JP2006347908A

JP2006347908A - シアル酸含有３糖化合物、それを用いるサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出

Info

Publication number: JP2006347908A
Application number: JP2005173183A
Authority: JP
Inventors: Hirotaka Uzawa; 浩隆鵜沢; Akio So; 暁雄曽
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2005-06-14
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2025-06-14
Also published as: JP4742339B2

Abstract

【課題】サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質を検出することが可能な糖化合物およびそれを用いるセンサーチップ、検出方法の提供。
【解決手段】シアル酸含有３糖化合物は、下記一般式（１）で表される。

〔式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示し；Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方はシアル酸残基を示し；Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示す。〕
【選択図】なし

Description

本発明は、シアル酸含有３糖化合物、それを用いるサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出用センサーチップ、検出用微粒子または吸着材、除染剤およびサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法に関する。

新型肺炎（ＳＡＲＳ（サーズ）；Severe Acute Respiratory Syndrome）は、２００３年に中国、台湾、カナダで流行した。この感染症は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）によるもので、死亡率は１０％以上に達する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの表面には、スパイクタンパク質とよばれるタンパク質が多数存在しており、このスパイクタンパク質がホスト細胞上の特定のレセプターと結合して感染が始まると考えられている。このウイルスは、発見後歴史が新しく、ヒトＳＡＲＳウイルスのレセプターに関しても現段階では不明な点が多い。

これまで、サーズウイルスの検出には、遺伝子診断法（ＲＴ−ＰＣＲ法：非特許文献１）、抗体法（非特許文献２）などが知られている。しかしながら、遺伝子診断法はウイルス以外による汚染の危険性があり、ウイルスの存在を推測する程度に過ぎない。抗体法は、抗体の安定性の問題から２〜８℃といった低温下で抗体を保存する必要があり、温度管理の手間などがあり煩雑な方法であった。このため、精度の高い、簡便なサーズウイルスの検出方法が望まれていた。

一方、バイオテクノロジー、生化学研究、臨床検査、食品検査などの分野においては、ウイルスなどに存在する糖結合性蛋白質を高感度に検出・定量する方法が提案されている（特許文献１）。
しかし、これまで、サーズウイルスがレセプターとなる糖鎖構造は解明されておらず、糖鎖を利用するサーズウイルスの検出、吸着方法の報告もない。

米国特許第３２３１７３３号 Journal of Virological Methods, vol. 122, pp. 29-36 (2004). Clinical Immunology, vol. 113, pp. 145-150 (2004).

本発明は、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質を検出することが可能な新規な糖化合物を提供することを課題とする。

さらに本発明は、高感度で簡便かつ迅速にサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質を検出できるバイオセンサーチップ、検出用試薬、検出用微粒子、吸着材、徐染剤およびサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法を提供することを課題とする。

本願発明者らは、上記課題に鑑み、本願発明者らが合成した糖鎖について、サーズウイルスとの結合可能な糖鎖について研究した。具体的には、サーズウイルス表面に存在するスパイク蛋白質と呼ばれるタンパク質と結合しうる糖鎖について鋭意研究し、特定の糖鎖構造が、極めて効果的にサーズウイルスのスパイク蛋白質と結合することを初めて見出した。この糖鎖構造を有する化合物を用いることにより、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の迅速な検出、吸着材などを提供することができることを見出し、本願発明を完成した。

すなわち本件発明は以下を含む。
〔１〕下記一般式（１）：

〔式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示し；
Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方は下記式（２）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_１およびＸ_２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示す。〕で表される、シアル酸含有３糖化合物。
〔２〕前記Ｒ_２が前記式（２）で表されるシアル酸残基であり、前記Ｒ_３がＨである、〔１〕に記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔３〕前記Ｒ_２がＨであり、前記Ｒ_３が前記式（２）で表されるシアル酸残基である、〔１〕に記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔４〕前記Ｘ_１が芳香族置換基であり、Ｘ_２が直鎖もしくは分岐した炭素原子数２〜２０のアルキル基である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔５〕前記Ｘ_１が、下記式（３）

で表される２価の基である、〔４〕に記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔６〕前記Ｘ_２が、-C_nH_2n- (n = 2-6)である、〔４〕または〔５〕に記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔７〕Ｙが、ジスルフィド基である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔８〕下記式（４）

〔式中、Ｒ_１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩を示す〕で表される、〔１〕に記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔９〕下記式（５）

〔式中、Ｒ_１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩を示す〕で表される、〔１〕に記載のシアル酸含有３糖化合物。
〔１０〕下記一般式（６）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表されるシアル酸含有３糖化合物が、金属基板表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ。
〔１１〕下記一般式（６）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表されるシアル酸含有３糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子。
〔１２〕〔１１〕に記載の前記微粒子が、溶液中にコロイドで存在している、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬。
〔１３〕下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１）試験体を、〔１０〕に記載のセンサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２）基板に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
〔１４〕下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１）試験体を、〔１２〕に記載の試薬に添加して、〔１１〕に記載の前記微粒子と接触させる工程、
（２）前記微粒子に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
〔１５〕下記一般式（６）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表されるシアル酸含有３糖化合物を含有する、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質吸着材。

以下に、シアル酸含有３糖化合物、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出試薬、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法、吸着材について具体的に説明する。

<シアル酸含有３糖化合物>
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出、吸着に用いることのできる好ましいシアル酸含有３糖化合物は、下記一般式（６）で表される。

式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示す。これらのうちでは、−ＮＨＣＯＣＨ_３が好ましい。−ＮＨＣＯＣＨ_３の場合、−ＯＨよりサーズウイルスとの結合、より具体的にはサーズウイルス表面に存在するスパイクタンパク質との結合が強い。

本明細書において、「スパイク蛋白質」とは、コロナウイルスに特徴的なタンパク質で、このスパイク蛋白質はサーズウイルス（サーズウイルスは、コロナウイルスに属する）の膜表面に存在する突起状の蛋白質である。これは、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットから構成される（Clinical Immunology, 113, 145-150 (2004))。また、ホスト細胞に感染する（結合する）ために必要な蛋白質である（感染機構の詳細は、Trends in Microbiology, 12, 466-472 (2004)に掲載されている。）。なお、これまでホスト細胞上の糖鎖に結合するという事実はない。

Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方は下記式（２）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示す。

前記式（６）中、シアル酸残基が導入された３糖部分が、サーズウイルスのスパイクタンパク質と特異的に結合する。

前記−ＣＯ₂Ｍが生理的に許容される塩である場合、その塩の形態は特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。

無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。

無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、トリメチルアミン塩、ピリジニウム塩などがあげられ、これらのうち、さらに好ましくはトリメチルアミン塩、ピリジニウム塩である。

酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。

式中、Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味する。
前記置換基は下記Ａ群から選択することができる。
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基。

「Ｃ_２〜２０アルキル基」とは、炭素原子数２〜２０のアルキル基であり、直鎖状、分岐状アルキル基のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキル基である。炭素原子数は、好ましくは４〜２０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１３〜１８である。

「Ｃ_２〜２０アルケニル基」とは、炭素原子数２〜２０のアルケニル基であり、直鎖状、分岐状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルケニル基である。炭素原子数は、好ましくは４〜２０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１３〜１８である。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。複数の不飽和結合を含む場合には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−のような配置を含んでいてもよい。

