JP2009264966A - 糖鎖配列の同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CHオリゴ糖、CSAオリゴ糖及びCSCオリゴ糖について、各々のMS2スペクトルにおいて出現するフラグメントイオンのm/z値の規則性を見出し数式化する。さらに、前記数式に当てはめて予測した、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したCH又はCSのフラグメントイオンのm/z値と、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なCH又はCSのMS2スペクトルのm/z値の実測値が実質的に一致したときに、前記任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置が、前記不明であったCH又はCSの糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する。
【選択図】図3
Description
CH:コンドロイチン
CS:コンドロイチン硫酸
GAG:グリコサミノグリカン
GAG創薬:GAGを基点とした糖鎖創薬
MS:質量分析
MSn:多段階質量分析
MS2:2段階質量分析
Hep:ヘパリン
HS:ヘパラン硫酸
GalNAc:N−アセチルガラクトサミン
GlcA:グルクロン酸
CSA:コンドロイチン硫酸A(GalNAcのC−4位の水酸基が硫酸化されたもの(GalNAc4S))
CSC:コンドロイチン硫酸C(GalNAcのC−6位の水酸基が硫酸化されたもの(GalNAc6S))
ESI−IT:エレクトロスプレーイオン化−イオントラップ型
CID:衝突誘起解離
遍性の高い手法は開発されていないと言ってよい。これまでに、Hep/HSオリゴ糖の分子構造をMSnによって解析するアルゴリズムが発表されているが(非特許文献7)、本法を用いてもウロン酸エピマーに関する構造情報は得ることができない。また、非特許文献8においてはケラタン硫酸の配列解析法が紹介されているが、ウロン酸を有するGAGには適用できない方法論である。
Trends in Glycoscience and Glycotechnology 18,293−312,2006 Medical Science Digest 33,964−965,2007 Journal of American Society of Mass Spectrometry 11,916−920,2000 Analytical Chemistry 73,3513−3520,2001 Journal of American Society of Mass Spectrometry 15,1274−1286,2004 Journal of American Society of Mass Spectrometry 18,234−244,2007 Analytical Chemistry 77,5902−5911,2004 Analytical Chemistry 78,891−900,2006 Advances in Pharmacology 53,33−48,2006 Advances in Pharmacology 53,282−295,2006 Advances in Pharmacology 53,523−539,2006 Analytical Chemistry 73,6030−6039,2001 Journal of American Society of Mass Spectrometry 14,1270−1281,2003 Electrophoresis 25,2010−2016,2004
(1)少なくとも以下の工程を含む、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付した際に生じるフラグメントイオンのMS2スペクトルにおけるm/z値を予測する方法:
(I)MS2スペクトルにおけるm/z値の予測対象となる2糖単位からなるコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を設定する工程;
(II)前記(I)のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付した際に切断されるグリコシド結合が属する2糖単位を選択する工程;
(III)前記(I)のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸について、下記の(i)〜(iv)の各数値を求める工程;及び
(i)N:2糖単位の数、
(ii)u:還元末端から順に2糖単位を1単位として番号を付した場合における、前記(II)で選択した2糖単位の番号、
(iii)s:前記(II)において選択した2糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの硫酸基の数、
(iv)a:前記(II)において選択した2糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの価数、
(IV)前記(III)の工程により求めた各数値を、以下の(A)〜(C)のいずれかに従って下記(イ)〜(ニ)の式に当てはめて、前記(II)で選択した2糖単位に属するグリコシド結合の切断によって生じ得るB、C、Y及びZ−タイプから選ばれるフラグメントイオンのMS2スペクトルにおけるm/z値を求める工程;
(A)前記(II)で選択したグリコシド結合が属する2糖単位を構成するN−アセチルガラクトサミンが硫酸基を有さない場合には下記の(ロ)及び(ニ)の式、
(B)前記N−アセチルガラクトサミンのC−4位に硫酸基を有している場合には下記の(イ)及び(ハ)の式、又は
