JP2006250668A - Non-labelled biochip - Google Patents
Non-labelled biochip Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006250668A JP2006250668A JP2005066653A JP2005066653A JP2006250668A JP 2006250668 A JP2006250668 A JP 2006250668A JP 2005066653 A JP2005066653 A JP 2005066653A JP 2005066653 A JP2005066653 A JP 2005066653A JP 2006250668 A JP2006250668 A JP 2006250668A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- layer
- lspr
- plasmon resonance
- molecular recognition
- localized plasmon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
本発明は局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ、該チップの製造方法、並びに該チップを用いての多検体の検出方法、スクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR), a method for producing the chip, a method for detecting multiple samples using the chip, and a screening method.
従来酵素や抗体、DNAなどといった生体分子の高い認識能を利用した目的物質の検出および定量には、アルカリホスホターゼやペルオキシダーゼ等で生体分子を標識し、電気信号を増幅させる電気化学的測定手法や酵素反応による発色、蛍光の程度により目的物質を検出・定量するELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)法が主に用いられている。また、電気化学的手法では、電極表面へ目的物質を特異的に認識する生体分子を認識素子として固定化し、認識素子へ目的物質が結合した際に生じる電気化学的なシグナル変化あるいは酵素などの標識物質によるシグナル増幅を検出し、定量を行うものである。また、ELISA法においては生体分子と目的物質との結合後にあらかじめ標識した酵素による酵素反応や蛍光分子による、目的物質の濃度に依存した発色もしくは蛍光を検出する手法である。しかしながら、これらの測定手法では、生体分子へ標識作業を必要とし、一連の作業に長い時間を要するとともに、生体分子が有する高い認識能の阻害を招くことから、目的物質の微量測定や、高感度測定が困難である。また、簡便な測定手法として注目されているイムノクロマト法でも金コロイドやポリスチレン粒子等の修飾が必要である。これら背景から、生体分子へ酵素や蛍光分子などを標識することなく（非標識）、目的物質の検出および定量が行える測定手法が望まれてきた。そこで、非標識での目的物質の検出および定量が可能な共鳴角のシフトを検出する表面プラズモン共鳴(Surface plasmon resonance : SPR)法や振動数変化を検出する水晶振動子(Quartz crystal microbalance : QCM)法、また、共振周波数変化を検出するカンチレバーによる非標識に目的物質の検出・定量手法が開発されている。 For the detection and quantification of target substances using conventional biomolecules such as enzymes, antibodies, DNA, etc., electrochemical measurement techniques that label biomolecules with alkaline phosphotase or peroxidase and amplify electrical signals An ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) method for detecting and quantifying a target substance based on the degree of color development and fluorescence by an enzyme reaction is mainly used. In the electrochemical method, a biomolecule that specifically recognizes a target substance on the electrode surface is immobilized as a recognition element, and an electrochemical signal change that occurs when the target substance is bound to the recognition element or a label such as an enzyme. The signal amplification by the substance is detected and quantified. In addition, the ELISA method is a method for detecting color development or fluorescence depending on the concentration of a target substance by an enzyme reaction by an enzyme labeled in advance after binding of a biomolecule and the target substance or a fluorescent molecule. However, these measurement methods require labeling of biomolecules, a long time is required for a series of operations, and inhibit the high recognition ability of biomolecules. Measurement is difficult. Also, immunochromatography, which is attracting attention as a simple measurement technique, requires modification of gold colloid, polystyrene particles, and the like. From these backgrounds, there has been a demand for a measurement technique capable of detecting and quantifying a target substance without labeling enzymes or fluorescent molecules to biomolecules (unlabeled). Therefore, the surface plasmon resonance (SPR) method that detects the shift of the resonance angle that can detect and quantify the target substance without labeling, and the quartz crystal (Quartz crystal microbalance: QCM) that detects the frequency change. In addition, a method for detecting and quantifying a target substance without labeling using a cantilever for detecting a change in resonance frequency has been developed.
電気化学的手法あるいはELISA法などの従来の生体分子を用いた目的物質の検出・定量システムでは、目的物質あるいは認識素子として用いる生体分子へ酵素や蛍光物質などの標識剤を必要とする。この標識作業は、従来高い認識能を有する生体分子の認識能を阻害すると同時に、標識作業を必要とするため、感度の低下および操作の煩雑化を招いている。また、これまでに開発された非標識測定法のSPR法の場合、共鳴角シフトを検出するために大型の光学系を構築する必要があるとともに、一連の操作が煩雑である。そのためオンサイトでの目的物質のモニタリングに適さない。また、QCM法では、簡便に測定は可能ではあるが、ノイズが大きく、高感度測定には適さない。そしてカンチレバー法ではデバイス作製が非常に困難という点とともに、簡易測定には適さないという点がある。 In a conventional target substance detection / quantification system using biomolecules such as an electrochemical technique or ELISA method, a labeling agent such as an enzyme or a fluorescent substance is required for the target substance or biomolecule used as a recognition element. This labeling operation has previously hindered the recognition ability of biomolecules having high recognition ability, and at the same time requires a labeling operation, resulting in a decrease in sensitivity and complication of operation. Further, in the case of the SPR method of the unlabeled measurement method developed so far, it is necessary to construct a large optical system in order to detect the resonance angle shift, and the series of operations is complicated. Therefore, it is not suitable for on-site monitoring of target substances. In addition, the QCM method allows simple measurement, but is noisy and not suitable for high sensitivity measurement. And the cantilever method has a point that it is very difficult to manufacture a device and is not suitable for a simple measurement.