「Ｃ_２〜２０アルキニル基」とは、炭素原子数２〜２０のアルキニル基であり、直鎖状、分岐状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキニル基である。炭素原子数は、好ましくは４〜２０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１３〜１８である。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。

「Ｃ_６〜10アリール基」とは、炭素数６〜１０の芳香族性の炭化水素環式基をいい、具体的には例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などが挙げられる。

「Ｃ_１〜２０アルキルカルボニルオキシプロピル基」とは、Ｃ_１〜２０アルキル基−ＣＯ−Ｏ−Ｃ₃Ｈ₆−で表される基であり、Ｃ_１〜２０アルキル基は直鎖状、分岐状アルキル基のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキル基である。

「Ｃ_2〜２１アルキルオキシプロピル基」とは、Ｃ_２〜２１アルキル基−Ｏ−Ｃ₃Ｈ₆−で表される基であり、Ｃ_２〜２１アルキル基は直鎖状、分岐状アルキル基のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキル基である。

「Ｃ_２〜２０アルケニルカルボニルオキシプロピル基」とは、Ｃ_２〜２０アルケニル基−ＣＯ−Ｏ−Ｃ₃Ｈ₆−で表される基であり、Ｃ_２〜２０アルケニル基は直鎖状、分岐状のいずれでもよい。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。複数の不飽和結合を含む場合には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−のような配置を含んでいてもよい。

「Ｃ_2〜２１アルケニルオキシプロピル基」とは、Ｃ_２〜２１アルケニル基−Ｏ−Ｃ₃Ｈ₆−で表される基であり、Ｃ_２〜２１アルケニル基は直鎖状、分岐状のいずれでもよい。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。複数の不飽和結合を含む場合には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−のような配置を含んでいてもよい。

「置換基を有していてもよい」とは、置換可能な部位に、任意に組み合わせて１または複数個の置換基を有してもよいことを意味する。

これらＸ₃のうち、好ましくは、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基である。

これらにおいて、置換基としては、好ましくは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ、または−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙである。

このうち、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基が置換基を有する場合その置換基としては、前記−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙで表される基が好ましい。

また、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基が置換基を有する場合その置換基としては、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙまたは−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙが好ましい。

式（６）においてＸ₃としては、より具体的には、たとえば下記式（７）〜（１１）で表される基がより好ましい。

式（７）〜（１１）中、ｎは好ましくは２〜２０の整数を示し、より好ましくは２〜１０、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５である。前記ｐは、好ましくは１〜１７の整数を示し、より好ましくは７〜１７、さらに好ましくは１０〜１５である。ｑは、好ましくは１〜２０の整数を示し、より好ましくは１０〜２０、さらに好ましくは１３〜１８である。

このような式（７）〜（１１）で表されるように、リンカー部位（−ＣＯＣ_nＨ_2nYまたは−ＣＨ₂Ｃ_nＨ_2nY）と側鎖部位（−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣ_pＨ_2pＣＨ₃、−ＣＨ₂Ｏ（ＣＯ）Ｃ_qＨ_2qＣＨ₃または−ＣＨ₂ＯＣＨ₂Ｃ_qＨ_2qＣＨ₃）とを有すると、シアル酸含有３糖化合物をセンサーに適した配向性で高密度に基板や微粒子に固定することができるとともに、シアル酸含有３糖化合物を含有するバイオセンサーあるいは糖脂質含有微粒子を含有する検出試薬を用いると、極微量のサーズウイルスでも高感度に検出・定量できる。

特に、式（７）〜（１１）において、ｎが上記範囲にあると、シアル酸含有３糖化合物を、基板表面あるいは微粒子表面に結合したときのセンサーの感度が向上するとともに、サーズウイルスとの結合に適した密度・配向性をもって基板表面または微粒子表面に効果的に結合させることができる。

前記式中、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示す。本明細書において「チオール基」とは−ＳＨで表される基であり、「ジスルフィド基」とは、−Ｓ−Ｓ−で表される構造を有する基である。

前記ジスルフィド基としては、好ましくは環状ジスルフィド基が挙げられ、このうち５員環のジチオラニル基、たとえば１，２−ジチオラン−３−イル基、１，２−ジチオラン−４−イル基など、６員環のジチアニル基、たとえば１，２−ジチアン−３−イル基、１，２−ジチアン−４−イル基などが挙げられる。これらのうちでは、５員環のジチオラニル基が好ましく、１，２−ジチオラン−３−イル基がより好ましい。また、チオクト酸（リポ酸）から誘導される基を用いることもできる。

これらのうちでは、ジスルフィド基が好ましい。ジスルフィド基の場合、シアル酸含有３糖化合物を基板表面又は微粒子表面に強固に安定に固定化することができる。特に、前記式（７）〜（１１）で表される基では、シアル酸含有３糖部位、リンカー部位、および側鎖部位の立体障害が予測され、結合密度の低下、感度低下などが考えられるが、本発明のように特定のリンカーと側鎖とジスルフィド基の組み合わせにより、強固で安定な固定化が可能となり、立体障害の影響がなく高感度のセンサーとすることができる。

さらに、式（７）において、前記−ＣＯＣ_nＨ_2nYの主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ１）と、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣ_pＨ_2pＣＨ₃の主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ２）とは、好ましくはＮ１：Ｎ２＝１：１．５〜１：５、さらに好ましくは１：２〜１：３の範囲にある。
また、式（８）〜（１１）において、前記−ＣＯＣ_nＨ_2nYまたは−ＣＨ₂Ｃ_nＨ_2nYの主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ１）と、前記−ＣＨ₂Ｏ（ＣＯ）Ｃ_qＨ_2qＣＨ₃または−ＣＨ₂ＯＣＨ₂Ｃ_qＨ_2qＣＨ₃の主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ２）とは、好ましくはＮ１：Ｎ２＝１：１．５〜１：５、さらに好ましくは１：２〜１：３の範囲にある。

なお、Ｎ１においては、前記−ＣＯＣ_nＨ_2nYにおいてＹ中の硫黄原子と−ＣＯとを最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とし、Ｙがジスルフィド基の場合はそのうちの−ＣＯに近い硫黄原子側を主鎖上の原子とし、合計数Ｎ１には硫黄原子を含まない。また、Ｎ２においては、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣ_pＨ_2pＣＨ₃、−ＣＨ₂Ｏ（ＣＯ）Ｃ_qＨ_2qＣＨ₃または−ＣＨ₂ＯＣＨ₂Ｃ_qＨ_2qＣＨ₃において末端の−ＣＨ₃と−ＣＨ（ＯＨ）または−ＣＨ₂Ｏとを最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とする。

このような式（７）〜（１１）の側鎖部位が含まれていると、側鎖部位が存在しない場合と比較して、検出感度を格段に向上させることができる。さらに、このような炭素数あるいは原子数で側鎖部位が構成され、側鎖部位が前記リンカー部位の長さよりも大きい長さとなる場合、シアル酸含有３糖化合物をより高度な配向性で基板や微粒子に固定することができるとともに、該シアル酸含有３糖化合物を含有するバイオセンサーあるいは糖脂質含有微粒子を含有する検出試薬を用いると、より微量のサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質でも高感度に検出・定量できる。

このような式（６）あるいは式（７）〜（１１）で表される化合物は、細胞二重層膜の表側に多く存在するグリセロ糖脂質（親水性基として糖、脂溶性基としてグリセリド部位又はジアシルグリセロール部位を有する糖脂質）などから誘導することができ、原料入手の容易性からも好適である。