(C)前記N−アセチルガラクトサミンのC−6位のみに硫酸基を有している場合には下記の(イ)〜(ニ)の全ての式、
(イ)B2(N-u)+1イオン(m/z)={[379(N−u)+176]+80s−a}/a、
(ロ)C2(N-u)+1イオン(m/z)={[379(N−u)+176]+18+80s−a}/a、
(ハ)Y2u-1イオン(m/z)={[379(u−1)+203]+18+80s−a}/a、
(ニ)Z2u-1イオン(m/z)={[379(u−1)+203]+80s−a}/a、
(2)少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法;
(V)分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付して、得られたMS2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのm/z値を取得する工程、
(VI)(1)に記載の方法で、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付した際に2糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについて、MS2スペクトルにおけるm/z値の予測値を取得する工程、
(VII)前記(V)の工程により取得した全てのm/z値と、前記(VI)の工程により取得した全てのm/z値の予測値とを比較し、両者が実質的に一致したときに、前記分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置が、前記(VI)の工程で設定した糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する工程、
(3)前記(V)の工程により取得した全てのm/z値と、前記(VI)の工程により取得した全てのm/z値の予測値とが実質的に一致するまで前記(VI)及び(VII)の工程を繰り返す工程をさらに含む、(2)に記載の同定方法、
(4)少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法;
(VIII)(1)に記載の方法で、異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、2糖単位からなる複数のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の各々について、MS2に付した際に2糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについてMS2スペクトルにおけるm/z値の予測値を取得し、前記糖鎖長及び硫酸基位置と、前記m/z値の予測値との対応についてデータベースを作成する工程、
(IX)分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付して、得られたMS2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのm/z値を取得する工程、
(X)前記(IX)の工程により取得した全てのm/z値を、前記(VIII)の工程で作成したデータベース上のm/z値と照合し、前記(IX)の工程により取得した全てのm/z値と実質的に一致するm/z値の予測値を有するコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を見出す工程、
(5)前記コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸は、それぞれコンドロイチンオリゴ糖又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖である(1)〜(4)のいずれかに記載の方法、
を提供するものである。
も可能になる。
メントイオンについてのm/z値の予測値が含まれることの他、前記実測値の中に前記予測値の一部のみが含まれる場合をも意味する。ここで、CH又はCSをMS2に付した際には、2糖単位中のグリコシド結合以外の部分が切断されて生じたフラグメントイオンも含まれるので、前記実測値の数が前記予測値の数より少なくなることはない。
また、任意の2糖単位をU=uと表現する。
lNAc側で生じた場合には、その切断により生じる非還元末端側及び還元末端側のフラグメントイオンをそれぞれC−タイプイオン及びZ−タイプイオンと呼ぶ。
3)Y2u-1イオン(m/z)={[379(u−1)+203]+18+80s−a}/a
4)Z2u-1イオン(m/z)={[379(u−1)+203]+80s−a}/a
N: 被検糖鎖の2糖単位数
U: 着目する切断グリコシド結合の属する、還元末端からの2糖単位の番号
379: 硫酸基を持たない2糖単位の質量
176: 硫酸基を持たないGlcA残基の質量
203: 硫酸基を持たないGalNAc残基の質量
80: 硫酸基1個あたりの質量
18: グリコシド結合の酸素の質量
s: グリコシド結合が切断されて生じたイオンに含まれる硫酸基数(多くの場合、MS2スペクトルより判読可能)
a: グリコシド結合が切断されて生じたイオンの価数(多くの場合、MS2スペクトルにおける同位体組成より判読可能)
