JP2006501167A5 - - Google Patents
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Description
発明の背景
腫瘍壊死因子-関連活性化-誘導サイトカイン（tumor necrosis factor-related activation-induced cytokine：TRANCE）、オステオプロテゲリンリガンド（osteoprotegerin ligand）（OPGL-本明細書中で用いる命名法）および破骨細胞分化因子（osteoclast differentiation factor：ODF）ともいう核因子-カッパBリガンドの受容体アクチベーター（receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand：RANKL）は、骨芽細胞および骨髄間質細胞で発現される膜貫通リガンドであって、T細胞によって生産される（1-4）。RANK、破骨細胞の分化、活性化および生存に不可欠な破骨細胞受容体への結合に続き、M-CSFに由来するシグナルと共働する経路において、OPGLは破骨細胞形成を誘導する（CD98）（5、6）。骨芽細胞および骨髄間質細胞によっても生産されるOPG（または骨芽細胞阻害因子、OCIF）は膜貫通ドメインを欠き、OPGLに対するデコイ受容体として作用し、OPGLのRANKとの結合を競合的に阻害し、従って、骨代謝を調節する（7）。骨代謝の調節においてOPGL/OPGによって果たされる非常に重要な役割は、これらの分子の発現が改変されたマウスにおける骨格表現型の極端（骨粗鬆症対大理石骨病）の知見、およびヒトにおけるオステオプロテゲリン遺伝子での多形が骨粗鬆症骨折に関連するという最近の報告によって支持される（43）。骨芽細胞および間質細胞からのOPGおよびOPGLの分泌は、しばしば逆様式で多数のホルモンおよびサイトカインによって調節される（8）。
腫瘍壊死因子-関連活性化-誘導サイトカイン（tumor necrosis factor-related activation-induced cytokine：TRANCE）、オステオプロテゲリンリガンド（osteoprotegerin ligand）（OPGL-本明細書中で用いる命名法）および破骨細胞分化因子（osteoclast differentiation factor：ODF）ともいう核因子-カッパBリガンドの受容体アクチベーター（receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand：RANKL）は、骨芽細胞および骨髄間質細胞で発現される膜貫通リガンドであって、T細胞によって生産される（1-4）。RANK、破骨細胞の分化、活性化および生存に不可欠な破骨細胞受容体への結合に続き、M-CSFに由来するシグナルと共働する経路において、OPGLは破骨細胞形成を誘導する（CD98）（5、6）。骨芽細胞および骨髄間質細胞によっても生産されるOPG（または骨芽細胞阻害因子、OCIF）は膜貫通ドメインを欠き、OPGLに対するデコイ受容体として作用し、OPGLのRANKとの結合を競合的に阻害し、従って、骨代謝を調節する（7）。骨代謝の調節においてOPGL/OPGによって果たされる非常に重要な役割は、これらの分子の発現が改変されたマウスにおける骨格表現型の極端（骨粗鬆症対大理石骨病）の知見、およびヒトにおけるオステオプロテゲリン遺伝子での多形が骨粗鬆症骨折に関連するという最近の報告によって支持される（43）。骨芽細胞および間質細胞からのOPGおよびOPGLの分泌は、しばしば逆様式で多数のホルモンおよびサイトカインによって調節される（8）。
サイトカイン媒介調節の複雑な役割の例として、TNFαは、間質細胞-枯渇ラットの骨髄細胞培養での破骨細胞の発生においてOPGLと協働し（9）、およびインスリン様成長因子I（IGF-I）または骨形成骨形態タンパク質（BMP-2、-4および-6）によって提供されるシグナルの下流の段階で骨芽細胞分化およびオステオカルシン/骨小節形成を阻害する（10）の双方が記載されている。サイトカインTGFβ1はBMP-2誘導骨芽細胞発生を阻害するとも報告されており（11）、他方、対照的に、TGFβ2およびTGFβ3は、共に、転写因子SmadおよびCbfa1の改変された発現と関連して、OPGを増加させる（およびOPGLを減少させる）ことによって破骨細胞形成を阻害する（12）。増強されたIL-6生産（および増強されたOPGL）は、マウスにおける慢性アルコール摂取に続いての増大した破骨細胞形成および骨喪失を説明すると考えられており（13）、同様に、IL-4およびIL-13はヒト骨芽細胞において増殖を阻害し、IL-6形成を刺激する（14）。骨代謝回転における他のプロ炎症サイトカイン（IL-1を含む）に対する重要な役割もまたよく記載されている（15）。幾分驚くべきことには、恐らくは、IFNγ、炎症タイプのサイトカインは、RANKL-誘導破骨細胞活性化に逆らうことによって骨芽細胞活性を増強させると報告されている（16）。