上記測定法とは別に、金や銀、白金などのナノメートルオーダーでの貴金属微粒子に発現する非線形光学現象である局在表面プラズモン共鳴（LSPR）を利用した測定法がある。これらの先行文献として、特許公開2002-365210、2002-253233がある。
上記特許文献記載の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップでは、細密かつ再現良く単一の粒子層が形成できず、洗浄操作などの課程において、粒子の脱離も発生し、そのため低感度化を引き起こす。また、分子量の大きい分子認識素子を固定化することができず、検出対象が限定され、さらに多種類の分子認識素子を固定化することができず、スクリーニング用途として適用できない。
本発明は、上記記載した問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、良好な感度が得られ、かつ細胞のような分子量の大きい分子認識素子を固定化し、相互作用の検出および定量を可能とした局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップを提供することである。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、基板上に配置された金属膜（第１層）、該金属膜上に結合し得る官能基を有する自己組織化単分子膜層（第２層）、該自己組織化単分子膜層上と共有結合を介して固定化した粒子層（第３層）、該粒子層上に配置された金属膜（第４層）を含む局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップでは、分子量が大きい分子認識素子が固定化可能であり、さらに良好な感度が得られることを見出し、本発明を完成した。
In the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) described in the above-mentioned patent document, a single particle layer cannot be formed precisely and reproducibly, and particle desorption occurs in the course of cleaning operation, etc. Cause In addition, a molecular recognition element having a large molecular weight cannot be immobilized, the detection target is limited, and many types of molecular recognition elements cannot be immobilized, and cannot be applied as screening applications.
This invention made it the subject which should be solved to eliminate the above-mentioned problem. That is, the present invention provides a measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) that can obtain a good sensitivity and immobilizes a molecular recognition element having a large molecular weight such as a cell and enables detection and quantification of interaction. Is to provide. As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that a metal film (first layer) disposed on a substrate and a self-assembled monolayer having a functional group capable of binding on the metal film. (Second layer), a particle layer (third layer) immobilized on the self-assembled monolayer through a covalent bond, and a metal film (fourth layer) disposed on the particle layer. With the measurement chip for surface plasmon resonance (LSPR), it has been found that a molecular recognition element having a large molecular weight can be immobilized, and that better sensitivity can be obtained, and the present invention has been completed.
本発明は、つまり本発明は以下よりなる。
「１．基板、該基板上に配置された金属膜（第１層）、該金属膜上に結合し得る官能基を有する自己組織化単分子膜層（第２層）、該自己組織化単分子膜層上と共有結合を介して固定化された粒子層（第３層）、該粒子層上に配置された金属膜（第４層）を含むことを特徴とする局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ。
２．前記粒子層（第３層）が、単一粒子層であることを特徴とする前項１に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ。
３．前記金属膜（第１層）の膜厚が20〜40nm、前記金属膜（第４層）の膜厚が30〜50nmであることを特徴とする前項１又は２に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ。
４．前項１−３のいずれか１に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップの金属膜（第４層）上に分子認識素子が固定化されていることを特徴とする局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー。
５．前項１−３のいずれか１に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップの金属膜（第４層）上が複数の領域に区画されることなく複数の分子認識素子が固定化されていることを特徴とする局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー。
６．前記分子認識素子が、以下のいずれか１又は１以上から選択されることを特徴とする前項４又５に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー。
（１）抗体、（２）抗原、（３）ＤＮＡ、（４）ＰＮＡ、（５）細胞
７．粒子層（第３層）を共有結合を介して自己組織化単分子膜層（第２層）上に単一粒子層に固定化する工程を含む、前項１―３のいずれか１に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップの製造方法。
８．前記粒子層（第３層）を共有結合を介して自己組織化単分子膜層（第２層）上に単一粒子層に固定化する方法が、shaker法であることを特徴とする前項７に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップの製造方法。
９．前項４に記載の分子認識素子が固定化されている局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサーと、目的物質を含む試料とを接触させて、該バイオセンサー 上に固定化された分子認識素子と目的物質との相互作用を検出および／または定量することを特徴とする、分子認識素子と相互作用する物質の測定する方法。
１０．前項５に記載の複数の領域に区画されることなく複数の分子認識素子が固定化されている局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサーと、候補目的物質を含む試料とを接触させて、該バイオセンサー 上の複数の分子認識素子と候補目的物質との相互作用を検出することを特徴とする、分子認識素子と相互作用する物質のスクリーニング方法。
１１．前項１−３のいずれか１に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ及び前項４―６のいずれか１に記載の局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサーの製造に使用する試薬の少なくとも１を含む、局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー用測定チップ又は局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー製造キット。」
The present invention, that is, the present invention comprises the following.