すなわち、グリコシド結合が切断される2糖単位中に存在するGalNAc残基に硫酸基が存在しない場合には、C2(N-u)+1イオン及びZ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じ、グリコシド結合が切断される2糖単位中に存在するGalNAc残基のC−4位に硫酸基が存在する場合には、B2(N-u)+1イオン及びY2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じ、グリコシド結合が切断される2糖単位中に存在するGalNAc残基のC−6位に硫酸基が存在する場合には、B2(N-u)+1イオン及びY2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断と、C2(N-u)+1イオン及びZ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じる。
B2(N-u)+1イオン(m/z)={[379(N−u)+176]+80s−a}/a
の値のみ算出することができる。
B2(2-1)+1(=3)イオン(m/z)={[379(2−1)+176]+80×1−1}/1
=634、及び
C2(2-1)+1(=3)イオン(m/z)={[379(2−1)+176]+18+80×1−1}/1
=652
となり、どちらのイオンもMS2スペクトル上に観測されていることから、重ねて還元末端GalNAcのC−6位が硫酸化されていることを確認し得る。
ンのm/z値を予測すると以下のようになる。
Y2×2-1(=3)イオン(m/z)={[379(2−1)+203]+18+80×1−1}/1
=679、及び
Z2×2-1(=3)イオン(m/z)={[379(2−1)+203]+80×1−1}/1=661。
B1(m/z)=175
C1(m/z)=193
のそれぞれに相当するイオンについてはMS2スペクトル上に確認することができたため、当該グリコシド結合に関与するGalNAcのC−6位が硫酸化されていることが強く示唆される。
GlcA−GalNAc6S−GlcA−GalNAc6S
の配列であると確定することができる。
MS 2 におけるCHの断片化規則の解析
硫酸基を持たないCHオリゴ糖を、そのMSnによる断片化(フラグメンテーション)の規則性を調べるために分析した。
全てのCHオリゴ糖は愛知医科大学分子医科学研究所から入手した。簡単な手順は以下のとおりである。CHの飽和4糖及び6糖(CH4及びCH6)はJ.Biol Chem. 277,21567−21575(2002)及びAnal. Biochem. 365,62−73(2007)に記載の方法をわずかに改良して調製した。すなわち、CH(生化学工業株式会社製)を精巣ヒアルロニダーゼ(タイプ−5、シグマ社製)により消化し、生じたオリゴ糖を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで分離した後、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。非還元末端にGalNAcを有するCH3及びCH5は、CH4及びCH6をβグルクロニダーゼ(牛肝臓由来、タイプB−1、シグマ社製)で処理することによって得た。CH6より長いオリゴ糖は、CH6を最初の
グリコシル化アクセプターとして使用し、CHポリメラーゼにより酵素的に合成した。
負イオンモードESI−IT MSは、Esquire 3000 Plus(Bruker Daltonik GmbH社製) を使用した。オリゴ糖を2.5mMの酢酸アンモニウムを含む50%メタノール(pH6.0)に溶解し、シリンジポンプを用いて360μL/時間の流速で装置に直接注入した。−3.8kVのキャピラリー電圧、−500Vのエンド−プレートオフセット、4.0L/分の乾燥窒素ガス流量、300℃の乾燥温度にそれぞれセットして操作した。CID法によるMSnデータは、フラグメンテーションエネルギーを1.0Vに調整して取得した。スキャン分子量範囲は、m/z 50〜1000又は1500に設定し、スキャン解像度は5500Da/sに設定した。
5,397−409,1988に従って実施した)
3糖(CH3)〜8糖(CH8)のCHオリゴ糖について負イオンESI質量スペクトルを得た(表1)。CH4〜CH8では2重の脱プロトン化分子である[M−2H]2-が顕著に出現した一方で、CH3では[M−H]-が顕著に出現した。その後、それらの断片化特性を調べるためにCID MSn実験を行った。
B):CH6)。ほぼ全ての観察されたプロダクトイオン(フラグメントイオン)はグリコシド切断に由来するものであり、共通の断片化規則を見出した。すなわち、飽和CHオリゴ糖は全てのCIDプロセス1回ごとに単糖の残基を消失し、C−タイプイオンを生じた。
主にC−タイプイオンを産生するこれらの断片化について、3つのメカニズムが提唱できる(図8)。GalNAc残基の脱離は、チャージ・インデュースト・フラグメンテーションによって起こり得る(図8(A)、(C))。一方、GlcA残基の脱離についても同様に、オキシラン環を形成するメカニズムが考えられる(図8(B))。
MS 2 におけるCSの断片化規則の解析
配列が均一な2糖、4糖及び6糖のCSA及びCSCオリゴ糖をMSnによって分析した。硫酸化された部位に特有のフラグメンテーションの特徴がMS2スペクトルに観察された。断片化結果に基づいて、予想される開裂メカニズムについても考察する。
(1)CSオリゴ糖の調製
全てのCSオリゴ糖は生化学工業株式会社において調製した(図9)。2糖、4糖及び6糖の均一な配列のCSAオリゴ糖(CSA2、CSA4及びCSA6)はチョウザメの脊索から単離されたCSA(生化学工業株式会社製)から調製した。このCSAはC−4が硫酸化されたGalNAcを有する2糖単位がクジラ軟骨から単離されたそれよりもかなり豊富である。このCSAを精巣ヒアルロニダーゼ(タイプV, 購入先:シグマ社)で消化し、これにより生成したオリゴ糖を、硫酸化部位の異なる異性的オリゴ糖を分離できるNH2修飾シリカカラム(YMC−Pack NH2, YMC社製)に接続された陰イオン交換HPLCによって繰り返し分離し、その後サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。こうして得られたオリゴ糖の構造を1H−NMR測定及び酵素消化分析の両方によって分析し、C−4部位が硫酸化されたGalNAcのみを有することを確認した。