また、Ｘ₃は、任意のポリマーに結合していてもよい。

また、Ｘ₃は、−Ｘ₁ＮＨ−（ＣＯ）−Ｘ₂Ｙで表される基（１２）も好ましい。このような化合物（６）としては具体的には下記式（１）で表すことができる。

式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は前述と同じである。糖鎖末端の、−Ｘ_１−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘ_２−Ｙは、センサーチップを基板表面あるいは金属微粒子表面に固定化する部分である。

Ｘ_１およびＸ_２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−（ｎが２〜２０、好ましくは２〜６）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０、好ましくは６〜８の２価の芳香族基を示す。

これらのうち、Ｘ_１としては芳香族基が好ましく、芳香族基としては下記式（３）

で表される基がさらに好ましい。

Ｘ_２としては、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−（ｎが２〜２０、好ましくは２〜６）で表されるアルキル基が好ましく、これらのうちではさらに好ましくは直鎖であり、ｎ＝４である場合が特に好ましい。

Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を示し、ジスルフィド基が好ましい。「ジスルフィド基」は前記と同様である。

このような化合物として、より具体的にはたとえば下記式（４）、（５）で表される化合物が挙げられる。

このような本発明に係る化合物は、極めて効果的にサーズウイルス、特に、サーズウイルスのスパイク蛋白質と結合する。

シアル酸含有３糖化合物の製造方法
本発明に係るシアル酸含有３糖化合物の製造方法に限定はないが、たとえば、下記に示すような方法が挙げられる。
<シアル酸含有３糖化合物の合成方法>
還元末側の配糖体部位は、一例として、ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）基を有する３糖について示すが、配糖体部位は、これに限定されない。

スキーム１

１ａの合成
スキーム１に示すように、市販のｐＮＰＮ−アセチルグルコサミンをアクセプターに用い、ラクトース、ｐＮＰラクトースなどをドナーとして共存させ、ガラクトシダーゼのような加水分解酵素を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミンの４位にガラクトースを選択的に転位させ、化合物１ａを得ることができる。

該酵素反応においては、ガラクトシルトランスフェラーゼのような転位酵素を用いてもよい。この場合のドナーには、たとえば、ＵＤＰ−ガラクトースを使用することができる。この２糖の結合様式は、β１−４結合である。加水分解酵素の起源によっては、β１−３結合の２糖も合成することが可能であるが、これらも、サーズウイルスと結合できる糖鎖であり、検出用センサーや吸着剤の開発に有効である。

前記酵素反応は、たとえば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、または酢酸緩衝液中、好ましくは２０−８０℃、さらに好ましくは３０−４５℃で実施できる。緩衝液のｐＨは、好ましくはｐＨ１−１０、さらに好ましくはｐＨ３−８である。反応時間は、好ましくは３０分−３０日、さらに好ましくは３時間−７日である。緩衝液に、アセトニトリル、メタノールなどの有機溶媒を加えてもよい。有機溶媒を加える割合は、好ましくは１−８０％、さらに好ましくは１０−５０％である。アクセプター（ｐＮＰＮ−アセチルグルコサミン）とドナー（ラクトース、ｐＮＰラクトースなど）の割合は、好ましくは１：９９〜９９：１、さらに好ましくは１：１０程度である。なお、市販の加水分解酵素には、夾雑するＮ−アセチルヘキソサミニダーゼが混入しており、これがアクセプターを加水分解することがあるので、予め必要に応じ、フェニルセファロースなどのカラムで酵素を粗精製することが好ましい。用いる酵素のユニット数は、好ましくは０．１〜１００ユニット、さらに好ましくは０．２〜１０ユニットである。

２ａ、３ａの合成
次に、この２糖の化合物１ａをアクセプターに用い、ドナーのCMP-NeuAc、血清アルブミン、マンガンイオン（通常は、MnCl₂）、および、アルカリフォスファターゼを共存させ、α2,3-sialyltransferaseを加えれば、化合物１ａの３位にシアル酸残基が転位した３糖化合物２aを得ることができる。
一方、α2,3-sialyltransferaseのかわりにα2,6-sialyltransferaseを用いれば、１ａの６位にシアル酸残基が転位した３糖化合物３ａを得ることができる。

酵素反応条件は、上記と同様である。緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりにモルフォリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液を使用してもよい。ｐＨは、好ましくはｐＨ４−９で、さらに好ましくはｐＨ５−７で、特に好ましくはｐＨ６−７である。添加するアルカリフォスファターゼは、各sialyltransferaseに対して好ましくは１−１０００当量、さらに好ましくは５−２０当量である。
アクセプター１ａとドナー（CMP-NeuAc）の割合は、前述と同様であるが、好ましくは１：１〜１．５である。
反応は、ＨＰＬＣによりモニタリングを行いながら実施することが好ましい。カラムとしては、たとえば、ＯＤＳ―Ｃ１８カラムなどを用いることができ、溶離液には、たとえば、１５％アセトニトリル水溶液で、0.1-1%のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えて分析する。バイオゲルＰ−２等の分子ふるい用カラムを使用してもよい。

<配糖体部位の変換方法：式（４）の化合物の合成>
スキーム２

配糖体部位がｐ−ニトロフェニル基である化合物２ａをｐ−アミノフェニル基へと還元して、３糖４ａを得ることができる。
この反応は、水素気流下、パラジウム、パラジウム−活性炭、水酸化パラジウムなどの触媒の存在下で行う。パラジウムの代わりに、ギ酸アンモニウムなどを使用してもよい。
溶媒は、水、メタノール、エタノール、これらの混液を使用することができる。反応温度は、好ましくは１０−８０℃で、さらに好ましくは２０−４０℃である。圧力は、好ましくは１気圧〜１００気圧、さらに好ましくは１気圧である。反応時間は、好ましくは３０分〜３日、さらに好ましくは１時間―２４時間である。

次に、３糖化合物４ａを、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5- triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM)の存在下、リポ酸と反応させ、３糖化合物５ａへと変換することができる。
溶媒は、エタノール、メタノール、水、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはこれらの混液を用いることができ、これらのうち好ましくは、エタノール、水、またはメタノールである。反応温度は、好ましくは１０℃−８０℃、さらに好ましくは２０−４０℃である。３糖化合物４ａに対して、リポ酸は、好ましくは０．９−１０当量、さらに好ましくは０．９−２当量である。また、DMT-MMは、好ましくは０．９−１０当量、さらに好ましくは０．９−２当量である。

<配糖体部位の変換方法：式（５）の化合物の合成>
スキーム３

化合物５ａと同様にして、ガラクトースの６位にシアル酸残基を有する化合物３ａから化合物７ａを得ることができる。

<配糖体部位の変換方法：式（７）の配糖体部位を有する化合物の合成>
式（７）の配糖体部位を有するシアル酸含有３糖化合物は、下記スキーム４に示すように、たとえば出発原料として天然に由来するスフィンゴ糖脂質を用いる方法により種々の配糖体部位を有する化合物を得ることができる。

スキーム４

スフィンゴ糖脂質（１ｂ）（式中、Ｇ_Nは糖鎖部位を示し、たとえば、グルコース単位であり、Ｒ^3’は−Ｃ_10〜18Ｈ_20〜30−ＣＨ₃であり、Ｒ^’は−Ｃ_10〜20Ｈ_20〜40−ＣＨ₃である。）は、１個以上の糖が直鎖あるいは分岐鎖で共有結合している糖鎖部位と、スフィンゴシン塩基に脂肪酸がN-アシル結合したセラミドと呼ばれる脂質を骨格としている。該スフィンゴ糖脂質は、脊椎動物、無脊椎動物、植物などに広く存在する化合物である。これらは、タカラバイオ、Sigma社などの市販品を用いることができる。