好ましい態様において、スクリーニング方法で用いられるCD200Rは、CD200での刺激に際して測定可能なマーカーを生じるCD200受容体を生産する骨細胞上にある。
もう1つの局面において、本発明は、有効量のCD200受容体アンタゴニストを投与することを含む骨発生を阻害する方法を提供する。また、本発明は、CD200Rアンタゴニストの、骨発生を阻害するための、または骨発生を阻害するための薬剤の製造のための使用を含む。
モノクローナル抗体を生産するためには、抗体生産細胞（リンパ球）を免疫化動物から回収し、標準的な体細胞融合手法によって骨髄腫細胞と融合させることができ、従って、これらの細胞を不滅化し、ハイブリドーマ細胞が得られる。そのような技術は当技術分野において周知である（例えば、KohlerおよびMilsteinによって元来開発されたハイブリドーマ技術（Nature 256、495-497（1975））ならびにヒトB細胞ハイブリドーマ技術のような他の技術（Kozborら、Immunol. Today 4、72（1983））、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy（1985）Allen R. Bliss、Inc.,77〜96頁）、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huseら、Science 246、1275（1989））。ハイブリドーマ細胞は、前記ペプチドと特異的に反応する抗体の生産用に免疫化学的にに操作することができ、モノクローナル抗体を単離することができる。従って、本発明では、モノクローナル抗体をCD200またはCD200Rについての特異性でもってモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も考えられる。
CD200受容体活性の変化は、受容体を通じてのシグナリングの変化、または骨細胞中の受容体を通じてのシグナリングに関連する機能の変化を含む。例えば、本明細書中に記載するように、CD200受容体の刺激の結果、骨代謝に関連する分子のmRNAの増加した発現、ならびに骨発生に関連するサイトカインの放出がもたらされる。従って、サイトカインレベルおよび/またはある種の分子のmRNAレベルを測定して、CD200受容体活性が被検化合物によって調節されるか否かを決定することができる。インビボモデルを用いることもできる。例えば、CD200:CD200Rモジュレーターの効果を、骨粗鬆症の卵巣摘除ラットモデルで評価することができる。プロトコルの十分な記載は、参照として本明細書に組み入れられる、Rixonら、J. Bone ＆ Mineral Research 9, 1179-1189, 1994およびWhitfieldら、Calcif. Tissue Int. 58, 81-87, 1996に記載される。簡単に述べれば、正常なSham-OVX（卵巣摘除）、およびOVX スプラーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラット（三月齢；255〜260g）を群にランダム化する。前記動物に1日1回の6つの皮下注射/週を与え、OVXから第2週の最後に開始し、OVXから第8週の最後に終了する（すなわち、36注射）。Sham-OVXおよびOVX対照ラットには溶剤（0.001N HClを含有する0.15M NaCl）の36注射を与え、他方、OVXラットには選択された用量の溶剤中の物質を与える。OVXから第8週後の最後に、大腿部を摘出し単離し、洗浄し、中央-骨幹で半分に切断し、基部側半分を捨てる。骨端を除去した後、各半分の大腿部を長さ方向に2つの部分に割り、骨髄をフラッシュする。
1つの態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法を用いて、CD200受容体アゴニストを同定することができる。本明細書中で用いられる用語「CD200受容体アゴニスト」は、CD200受容体に結合し、それを架橋させ、またはそれを連結することができ、結果として前記受容体の刺激を生じるいずれの物質も意味する。CD200受容体の刺激は、受容体を通じてのシグナリングの刺激、または受容体を通じてのシグナリングに関連する骨細胞の機能の刺激を含む。例えば、アゴニストによる受容体の刺激の結果、破骨細胞形成の低下、および破骨細胞によって媒介される結果としての骨吸収の低下による、骨発生の正味の増加がもたらされる。
