JP2006503592A - 焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの減少方法、アクリルアミドの減少した濃度を有する焙煎したコーヒー豆、及び商品 - Google Patents
焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの減少方法、アクリルアミドの減少した濃度を有する焙煎したコーヒー豆、及び商品 Download PDFInfo
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Abstract
Description
別の態様では、本発明は、コーヒー豆中のアスパラギンの濃度を減少させる方法を提供する。1つの実施形態では、本方法はアスパラギン還元酵素をコーヒー豆に添加することを含む。
別の態様では、本発明は、アクリルアミドの減少した濃度を有する焙煎したコーヒー豆を提供する。
別の態様では、本発明は、アスパラギンの減少した濃度を有するコーヒー豆を提供する。
更に別の態様では、本発明は、焙煎したコーヒー豆を含む製品が、減少した濃度又は低濃度のアクリルアミドを有することを消費者に伝える商品を提供する。
更に別の態様では、本発明は、コーヒー豆を含む製品が、減少した濃度又は低濃度のアスパラギンを有することを消費者に伝える商品を提供する。
本明細書で使用するとき、指示がない限り、パーセンテージ(%)はすべて重量によるものである。
それ故に、出願人は、焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの形成が、豆の最終的な焙煎の前に、アスパラギンを除去することにより、又はコーヒー豆中のアスパラギンを別の物質に変換することにより減少できることを更に見出した。減少した濃度のアスパラギンを含有するこうした豆が最終的な焙煎を受ける場合には、形成されるアクリルアミドの量は減少する。
1つの態様では、本発明は、焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの減少方法を提供する。1つの実施形態では、本方法は、コーヒー豆中のアスパラギンの濃度を減少させることを含む。別の態様では、本方法はアスパラギン還元酵素をコーヒー豆に添加することを含む。好ましい酵素はアスパラギナーゼである。
(1)アスパラギンを含有するコーヒー豆を提供する工程;
(2)任意選択的に、コーヒー豆を前処理する工程;
(3)アスパラギン還元酵素をコーヒー豆に添加する工程;
(4)酵素がアスパラギンと反応するために十分な時間を与える工程;
(5)任意選択的に、酵素を非活性化又は除去する工程;及び
(6)コーヒー豆を焙煎して、焙煎したコーヒー豆を形成する工程を含む。
(1)アスパラギンを含有するコーヒー豆を提供する工程;
(2)任意選択的に、コーヒー豆を前処理する工程;
(3)アスパラギン還元酵素をコーヒー豆に添加する工程;
(4)酵素がアスパラギンと反応するために十分な時間を与える工程;
(5)任意選択的に、酵素を非活性化又は除去する工程を含む。
コーヒー豆は、世界中の狭い亜熱帯地域のコーヒーの木から育つコーヒーチェリーの種である。多くのコーヒー種があるが、2つの主要な商業用コーヒー種である、アラビカ種(Coffea arabica)とカネフォーラ種変種ロブスタ(Coffea canephora var.robusta)が存在することが、一般に認識されている。アラビカ種からのコーヒーは、ブラジルに由来する「ブラジル」として記述されるものか、又は他の高級コーヒー生産国で生育する「アザーマイルド(Other Milds)」である。高級アラビカの国は、コロンビア、グアテマラ、スマトラ、インドネシア、コスタリカ、メキシコ、米国(ハワイ)、エルサルバドル、ペルー、ケニア、エチオピア、及びジャマイカを包含するものとして一般に認識されている。カネフォーラ種変種ロブスタ(canephora var.robusta)からのコーヒーは、典型的には安価の増量剤として又はアラビカコーヒー用の追加のカフェイン供給源として用いられる。これらのロブスタコーヒーは、西部及び中央アフリカ、インド、東南アジア、インドネシア、及びブラジルの低地域において、典型的には生育する。コーヒーチェリーが収穫された後、典型的には果実は種から取り除かれる。
様々な種類の豆の混合物を包含するいずれの好適なコーヒー豆も、本発明にしたがって用いることができる。好ましいコーヒー豆は、アラビカ、ロブスタ、又はこれらの混合物である。
コーヒー豆は、酵素の添加前又は添加中に任意選択的に前処理されてもよい。好適な前処理には、乾燥、水和、機械的作用(例えば湿式−ブラッシング)なし又はありによるすすぎ、加圧、蒸気処理、湯通し、加熱、減圧加工(例えば真空)、粒度減少、又はこれらの組み合わせが挙げられる。好適な前処理方法はまた、コーヒー豆の1以上のセルロース分解酵素への暴露を包含することができ;この方法は単独で又は1以上のその他の前処理方法と組み合わせて用いることができる。いずれの好適なセルロース分解酵素も用いることができるが、好ましいセルロース分解酵素には、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「アスパラギン還元酵素」は、コーヒー豆中のアスパラギンの濃度を減少できるいかなる酵素も包含する。1つの実施形態では、アスパラギン還元酵素は、遊離アスパラギンのアミド基を加水分解することができる酵素である。本明細書に用いるのに好ましい酵素は、アスパラギナーゼである。アスパラギナーゼの好ましい供給源は、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)のカタログ番号A2925である。