“1. a substrate, a metal film (first layer) disposed on the substrate, a self-assembled monolayer film (second layer) having a functional group capable of binding on the metal film, the self-assembled monolayer A localized plasmon resonance (LSPR) comprising a particle layer (third layer) immobilized on a molecular film layer via a covalent bond, and a metal film (fourth layer) disposed on the particle layer ) Measuring chip for.
2. 2. The measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) according to item 1, wherein the particle layer (third layer) is a single particle layer.
3. 3. The localized plasmon resonance according to item 1 or 2, wherein the metal film (first layer) has a thickness of 20 to 40 nm, and the metal film (fourth layer) has a thickness of 30 to 50 nm. Measuring chip for LSPR).
4). The localized plasmon resonance (wherein a molecular recognition element is immobilized on the metal film (fourth layer) of the measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) according to any one of the preceding items 1-3) LSPR) Biosensor.
5. A plurality of molecular recognition elements are immobilized without dividing a metal film (fourth layer) of the measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) according to any one of the preceding items 1-3 into a plurality of regions. A localized plasmon resonance (LSPR) biosensor.
6). 6. The localized plasmon resonance (LSPR) biosensor according to 4 or 5 above, wherein the molecular recognition element is selected from any one or more of the following.
(1) antibody, (2) antigen, (3) DNA, (4) PNA, (5) cell 4. The method according to any one of items 1 to 3, further comprising the step of immobilizing the particle layer (third layer) on the self-assembled monolayer (second layer) via a covalent bond to the single particle layer. A method of manufacturing a measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR).
8). 7. The method according to item 7 above, wherein the method of fixing the particle layer (third layer) to the single particle layer on the self-assembled monolayer (second layer) via a covalent bond is a shaker method. A manufacturing method of a measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) described in 1.
9. A molecular recognition element immobilized on a biosensor by contacting a localized plasmon resonance (LSPR) biosensor on which the molecular recognition element described in the preceding item 4 is immobilized with a sample containing a target substance. A method for measuring a substance interacting with a molecular recognition element, comprising detecting and / or quantifying an interaction with the substance.
10. A localized plasmon resonance (LSPR) biosensor in which a plurality of molecular recognition elements are immobilized without being divided into a plurality of regions described in the preceding item 5 and a sample containing a candidate target substance are brought into contact with each other, A screening method for a substance that interacts with a molecular recognition element, comprising detecting an interaction between a plurality of molecular recognition elements on a sensor and a candidate target substance.
11. The measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) according to any one of 1-3 above and at least one of the reagents used for the production of the localized plasmon resonance (LSPR) biosensor according to any one of 4-6 above A measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) biosensor or a localized plasmon resonance (LSPR) biosensor manufacturing kit, comprising: "
本発明によれば、従来の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップと比較して、分子量が大きい分子認識素子が固定化可能な局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップチップを提供することができる。また本発明のチップは、抗原・抗体反応のみならずDNAや細胞を用いて、相互作用解析や、細胞代謝物の検出も可能であり、センサーの役割を果たすだけでなく、スクリーニング用途にも適用可能である。 According to the present invention, there is provided a measurement chip chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) in which a molecular recognition element having a large molecular weight can be immobilized as compared with a conventional measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR). be able to. The chip of the present invention can be used not only for antigen / antibody reactions but also for DNA and cells to perform interaction analysis and detection of cell metabolites. Is possible.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、基板、金属膜の第１層、自己組織化単分子膜層の第２層、粒子層の第３層、金属膜の第４層を含む局在表面プラズモン共鳴（LSPR）センサーに使用されるものであって、照射された光を透過及び反射する部分、並びに分子認識素子を固定化する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。 The measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention includes a substrate, a first layer of a metal film, a second layer of a self-assembled monolayer, a third layer of a particle layer, and a fourth layer of a metal film. A member that includes a portion that transmits and reflects irradiated light and a portion that immobilizes a molecular recognition element, and is used in a localized surface plasmon resonance (LSPR) sensor including It may be fixed to the main body or may be removable.