たとえば、該スフィンゴ糖脂質（１ｂ）を公知の方法を用いて酵素処理することにより（J. Biol. Chem.、Vol.250、P.24370、1995年）、セラミド部位にあるアミド結合を選択的に加水分解し、アミノ基をもつスフィンゴシン塩基が疎水性部となる一本鎖糖脂質である化合物（２ｂ）（リゾ体）を得ることができる。該酵素反応は、スフィンゴ糖脂質やスフィンゴミエリンに特異的作用することのできる酵素、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ(Sphingolipid ceramide N-deacylase: SCDase, E.C. 3.5.1.69)を用いる。当該酵素はすべてのスフィンゴ糖脂質とスフィンゴミエリンに作用する。

前記SCDaseは、反応液のpHや界面活性剤濃度により、加水分解以外に、縮合反応と脂肪酸交換反応も効率よく触媒することができる（J. Lipid Res.、Vol.38、P.1923、1997年）。

前記酵素による加水分解反応は、スフィンゴ糖脂質10μmolに対してSCDaseを好ましくは1〜5U添加し、好ましくはpH5.5〜6.5の酢酸緩衝液中で、界面活性剤としてたとえばタウロデオキシコール酸ナトリウム0.5%〜2.0%の存在下に、３０〜４０℃で実施することが好ましい。さらに反応液の上層部に、好ましくは反応液の１０倍量に相当する炭素数１０〜１８の炭化水素溶媒を加えることにより高い収率で化合物（２ｂ）を得ることができる。

次に、得られた化合物（２ｂ）のアミノ基に、金属基板または金属微粒子表面と化学的固定及び／又は物理的な吸着による固定が可能なリンカー部位となる化合物（３ｂ）を化学結合により結合させて化合物（４ｂ）を得ることができる。このような化合物としてはたとえば、ＨＯＯＣ−Ｃ_nＨ_2nＹ（３ｂ）（式中、ｎ、Ｙは前記式（７）〜（１１）中のｎ、Ｙと同意義である。）で表される、チオオクト酸、チオール基を末端に有する脂肪酸、ジスルフィド基を有する脂肪酸が挙げられる。

また、リンカー部位を誘導する化合物（３ｂ）は、あらかじめカルボキシル基をN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）などで活性化したものを用いてもよい。
リゾ体（２ｂ）のアミノ基と化合物（３ｂ）のカルボキシル基との反応は、溶媒中、必要に応じ脱水縮合剤の存在下に実施する。化合物（３ｂ）の使用量は、リゾ体（２ｂ）に対して、１〜３当量の範囲にあることが好ましい。
前記溶媒としては、たとえば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル、エタノールなどの有機溶媒、水などが挙げられる。溶媒は、１種単独であるいは２種以上を混合して用いることができる。

脱水縮合剤を用いる場合、たとえば、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩（DMT-MM）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはWSC）などが挙げられる。また、N-メチルモルホリン（NMP）、NHS等の活性化剤を上記脱水縮合剤を併用して用いることもできる。
反応は、好ましくは０℃から４０℃の範囲の温度で、好ましくは１〜４８時間程度行う。

スキーム５
スキーム５に示すように、さらに側鎖部分の２重結合に、エポキシ基、水酸基を導入したり、アルデヒドに変換することにより、側鎖部分の炭素数を変換することができる。

上記スキーム５において、Ｒ⁵は−Ｃ_nＨ_2n−Ｙである。Ｒ⁴は、−Ｃ_pＨ_2p−ＣＨ₃で表される基である。Ｒ^4’は、Ｒ⁴と異なる−Ｃ_pＨ_2p−ＣＨ₃で表される基である。
Ｇ_N、ｎ、ｐは、前記と同義である。

オレフィン部分にエポキシ基を導入するには、アルカリ性過酸化水素（Ｐｒｉｌｅｚｈａｅｖエポキシ化反応）、m-クロロ過安息香酸(m-chloro perbenzoic acid；MCPBA酸化)、Ti(O-i-Pr)₄と酒石酸ジエチルメタノールの存在下tert-ブチルヒドロペルオキシド（香月−Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ不斉酸化）などを用いて行うことができる。

オレフィンに水酸基を導入するには、カンファースルホン酸(CSA)やｐ−トルエンスルホン酸(pTsOH)のような酸、もしくは、水酸化ナトリウム(NaOH)や水酸化カリウム(KOH)のような塩基の存在下、先のエポキシ基を開裂させ水酸基（ジオール）を導入できる。

また、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₃CN）により、還元的に開裂させてもよい。あるいは、オレフィンにBH₃を作用させ、その後、過酸化水素水で処理して、モノオール（モノアルコール）に変換できる（ヒドロボレーション）。

さらに、オレフィンをオゾン気流下でオゾン酸化すると、アルデヒドが得られる。エポキシ基を開裂させて得られる水酸基（ジオール）を、過ヨウ素酸酸化して同様の誘導体を得ることもできる（但し、糖水酸基は、例えば、アセチル基などのアシル系保護基で保護しておく必要がある）。

得られるアルデヒドは、その後、Wittig反応により、任意の長さの炭化水素を有するリンイリドと反応させて、式（７）中の側鎖の長さを任意に変換することができる。

このようにして得られる式（７）の側鎖を有する化合物４ｂ等は、たとえばグルコース単位を有しているが、たとえば、スキーム１で示したのと同様の方法により、グルコース単位をシアル酸含有３糖単位に変換することができる。

<配糖体部位の変換方法：式（８）〜（１１）の配糖体部位を有する化合物の合成>
スキーム６
さらにスキーム６に示すような、出発原料として天然に由来するグリセロ糖脂質を用いる方法により、式（８）〜（１１）の配糖体部位を有するシアル酸含有３糖化合物を合成することができる。

式中、Ｇ_Nは糖鎖部位であり、たとえば、グルコース単位である。Ｒ⁶、Ｒ⁷は、互いに独立に−Ｃ_rＨ_2r−ＣＨ₃（式中、ｒは、１〜２０の整数を示す。）である。これらは、Sigma社などの市販品を用いることができる。

化合物６ｂは、化合物５ｂのアシル基部分を通常の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、水酸化リチウムなどで処理して、脱アシル化を行うことにより得ることができる。
また、アシル部分の２位に選択的に作用するリパーゼを使用すると、化合物６ｃへと変換できる。同様に、1,3−特異的リパーゼを作用させると、化合物６ｄに変換できる。これらの反応は、緩衝液中で行うことが好ましい。

次に、ＨＯＯＣ−Ｃ_nＨ_2nＹ(７ａ)、またはこのビニールエステル、トリクロロアセチルのエステル（活性エステル）体を用い、有機溶媒（エーテル、クロロホルム、トルエン、塩化メチレン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ＤＭＦなど）中で、リパーゼを作用させると、エステル交換反応が生じ、対応する化合物８ｂ〜８ｄを得ることができる。