酵素は、重量又は体積よりむしろ、活性単位によって市販されている。したがって、所望の程度のアクリルアミドの減少を達成するために必要な酵素の有効量は、用いられる特定の酵素製品の活性によって決まる。
酵素がアスパラギンと反応するために必要な時間の量は、アスパラギン(したがってアクリルアミド)減少の所望の程度、特定のコーヒー豆の特徴(例えば、化学的組成、存在するアスパラギンの量、粒度)、及び添加される特定の酵素が挙げられるが、これらに限定されない要因によって決まる。好ましくは、アスパラギンの濃度が少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約50%、なおより好ましくは少なくとも約70%、更により好ましくは少なくとも約90%減少させるコーヒー豆をもたらすのに十分な量の時間にわたって、酵素を反応させる。一般に、酵素を長く反応させるほど、アスパラギンの減少の程度は大きくなり、したがって焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの減少の程度も大きくなる。酵素が反応するために十分な時間を与える工程は、いずれの好適な方式で実行することができ;例えばそれは酵素をコーヒー豆に添加するのと同時に、酵素をコーヒー豆と混合、酵素溶液のコーヒー豆による吸収、又はこれらの組み合わせにより実行することができる。
1つの実施形態では、コーヒー豆は、約500ppm未満、好ましくは約300ppm未満、より好ましくは約200ppm未満、なおより好ましくは約100ppm未満のアスパラギンを含む。
酵素が所望の程度に反応した後、酵素を任意選択的に、非活性化又はコーヒー豆から除去することができる。消費に安全な(例えば、天然起源の及び一般食品中に見出される)酵素が用いられる場合、酵素を非活性化又は除去しないことを選択してもよい。あるいは、酵素は、酵素を非活性化するいずれの好適な手段により非活性化することができる。例えば、酵素は熱の使用、pH調整、プロテアーゼによる処理、又はこれらの組み合わせを通じて非活性化することができる。更に、抽出が挙げられるがこれに限定されない、いずれかの好適な手段により、コーヒー豆から酵素を除去することができる。酵素は、非活性化する、除去する、又は非活性化と除去の組み合わせを受けることができる。
次にコーヒー豆を焙煎して、焙煎したコーヒー豆を形成する。焙煎を含むいずれの好適なプロセスも用いることができる。本明細書で使用するとき、「焙煎」という用語は、コーヒー独特の香味を創出するコーヒー豆のいずれかの好適な熱処理を包含する。好適な焙煎技術には、オーブン焙煎、押出焙煎、蒸気焙煎(例えばポスト焙煎なし)、赤外線焙煎、マイクロ波焙煎、誘電分極(di-electric)/誘導加熱焙煎、及びこれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。コーヒー豆を焙煎するための典型的な焙煎機器及び方法は、例えば、シベッツ・アンド・フート(Sivetz & Foote)のコーヒー加工技術(Coffee Processing Technology)、コネチカット州ウェストポートのアヴィ出版社(Avi Publishing Co.)、第1巻(1963年)、203〜226ページに記載されている。焙煎したコーヒー豆は、カフェイン抜きの種類、カフェイン入りの種類、又はこれらの混合物のようないずれの好適な形態であることもできる。
本発明はいずれの好適な手段によっても実行することができる。例えば、本明細書の方法は、バッチ、半バッチ、又は連続モードにより実行できる。
本明細書の方法は以下に示される好ましい実施形態により一般に記載されるが、当業者は、本明細書の方法はいずれの好適な方式によっても実行できることを理解すべきである。
別の態様では、本発明は商品を提供する。1つの実施形態では、商品は、
(a)焙煎したコーヒー豆を含む製品であって、前記焙煎したコーヒー豆がアクリルアミドの減少した濃度を有する製品と;
(b)製品を収容するための容器と;
(c)容器に付随するメッセージとを含む。
(a)コーヒー豆を含む製品であって、前記コーヒー豆がアスパラギンの減少した濃度を有する製品と;
(b)コーヒー豆を収容するための容器と;
(c)容器に付随するメッセージとを含む。
焙煎したコーヒー豆又はコーヒー豆を含む製品を分配、提示、陳列、又は貯蔵することができるいずれの容器も好適である。好適な容器には、袋、金属容器、箱、ボール、皿、小型容器、及び缶が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の要素を特徴付けるために用いるパラメータを、特定の分析方法により定量化する。これらの方法は次のように詳細に記載される。
