JP2006292627A - オリゴ糖の同定方法、オリゴ糖の配列分析方法 - Google Patents
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Abstract
また、本発明の別の目的は、N−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖において、糖修飾基に関する情報が得られるオリゴ糖の配列分析方法を提供することである。
【解決手段】 本発明に係る同定方法は、N−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖の質量分析のn乗スペクトル(nは2以上の整数)を用いて被検オリゴ糖の同定を行う。また、本発明に係る配列分析方法は、N−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖の質量分析のn乗スペクトル(nは2以上の整数)を用いて前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得る。
【選択図】 なし
Description
核磁気共鳴(NMR)スペクトル測定による識別同定も可能であるが、試料を比較的多量に必要とするという問題がある。
また、本発明の別の目的は、N−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖において、糖修飾基に関する情報が得られるオリゴ糖の配列分析方法を提供することである。
なお、本発明のように交互配列型化合物を対象とし、フラグメンテーションの規則性によって得られるスペクトルを予測し、それと照らしながらオリゴ糖の同定および配列解析が可能であることを報告した例はこれまでにはない。
1. N−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖をESI法又はMALDI法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを1回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のn乗スペクトル(nは2以上の整数)を得て、前記n乗スペクトルから被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とするオリゴ糖の同定方法。
2. 前記n乗スペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のn乗スペクトルとを比較することにより、被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とする上記1に記載のオリゴ糖の同定方法。
3. 前記被検オリゴ糖が、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも1種以上を含むことを特徴とする上記1又は2に記載のオリゴ糖の同定方法。
4. 前記被検オリゴ糖が、N−アセチルヘパロサンに由来するオリゴ糖であることを同定することを特徴とする上記1〜3のいずれかに記載のオリゴ糖の同定方法。
5. N−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖をMALDI法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを1回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のn乗スペクトル(nは2以上の整数)を得て、
前記n乗スペクトルから前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得ることを特徴とするオリゴ糖の配列分析方法。
6. 前記修飾基情報が、少なくともオリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造のいずれかを含むことを特徴とする上記5に記載のオリゴ糖の配列分析方法。
また、本発明によれば、N−アセチルへパロサン全長の構造を推定することも可能となり、例えば、生体内酵素或いは化学的手法等により構造修飾を施されたN−アセチルへパロサンの構造解析等に有用である。
(同定方法)
まず、本発明に係る第1の方法は、N−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖のMSnスペクトルから、被検オリゴ糖がどのようなグリコサミノグリカンに由来するオリゴ糖であるかを同定する方法である。
本発明の同定方法に係る被検オリゴ糖としては、N−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有するものであればよく、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも1種以上を含むことが好ましい。
MSnスペクトルは少なくともMS2スペクトルまで求めることが好ましい。
また、本発明に係る第2の方法は、N−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖においてMSnスペクトルを測定することにより、当該被検オリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造等の修飾基情報を得て、当該オリゴ糖の配列を分析する方法である。
これら各々のシグナルを構造式上に帰属すると、図11及び図12に示すように、種々の位置のグリコシド結合が切断されたフラグメントイオンが万遍なく生じていることが判明した。(図11は偶数糖について、図12は奇数糖について示している。)
A:5糖以上の奇数糖および6糖以上の偶数糖のMS2スペクトルには必ず、4糖フラグメント以上の、構造上可能なすべての偶数糖フラグメントシグナルが観測される。それらのm/z値は、757+n×379(nは0以上の整数)近傍である。
B:5糖以上の奇数糖および4糖以上の偶数糖のMS2スペクトルには必ず、3糖フラグメント以上の、構造上可能なすべての奇数糖フラグメントシグナルが観測される。それらのm/z値は、599+m×379(mは0以上の整数)近傍である。
また、一般にN−アセチルヘパロサンの修飾基としては、硫酸基、メチル基、アセチル基、エチル基、ベンジル基、リン酸基等が挙げられる。また、水酸基の酸化、還元や、ウロン酸のエステル化等の修飾も決定可能である。さらに、本発明の方法によれば、修飾基の位置のみならず、修飾基の質量からN−アセチルヘパロサンに結合している修飾基の構造も特定することが可能である。
[実施例1]
(不飽和2糖のMS2分析による同定)
(1)N−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖の調製
特開2004−18840号公報の実施例1に記載の方法と同様にして大腸菌K5菌株を培養し、N−アセチルヘパロサン画分を得て、さらに、同公報の実施例2に記載の方法と同様にしてこのN−アセチルヘパロサン画分を精製した。
精製したN−アセチルヘパロサン画分(100mg)を濃度が10mg/mlになるように、5mM酢酸カルシウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。
その後、沸騰水浴中で反応を停止させた後、沈殿物を遠心分離(8,000rpm、20分)によって除去し、上清液を凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を131.25mg得た(塩類を含む)。
分解酵素として放線菌由来ヒアルロニダーゼを用い、ヒアルロナンを分解することで、ヒアルロナン由来の2糖のオリゴ糖を調製した。
また、分解酵素としてProteus vulgaris由来コンドロイチナーゼABCを用い、コンドロイチンを分解することで、コンドロイチン由来の2糖のオリゴ糖を調製した。