なお、以上の反応は、特に糖中の水酸基を保護しなくてもよい。また、必要に応じ、糖の６位を、シリル系保護基（ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基）、トリチル基のようなエーテル系保護基、４位と６位をイソプロピリデン基やベンジリデン基のようなアセタール系保護基、あるいは、レブリロイル基などで選択的に保護してもよい。

シリル系保護基は、酢酸の共存下、テトラブチルアンモニウムフルオリドで、トリチル基は、CSAやp-TsOHあるいは、接触水添により除去できる。アセタール系保護基も、酸処理で除去できる。側鎖に飽和炭化水素基を含む場合には、ベンジリデン基は、接触水添によっても脱保護が可能である。レブリロイル基は、ヒドラジン−酢酸で選択的に除去できる。これらの脱保護の条件はいずれも、グリセロール部位のアシル基に何ら影響を及ぼすことなく、除去できる。

さらに側鎖部分のＲ⁴が、二重結合などを有するときには、前記と同様にして別の置換基を導入できる。

このようにして得られる化合物は、たとえばスキーム１で示したのと同様の方法により、ＧＮ単位をシアル酸含有３糖単位に変換する。

<サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ>
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップは、前記シアル酸含有３糖化合物が金属基板表面に固定されている。

金属基板の素材としては、たとえば、好ましくは金、銀、白金、銅、パラジウムなどが挙げられ、これらのうちさらに好ましくは金または白金、特に好ましくは金が挙げられる。基板の形状は限定されず、板状、管状、球状などの形状が挙げられる。このうち板状の形状を有する基板を好ましく用いることができる。

金属基板への固定化は、好ましくは、金属表面と、チオール基（-SH）あるいはジスルフィド基（-S-S-）との直接的な共有結合や吸着により行うことができる。
したがって、この場合、シアル酸含有３糖化合物のうち、配糖体の末端に、−ＳＨまたはジスルフィド基を末端に有する化合物が好ましい。すなわち前記式（１）あるいは、前記式（６）においてＸ₃が式（７）〜（１１）で表される化合物を用いることが好ましい。

前記式（６）において、Ｘ₃が式（７）〜（１１）で表される基である場合、側鎖部位の自己組織化による相乗効果により、より高度な配向性と高密度な固定が可能となる。さらに、この自己組織化は、スフィンゴシン塩基のような天然由来の側鎖を有することが望ましい。これは、センサーチップなどの基板表面が、細胞膜の表面状態に近似した状態にあるためではないかと推測される。

基板との結合は、自己組織化単分子膜(SAM：Self-Assembled Monolayer)法などを用いて行うことができる。すなわち、チオール基あるいはジスルフィド基を有する化合物が、金などと特異的に吸着し、アルキル鎖間のvan der Waals 力によりＳＡＭを形成させる方法である。
シアル酸含有３糖化合物が−ＳＨまたはジスルフィド基を末端に有する場合、シアル酸含有３糖化合物による金属基板表面への単分子膜の構築は、特殊な装置を必要とせず、これら誘導体の溶液中に基板を浸漬するだけで容易に実施できる。浸漬条件（溶媒、濃度、温度、時間）によって構造、配向の制御も可能である。ここで用いられる溶媒は特に限定されるものではないが、固定化させる誘導体が溶解する有機溶媒であることが好ましい。

通常、金属基板表面におけるシアル酸含有３糖化合物の結合割合は、好ましくは0.1〜10個／nm²、さらに好ましくは1〜10個／nm²の範囲である。このような結合割合であると、優れた検出感度を発揮することができる。
特に、式（７）〜（１１）において、側鎖部位が前記リンカー部位よりも長くなると、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、シアル酸含有３糖化合物同士がサーズウイルスとの結合に適した配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。それにより、上記のような好ましい結合割合が達成されたものと推測される。

<サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法（１）>
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法は、下記の工程からなる。
（１）試験化合物を、前記センサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２）基板に結合したサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスを検出する工程。

前記シアル酸含有３糖化合物を金属基板に固定化したセンサーチップと、サーズウイルスまたはサーズウイルスのスパイクタンパク質との接触は通常、溶媒の存在下で行うことが好ましい。前記センサーチップを用いるサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質の検出においては、これらが変性しない溶媒を選択することが必要であり、たとえば水または緩衝液などを用いる。
溶媒のｐHは、好ましくは６〜８の範囲であり、温度は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲である。

緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）などが挙げられる。

以下に、本発明に係るセンサーチップのうち、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）による、ウイルスの検出方法の一例を示す。ＳＰＲによる検出方法では、標識物質を用いることなく試験化合物（アナライト、分析対象化合物ともいう）の変化を検出することができる。このＳＰＲの現象は、表面プラズモンが金属／液体界面で励起した場合に起こる光学現象を利用するもので、センサーチップ表面で生じる微少なプラズモン共鳴角（ＳＰＲシグナル）を検出して、たとえば、金属表面に固定化した物質と検体との間の二分子間結合および解離の変化を定量的に得ることができる。

サーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質の検出は、温度を好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲で一定に保持し、好ましくはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液で行う。

これにサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質を含む溶液をゆっくりと注入する。アフィニティー定数を求める場合には、サーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質の濃度を変化させ、２〜８回の測定をすることが望ましい。反応時間は結合・解離反応ともに３〜３０分程度が好ましいが、目的の相互作用によっては測定時間を変更する場合がある。

また、緩衝液の流速は好ましくは３〜５０μｌ/minで、検体量はnM〜mMを1回の測定につき５〜１０００μｌ程度にするのが好ましい。アフィニティー定数は２〜８点の測定濃度をとり、各濃度のセンサーグラムにおいて、平衡状態よりスキャッチャードプロットを作成してアフィニティー定数（K_dおよびK_a）を算定する。

このような、本発明のセンサーチップを用いる、表面プラズモン共鳴バイオセンサーは極微量（<0.01nM）のサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質でも、前処理あるいは標識物質を用いないで、高感度に検出できることができる。
すなわちセンサーチップとサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質との結合速度定数（K_a）および解離定数（K_D）は、前記式（１）で表されるシアル酸含有３糖化合物においてそれぞれ、高い値および小さい値を示す。

前記式（６）において、Ｘ₃が式（７）〜（１１）で表される基である場合、Ｋａはさらに高い値を示す。このような効果はスフィンゴシン塩基などの側鎖部位の自己組織化機能により、高度な配向性と高密度な固定化が行われ、複数の近接する糖鎖部位が効率よくサーズウイルスを強く結合させるためである。

<サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出試薬>
サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子
本発明に係るサーズウイルス検出用微粒子は、前記シアル酸含有３糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている微粒子である。

金属微粒子の素材としては、好ましくは金、銀、白金、銅、パラジウムなどが挙げられ、これらのうちより好ましくは金または白金、特に好ましくは金である。

このような金属微粒子は、平均粒子径が、好ましくは１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは１〜５０ｎｍの範囲にある。また、金属微粒子は、単分散な粒子径であることが好ましい。この範囲の金属微粒子を用いることで、視覚的に検出可能なシグナル色（オレンジ〜赤）が得られ、かつ溶媒中における分散安定性が良好になり、高感度で検出時間の短縮が図ることができる。

本発明で用いる金属微粒子は、公知の方法により製造することができる。たとえば、金微粒子は、Frensの方法を用いることにより、種々の大きさの微粒子を容易に製造することができる（Nature Phys. Sci.、Vol.241、P.20、1973年）。