(食品中のアクリルアミド(AA)を測定する方法)
(概略)
焙煎して挽いたコーヒーに、13C−AAを加え、熱水で抽出する。水性の上清をエチルアセテートで2回抽出し、エチルアセテート抽出物を濃縮し、AA及び13C−AAを具体的に検出する選択されたイオン監視(monitoring)LC/MSにより分析する。
1.6.00±0.01gの試料を125mLの三角フラスコ中に秤量する。
2.脱イオン化蒸留水中の100ng/μL13C−AA(ISTD2)120μLを、可変式1000μLピペット(較正済み)を用いて試料上に直接に添加する。
3.ディスペンサーを用いて、40mLの脱イオン化蒸留水をフラスコに添加し、ホイルで覆う。
4.65℃の水浴中に30分間設置する。
5.ディスペンサーを用いて、10mLのエチレンジクロライドをフラスコに添加し、テクマー(Tekmar)製ティスマイザー(Tissumizer)(商標)(SDT−1810)又はウルトラ・テュラックス(Ultra Turrax)(登録商標)(T18ベーシック(T18 Basic))により30秒間均質化する。脱イオン化蒸留水を用いて分散した要素をフラスコ中にすすぐ。
6.25gの均質化物を8ドラムバイアル瓶中に設置する。
7.バイアル瓶にしっかりと蓋をし、262〜544rad/s(2500〜5200rpm)で30分間遠心分離する。
8.セップパック(Sep-Pak)(登録商標)プラスC18(Plus C18)(ウォーターズ(Waters)#WAT020515)を3mLのアセトニトリル、続いて6mLの脱イオン化蒸留水により調整する。
9.6mLの上清を、カートリッジを通過させ、8ドラムバイアル瓶中に溶出させる。
10.10mLのエチルアセテートをディスペンサーによりバイアル瓶に添加し、蓋をし、10秒間攪拌する。
11.いずれのエマルションも破壊させる;1度又は2度回転又は振動することにより促進し、次いで層を分離させる。
12.界面からいずれの液体も移さずに、できるだけ多くの上層をシンチレーションバイアル瓶に移す。10mL分のエチルアセテートによりもう一度抽出し、同じシンチレーションバイアル瓶に添加する。次に、およそ2gの無水硫酸ナトリウムを添加する。
13.60〜65℃の水浴中で窒素の穏やかな流れにより抽出物を約1mLに濃縮する。抽出物をピアス(Pierce)のリアクチ・バイアル(REACTI-VIAL)(商標)(又は同等の円錐形状のガラス製バイアル瓶)に移し、更に抽出物をおよそ100〜200μLの最終体積に濃縮する。この抽出物を、円錐スリーブ及び蓋付きオートサンプラーバイアル瓶中に設置する。
各試料の間にこの洗浄手順を用いる。
1.1Lの三角フラスコに熱い水道水を充填し(80%充填)、及びドーン(Dawn)(商標)食器洗浄液(プロクター・アンド・ギャンブル社(Procter & Gamble Co.)より入手可能)又は同等品の液滴を添加する。
2.ホモジナイザー分散要素をできるだけ深く水中に挿入する。
3.溶液を約10〜15秒間均質化する
4.三角フラスコから洗浄溶液を出し;すすいで、フラスコに熱い水道水を再充填する。
5.約10〜15秒間再均質化する。
6.フラスコを空にし、熱い水道水を再充填し;約10〜15秒間再均質化する。
7.水が透明でなく及び粒子を含まない場合には、この条件を達成するために必要なだけ何回も透明な熱い水道水を均質化することを続ける。
8.熱い水道水が透明で粒子を含まない場合には、分散要素を脱イオン化蒸留水ですすぐ。
試料は、マイクロマス(Micromass)LCZ質量分析計に接続するウォーターズ(Waters)2690LCを用いて分析する。
応答比(AAピーク面積/13C−AAピーク面積)が、エチルアセテート中の一連の6標準についての対応する濃度比に対してプロットされる。すべての標準は4.50μg/mLの13C−AAを含有し、AA濃度は0〜5.0ppmの範囲である。線形回帰により検量線がもたらされ、それにより測定された応答比から抽出物中の濃度比が決定される。この濃度比が、抽出手順の工程3において試料に添加される、正確に既知である13C−AAの濃度(公称2ppm)により掛け算され、AAのppmでの濃度がもたらされる。
検量線は、x軸上に濃度比([アクリルアミド]/[13C−アクリルアミド])、y軸上に応答比(mz/72面積/m/z73面積)をプロットすることにより作成される。この例について、その直線の方程式は、y=0.899x+0.0123である。
4.0分での13C−AAピーク(m/z73)の測定面積:500,000
応答比Rr=0.200検量線の傾き及び切片から、濃度比Rcが計算される:Rc=(0.200−0.0123)/0.899=0.209
試料中の13C−AAの添加濃度(2ppm)を与えると、AAの測定濃度は、0.209×2ppm=0.418ppmである
1.標準及び/又は試料の調製に用いられるすべてのはかりは、それらの較正を1組の正規のおもりにより毎週点検されなければならない。はかりは、測定される試料/標準の重量の範囲を網羅する少なくとも3つのおもりにより点検されるべきである。
2.6点の検量線が毎日実行されるべきである。
3.作業標準物質(WRM)は、試料の各組により分析されるべきである。この物質の濃度は、移動平均の2o以内であるべきである。そうでない場合は、器具を再較正し、WRMを再計算するべきである。
