JP2006507230A - ステロイド複合体、その調製方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、本発明は、ガンの診断および処置にて相乗効果を示す、該ステロイド複合体と細胞毒性物質の組合せに関する。
本発明の哺乳動物タンパク質は原則として、ステロイドと複合体を形成している時に水に可溶な哺乳動物タンパク質であってよい。
哺乳動物タンパク質を、球状タンパク質、血漿タンパク質、アルブミン、結合タンパク質(binder)または選択的ヒト腫瘍細胞抗原の抗体から選択することができる。
ヒトアルブミンおよびウシ血清アルブミン(BSA)は、本発明の複合体形成される好ましいタンパク質の例である。
ヒトアルブミンは、特定の複合体がヒトの処置を目的とする場合に特に好ましい。
既知の手法を用いて所定の好適な天然または天然でないタンパク質を供することは、当業者の技術的範囲内である。
本発明のステロイドタンパク質複合体を治療計画に用いることを目的とする場合、タンパク質は、処置を行う所望の被験者に免疫原性でないように選択されることが好ましい。
原理上、そのような処置を必要とする哺乳動物における上述の兆候の処置に前記複合体を用いることが可能である。
本発明の複合体を用いて処置され得る哺乳動物の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ロバ、ネコおよびサルを挙げることができる。好ましくは、複合体はヒトの処置に用いられる。
そのような処置に関して、複合体は原則として既知の投与方法、例えば経口投与または直腸投与あるいは非経口投与、経皮内注射または静脈注射により投与することが可能であり、ここで、非経口投与、経皮内注射または静脈注射が好ましい。
抗アンドロゲンの例としては、酢酸シプロテロン(cyproterone acetate)およびフルタミド(flutamide)を挙ることができる。抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンの例としては、それぞれタモキシフェン(tamoxifene)およびRU486を挙げることができる。
診断用途にて、標本(specimen, 試料)を複合体と接触させ、次に、適当な方法で結合した複合体を検出する。
1つの態様にて、薬剤的な腫瘍切除(pharmaceutical orchecthomy)をもたらし、かつ遊離テストステロンの悪影響を遮断するために、インビボ(in vivo)で前記複合体を抗アンドロゲンと組合せて診断に用いる。
故に、さらなる側面にて本発明は、哺乳動物タンパク質および細胞骨格作用薬とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイド(細胞増殖抑制性ではない)を含む医薬組成物に関する。
哺乳動物タンパク質とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイド(ここに、ステロイドは細胞増殖抑制性ではない)を含む医薬組成物;および、
細胞骨格作用薬、または、
腫瘍がテストステロン受容体、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体を有する場合に、それぞれ、抗アンドロゲン、抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンのうち1つを含む医薬組成物。
さらなる態様にて、本発明は以下を含むキットに関する:
哺乳動物タンパク質とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイド(ここに、ステロイドは細胞増殖抑制性ではない)を含む医薬組成物;および、
細胞骨格作用薬、および、
腫瘍がテストステロン受容体、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体を有する場合に、それぞれ、抗アンドロゲン、抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンのうち1つを含む医薬組成物。
本発明によれば、診断および治療用の物質を調製するために特定の分子を用いることができる。それらは、タンパク質−結合(例えば、BSA−結合、ヒト血清アルブミン(HSA)−結合、バインダー(結合剤)または選択的ヒト腫瘍細胞抗原の抗体、これらは限定的なものではない)ステロイドである。
細胞株
ヒト前立腺ガン(human prostate cancer)LNCaP細胞株は、元々、前立腺ガン(prostate adenocarcinoma)のリンパ節転移から単離されたものであり[16]、DSMZ(Braun-schweig, Germany)から購入した。細胞を、加熱不活化した10%ウシ胎仔血清(FBS)入りのRPMI 1640培地中で、空気中5%CO2の加湿大気中にて37℃で培養した。それらを1週間に1度サブカルチャーし、実験前に24時間、血清なしの培地でインキュベートした。すべての培養培地は、Gibco BRL(Life Technologies, Paisley, UK)から購入した。
i.結合分析
(膜の調製)