具体的には、たとえば金微粒子の製造方法としては、塩化金の溶液を加熱沸騰させ、ついで、クエン酸ナトリウムの溶液と混合して塩化金を還元する方法により行うことができる。上記二つの溶液を混合するとすぐに沸騰溶液は薄い青色に変色して核生成が開始される。ついで、すぐに青色から赤色に変わって単一分散微粒子の生成が起こり、塩化金の還元は沸騰をさらに続けることで完了する。
得られる微粒子の粒子径は、クエン酸ナトリウム溶液の濃度を変化させることにより調整することができる。このような金微粒子は溶液中に分散して存在できることが好ましく、その状態は特に限定されないが、金微粒子が安定な分散状態で存在していることが好ましい。例えば、コロイド状態（分散コロイド状態）となることがより好ましい。

金属微粒子に、シアル酸含有３糖化合物を固定化する方法としては、抗原−抗体反応等に代表される免疫反応に係る物質の固定方法（例えばJ. Histochem. Cytochem.,Vol.30、P.691、1982年）、前記センサーチップにシアル酸含有３糖化合物を固定化した方法を応用することが可能である。すなわち、金属微粒子を分散させた溶液と該シアル酸含有３糖化合物の溶液を5分以上混合する。この時、金属微粒子に対して十分量のシアル酸含有３糖化合物が固定されれば、金属コロイドは安定に分散され、サーズウイルス検出用微粒子を得ることができる。ここで、金属微粒子表面におけるシアル酸含有３糖化合物の結合割合は、溶液中のシアル酸含有３糖化合物の濃度やその他条件（例えば、溶媒、温度、時間など）でコントロールすることができる。

通常、金属微粒子表面におけるシアル酸含有３糖化合物の結合割合は、好ましくは0.1〜10個／nm²、さらに好ましくは1〜10個／nm²の範囲である。このような結合割合であると、優れた検出感度を発揮することができる。
特に、式（７）〜（１１）の前記シアル酸含有３糖化合物においては、特定の原子数で側鎖部位、リンカー部位が構成される。この場合、特に、側鎖部位が前記リンカー部位よりも長い場合、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、シアル酸含有３糖化合物同士がサーズウイルスとの結合に適した配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。それにより、上記のような好ましい結合割合が達成されたものと推測される。

また、このようなサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子は、溶液形態で保存することが、該微粒子の保存安定性の観点から好ましい。
この場合、前記式（７）〜（１１）で表されるシアル酸含有３糖化合物が結合した微粒子は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙまたは−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙで表されるリンカー部位において、ｎが好ましくは２〜１０の整数、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５であるとおり、リンカー部位の長さが特定範囲以内にあるため、溶液中での分散安定性に極めて優れている。したがって、本発明のシアル酸含有３糖化合物が結合した微粒子を含む試薬は、特に溶液中での使用に優れる。

前記シアル酸含有３糖化合物の金属微粒子への固定化においては、シアル酸含有３糖化合物の高度な配向性と高密度な固定を目的にしていることから、必要十分量のシアル酸含有３糖化合物を混合して固定化を図ることが好ましいが、過剰量のシアル酸含有３糖化合物を混合すると、混合溶液中からの除去作業が必要となる。

たとえば、金微粒子の場合、シアル酸含有３糖化合物を固定化した金微粒子の分散溶液の分散安定性、およびサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質の添加量と色調変化の関係から、シアル酸含有３糖化合物の最適な混合量を決定することができる。
すなわち、添加した化合物が最適量以下の場合、シアル酸含有３糖化合物を自己組織化するための十分な量に達しないため、金微粒子表面の疎水性が増加して分散安定性の低下し、色調の変化および凝集−沈殿を生じる。
また、添加した化合物が最適量以上の場合、サーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質を添加した後、凝集反応が過剰に添加した化合物によって阻害され、色調変化が小さくなる。したがって、色調変化や凝集が発生せず、かつサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質を添加したときに色調変化が大きい範囲内に制御することにより、最適な固定化を行うことができる。

サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬
前記金属微粒子へのシアル酸含有３糖化合物の固定化により、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子を得ることができるが、該微粒子を含む溶液は、そのまま本発明のサーズウイルス検出用試薬として使用することができる。
このため、前記固定化に使用する溶媒は、検出対象となるサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質が変性しないことが必要であり、たとえば水または緩衝液などを用いる。
溶媒のｐHは、好ましくは６〜８の範囲であり、温度は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲である。

このようにして、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子の合成に伴って、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子を溶媒中に含有するサーズウイルス検出用試薬が得られることとなる。このようなサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬においては、溶液中に微粒子がコロイドになって存在していることが好ましく、該コロイドは分散して存在していることがより好ましい。

微粒子の金属コロイドが安定化されたかの確認は、たとえば、金コロイドの場合、混合溶液に等量の１０％塩化ナトリウム水溶液を加えて、金コロイドの色調に変化がなければ安定化されていると認定することができる。
サーズウイルス検出用試薬中のサーズウイルス検出用微粒子の濃度は、好ましくは１．０×１０⁵〜１．０×１０¹⁵個／Ｌ、さらに好ましくは１．０×１０⁷〜１．０×１０¹³個／Ｌの範囲である。
このような濃度範囲であると、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子のコロイドが分散して安定に存在し、保存安定性を向上させることができるとともに、サーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質の検出感度を向上させることができる。

<サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法（２）>
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法は下記の工程からなる。
（１）試験化合物を、前記サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬に添加して、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子に接触させる工程、
（２）サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子に結合したサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスを検出する工程。

サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子に結合したサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスの検出手段としては、たとえば、サーズウイルス検出用微粒子のコロイド溶液において、該微粒子がサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスと結合する際の色調変化から該サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスの検出を行う方法が挙げられる。
具体的には、たとえば、金微粒子の場合、サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスがサーズウイルス検出用微粒子と結合していない状態において、前記微粒子のコロイド粒子が分散した状態で溶液は赤色を示すが、サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスが結合すると前記微粒子が凝集して赤色が薄れるあるいは無色透明に変化する、または、凝集体（沈殿物）が生じる。

色調変化の計測手法としては、目視により観測し、その結果に基づいて測定対象物質の存在を簡便に半定量することができる。

また、色調変化を分光光度計により高感度検出することも可能である。その場合、色調変化を測定するための波長としては、色調変化を測定可能な波長であれば、特に限定されないが、たとえば、金微粒子の場合、金微粒子の極大吸収波長付近500〜550nm付近が測定感度を高くすることができるので望ましい。多波長による吸光度測定を行うことで、精度の高い検出が可能であることは言うまでもない。
色調変化の測定を行える装置としては、比色計、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析機等が挙げられる。

このような色調変化を計測することにより、高感度に対象化合物を検出することができる。

<サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質吸着材>
前記シアル酸含有３糖化合物は、シアル酸残基が導入された３糖部分が、サーズウイルスのスパイクタンパク質と特異的に結合するので、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の吸着材として用いることができる。
吸着材としては、不織布、織布などのシート状のもの、溶液に含有させて噴霧した噴霧状のものが挙げられる。

たとえば、生理食塩水等の水溶液中に前記シアル酸含有３糖化合物を含有する溶液を、うがい薬やエアロゾール状のスプレー液として使用すれば、感染予防効果も高く、院内感染予防試薬として用いることもできる。