食品及び飲料製品中のアスパラギン及びアスパラギン酸の測定
(原理)
秤量した量の試料を5%HClと混合し、30分間加熱し、次に均質化する。均質化物の一部分を遠心分離し、次いで上清の一部を希釈し、FMOC試薬(9−フルオレニルメチルクロロホルメート)により処理するが、これはアスパラギン及びアスパラギン酸と反応して極めて蛍光性の誘導体を形成する。次に逆相HPLCを用いて、その他の試料マトリックス構成成分からFMOC−アスパラギンを分離する。検出は、260nmでの励起時の313ナノメーター(nm)での蛍光発光による。既知濃度の標準の分析は、定量化を可能にする。
4つの標準(50〜600ppm)の作業検量線は、0.998以上の相関関係を与える。2000ppmまでから得られた曲線もまた、0.998の相関関係を与える。
コーヒー試料:
焙煎して挽いたコーヒー試料に、アスパラギン及びアスパラギン酸の両方を4つの濃度(40、200、400、及び600ppm)で添加する。アスパラギンは86%(4%未満の相対標準偏差)で回収され、アスパラギン酸は92%(4%未満の相対標準偏差)で回収される。
1.ハーバート,P.(Herbert,P.);サントス,L(Santos,L);アルベス,A.(Alves,A.)食品科学誌(Journal of Food Science)(2001年)、66(9)、1319〜1325。
2.ヘームス,ダニー(Heems,Dany);ラック,ジュネービュー(Luck,Geneviewe);フラウデュー,クリソフ;(Fraudeau,Chrisophe);ヴェレッテ,エリック(Verette,Eric.)クロマトグラフィー誌(Journal of Chromatography)、A(1998年)、798(1+2)、9〜17。
以下のものは推奨される化学物質及び機器であるが;同等材料置換は受容できる。
トランスファーピペット、ポリエチレン(サムコ(Samco)#222)
メスフラスコ(25、100、250、1000mL)
メスピペット(10mL)
メスシリンダー(100〜1000mL)
HPLC容器(500mL、1又は2L)
ビーカー
磁性攪拌器/攪拌棒
化学(4桁)天秤
シンチレーションバイアル瓶
遠心管、スクリューキャップ(100×16mm)蓋付き
オートサンプラーバイアル瓶(8×30mm、1mL)クリンプキャップ付き
安全性:この方法はドラフトの使用を必要とし、化学物質への暴露を伴う。ドラフトの使用及び化学物質流出についての安全な実行(Safe Practices for Fume Hood Use and Chemical Spills)に目を通してください。
フェノメネックス(Phenomenex)ルナ(Luna)100×4.6mmC−18(2)3μ#00D−4251−EO
希釈剤(pH8.3〜8.5;1000mL)。
1.3.0gのホウ酸ナトリウム、3.0gのホウ酸、及び8.0gの重炭酸ナトリウムを乾燥した秤量済みのビーカー中に秤量する。
2.空の800mLのビーカーを磁性攪拌器上に設置する。約500mLのミリ−Q(Milli-Q)(商標)水及び攪拌棒を添加する。はねをあげずに水を激しく攪拌する。
3.工程1からの試薬を水中に定量的に移し;それらが完全に溶解するまで攪拌する。
4.工程3からの溶液を1Lのメスフラスコに定量的に移し、ミリ−Q(Milli-Q)(商標)水により体積まで希釈し、よく混合する。6ヶ月まで安定である。
1.40gの塩化カルシウム二水和物を秤量済みの250mLビーカー中に秤量する。
2.60gのミリ−Q(Milli-Q)(商標)水を添加する。よく混合する。周囲条件で蓋付きガラス瓶中に保存する。1年まで安定である。
安全性:ペンタン及びエチルアセテートは揮発性及び可燃性である。次の操作をドラフト中で実行する。
1.400mLのペンタンを500mLのHPLC容器瓶に移す。
2.100mLのエチルアセテートを添加する。よく混合する。蓋をしてドラフト中/下に保存する。
1.1.35gのテトラメチルアンモニウムクロライド、3.65gのクエン酸、及び1.60gのクエン酸ナトリウムを乾燥した秤量済みのビーカー中に秤量する。
2.空の800mLのビーカーを磁性攪拌器上に設置する。約500mLのミリ−Q(Milli-Q)(商標)水及び攪拌棒を添加する。はねをあげずに水を激しく攪拌する。
3.工程1からの試薬を水中に定量的に移し;それらが完全に溶解するまで攪拌する。
4.工程3からの溶液を1Lのメスシリンダーに定量的に移し、ミリ−Q(Milli-Q)(商標)水により1000mlまで希釈し;よく混合する。
5.2LのHPLCの移動相容器に移す。
6.200mLミリ−Q(Milli-Q)(商標)水、100mLメタノール、及び700mLアセトニトリルを添加する。後の2溶媒を激しく攪拌しながらゆっくりと添加する。この操作をドラフト中で実行し、個人用保護機器を装着する。具体的詳細については付随する製品安全データシート(Material Safety Data Sheets)(MSDS)を参照のこと。
7.移動相を真空吸引により攪拌しながら脱気する。
1.0.10gのFMOC試薬を秤量済みの100mLメスフラスコ中に秤量する。