負イオンモードESI−IT MSは、Esquire 3000 Plus(Bruker Daltonik GmbH社製)を使用した。オリゴ糖サンプルは2.5mM酢酸アンモニウムを含むメタノール(スペクトロフォトメトリックグレード、販売元:アルドリッチケミカル)に溶解し、20μL/hの流速でナノスプレー装置(PicoTipTM Emitter、New Objective社製)を用いて装置に注入した。−2.5kVのキャピラリー電圧、−500Vのエンドプレートオフセット、5.0L/分の乾燥窒素ガス流量、300℃の乾燥温度にセットし操作した。CID−MS2データはフラグメンテーションエネルギーを1.0Vに調整して取得した。スキャン質量範囲はm/z 50〜1500であり、スキャン解像度は5500m/z/sとした。
1)均一な配列のCSAオリゴ糖
チョウザメの脊索由来のCSAはGlcA−GalNAc4S配列を高含有(>90%)するものであるため、その単純反復配列(均一な配列)のオリゴ糖の調製に適している。このCSAから得られたオリゴ糖、すなわちCSA2、CSA4及びCSA6をMSnにかけた。
同様に、均一な配列のCSCオリゴ糖を分析した。それらのMS2スペクトルを図11に示すが、均一な配列のCSAオリゴ糖の場合とは対照的に、非常に複雑な特徴を示した。CSAオリゴ糖で観察されたプロダクトイオンの全てはCSCオリゴ糖断片においてもまた観察され、特にB−タイプ及びY−タイプイオンが共通している点は注目に値する(図10)。加えて、同一のグリコシド結合において、C−タイプ及びZ−タイプイオンがB−タイプ及びY−タイプイオンと匹敵する程度にほぼ等量生じた。興味深いことに、いくつかのプロダクトイオンは硫酸基を失って水酸基を生じている点(例えば、[M−SO3−nH]n-、B3−SO3、C3−SO3等)もまた注目された。脱硫酸種及びC−タイプ及びZ−タイプイオンは、均一な配列のCSAオリゴ糖の断片としては、全く検出されないか、検出されても極微量であった。すなわち、CSCオリゴ糖の前駆イオンは多様な断片化を起こすことが分かった。
本研究で得られたデータは、CS骨格の断片化(フラグメンテーション)パターンがGalNAc残基における硫酸化位置を明確に反映することを示してきた。これらの断片化メカニズムは下記のように考察できる。
この切断はCSAとCSCオリゴ糖の両方の断片化において起こったが、CHオリゴ糖では起こらなかった。すなわちこれは、CSの硫酸化配列のための特有の開裂プロセスとして考えられ、GlcAのC−2水酸基が関与するメカニズムによって理解される(図12(B)及び(C)、非特許文献5)。このプロセスは電荷位置に影響されない断片化(チャージリモートフラグメンテーション)であり、従って、GalNAc残基における硫酸基の位置とは無関係に生じる。
このタイプのグルクロニド切断はCSCオリゴ糖において観察されたが、CSAでは観察されなかった。一方で、非硫酸化CHオリゴ糖でも生じる切断パターンである(図12(A))。チャージインデューストフラグメンテーションによるCHオリゴ糖の断片化において、カルボキシル基に存在する負電荷は、C−タイプ及びZ−タイプイオンを与える開裂プロセスの引き金となる(図8)。しかしながら、本来硫酸化された糖の一般的なケースではそれらは荷電に影響されない断片化(チャージリモートフラグメンテーション)をする(非特許文献5及びRapid Commun. Mass Spectrom. 19 1788−1796(2005))。ここで、CSCオリゴ糖の断片化については、プロトン移動を仮定することにより、その断片化メカニズムを理解することが可能である(図12(C))。
次に、上記MS2スペクトルの規則性に基づき、任意の配列のCSについて、その配列の予測が可能であることについて述べる。
ができた(図12に断片化メカニズムを示す)。これらの結果を総合すれば、不均一な硫酸化配列を有するCSオリゴ糖の断片化挙動についても、図13のように推測可能であることが理解できる。
Claims (5)
- 少なくとも以下の工程を含む、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付した際に生じるフラグメントイオンのMS2スペクトルにおけるm/z値を予測する方法:
(I)MS2スペクトルにおけるm/z値の予測対象となる2糖単位からなるコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を設定する工程;
(II)前記(I)のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付した際に切断されるグリコシド結合が属する2糖単位を選択する工程;
(III)前記(I)のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸について、下記の(i)〜(iv)の各数値を求める工程;及び
(i)N:2糖単位の数、
(ii)u:還元末端から順に2糖単位を1単位として番号を付した場合における、前記(II)で選択した2糖単位の番号、
(iii)s:前記(II)において選択した2糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの硫酸基の数、
(iv)a:前記(II)において選択した2糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの価数、