血清なしで150cm2フラスコにて培養した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、剥離により採取し、1500rpmで遠心した。ペレット状の細胞を、新鮮に添加したプロテアーゼ阻害剤(lOμg/ml PMSFおよび1μ/ml アプロチニン)を含むpH7.4の50mMトリス−HCl緩衝液中における超音波処理(sonication)により均一化した。破壊されていない細胞を2500gで15分間の遠心により除去した。膜を45,000gで1時間の遠心により得、同じ緩衝液で1度洗浄した。タンパク質濃度をBradfordの方法により測定した[18]。
細胞膜をタンパク質終濃度2mg/mlで、かつ1000倍過剰のモル量の標識していないアンドロゲン(DHT)を添加しない(総結合量)あるいは添加した(非特異的結合量)、少なくとも6つの異なる濃度の[3H]テストステロン(2-50nMの範囲)を含む、終量0.1mlにて飽和結合実験を行った。置換結合実験にて、終濃度2mg/mlの細胞膜調製物を、10-12〜10-6 Mの範囲の異なる濃度の標識していないステロイド(DHT、エストラジオール、プロゲステロン、すべてSigma, St Louis, MOから購入)の非存在下または存在下における5nMの[3H] テストステロン(比活性度 95 Ci/mmole, Amersham-Pharmacia, Buckinghamshire, UK)と一緒に、インキュベートした。非特異的な結合を、5μM DHTの存在下で測定した。両方の結合実験にて、4℃で一晩インキュベーション後、水中0.5%ポリエチレンイミン(PEI)に前もって浸しておいたGF/Bフィルターで減圧下にてろ過することにより結合した放射活性物を単離し、氷冷トリス-HC1緩衝液で3回洗浄した。ろ過液を4mlのシンチレーション・カクテルと混合し、結合放射活性を60%効率のトリチウムにてシンチレーション・カウンターで測定した(Tricarb, Series 4000, Packard)。
血清なしの培地で24時間培養したLNCaP細胞を、剥離により培養フラスコから分離し、106細胞/mlの密度でPBSに懸濁した。それらを、10-7M テストステロン-BSA-FITC複合体と一緒に室温で異なる時間(1分〜1時間)インキュベートした。1000倍のBSA-FITCを非特異的な結合の測定に用いた。前方散乱光(forward scatter,FS)と側方散乱光(side scatter,SS)を通した10,000細胞数の試料にて、Coulter Epics L-MCL装置(Beckman-Coulter Inc. Foullerton CA, USA)を用いたフローサイトメトリーにより細胞を分析した。テストステロン3-(O-カルボキシメチル)オキシム-BSA-FITC (テストステロン-BSA-FITCと呼称)、テストステロン3-(O-カルボキシメチル)オキシム-BSA(テストステロン-BSAと呼称する)、エストラジオール6-(O-カルボキシメチル)オキシム-BSA-FITC(エストラジオール-BSA-FITCと呼称する)、プロゲステロン3-(O-カルボキシメチル)オキシム-BSA-FITC(プロゲステロン-BSA-FITCと呼称する)およびBSA-FITCを、Sigma (St Louis, MO)から入手した。
LNCaP細胞を、培養培地を無血清培地に置換する前に少なくとも48時間、ポリ−L−リジンでコートしたガラスカバースリップ上に増殖させた。24時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、DHTの存在下または非存在下でテストステロン-BSA-FITCと一緒に30分間インキュベートした。陰性対照としてBSA-FITCを用いた。その後、細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中2% PFAで30分間固定した。グリセロールとヴェスタシールド(Vestashield)(Vector, Burlingame, CA)の1:1(v/v)混合液を用いて、カバースリップをスライドにマウントした。標本を共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)(Leica TCS-NT, Lasertechnik, Heidelberg, Germany)を用いて分析した。
組織スライドをホルマリン固定した組織調製物のパラフィン塊から調製した。3〜4ミクロン(μm)の厚さの組織切片を切断し、SuperFrost Plusスライド(Kindler O GmbH, Freiburg, Germany)上に置き、56℃で2時間インキュベートし、キシレンで6回洗浄し(5分ずつ)、次に96%、80%および70%エタノールで5分ずつ洗浄し、最後に蒸留水で20分間洗浄した。その後、組織スライドを、500ワットのマイクロ波オーブン中でクエン酸緩衝液中にて各4.5分間で3回インキュベートした。別法にて、スライドを40℃で一晩インキュベートし、より緩やかな方法でパラフィンを除去した。その後、それらを蒸留水およびトリス緩衝生理食塩水(TBS、10 mM、pH 7.4)中にて洗浄した。TBS中2%BSA溶液と一緒に10分間インキュベートすることにより、BSAの非特異的吸着を確立し、その後TBSで2回洗浄した。次にスライドをBSA-FITC-ステロイドと一緒に10分間インキュベートし、TBSで洗浄した。グリセロールとヴェスタシールド(Vestashield)(Vector, Burlingame, CA)の1:1(v/v)混合液を用いて、カバースリップをスライド上にマウントした。標本を共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)(Leica TCS-NT, Lasertechnik, Heidelberg, Germany)を用いて分析した。