2.アセトンを添加して溶解し、同じものにより体積まで希釈する。よく混合する。この操作をドラフト中で実行する。化学物質についてのMSDS中で指定されたPPE(個人用保護機器)を装着する。
3.6ヶ月以下の間冷蔵保存する。
1.100mLのミリ−Q(Milli-Q)(商標)水を200mLのメスフラスコ中に添加する。
2.4mLの1NのHClをメスフラスコに添加する。
ミリ−Q(Milli-Q)(商標)水により体積にする。
ISTD A−内部標準原液A
1.0.5gのアミノイソ酪酸を秤量済みの250mLのメスフラスコ中に秤量する。
2.25mLの1.0NのHCl及び約100mLのミリ−Q(Milli-Q)(商標)水を添加する。回転することにより、溶解するまで混合する。
ミリ−Q(Milli-Q)(商標)水により体積まで希釈し、よく混合する。6ヶ月以下の間冷蔵保存する。
1.1mLの内部標準原液Aを100mLのメスフラスコ中にピペットで取る。
2.ミリ−Q(Milli-Q)(商標)水により体積まで希釈する。1ヶ月の間安定である。
較正原液
秤量済みの50mlのメスフラスコ中に、0.100g(+/−0.001g)アスパラギン及び0.100g(+/−0.001g)アスパラギン酸を秤量する。25mLのミリ−Q(Milli-Q)(商標)水、及び1mLの1NのHClを添加する。音波浴中に溶解するまで設置し、次にミリ−Q(Milli-Q)(商標)H2Oにより体積までにする。溶液は6ヶ月間冷蔵において良好である。
次の作業較正標準を調製する:
1.6gの挽いたコーヒー*を125mLの三角フラスコ中に秤量する。
2.48.0mLの5%HCl溶液を各試料に添加する。
3.2mLのISTD Aを各試料に添加する。
4.アルミニウムホイルで各フラスコを覆い、60Cの水浴中に30分間設置する。
5.10mLのジクロロエタンを各試料に添加する。
6.試料を60秒間均質化する。
7.試料の一部分を30mLの遠心管中に注ぐ。
8.1047rad/s(10000rpm)で32分間5Cで遠心分離する。上清を「試料−希釈」工程1で用いる。
*コーヒー試料を細かく挽いていない場合には、秤量前に小型フードプロセッサーで挽くこと。試料の水分が多い場合には、挽いている間にドライアイスの数片を添加すること。
試料/標準を希釈し、内部標準を添加し、FMOC誘導体を形成するために3つのマイクロラボ(Microlab)方法を実行する。これらを以下に要約する。
工程1:(標準−ISTDの添加と希釈工程)
1.各標準について2組の管を準備する。およそ2mLの標準を1組の管の中に設置し、これらの充填された管をマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の最左端の位置に設置する。
2.空の管を有するラックをマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の最右端のラック位置に設置する。
3.20mLのガラス製(シンチレーション)バイアル瓶を作業内部標準溶液Bにより充填し、マイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の作業空間に設置する。
4.ADDISTD方法を選択する。(200μLのISTD B、50μLの標準溶液を、ミリ−Q(Milli-Q)(商標)水により、総体積4000μLに混合する)。
5.方法を実行する。
6.管の組を左の位置から取り出し、廃棄のため脇に置く。
7.作業内部標準溶液をマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)作業空間から取り出し、冷蔵する。
工程3のために右側の管を脇に置く。
1.各試料について2組の管を準備する。およそ2mLの試料を1組の管の中に設置し、これらの充填された管をマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の最左端の位置に設置する。
2.空の管を有するラックをマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の最右端のラック位置に設置する。
3.TRANSDIL方法を選択する。(試料番号、試料の量には50μL、及びミリ−Q(Milli-Q)(商標)水による最終希釈量には4000μLを設定する)。
4.本方法を実行する。
5.管の組を左の位置から取り出し、廃棄のため脇に置く。
工程3のために右側の管を脇に置く。
1.100×16mmスクリューキャップ管のラックを準備する。
2.ラックをマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の最右端のラック位置に設置する。
3.上記の希釈工程からの標準及び試料の管を、マイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の最左端のラック位置に設置する。
4.FMOC試薬溶液のアリコート(22mL)をガラス製シンチレーションバイアル瓶に移す。およそ100μLの40%塩化カルシウム溶液を添加し;よく混合する。(塩化カルシウムは、FMOC試薬に、マイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)による検出のために必要な「帯電」させるために添加される)。