また、シアル酸含有３糖化合物を含む溶液を不織布、あるいは織布などに膨潤させ、水分を乾燥させることにより、サーズウイルスを除去する吸着シートを得ることもできる。
たとえば、サーズウイルスの感染を防止するには、不織布のマスク、例えば、米国国立労働安全衛生研究所で認可したＮ９５マスク（住友３Ｍ、米国）が知られているが、息苦しいのが難点である。そこで、シアル酸含有３糖化合物を通常のマスクなどに吸着させることにより、息苦しさを感じず、サーズウイルスをトラップすることもできる。また、エアコン用フィルター、空気清浄機のフィルターなどに、シアル酸含有３糖化合物を吸着させることにより、サーズウイルスの除去も可能である。

以下に、本発明の実施例を挙げ、具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
なお、下記の実施例においては、サーズスパイク蛋白質は、Protein Sciences Corporation社 (Connecticut, Meriden)より購入した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置、および、センサーチップは、BIAcore 3000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)を使用した。¹H-NMRは、JEOL LA-600 spectrometerを用いて重水中で測定した。酵素は、Sigma社、または、Glycoscience社のものを使用した。
〔実施例１〕
工程１

（１）化合物１ａの合成
加水分解酵素としてBacillus circulans由来のβ-galactosidase (Sigma社)を用いた。通常、加水分解酵素β-galactosidaseには、夾雑酵素としてβ-N-acetylhexosaminidase (以下、NAHaseという)が含まれており、この夾雑酵素が基質のアクセプターであるｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、GlcNAcβ-pNPという）を加水分解する可能性があるので、あらかじめ精製して夾雑酵素を除く必要がある。Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences社）を用い、NAHase活性を除去した。

次に、GlcNAcβ-pNP (1.0 g) および lactose (4.0 g)を、５０％のアセトニトリルを含むsodium phosphate buffer (20 mM, pH6.8) 35 mLに溶解させ、上記の精製したβ-galactosidase (3.2 U)を加えた。３０℃で反応させ、Amide-80 column（東ソー製）を用いて、HPLCによってモニタリングした。
化合物１ａが最大となる２４時間後に反応を止め、ODS−C18（メルク製）、 Toyopearl HW-40S（東ソー製）、およびBioGel P2（バイオラッド製）により精製し、化合物１ａを265 mg得た。
このシンプルで簡便な方法により、β-galactosidaseを使用して、化合物１ａを大量に合成することができた。

化合物１a: ¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ 8.205 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.149 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.303 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1), 4.476 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H’-1), and 1.987 (s, 3H, NHAc).

（２）化合物２ａの合成
化合物１ａのシアル化は、組み換えラット由来α2,3-(N)-sialyltransferaseを用いて行い、シアリールラクトサミン３糖の化合物２ａを合成した。
化合物１ａ (10 mg, 15.8 μmol)、CMP-Neu5Ac (10.5 mg, 16.0 μmol)、BSA (1.2 mg/mL)および20 mM MnCl₂を含有する40 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) 緩衝液 (pH 6.3, 0.8 mL)、25 U alkaline phosphatase および α2,3-sialyltransferase (20 mU)（組み換えラット由来）を３０℃でインキュベートした。

この反応をＨＰＬＣでモニターした。４８時間のインキュベーションの後、ＨＰＬＣ解析により、大部分の化合物１ａがシアル化されたことを確認した。
この反応混合液をODS (１５％acetonitrile（０．１％TFA as eluentを含有) および BioGel P2 カラムのクロマトグラフィーで精製し、シアリールラクトサミン３糖の化合物２ａを、ドナーを基にして９１％(14.5 mg)で得た。

化合物２ａ: ¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ 8.183 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.141 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.310 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1), 4.568 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H’-1), 2.730 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H, H-3_e"), 2.010, 1.990 (2s, 6H, 2 NHAc), and 1.782 (t, J = 12.0 Hz, 1H, H-3_a"); ¹³C NMR δ 77.120 (C-3); [α]_D = - 46.7 (1.20, water).

工程２

（３）化合物５ａの合成：
化合物２ａを水素の存在下で還元し、p-aminophenyl誘導体４ａへと変換した。
次に、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methlmorpholinium chloride (DMT-MM, 2.9 mg)を、リポ酸(1.9 mg)および還元体４ａ(8 mg)のエタノール溶液に加えた。２４時間、室温下で撹拌し、エタノールを減圧濃縮して除いた。残さをODSカラムで精製して化合物５ａを7.4 mg得た。

化合物４ａ: ¹H NMR δ 6.925 (d, J = 8.4 Hz, 2H, o-Ph), 6.825 (d, J = 8.4 Hz, 2H, m-Ph), 4.991 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.539 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H’-1), 2.719 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H, H-3_e"), 2.010, 2.001 (2s, 6H, 2 NHAc), and 1.771 (t, J = 12.0 Hz, 1H, H-3_a").
化合物５ａ: ¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ 7.317 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.038 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.116 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.586 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H’-1), 2.723 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H, H-3_e"), 1.999, 1.983 (2s, 6H, NHAc), and 1.772 (t, J = 12.0 Hz, 1H, H-3_a").

〔実施例２〕
工程３

（１）化合物３ａの調製：
酵素にrat liver α2,6-sialyltransferaseを用い、化合物２ａの合成と同様の方法で、化合物３ａを化合物１ａ(10 mg)から高収率(15.0 mg, 93% ドナーを基に計算)で得た。
化合物２ａおよび３ａの合成の両方において、ドナーのCMP-Neu5Acをアクセプターに対して当モル比で使用しているものの、化合物１ａは効率よくシアル化された。ドナーのCMP-Neu5Acは高価であるが、本発明においては、ドナー／アクセプター当モル量を用いることにより、高い収率が得られている。従って、本法は、魅力的で実用的な方法である。

化合物３ａ: ¹H NMR δ 8.232 (d, J = 9.6 Hz, 2H, o-Ph), 7.176 (d, J = 9.6 Hz, 2H, m-Ph), 5.351 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.465 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H’-1), 2.668 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H, H-3_e"), 2.010, 1.998 (2s, 6H, 2 NHAc), and 1.723 (t, J = 12.0 Hz, 1H, H-3_a"); ¹³C NMRδ65.086 (C-6); [α]_D = - 132.7 (0.43, water)

（１）シアリールコンジュゲート７ａの合成
化合物３ａを水素の存在下で還元して、p-aminophenyl 誘導体６ａへと変換した。次に、エタノール1.0 mL中のDMT-MM (2.3 mg) を、リポ酸 (1.5 mg) および化合物６ａ (6 mg) のエタノール溶液に室温で加えた。室温で２４時間撹拌後、エタノールを減圧濃縮して除去した。残さをＯＤＳカラムで精製して、化合物７ａ (5.2 mg)を得た。

化合物６ａ: ¹H NMRδ6.979 (d, J = 8.4 Hz, 2H, o-Ph), 6.908 (d, J = 8.4 Hz, 2H, m-Ph), 5.064 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-1), 4.437 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H’-1), 2.639 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H, H-3_e"), 2.025, 1.992 (2s, 6H, 2 NHAc), and 1.698 (t, J = 12.0 Hz, 1H, H-3_a").
化合物７ａ: ¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ7.320 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.047 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.155 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.444 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H’-1), 2.644 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, 1H, H-3_e"), 2.019, 1.991 (2s, 6H, NHAc), and 1.747 (t, J = 12.0 Hz, 1H, H-3_a").