ESI-IT-MS(Esquire 3000 plus,ブルカー・ダルトニクス社製)およびMALDI-TOF-MS(Ultraflex,ブルカー・ダルトニクス社製)を用い、それぞれの方法にてMS2スペクトルを測定した。なお、MS2スペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法は、ESI-IT-MSにおいてはCID法、MALDI-TOF-MSにおいてはPSD法を用いた。測定用マトリックスとしてはDHB (2,5- dihydroxybenzoic acid)を用いた。
この結果をそれぞれ図1及び2に示す。なお、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和2糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
図1及び図2に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、N−アセチルヘパロサン由来2糖のMS2スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、他の不飽和2糖との判別が可能であることがわかった。
(不飽和4糖のMS2分析による同定)
(1)オリゴ糖の調製
上記実施例1と同様の方法により、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチン由来の4糖のオリゴ糖を調製した。
(2)質量分析
上記実施例1と同様にして、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSを用い、それぞれの方法にてMS2スペクトルを測定した。なお、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和4糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
この結果をそれぞれ図3及び4に示す。図3及び4に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、MS2スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、不飽和4糖がいずれの構造かを判別することが可能であることがわかった。
(不飽和6糖のMS2分析による同定)
(1)オリゴ糖の調製
上記実施例1と同様の方法により、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチン由来の6糖のオリゴ糖を調製した。
(2)質量分析
上記実施例1と同様にして、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSを用い、それぞれの方法にてMS2スペクトルを測定した。なお、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和6糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
この結果をそれぞれ図5及び6に示す。図5及び6に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、N−アセチルヘパロサン由来6糖のMS2スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、他の不飽和6糖との判別が可能であることがわかった。
また、ヒアルロナンの不飽和偶数オリゴ糖に関してMALDI-TOF-MSを用いてMS2スペクトルを測定すると、必ずm/z=175(不飽和ウロン酸)と、m/z=[M-203](Mは前駆イオンのm/z値、203は還元末端のN-アセチルヘキソサミンの質量221からグリコシド生成による脱水値18を除した値)の二本のシグナルが強く観測されることもわかった。
(N−アセチルヘパロサンの配列決定)
(1)N−アセチルヘパロサンオリゴ糖のMS1およびMS2スペクトルの測定
上記実施例1の(1)に記載の方法と同様にして、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した、N-アセチルヘパロサンのオリゴ糖画分(2〜20糖の不飽和偶数糖および3〜21糖の奇数糖)を得た。
各オリゴ糖画分について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)装置を用いて、MS1およびMS2スペクトルを測定した。
なお、質量分析装置としては、ブルカー・ダルトニクス社製のUltraflexを使用し、測定用マトリックスとしてはDHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)を用いた。MS2スペクトルは各々のオリゴ糖のMS1スペクトル測定で得られた分子量関連イオンを前駆イオンとし、PSD(ポストソース分解)法により測定した。
この結果を図7〜10に示す。図7は不飽和偶数オリゴ糖のMS1スペクトル、図8は不飽和偶数オリゴ糖のMS2スペクトル、図9は奇数オリゴ糖のMS1スペクトル、図10は奇数オリゴ糖のMS2スペクトルを示している。
図7〜10に示すように、不飽和偶数糖、奇数糖とも、MS2スペクトルにおいて規則性の高いシグナルが得られた。
Claims (6)
- N−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖をESI法又はMALDI法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを1回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のn乗スペクトル(nは2以上の整数)を得て、前記n乗スペクトルから被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とするオリゴ糖の同定方法。
- 前記n乗スペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のn乗スペクトルとを比較することにより、被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とする請求項1に記載のオリゴ糖の同定方法。
- 前記被検オリゴ糖が、N−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも1種以上を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のオリゴ糖の同定方法。
- 前記被検オリゴ糖が、N−アセチルヘパロサンに由来するオリゴ糖であることを同定することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のオリゴ糖の同定方法。
- N−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖をMALDI法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを1回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のn乗スペクトル(nは2以上の整数)を得て、
前記n乗スペクトルから前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得ることを特徴とするオリゴ糖の配列分析方法。 - 前記修飾基情報が、少なくともオリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造のいずれかを含むことを特徴とする請求項5に記載のオリゴ糖の配列分析方法。
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