5.バイアル瓶をマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)の作業空間上に設置する。
6.ADDFMOC方法を選択する。
7.注射器1及び2を水から希釈剤(pH8.3〜8.5)に切り替える。
8.希釈剤(pH8.3〜8.5)を用いる注射器1及び2について少なくとも5サイクルの洗浄を実行する。
9.ADDFMOC方法を実行する。(450μLのFMOC溶液、上記のADDISTDからの250μL試料を、希釈溶液により、最終体積1300μLに混合する)。
10.管の組を試料(SAMPLE)ラック位置から取り出し、脇に置く。
11.FMOC試薬溶液をマイクロラボ(MICROLAB)(登録商標)作業空間から取り出し、冷蔵する。
13.管の組を最右端位置から取り出し、ドラフト中に設置する。少なくとも10分間、又は溶液が澄むまで(しかし20分以下)放置する。
14.2mLの抽出溶媒を各管に添加する。蓋をし、高速で2分間攪拌して、未反応のFMOC試薬を抽出する。
15.55×16mm管の別の管の組を準備する。1mLの移動相溶液を各管に添加する。
16.1.0mLの水性(下部)層を遠心管から55×16mm管に移す。
17.上部(有機)層を廃棄する。
18.試料をオートサンプラーバイアル瓶に移し、密封する。
操作条件
ケミ・ステーション(Chem Station)ソフトウェアを有するHP1100
検出器 :ウォーターズ474走査蛍光検出器(Waters 474 Scanning Fluorescence detector)
モデル :Norm
信号 :0.0000
波長 :Ex260
Em313
Gain :10
Atten :1
Response:FST
カラム:フェノメックス(Phenomex)ルナ(Luna)C18(2)100×4.6mm3μ
流速 :1.000ml/分
定組成の運転(Isocratic run)(試薬−移動相の調製を参照のこと)
注入体積:10.0μL
温度設定:非制御
試料溶液は、既知量の標準曲線に対して面積計算を用いて計算される:
y=mx+b
y(アスパラギン/ISTDの比)=m(傾き)×(アスパラギン濃度)+b(y切片)
(y−b)/m=x
アスパラギンのppm=アスパラギンの面積(area aspargine)/ISTDの面積−切片)/傾き
[ppm=μg/mL]
例:
アスパラギンのppm=(215.45436/551.828−0.0165)/0.0023=176.93ppm
試料調製工程における希釈/均質化の補正。
・作業標準物質(Working Reference Material)の点検用試料の精度は、アスパラギンの既知の結果の10%以内でなくてはならない。
・検量線の線形性(r2)は、0.995以上でなければならない。
図3は、LC分析の見本のクロマトグラムを示す。
アクリルアミドの%減少=[(対照試料中のアクリルアミド濃度−酵素処理試料中のアクリルアミド濃度)/対照試料中のアクリルアミド濃度]×100
対照試料は、当該技術分野において既知のような従来の方式で調製される。対照試料及び酵素処理試料の両方は、同じ方式で、ほぼ同じハンター(Hunter)L色に焙煎される。
アスパラギンの%減少=[(対照試料中のアスパラギン濃度−酵素処理試料中のアスパラギン濃度)/対照試料中のアスパラギン濃度]×100
対照試料は、当該技術分野において既知のような従来の方式で調製される。焙煎される場合、対照試料及び酵素処理試料の両方は、同じ方式で、ほぼ同じハンター(Hunter)L色に焙煎される。
600gの蒸留水中に溶解した、1,000単位のアスパラギナーゼ、及び0.1%(コーヒー重量の)セルラーゼよりなる酵素溶液を配合する。1200gの洗浄した、グアテマラからのアラビカのグリーンコーヒー豆を3Lの丸底フラスコ中に設置し、これを次に35℃に設定された水浴と共にロータリーエバポレーター上に設置する。回転するフラスコ上で5分間63.5cm(25インチ)の真空を引き、次にコーヒー豆の表面を濡らすのに十分な酵素溶液をフラスコに添加する。真空を次に解除する。更に2回、真空を系に約10秒間適用して次いで解除する。次にコーヒー豆のフラスコを、大気圧で豆の表面上の全酵素溶液が吸収されるまで回転させたままにする。このプロセスを、600gの酵素溶液がコーヒーに添加されるまで繰り返す。
洗浄したアラビカのグリーンコーヒー豆(試料#1、グリーン)を、大気圧蒸気を用いて水分約25%に湿潤する。次にコーヒー豆を、蒸気に当てられたコーヒー豆と水との比で約1:4の水中に、約30分間穏やかに攪拌しながら浸漬する。抽出されたコーヒー豆を取り出し、抽出物を次に、予備湿潤したコーヒー豆の別のバッチを浸漬するために用いる。このプロセスを、約1:4〜約1:1のコーヒー豆と抽出物との比で、抽出物中に含有される固形物が一定濃度を達成するまで繰り返す。
洗浄したアラビカのグリーンコーヒー豆(試料#1、グリーン)を、大気圧蒸気を用いて水分約25%に湿潤する。次にコーヒー豆を、蒸気に当てられたコーヒー豆と水との比で約1:4の水中に、約30分間穏やかに攪拌しながら浸漬する。抽出されたコーヒー豆を取り出し、抽出物を次に、予備湿潤したコーヒー豆の別のバッチを浸漬するために用いる。このプロセスを、約1:4〜約1:1のコーヒー豆と抽出物との比で、抽出物中に含有される固形物が一定濃度を達成するまで繰り返す。