単量体アクチン(トライトン可溶性)および多量体アクチン(トライトン不溶性)を測定するため、LNCaP細胞をDHTまたはテストステロン-BSA(10-7 M)の存在下あるいは非存在下で10分間インキュベートした。その後、トライトン抽出緩衝液(0.3%トライトンX-100、5mM トリス(pH 7.4)、2mM EGTA、300mM ショ糖、2μM ファロイジン、1mM PMSF、10μg/mlロイペプチン、20μg/ml アプロチニン、1mM バナジン酸ナトリウムおよび50 mM NaF)500μlを添加し、混合液を氷上で5分間インキュベートした。緩衝液を除去した後、可溶性タンパク質を等量の6%PCAで沈殿させた。プレート上に残ったトライトン不溶性画分を、1mlの3%PCAで沈殿させた。それぞれの画分の等量を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)した。生じたタンパク質バンドをニトロセルロース膜に転写し、前記膜を、室温で1時間、TBS-T(20mM トリス(pH 7.6)、137mM NaCl、0.05% Tween-20)中5%脱脂粉乳で遮へいした。抗体溶液(TBS-T中)を室温で1時間添加した[モノクローナル・マウス・抗-アクチン一次抗体 (Amersham-Pharmacia, Bukinghamshire, UK)およびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ-結合二次抗体(Chemicon, Temecula,CA)]。ブロット(blot)をECLシステム(Amersham-Pharmacia, Bukinghamshire, UK)を用いて発色させ、バンド強度をPC-based 画像解析 (Image Analysis Inc. , Ontario, Canada)を用いて定量した[19]。
テストステロン-BSAまたはDHT処理した細胞、および未処置(対照)の細胞を、氷冷したPBSで3回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を添加した、1% ノニデット(Nonidet)P-40、20mM トリス pH7.4および137mM NaClを含む冷リン酸緩衝液に懸濁した。透明溶解液をプロテインA−セファロースと一緒に4℃で1時間前もって吸着させておき、遠心し、上清(タンパク質と等量)を既述の抗体とプロテインA−セファロースビーズを用いて免疫沈降した。
GST-PBDを用いた親和性沈殿を、Benard et alの方法[22]を基にした分析法を用いて行った。細胞を、分析キット(UBI, Lake Placid, NY)により提供されるMg2+溶解緩衝液 (MLB)中に溶解し、グルタチオン−アガロースと結合した8gのGST-PBDを混合し、4℃で1時間インキュベートした。沈殿物をMLBで3回洗浄し、Laemmli's試料緩衝液に懸濁した。タンパク質を11%SDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗-Cdc42または抗-Rac抗体と一緒にブロットした。
ヌードマウスの背中に、全量0.1mlにてマトリゲル(登録商標)(Sigma, St Louis, MO)中に希釈した 5×106LNCaP細胞を注入した。4週間後、肉眼で見える腫瘍が生じ、以下のような処置を開始した:PBS中に希釈した薬剤を、全量0.5mlで1週間に3度腹腔内に注入した。動物を4つの群に分けた:第一の群に5×10-6 M BSAを注入した。第二の群に5×10-6 M テストステロン-BSA複合体を注入した。第三の群に10mg/mlタキソール(登録商標)を注入し、第四の群にはテストステロン-BSAとタキソール(登録商標)の組合せを導入した。処置の4週間後に腫瘍を測定した。腫瘍を切除し、測定し、重さを量り、さらなる分析のために病理学者に送った。
ヒト前立腺ガン細胞株LNCaPの膜アンドロゲン結合部位
LNCaP細胞の培養物から調製した膜を、1000倍モル過剰量の標識していないアンドロゲン(DHT)の存在下または非存在下にて異なる濃度の[3H]テストステロン(2-50nMの範囲)と一緒にインキュベートした。4℃で一晩インキュベーションした後、膜結合放射活性物を単離し、測定した。図1Aに示したように、1〜50nMの範囲の[3H]テストステロンは特異的可飽和結合を誘導することが分かった。結果のスキャッチャード解析(Scatchard analysis)(図5A掲載)は、テストステロン (KD 10.9nM)の高い結合親和性、および1mgのタンパク質に対する144.3 fモルの結合部位の数(細胞当たり約13340部位数に相当)を明らかにした。