局在表面プラズモン共鳴（LSPR）の現象は、入射光の振動電場と金属微粒子などの内部の自由電子が、共鳴的に振動によるものである。この現象はバルクでの金や銀などでは起こることがない現象である。従って、可視領域における吸収スペクトルを測定することにより、試料中の目的物質の検出及び濃度を測定することができる。 The phenomenon of localized surface plasmon resonance (LSPR) is caused by the vibration of the incident electric field and the internal free electrons such as metal fine particles. This phenomenon does not occur with bulk gold or silver. Therefore, the detection and concentration of the target substance in the sample can be measured by measuring the absorption spectrum in the visible region.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップで使用することができる基板としては、例えば、局在表面プラズモン共鳴現象に影響を与えないものであればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどの白色光に対して透明な材料からなるもの、さらにはシリコン、石英等が使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。基板の厚さは特には限定されないが、通常0.1 〜20mm程度である。 The substrate that can be used in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention may be any substrate as long as it does not affect the localized surface plasmon resonance phenomenon. For example, glass, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, or the like made of a material transparent to white light, silicon, quartz, or the like can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability. The thickness of the substrate is not particularly limited, but is usually about 0.1 to 20 mm.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおいて、「配置された」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。 In the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, “arranged” means that the metal film is in direct contact with the substrate in addition to the case where the metal film is arranged in direct contact with the substrate. Without meaning, it is meant to include the case where it is arranged through another layer.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける金属膜としては、局在表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。例えば、使用できる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。 The metal film in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention is not particularly limited as long as localized surface plasmon resonance can occur. For example, as a kind of metal which can be used, gold | metal | money, silver, copper, aluminum, platinum etc. are mentioned, These can be used individually or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and a layer made of gold, silver, or the like.
第１層及び第４層の金属膜の膜厚は任意であるが、高感度検出を考慮した場合、第１層及び第４層の膜厚は3〜100nm、好ましくは20〜60nmである、さらに好ましくは25-45nmである。なお、第１層と第４層の好適な組み合わせは、それぞれ20-40nm、30-50nmであり、さらに好ましくはそれぞれ30nm、40nmである。 The film thickness of the metal film of the first layer and the fourth layer is arbitrary, but when high sensitivity detection is considered, the film thickness of the first layer and the fourth layer is 3 to 100 nm, preferably 20 to 60 nm. More preferably, it is 25-45 nm. A suitable combination of the first layer and the fourth layer is 20-40 nm and 30-50 nm, respectively, more preferably 30 nm and 40 nm, respectively.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける第１層及び第４層の金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。好ましくは、均一に膜形成が可能な手法である、スパッタ法、蒸着法である。 Formation of the metal films of the first layer and the fourth layer in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention may be performed by a conventional method, for example, sputtering method, vapor deposition method, ion plating method, electroplating. It can be performed by a method, an electroless plating method or the like. The sputtering method and the vapor deposition method, which are methods capable of forming a film uniformly, are preferable.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける第２層の「自己組織化単分子膜層」は、固体表面へ種々の分子が配向・集積された分子膜を意味する。第１層の金属表面にチオール基などの金属表面の原子と結合しうる官能基が存在し、さらにもう一方の末端に種々の官能基が存在している。具体的には、4,4'-dithiodibutylic acid (DDA)にて形成された単分子膜である。 The “self-assembled monolayer” of the second layer in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention means a molecular film in which various molecules are oriented and integrated on a solid surface. A functional group capable of bonding to a metal surface atom such as a thiol group is present on the metal surface of the first layer, and various functional groups are present at the other end. Specifically, it is a monomolecular film formed of 4,4′-dithiodibutylic acid (DDA).
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップでは、「金属膜（第１層）上に結合し得る官能基を有する自己組織化単分子膜層（第２層）」とは、アルカンチオール化合物が金表面と反応し、Au-S結合するとともに、アルキル鎖同士の相互作用によって高い配向性を持つ単分子膜を意味する。現在ではチオール類のみならず基板結合部位としてジスルフィドやスルフィドを用いることでも形成が可能である。
具体的には、金属表面の原子と結合しうる官能基であるチオール基を介して金属膜上に固定化されている。また、チオールを有する試薬として、例えば、4,4'-dithiodibutylic acid (DDA)がある。
さらに、本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける、第２層の形成は常法によって行えばよく、例えば、金属表面の原子と結合しうる官能基を含有する少なくとも１種類以上のシランカップリング剤により形成することができる。シランカップリング剤とは、その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のある加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
In the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, “a self-assembled monolayer (second layer) having a functional group capable of binding on a metal film (first layer)” is an alkane. A thiol compound reacts with the gold surface to form an Au-S bond, and means a monomolecular film having high orientation by the interaction between alkyl chains. At present, it can be formed not only by thiols but also by using disulfide or sulfide as a substrate binding site.
Specifically, it is immobilized on the metal film via a thiol group that is a functional group capable of bonding to atoms on the metal surface. An example of a thiol-containing reagent is 4,4′-dithiodibutylic acid (DDA).