(IV)前記(III)の工程により求めた各数値を、以下の(A)〜(C)のいずれかに従って下記(イ)〜(ニ)の式に当てはめて、前記(II)で選択した2糖単位に属するグリコシド結合の切断によって生じ得るB、C、Y及びZ−タイプから選ばれるフラグメントイオンのMS2スペクトルにおけるm/z値を求める工程;
(A)前記(II)で選択したグリコシド結合が属する2糖単位を構成するN−アセチルガラクトサミンが硫酸基を有さない場合には下記の(ロ)及び(ニ)の式、
(B)前記N−アセチルガラクトサミンのC−4位に硫酸基を有している場合には下記の(イ)及び(ハ)の式、又は
(C)前記N−アセチルガラクトサミンのC−6位のみに硫酸基を有している場合には下記の(イ)〜(ニ)の全ての式、
(イ)B2(N-u)+1イオン(m/z)={[379(N−u)+176]+80s−a}/a、
(ロ)C2(N-u)+1イオン(m/z)={[379(N−u)+176]+18+80s−a}/a、
(ハ)Y2u-1イオン(m/z)={[379(u−1)+203]+18+80s−a}/a、
(ニ)Z2u-1イオン(m/z)={[379(u−1)+203]+80s−a}/a。 - 少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法;
(V)分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付して、得られたMS2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのm/z値を取得する工程、
(VI)請求項1に記載の方法で、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付した際に2糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについて、MS2スペクトルにおけるm/z値の予測値を取得する工程、及び
(VII)前記(V)の工程により取得した全てのm/z値と、前記(VI)の工程により取得した全てのm/z値の予測値とを比較し、両者が実質的に一致したときに、前記分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置が、前記(VI)の工程で設定した糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する工程。 - 前記(V)の工程により取得した全てのm/z値と、前記(VI)の工程により取得した全てのm/z値の予測値とが実質的に一致するまで前記(VI)及び(VII)の工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項2に記載の同定方法。
- 少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法;
(VIII)請求項1に記載の方法で、異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、2糖単位からなる複数のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の各々について、MS2に付した際に2糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについてMS2スペクトルにおけるm/z値の予測値を取得し、前記糖鎖長及び硫酸基位置と、前記m/z値の予測値との対応についてデータベースを作成する工程、
(IX)分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をMS2に付して、得られたMS2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのm/z値を取得する工程、及び
(X)前記(IX)の工程により取得した全てのm/z値を、前記(VIII)の工程で作成したデータベース上のm/z値と照合し、前記(IX)の工程により取得した全てのm/z値と実質的に一致するm/z値の予測値を有するコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を見出す工程。 - 前記コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸は、それぞれコンドロイチンオリゴ糖又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
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WO2007111321A1 (ja) * | 2006-03-26 | 2007-10-04 | Japan Science And Technology Agency | 硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の分析方法、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬、薬学的組成物および医薬の製造方法、疾患の治療、診断、症状の軽減および予防方法 |
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JP2015040757A (ja) * | 2013-08-21 | 2015-03-02 | 国立大学法人東北大学 | スペクトル予測方法、スペクトル予測装置、およびプログラム |
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