14個の前立腺ガン標本にて、10個の良性前立腺肥大症(BPH)の経尿管切除片、および顕微鏡下で確認した8個の同じ症例由来の悪性でない標本に対し、本発明者らは上皮細胞標本を調製した。細胞を、ビメンチン(vimentin)、サイトケラチン(cytokeratine)およびPSAに対するモノクローナル抗体で免疫染色し、それぞれ間質、および正常または悪性上皮細胞を示す証拠とした。上皮細胞は、すべての実験標本にて全細胞数の85%以上を占めることが確認された。細胞をテストステロン-BSAと一緒に10分間インキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。図3に示すように、膜テストステロン結合は、BPHの場合にはとても低い結合だが、ガンの場合にはすべて高い結合が見られる。この観点にて、膜テストステロン受容体は、悪性と良性の前立腺腫瘍を完全に判別することができる。
エストロゲン-、プロゲステロン-およびアンドロゲン-膜結合を、ステロイド受容体陽性および陰性の腫瘍にて免疫細胞化学により分析した。典型的な結果を図5に示す。図に示したように、細胞内ステロイド受容体の状態にかかわらず、BSA-結合ステロイドが組織調製液中の成分として確認される。アンドロゲン受容体は、これらの乳房腫瘍に低濃度存在している。対照的に、エストラジオール-BSAおよびプロゲステロン-BSAは、胸部の腫瘍細胞にて細胞周囲の成分として確認される。このことは、ER/PR陰性腫瘍にてより明らかであり、すなわち細胞内受容体との相互作用がない。実際には、ER/PR陽性の場合、スライド調製中に細胞性障害が起こり、ある場合には染色の拡散したパターンを示し、これらの場合は、細胞周辺、細胞内、または核結合によるものではない。
正常な血液中の白血球細胞(WBC)にて、本発明者らは、テストステロン膜結合を確認した(通常のフローサイトメトー分析を行った)。テストステロン陽性細胞の分布を、表1に示す。
表1:20人の健康な血液ドナーにおけるWBCの異なる群での膜テストステロン陽性(Testo+) 細胞の分布
表2:リンパ球の異なる種類における膜テストステロン陽性細胞の分布。T細胞をCD3マーカーの分析により分析し、B細胞をCD19の発現により分析し、NK細胞をCD56リンパ球抗原の発現により分析した。上述のマーカー(PE標識したモノクローナル抗体によりマークした)とテストステロン−BSA−FITCの共発現を、テストステロン陽性な細胞の一部の検出に用いた。
表4:血液悪性腫瘍の4つの場合における膜テストステロン受容体の分布。正常血液ドナーにて得られた結果を、比較のために示す。
図7に、共焦点レーザー走査顕微鏡により分析した、LNCaPヒト前立腺ガン細胞のアクチン骨格に対するテストステロン-BSA複合体の作用の効果を示す。図に示すように、テストステロン投与後10分で、細胞骨格の完全な形態変化が起こった。アクチンフィラメントは、細胞の周囲に再分配されるが、図7の下方パネルに示すように、可溶性アクチン(単量体)の不溶性アクチン(多量体)に対する割合の著しい減少が、重合過程を有利にし、アクチン細胞骨格の完全な形態変化が起こったことを示している。
上記の結果を踏まえ、本発明者らは前立腺ガンLNCaP細胞をテストステロン-BSAのみ(10-7 M)と一緒に、またはタキソール(登録商標)(10-8 M)も一緒に24時間インキュベートした。図8Aに示すように、テストステロン-BSAのみと一緒にインキュベートした細胞が50%の減少を示した。さらに、〜7%までのタキソール(登録商標)の作用の相乗効果も見られた。培地を前記24時間のインキュベーション後に置換し、細胞を添加物質なしの新鮮な培地でさらに48時間培養すると、(臨床における低投与量のタキソール(登録商標)の一週間投与に似せた条件)、細胞は部分的に回復した(図8B)。この場合、テストステロン-BSAの作用はタキソール(登録商標)よりも効果があった。この効果は、図8Cに示すようにテストステロン-BSAの投与量に比例し、テストステロン-BSAとタキソール(登録商標)の相加効果を示した。
すべてのマウスが、用いた濃度のテストステロン-BSAのもと、十分に維持された。図9に示すように、テストステロン-BSAは、時間依存的に53%の腫瘍容積の減少を誘導した。タキソール(登録商標)の添加が、77%の腫瘍重量の劇的な減少を生じた。本実験は4週間で終了したが、テストステロン-BSAは停滞状態(plateau)には達しなかった。よって、より長期間の処理が腫瘍容積のより大きな減少となる可能性がある。さらに、アポトーシスがすべての腫瘍研究にて組織学的に観察された。
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Claims (25)
- 1つまたはそれ以上の哺乳動物タンパク質とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイドの、固形ガンまたは血液悪性腫瘍の処置あるいは診断のための医薬組成物の製造における使用(ここに、ステロイドは細胞増殖抑制性ではない)。
- ステロイドが、テストステロン、エストロゲン、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、グルココルチコイドまたはその既知の類似体から選択される、請求項1に記載の使用。
- 哺乳動物タンパク質が、球状タンパク質、血漿タンパク質、アルブミン、バインダー(結合剤)または選択的ヒト腫瘍細胞抗原の抗体から選択される、請求項1または2に記載の使用。
- 哺乳動物タンパク質が、ヒトアルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項3に記載の使用。