Furthermore, in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, the second layer may be formed by a conventional method, for example, at least one or more kinds containing a functional group capable of binding to atoms on the metal surface. The silane coupling agent can be used. Silane coupling agents are organic functional groups that have an affinity for organic materials such as vinyl, epoxy, amino, and mercapto groups in the molecule, and affinity for inorganic materials such as methoxy and ethoxy groups. An organosilicon compound having a hydrolyzable group.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける、「粒子」は、局在表面プラズモン共鳴に影響を与えないようなものであれば特に限定されない。例えば、使用できる粒子の種類としては、誘電体粒子等である。具体的には、ポリスチレン粒子、ポリエチレン粒子、シリカ粒子、ガラス粒子等が挙げることができる。また、誘電体粒子の直径は、3〜200nm、好ましくは70〜120nm、さらに好ましくは100nmである。また、使用する粒子の粒径に応じて、局在プラズモン共鳴が励起される波長域が異なる。 The “particle” in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention is not particularly limited as long as it does not affect the localized surface plasmon resonance. For example, the types of particles that can be used are dielectric particles. Specific examples include polystyrene particles, polyethylene particles, silica particles, glass particles, and the like. The diameter of the dielectric particles is 3 to 200 nm, preferably 70 to 120 nm, and more preferably 100 nm. Further, the wavelength range in which the localized plasmon resonance is excited differs depending on the particle size of the particles used.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける第３層の「自己組織化単分子膜層上と共有結合を介して固定化された粒子層」は、粒子が第２層へ細密に二次元的な層が形成された状態を意味する。また、検出感度を向上させるために好適には、粒子層は単一粒子層であることが望ましい。
さらに、本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける、第３層の形成は、表面修飾がなされた粒子を第２層の表面と化学結合によって行うことができる。具体的には、粒子の表面のアミノ基が第２層の自己組織化単分子膜上のカルボキシル基と共有結合（アミド結合）を行うことである。
さらに、第３層を単一粒子層とするために、従来の表面修飾した粒子溶液を、単に第２層表面へ展開したのではなく、粒子溶液を第２層である自己組織化単分子膜層表面へ展開する際に、shakerを用いて、自己組織化単分子膜層表面へ均一に、粒子がいきわたるようにすることで、細密かつ単一粒子の粒子層を形成することが可能となる。なお、このような方法を「shaker法」と称する。
In the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, the third layer “particle layer immobilized on the self-assembled monolayer through covalent bonds” is finely packed into the second layer. Means that a two-dimensional layer is formed. In order to improve detection sensitivity, the particle layer is preferably a single particle layer.
Furthermore, in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, the third layer can be formed by chemically bonding the surface-modified particles to the surface of the second layer. Specifically, the amino group on the surface of the particle forms a covalent bond (amide bond) with a carboxyl group on the second layer self-assembled monolayer.
Furthermore, in order to make the third layer into a single particle layer, the conventional surface-modified particle solution is not simply developed on the surface of the second layer, but the self-assembled monolayer that is the second layer. When developing on the surface of the layer, using a shaker allows the particles to spread uniformly on the surface of the self-assembled monolayer layer, so that a fine and single particle layer can be formed. . Such a method is referred to as a “shaker method”.
本発明の分子認識素子は、特異結合物質が存在しうる全ての物質である。すなわち、分子認識素子は、試料中の目的物質又は候補目的物質と特異的に結合できかつ金属膜に固定化できればどのようなものでもよい。例えば、抗原に対しては抗体、抗体に対しては抗原、ハプテンに対しては抗ハプテン抗体、抗ハプテン抗体に対してはハプテン、ＤＮＡに対してはハイブリダイズすることができるＤＮＡ又はＰＮＡ、ビオチンに対してはアビジンあるいはストレプトアビジン、アビジンあるいはストレプトアビジンに対してはビオチンあるいはビオチン化タンパク、ホルモン受容体（例えばインスリン受容体）に対してはホルモン（例えばインスリン）、ホルモン（例えばインスリン）に対してはホルモン受容体（例えばインスリン受容体）、レクチンに対しては対応する糖鎖、糖鎖に対しては対応するレクチンなどが分子認識素子の例として挙げられる。また、分子認識素子は、特異的結合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニットなどをも含む。さらに、細胞自体を分子認識素子として選択可能であり、この場合の目的物質又は候補目的物質は、該細胞のある一部（受容体等）を特異的に認識するものでよい。なお、実施例の分子認識素子として、ＰＮＡ、抗体（抗Fibriogen抗体、抗Dinitrophenyl(DNP)抗体）、細胞（マウス脾臓中に存在するＢ細胞）を使用した。
さらに、本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける、分子認識素子の金属膜（第４層）への固定化は、物理的吸着、化学結合によって行うことができる。しかしこれらの方法に限定されない。
The molecular recognition element of the present invention is any substance in which a specific binding substance can exist. That is, the molecular recognition element may be anything as long as it can specifically bind to the target substance or candidate target substance in the sample and can be immobilized on the metal film. For example, an antibody for an antigen, an antigen for an antibody, an anti-hapten antibody for a hapten, a hapten for an anti-hapten antibody, a DNA or PNA that can hybridize to DNA, biotin For avidin or streptavidin, biotin or biotinylated protein for avidin or streptavidin, hormone (eg insulin) for hormone receptor (eg insulin receptor), hormone (eg insulin) Examples of molecular recognition elements include hormone receptors (for example, insulin receptors), sugar chains corresponding to lectins, and lectins corresponding to sugar chains. The molecular recognition element also includes those fragments or subunits having specific binding ability. Furthermore, the cell itself can be selected as a molecular recognition element, and the target substance or candidate target substance in this case may specifically recognize a part of the cell (such as a receptor). In addition, PNA, an antibody (anti-Fibriogen antibody, an anti-Dinitrophenyl (DNP) antibody), and a cell (B cell present in the mouse spleen) were used as the molecular recognition element of the example.