〔実施例３〕
シアル酸含有３糖化合物が結合したセンサーチップ１の調製
（１）表面に化合物５ａを結合したセンサーチップ１の調製
シアリルコンジュゲートの固定化のための金表面として、SIA kit Au (BIAcore製)を用いた。オゾンクリーナーで洗浄したSIA kit Auプレートを、化合物５ａを含むメタノール溶液(2 mL, 60 μM)に浸した。室温下で、２４時間放置後、その金プレートを反応溶液から取り出し、メタノールおよび水で洗浄し、窒素気流下で乾燥させ、センサーチップ１を得た。

（２）表面に化合物７ａを結合したセンサーチップの調整
表面に化合物５ａを結合したセンサーチップと同様の方法により、表面に化合物７ａを結合したセンサーチップ２を得た。

〔実施例４〕
サーズスパイク蛋白質と、化合物５ａ、化合物７ａがそれぞれ表面に結合したセンサーチップ１、２との相互作用解析
1μｇ／ｍＬの濃度のＳＡＲＳスパイク蛋白質溶液を、化合物５ａ、または、化合物７ａを表面に結合したセンサーチップ１または２を装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物５ａが結合したセンサーチップ１、化合物７ａが結合したセンサーチップ２のそれぞれの表面で、ＳＡＲＳスパイク蛋白質が結合していることがわかった。
センサーチップ１の試験結果を図１、センサーチップ２の試験結果を図２に示す。

〔比較例１〕

市販のp-nitrophenyl α-D-glucopyranoside（化合物９）（250mg）を水に溶解し、パラジウムブラック（10mg）を加え、１気圧、常温下で水素の存在下、還元を行った。セライトろ過して、触媒を除き、減圧濃縮して、化合物１０を225mg（99%）得た。続いて、化合物１０（225mg、0.83mmol）およびsuccinimidyl 1,2-dithiolane-3-pentanoate（300 mg、0.99mmol）を乾燥ＤＭＦ5mlに溶解し、25℃で48時間反応させた。そして、化合物１１を得た（200mg、59％）。

化合物１１の¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) ：δ7.45 (d, aromatics, J = 9.0 Hz), 7.119 (d, aromatics, J = 9.0 Hz), 5.416 (d, H-1, J = 3.6 Hz), 3.829 (t, H-3, J = 9.4 Hz), 3.542 (dd, H-2, J=3.6 and 9.6 Hz), 3.404 (t, H-4, J=9.2Hz), 3.21-3.05 (m, dithiolane of lipoic acid, 2H), 2.50-2.41 (m, dithiolane of lipoic acid, 1H), 2.353 (t, -CH₂-CONH-, J=7.4Hz), 1.94-1.84 (m, dithiolane of lipoic acid, 1H), 1.80-1.62 (m, -CH₂-, 4H) and 1.56-1.45 (m, -CH₂-, 2H).

〔比較例２〕
化合物１１が結合したセンサーチップ３の調製
実施例３で示した方法と同様にして、表面に比較例１で製造した化合物１１を結合したセンサーチップ３を得た。

〔比較例３〕
比較例２のセンサーチップ３に対して、SARSスパイクタンパク質をインジェクトしたときのＳＰＲを図３に示す。図１、２には、シアル酸含有３糖化合物５ａおよび７ａがそれぞれ結合したセンサーチップ１およびセンサーチップ２に対する、SARSスパイクタンパク質のＳＰＲ結果が示されているが、図３に示すように、化合物１１が結合したセンサーチップ３では、SARSスパイクタンパク質は全く結合しなかった。このことは、SARSスパイクタンパク質が、化合物５ａまたは７ａがそれぞれ結合したセンサーチップ１およびセンサーチップ２に、特異的に結合していることを示している。

本発明に係るシアル酸含有３糖化合物を基板あるいは微粒子表面に固定化した、センサーチップまたは金属微粒子含有試薬は、極微量のサーズウイルスあるいはそのスパイクタンパク質を高感度かつ迅速に検出できる。

前記センサーチップは、標識物質を用いることなくリガンドの変化を高感度に検出することのできる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）あるいは水晶振動子（Quartz Crystal Microbalance: QCM）に適用することにより、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の微量検出が可能である。

また、前記金属微粒子によるコロイド検出方法、たとえば金微粒子による金コロイド凝集法は、迅速で簡便に行えるサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質のセンシング方法である。

前記シアル酸含有３糖化合物を含む吸着材は、マスク、フィルターなどの吸着シートとして用いることができるほか、吸着材を含む溶液をスプレーとして使用することでサーズウイルスの感染予防にも有効である。

図１は化合物５ａを固定化したセンサーチップ１の表面とサーズウイルスのスパイクタンパク質との相互作用のSPRセンサーグラムである。図２は化合物７ａを固定化したセンサーチップ２の表面とサーズウイルスのスパイクタンパク質との相互作用のSPRセンサーグラムである。図３は化合物１１を固定化したセンサーチップ３の表面とサーズウイルスのスパイクタンパク質との相互作用のSPRセンサーグラムである。

Claims

下記一般式（１）：

〔式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示し；
Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方は下記式（２）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_１およびＸ_２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示す。〕で表される、シアル酸含有３糖化合物。
前記Ｒ_２が前記式（２）で表されるシアル酸残基であり、前記Ｒ_３がＨである、請求項１に記載のシアル酸含有３糖化合物。
前記Ｒ_２がＨであり、前記Ｒ_３が前記式（２）で表されるシアル酸残基である、請求項１に記載のシアル酸含有３糖化合物。
前記Ｘ_１が芳香族置換基であり、Ｘ_２が直鎖もしくは分岐した炭素原子数２〜２０のアルキル基である、請求項１〜３のいずれかに記載のシアル酸含有３糖化合物。
前記Ｘ_１が、下記式（３）

で表される２価の基である、請求項４に記載のシアル酸含有３糖化合物。
前記Ｘ_２が、-C_nH_2n- (n = 2-6)である、請求項４または５に記載のシアル酸含有３糖化合物。
Ｙが、ジスルフィド基である、請求項１〜６のいずれかに記載のシアル酸含有３糖化合物。
下記式（４）

〔式中、Ｒ_１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩を示す〕で表される、請求項１に記載のシアル酸含有３糖化合物。
下記式（５）

〔式中、Ｒ_１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩を示す〕で表される、請求項１に記載のシアル酸含有３糖化合物。
下記一般式（６）

〔式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示し；
Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方は下記式（２）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表されるシアル酸含有３糖化合物が、金属基板表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ。
下記一般式（６）

〔式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示し；
Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方は下記式（２）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表されるシアル酸含有３糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子。
請求項１１に記載の前記微粒子が、溶液中にコロイドで存在している、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬。
下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１）試験体を、請求項１０に記載のセンサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２）基板に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１）試験体を、請求項１２に記載の試薬に添加して、請求項１１に記載の前記微粒子と接触させる工程、
（２）前記微粒子に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
下記一般式（６）

〔式中、Ｒ_１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ_３を示し；
Ｒ_２およびＲ_３のいずれか一方は下記式（２）

で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）であり、Ｒ_２およびＲ_３の残りの一方はＨを示し；
Ｘ_３は、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ_２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ_６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ_1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ_2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ_2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ₂Ｙ（式中、Ｘ₂は、直鎖もしくは分岐した−Ｃ_nＨ_2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ_nＨ_2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ_１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ_１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表されるシアル酸含有３糖化合物を含有する、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質吸着材。