また、本発明は、薬物発見ビジネスを行うことを含めた本発明のスクリーニングアッセイ法の全てのビジネス適用も含む。従って、本発明は、
（a）CD200受容体のモジュレーターを同定するための一つまたは複数のアッセイ系を提供する工程；
（b）工程（a）で同定されたモジュレーター、またはそのさらなるアナログを、動物における効能および毒性につき治療的プロファイリングを行う工程；および
（c）許容される治療的プロファイルを有するものとして工程（b）で同定された一つまたは複数のモジュレーターを含む薬学的製剤を処方する工程
を含む、薬物発見ビジネスを行う方法も提供する。
（a）CD200受容体のモジュレーターを同定するための一つまたは複数のアッセイ系を提供する工程；
（b）工程（a）で同定されたモジュレーター、またはそのさらなるアナログを、動物における効能および毒性につき治療的プロファイリングを行う工程；および
（c）許容される治療的プロファイルを有するものとして工程（b）で同定された一つまたは複数のモジュレーターを含む薬学的製剤を処方する工程
を含む、薬物発見ビジネスを行う方法も提供する。
本発明の核酸分子を含む薬学的組成物は、骨発生を調節するために遺伝子治療で用いることができる。本発明のCD200またはCD200R分子をコードする核酸配列を含む組換え分子、またはその断片は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびDNAウイルスベクターのような送達ビヒクルを用いて、インビボにて細胞または組織に直接導入することができる。それらは、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションのような物理的技術、または共沈殿およびDNAのリポソームへの取込みのような化学的方法を用いてインビボにて細胞に導入することもできる。組換え分子は、エアロゾルの形態にて、または洗浄によって送達することもできる。本発明の核酸分子は、細胞への直接的注射によるように細胞外適用することもできる。CD200またはCD200R分子をコードする核酸分子は、好ましくは、免疫グロブリン（Ig）Fc領域をコードする核酸分子との融合として調製される。それ自体、CD200またはCD200R分子は、可溶性融合タンパク質としてインビボで発現される。
幾つかの実験においては、骨細胞発生を修飾する手段として、外因性CD200Fc（22）、または抗CD200R（23）の存在下で細胞をインキュベートした。培地を2日間隔で変更し、それは、M-CSF、デキサメタゾン（10-8M）、アスコルベート（75μg/ml）、リン酸グリセロール（10mM）および0.5％正常マウス血清を含んだ。ほとんどの実験において、回収に2日先立って、LPS注射マウス（24時間前に10mg/マウス腹腔内注射）からの0.5％血清で細胞をパルスした。明細書中で述べた実験においては、骨学スライド上の細胞を湿潤化CO2インキュベーター中でインキュベートして、（ELISA（後記参照）によるサイトカインタンパク質分析のための）培養上清への接近を可能とした。全てのスライドをRNAレイター（Ambion）にて10日後に固定し、mRNAをトリゾール溶液中に回収し、リアルタイムPCRを用い、地上で行なわれた培養、およびシミュレートされた微小重力培養の間で比較を行った。
結果
血清サイトカインによる破骨細胞活性化に続く骨培養におけるmRNA発現
予備実験において、本発明者は、（培養の最後の48時間における）LPS処理マウスの血清の存在下でのサイトカイン混合物での処理に続き、骨芽細胞先祖細胞MC3T3の存在下/非存在下で増殖させた骨髄間質細胞における骨代謝の調節に関連する分子の双方の定常状態mRNAレベルを調べた。これらの培養の上清におけるサイトカイン生産も評価した。
血清サイトカインによる破骨細胞活性化に続く骨培養におけるmRNA発現
予備実験において、本発明者は、（培養の最後の48時間における）LPS処理マウスの血清の存在下でのサイトカイン混合物での処理に続き、骨芽細胞先祖細胞MC3T3の存在下/非存在下で増殖させた骨髄間質細胞における骨代謝の調節に関連する分子の双方の定常状態mRNAレベルを調べた。これらの培養の上清におけるサイトカイン生産も評価した。
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