Furthermore, in the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, the molecular recognition element can be immobilized on the metal film (fourth layer) by physical adsorption or chemical bonding. However, it is not limited to these methods.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップにおける、分子認識素子の第４層の金属膜への固定化は、化学結合で行うことができる。また、分子認識素子を化学結合で金属膜（第４層）に固定化するために、分子認識素子と結合することができる官能基を別途導入してもよい。例えば、金属膜（第４層）表面に３−メルカプトプロピルトリメトキシシランで処理後、３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ化シランカップリング剤で再び処理して、該表面にアミノ基を導入することもできる。アミノ化シランカップリング剤としては、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシランなどが挙げられる。あるいは、例えば、金属膜（第４層）表面に３−メルカプトプロピルトリメトキシシランと３−アミノプロピルトリエトキシシランの混合物を同時に処理することで、１段階で、金属膜（第４層）表面にアミノ基を導入を導入することができる。 In the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention, the molecular recognition element can be immobilized on the metal film of the fourth layer by chemical bonding. In addition, in order to immobilize the molecular recognition element on the metal film (fourth layer) by chemical bonding, a functional group that can be bonded to the molecular recognition element may be separately introduced. For example, the surface of the metal film (fourth layer) is treated with 3-mercaptopropyltrimethoxysilane and then treated again with an aminated silane coupling agent such as 3-aminopropyltriethoxysilane to introduce amino groups on the surface. You can also As an aminated silane coupling agent, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) Examples include dimethoxymethylsilane. Alternatively, for example, by simultaneously treating the surface of the metal film (fourth layer) with a mixture of 3-mercaptopropyltrimethoxysilane and 3-aminopropyltriethoxysilane, the surface of the metal film (fourth layer) is formed in one step. Introduction of amino groups can be introduced.
また、自体公知のスポッター装置を用いて金属膜（第４層）上の複数の領域に区画されることなく複数の分子認識素子を固定化することができ、多検体検出用又はスクリーニング用局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップとすることができる。また、金属膜（第４層）の全面に分子認識素子を固定化する必要はなく、高価並びに合成又は抽出が困難な貴重な物質を分子認識素子として利用することができる。ここで、「複数」とは、２種以上の分子認識素子を意味する。 In addition, a plurality of molecular recognition elements can be immobilized without being partitioned into a plurality of regions on the metal film (fourth layer) using a well-known spotter device. It can be set as a measurement chip for surface plasmon resonance (LSPR). Further, it is not necessary to immobilize the molecule recognition element on the entire surface of the metal film (fourth layer), and a valuable substance that is expensive and difficult to synthesize or extract can be used as the molecule recognition element. Here, “plurality” means two or more types of molecular recognition elements.
本発明の目的物質は、分子認識素子と特異的に結合できるものを指す。種類によって分類すると、目的物質は、抗原、抗体、レセプター、リガンド、レクチン、糖鎖化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ハプテンなどが挙げられる。目的物質の機能から分類すると、ホルモン、イムノグロブリン、凝固因子、酵素、薬剤などと呼ばれるものを含む。物質名では、血清アルブミン、マクログロブリン、フェリチン、α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＩＶ−１ｐ２４などが目的物質の例として挙げられる。なお、実施例の目的物質としては、ＤＮＡ、抗原（Fibriogen抗原、Dinitrophenyl抗原）、細胞代謝産物である。
また、候補目的物質とは、分子認識素子と特異的に結合することが予測される物質群であり、本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップを用いたスクリーニングによって決定される。具体的な物質名は、目的物質と同じである。
また、試料は、目的物質又は候補目的物質を含む溶液を示す。例としては、血液、唾液、尿、鼻汁、涙液、糞便、組織抽出液、培養液等などが挙げられるが、これらに限定されない。
The target substance of the present invention refers to a substance that can specifically bind to a molecular recognition element. When classified by type, target substances include antigens, antibodies, receptors, ligands, lectins, sugar chain compounds, RNA, DNA, PNA, haptens and the like. When classified according to the function of the target substance, it includes substances called hormones, immunoglobulins, coagulation factors, enzymes, drugs and the like. Examples of the substance name include serum albumin, macroglobulin, ferritin, α-fetoprotein, CEA, prostate specific antigen (PSA), hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), HIV-1p24, and the like. In addition, the target substance of an Example is DNA, an antigen (Fibriogen antigen, Dinitrophenyl antigen), and a cell metabolite.