洗浄したアラビカのグリーンコーヒー豆(試料#1、グリーン)を、大気圧蒸気を用いて水分約25%に湿潤する。次にコーヒー豆を、蒸気に当てられたコーヒー豆と水との比で約1:4の水中に、約30分間穏やかに攪拌しながら浸漬する。抽出されたコーヒー豆を取り出し、抽出物を次に、予備湿潤したコーヒー豆の別のバッチを浸漬するために用いる。このプロセスを、約1:4〜約1:1のコーヒー豆と抽出物の比で、抽出物中に含有される固形物が一定濃度を達成するまで繰り返す。
乾燥して酵素処理した(圧力2時間)実施例1からのグリーンアラビカコーヒー豆が、焙煎前に採取され、カフェインを抜くプロセスに付された。米国特許第4,474,821号(モリソン・ジュニア(Morrison,Jr.)ら)に概説されるようなカフェインを抜くプロセスにしたがって、豆の中のもとのカフェイン濃度の97%が抽出される点まで、豆のカフェインを抜く。豆を次に焙煎し及び挽いて、従来の加工製品と比べて少なくとも約10%のアクリルアミドが減少する、カフェイン抜きの焙煎して挽いたコーヒーを製造する。
実施例2のグリーンアラビカコーヒー豆、試料#5が、焙煎前に採取され、カフェインを抜くプロセスに付された。米国特許第4,474,821号(モリソン・ジュニア(Morrison,Jr.)ら)に概説されるようなカフェインを抜くプロセスにしたがって、豆の中のもとのカフェイン濃度の97%が抽出される点まで、豆のカフェインを抜く。豆を次に焙煎し及び挽いて、従来の加工製品と比べて少なくとも約10%のアクリルアミドが減少する、カフェイン抜きの焙煎して挽いたコーヒーを製造する。
米国特許第4,474,821号(モリソン・ジュニア(Morrison,Jr.)ら)のカフェインを抜くプロセスにしたがって、豆の中のもとのカフェイン濃度の97%が抽出される点まで、グリーンアラビカコーヒー豆のカフェインを抜く。カフェイン抜きの豆は次に、上記の実施例1に概説したプロセスに付された。結果として得られる製品は、従来の加工製品と比べて少なくとも約10%のアクリルアミドが減少する、カフェイン抜きの焙煎して挽いたコーヒーである。
米国特許第4,474,821号(モリソン・ジュニア(Morrison,Jr.)ら)のカフェインを抜くプロセスにしたがって、豆の中のもとのカフェイン濃度の97%が抽出される点まで、グリーンアラビカコーヒー豆のカフェインを抜く。カフェイン抜きの豆は次に、上記の実施例2に概説したプロセスに付された。結果として得られる製品は、従来の加工製品と比べて少なくとも約10%のアクリルアミドが減少する、カフェイン抜きの焙煎して挽いたコーヒーである。
カフェイン含有グリーンコーヒー豆が、当該技術分野において既知のように(例えば米国特許第3,989,850号(エルブ(Erb)ら)に示されるもの)、コーヒー可溶物の水溶液と共に同時に抽出されるプロセスにより、コーヒー豆のカフェインを抜くが、ただしこの水溶液は上記の実施例2のように溶液中にアスパラギナーゼも含むことが既知のプロセスと異なる。抽出領域から取り出されたカフェイン抜きのコーヒーを処理して、表面上に含有される表面固形物を取り除き、次いで乾燥させ、次いで焙煎してカフェイン抜きの焙煎して挽いたコーヒーを形成する。酵素処理して焙煎したコーヒー豆、焙煎して挽いたコーヒー、及びそれから調製して入れたコーヒー中のアクリルアミドの濃度は、従来の加工製品と比べて少なくとも約10%減少する。
上記の実施例1〜9のいずれかから製造した、アクリルアミドの減少した焙煎して挽いたコーヒーは、直列の抽出カラムにより温度177℃(350°F)及び圧力8バール(827kPa(120psi))で、加熱した水による向流抽出を受け、20%固形物の濃縮コーヒー抽出物を生成する。抽出物はその芳香性構成成分を取り去られ、次いで60%の濃度に濃縮される。芳香物を濃縮し、次いで濃縮抽出物と再結合し、及び全体の流れを噴霧乾燥機に供給し、そこで液体を121℃(250°F)で加熱空気の向流中に噴霧する。最終の乾燥製品は、従来の加工製品より少なくとも約10%少ないアクリルアミドを有する、可溶性又はインスタントコーヒーの形態である。
上記の実施例1〜9のいずれかから製造した、アクリルアミドの減少した焙煎して挽いたコーヒーは、水性抽出に付され、7.5%固形物を含有するコーヒー濃縮物を生成する。次にこの濃縮物を次の処方(重量基準)に用いて、すぐ飲めるコーヒー製品を製造する。
水 50%
2%低脂肪乳 35%
フルクトース 7%
バニラ粉末 2%
本発明のコーヒー濃縮物 6%
これらの成分を均一に混合し、超高温(UHT)のプロセス条件に付して製品を殺菌し、次いで無菌で個々の包装容器中に充填する。このすぐ飲めるコーヒー飲料は、従来の加工製品と比べて少なくとも約10%アクリルアミドが少ない。
実施例10で製造されたインスタントコーヒーを次の処方(重量基準)に用いて、カフェ・ラテ型飲料を製造するために用いるインスタントクリーミーコーヒー粉末を製造する。
実施例10のインスタントコーヒー 16%
起泡性クリーム* 50%
スクロース 33.5%
香味 0.5%
(*起泡性クリームは68%脱脂乳、30%ココヤシ油、1%二酸化ケイ素流動剤、及び溶解中のタンパク質構造の安定化のための1%オルトリン酸二水素ナトリウムである。)
