 3.

[054] Assim, os dados apresentados demonstraram que ambas as linhagens, deletadas do gene fis, são atenuadas e imunogênicas e, portanto, a deleção do gene fis é adequada para linhagens vacinais dos sorovares Typhimurium e 4,[5],12:i:-.

Claims (2)

1. Uso de uma linhagem de Salmonella enterica Typhimurium ou 4,5,12:9 atenuada caracterizado por ser para preparar uma vacina para proteção de humanos e animais contra salmonelose, em que a referida linhagem de Salmonella apresenta deleção do gene fis.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da linhagem de Salmonella compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID no 1.

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