The candidate target substance is a group of substances that are predicted to specifically bind to the molecular recognition element, and is determined by screening using the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention. The specific substance name is the same as the target substance.
The sample indicates a solution containing the target substance or candidate target substance. Examples include, but are not limited to, blood, saliva, urine, nasal discharge, tears, stool, tissue extract, culture fluid, and the like.
本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、上記分子認識素子を固定化することにより本発明の局在プラズモン共鳴センサーとすることができる。
また、本発明の局在プラズモン共鳴センサーは、通常の用いられる方法であるチップ上の分子認識素子が固定化された部分に対して垂直方向の入射光を照射し、その反射光に対する吸収スペクトルを分光器を用いて測定する。
The measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention can be used as the localized plasmon resonance sensor of the present invention by immobilizing the molecular recognition element.
In addition, the localized plasmon resonance sensor of the present invention irradiates the incident light in the vertical direction to the portion where the molecular recognition element on the chip, which is a commonly used method, is fixed, and displays the absorption spectrum for the reflected light. Measure using a spectroscope.
また、本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、粒子を共有結合させて単一粒子層の形成を行うことで、粒子層の細密化を実現でき、従来のLSPR局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップのように粒子層を区画する必要がなく、複数の分子認識素子を固定化できる。よって、従来の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップと比較して大面積の（20mm×60mm）の基板をも用いることができる。これにより、本発明の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、分子認識素子、使用用途、サンプル数、試料量に柔軟に対応することが可能である。 In addition, the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention can realize a fine particle layer by covalently bonding particles to form a single particle layer. Unlike the measurement chip for plasmon resonance (LSPR), it is not necessary to partition the particle layer, and a plurality of molecular recognition elements can be immobilized. Therefore, a substrate having a large area (20 mm × 60 mm) can be used as compared with a conventional measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR). Thereby, the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention can flexibly cope with the molecular recognition element, the intended use, the number of samples, and the sample amount.
（分子認識素子と相互作用する物質の検出および／または定量方法）
試料中の目的物質の測定は以下のように行われる。
１）スポッターや分注器を用いて分子認識素子のチップ表面への固定化
２）目的物質の非特異的吸着を防ぐため、ウシ血清アルブミンやカゼインを用いたブロッキング操作
３）スポッターや分注器を用いた目的物質の添加
４）分子認識素子と目的物質との相互作用
５）界面活性剤やその他分子認識素子と相互作用をしない試薬を用いた洗浄操作による非特異的吸着の除去
６）分光器を用いた吸収スペクトル測定
なお、ここで「相互作用」とは、分子認識素子が、試料中の目的物質又は候補目的物質と特異的に認識することをだけを意味するのではなく、例えば、疎水性相互作用、静電的相互作用等の何らかの影響を与えることも意味する。
(Method for detecting and / or quantifying a substance interacting with a molecular recognition element)
The target substance in the sample is measured as follows.
1) Immobilization of molecular recognition element on chip surface using spotter or dispenser 2) Blocking operation using bovine serum albumin or casein to prevent non-specific adsorption of target substance 3) Spotter or dispenser Addition of target substance using injection device 4) Interaction between molecular recognition element and target substance 5) Removal of non-specific adsorption by washing operation using surfactants and other reagents that do not interact with molecular recognition element 6 ) Absorption spectrum measurement using a spectroscope Note that “interaction” does not mean that the molecular recognition element specifically recognizes the target substance or candidate target substance in the sample. For example, it also means giving some influence such as hydrophobic interaction and electrostatic interaction.
（分子認識素子と相互作用する物質のスクリーニング方法）
試料中の候補目的物質の測定は以下のように行われる。
１）スポッターや分注器を用いて分子認識素子のチップへの固定化
２）候補目的物質の非特異的吸着を防ぐため、ウシ血清アルブミンやカゼインを用いたブロッキング操作
３）スポッターや分注器を用い候補目的物質の添加
４）分子認識素子と候補目的物質との相互作用
５）界面活性剤やその他分子認識素子と相互作用をしない試薬を用いた洗浄操作による非特異的吸着の除去
６）分光器を用いた吸収スペクトル測定
(Screening method for substances that interact with molecular recognition elements)
Measurement of the candidate target substance in the sample is performed as follows.