上記の実施例1〜9のいずれかから製造した、アクリルアミドの減少した焙煎して挽いたコーヒーは、温度82℃(180°F)及び圧力6バール(620kPa(90psi))で、バッチ抽出容器中の加熱した水による水性抽出を受け、4.5%固形物の濃縮コーヒー抽出物を生成する。この抽出物を次に冷凍し、熱水を加えて戻して0.7%の固形物を有する最終のコーヒー飲料を製造する。これにより調製された抽出物及び最終コーヒー飲料は、従来の加工製品より少なくとも約10%アクリルアミドが少ない。
上記の実施例1〜9のいずれかから製造した、アクリルアミドの減少した焙煎して挽いたコーヒーを消費者に販売するために缶の中に包装する。缶の上に「アクリルアミドを含まない製品!」と記載するメッセージを印刷する。
上記の実施例1〜9のいずれかによる、酵素により処理されたグリーンコーヒー豆を円筒形容器に包装する。円筒形容器に「低アスパラギン」というラベルを貼る。
実施例11のすぐ飲める甘くしたカプチーノ製品を消費者に販売するために瓶の中に包装する。瓶のラベル上に「90%を超えるアクリルアミドの減少!」と記載する。製品のテレビコマーシャルでは、「アクリルアミド減少製品」というメッセージを伝える。
実施例1〜9のいずれかの焙煎して挽いたコーヒーから製造され入れたコーヒーを、カップに入れて消費者に販売する。入れたコーヒーが販売される小売店内部に掲示された標示には、「アクリルアミドを含まないコーヒーだけを販売します」というメッセージを伝える。
Claims (10)
- コーヒー豆中のアスパラギンの濃度を減少させる工程を含む、焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの濃度を減少させる方法。
- アスパラギン還元酵素をコーヒー豆に添加する工程を含み、好ましくは、前記アスパラギン還元酵素がアスパラギナーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アスパラギン還元酵素が、遊離アスパラギンのアミド基を加水分解することができる酵素である、請求項1又は2に記載の方法。
- (1)アスパラギンを含有するコーヒー豆を提供する工程;
(2)任意選択的に、該コーヒー豆を前処理する工程;
(3)アスパラギン還元酵素を該コーヒー豆に添加する工程;
(4)該酵素が該アスパラギンと反応するために十分な時間を与える工程;
(5)任意選択的に、該酵素を非活性化又は除去する工程;及び
(6)該コーヒー豆を焙煎して、焙煎したコーヒー豆を形成する工程
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記コーヒー豆中のアスパラギンの濃度を、10%〜100%、好ましくは30%〜100%、より好ましくは50%〜100%、更により好ましくは70%〜100%、最も好ましくは90%〜100%減少させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 500ppm未満のアスパラギン、好ましくは300ppm未満のアスパラギン、より好ましくは200ppm未満のアスパラギン、最も好ましくは100ppm未満のアスパラギンを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコーヒー豆。
- 前記焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの濃度を、10%〜100%、好ましくは30%〜100%、より好ましくは50%〜100%、更により好ましくは70%〜100%、最も好ましくは90%〜100%減少させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の焙煎したコーヒー豆。
- 前記焙煎したコーヒー豆中のアクリルアミドの濃度が、0〜160ppb、好ましくは0〜150ppb、より好ましくは0〜100ppb、更により好ましくは0〜50ppb、なおより好ましくは0〜20ppb、最も好ましくは0〜10ppbである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の焙煎したコーヒー豆。
- 前記製品中のアクリルアミドの濃度を、10%〜100%、好ましくは30%〜100%、より好ましくは50%〜100%、更により好ましくは70%〜100%、最も好ましくは90%〜100%減少させる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の焙煎したコーヒー豆を含む製品。
- (a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の焙煎したコーヒー豆を含む製品であって、前記焙煎したコーヒー豆が、アクリルアミドの減少した濃度を有する製品と;
(b)該製品を収容するための容器と;
(c)該容器に付随するメッセージとを含み、
該容器に付随する前記メッセージが、消費者に、該製品がアクリルアミドの減少した濃度を有することを知らせる商品。
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