- 医薬組成物がさらに、細胞骨格作用薬を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
- 細胞骨格作用薬が、タキソール(登録商標)またはタキソテール(登録商標)である、請求項5に記載の使用。
- 処置または診断される腫瘍が、テストステロン受容体、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体を有する場合に、医薬組成物が、それぞれ、抗アンドロゲン、抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンのうちの1つをも含む、請求項1〜6のいずれかに記載の使用。
- 抗アンドロゲンが、酢酸シプロテロンまたはフルタミドである、請求項7に記載の使用。
- 抗エストロゲンが、タモキシフェンである、請求項7に記載の使用。
- 抗プロゲステロンがRU486である、請求項7に記載の使用。
- 固形ガンが、前立腺ガン(ホルモン感受性または耐性)およびその転移ガン、乳ガンおよび様々な場所へのその転移ガン、褐色細胞腫およびそれらの転移ガン、骨腫瘍およびそれらの転移ガン、ならびに脳腫瘍(ニューロブラストーマ)から選択される、請求項1〜10のいずれかに記載の使用。
- 血液悪性腫瘍が、急性および慢性骨髄性白血病、急性および慢性リンパ性白血病ならびにリンパ腫(B細胞およびT細胞)から選択される、請求項1〜10のいずれかに記載の使用。
- 哺乳動物タンパク質とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイド(細胞増殖抑制性ではない)および細胞骨格作用薬を含む医薬組成物。
- ステロイドが、テストステロン、エストロゲン、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、グルココルチコイドまたはその既知の類似体から選択される、請求項13に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物タンパク質が、球状タンパク質、血漿タンパク質、アルブミン、バインダー(結合剤)または選択的ヒト腫瘍細胞抗原の抗体から選択される、請求項13または14に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物タンパク質が、ヒトアルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項15に記載の医薬組成物。
- 細胞骨格作用薬が、タキソール(登録商標)またはタキソテール(登録商標)である、請求項13〜16のいずれかに記載の医薬組成物。
- 処置または診断される腫瘍が、テストステロン受容体、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体を有する場合に、それぞれ、抗アンドロゲン、抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンをも含む、請求項13〜17のいずれかに記載の医薬組成物。
- 固形ガンまたは血液悪性腫瘍の処置における、請求項13〜18のいずれかに記載の医薬組成物、または請求項1〜12のいずれかに記載のように調製される医薬組成物の使用。
- 固形ガンが、前立腺ガン(ホルモン感受性または耐性)およびその転移ガン、乳ガンおよび様々な場所へのその転移ガン、褐色細胞腫およびそれらの転移ガン、骨腫瘍およびそれらの転移ガン、ならびに脳腫瘍(ニューロブラストーマ)から選択される、請求項19に記載の使用。
- 血液悪性腫瘍が、急性および慢性骨髄性白血病、急性および慢性リンパ性白血病ならびにリンパ腫(B細胞およびT細胞)から選択される、請求項19に記載の使用。
- 以下の工程を含む、固形ガンまたは血液障害の検出のための診断方法:
i)試料と請求項1に記載の医薬組成物の溶液を接触する;
ii)試料と結合する哺乳動物タンパク質とコンジュゲートしたステロイドの複合体の量を検出する。 - 複合体がさらに標識を含む、請求項22に記載の方法。
- 哺乳動物タンパク質とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイド(細胞増殖抑制性ではない)を含む医薬組成物;および、
細胞骨格作用薬を含む医薬組成物、または、
腫瘍が、テストステロン受容体、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体を有する場合に、それぞれ、抗アンドロゲン、抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンのうちの1つを含むキット(装置一式)。 - 哺乳動物タンパク質とコンジュゲートした1つまたはそれ以上のステロイド(細胞増殖抑制性ではない)を含む医薬組成物;および、
細胞骨格作用薬を含む医薬組成物、ならびに、
腫瘍が、テストステロン受容体、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体を有する場合に、それぞれ、抗アンドロゲン、抗エストロゲンおよび抗プロゲスチンのうちの1つ、を含む請求項24に記載のキット(装置一式)。
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