1) Immobilization of molecular recognition element on chip using spotter or dispenser 2) Blocking operation using bovine serum albumin or casein to prevent nonspecific adsorption of candidate target substance 3) Spotter or dispenser Addition of candidate target substance using injection device 4) Interaction between molecular recognition element and candidate target substance 5) Removal of non-specific adsorption by washing operation using surfactants and other reagents that do not interact with molecular recognition element 6) Absorption spectrum measurement using a spectroscope
（キット）
本発明の局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ及び局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサーの製造に使用する少なくとも１の試薬を局在プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ又は局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー製造用キットとすることができる。該キットの購入者は、目的物質又は候補目的物質を選択し、目的物質又は候補目的物質に対応する分子認識素子を本発明の局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー用測定チップに固定化し、局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー装置を用意に製造することができる。なお、キット中の試薬例としては、局在プラズモン共鳴（LSPR）バイオセンサー用測定チップ、固定化試薬、ブロッキング試薬、洗浄試薬等が挙げられるが、これらには限定されない。
(kit)
The measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) and the measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) or the localized plasmon resonance (LSPR) used in the manufacture of the measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) and the localized plasmon resonance (LSPR) biosensor of the present invention ) It can be a biosensor manufacturing kit. The purchaser of the kit selects the target substance or candidate target substance, immobilizes the molecular recognition element corresponding to the target substance or candidate target substance on the measurement chip for the localized plasmon resonance (LSPR) biosensor of the present invention, and A plasmon resonance (LSPR) biosensor device can be readily prepared. Examples of reagents in the kit include, but are not limited to, a measurement chip for a localized plasmon resonance (LSPR) biosensor, an immobilization reagent, a blocking reagent, and a washing reagent.
以下で本発明を実施例によって説明するが、本発明は、基板上に配置された金属膜（第１層）、該金属膜上に結合し得る官能基を有する自己組織化単分子膜層（第２層）、該自己組織化単分子膜層上と共有結合を介して固定化した粒子層（第３層）、該粒子層上に配置された金属膜（第４層）を含むことを特徴とする局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップであって、この基本原理を含む限り本発明はその対象を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described by way of examples. The present invention describes a metal film (first layer) disposed on a substrate, a self-assembled monolayer film having a functional group capable of binding on the metal film ( A second layer), a particle layer (third layer) immobilized on the self-assembled monolayer through a covalent bond, and a metal film (fourth layer) disposed on the particle layer. A measuring chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) which is a feature, and the present invention does not limit the object as long as this basic principle is included.
以下の方法により局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップの作製を行った。
スライドガラス表面（75nm×25nm）に、金を真空蒸着にて膜厚30nmに堆積させた（第１層）。続いて、第１層表面へ1mM 4,4'-Dithiodibutyric acid(DDA)を用いて自己組織化単分子層(Self assembled monolayer: SAM)形成をした（第２層）。そして、第２層表面へ400 mM EDCを添加し、該表面へ導入されたカルボキシル基の活性化を行った後、3-aminopropyltriethoxyxsilane(γ-APTES)にて、表面修飾を行った粒径100 nmのシリカ粒子を第２層表面へ共有結合させた（第３層）。なお、第２層表面への単一粒子層の形成にはshaker法を用いた。そして超純水を用いた洗浄操作による残余シリカ微粒子の除去の後、第３層表面へ金蒸着(40nm)を行い、局在表面プラズモン共鳴用測定チップとした。
次に、バネ定数18 N/mのAFMプローブを用いてタッピングモード条件にて、作製したチップ表面を走査し、表面解析を行った。
なお、局在表面プラズモン共鳴用測定チップの作製方法の概略図を図１に示す。
A measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) was prepared by the following method.
Gold was deposited on the surface of the slide glass (75 nm × 25 nm) to a thickness of 30 nm by vacuum evaporation (first layer). Subsequently, a self assembled monolayer (SAM) was formed on the surface of the first layer using 1 mM 4,4′-dithiodibutyric acid (DDA) (second layer). Then, 400 mM EDC was added to the surface of the second layer, the carboxyl group introduced to the surface was activated, and then the surface modification was performed with 3-aminopropyltriethoxyxsilane (γ-APTES). The silica particles were covalently bonded to the surface of the second layer (third layer). The shaker method was used to form a single particle layer on the surface of the second layer. Then, after removing the residual silica fine particles by a cleaning operation using ultrapure water, gold deposition (40 nm) was performed on the surface of the third layer to obtain a measurement chip for localized surface plasmon resonance.
Next, the surface of the fabricated chip was scanned using an AFM probe with a spring constant of 18 N / m under tapping mode conditions to perform surface analysis.
In addition, the schematic of the manufacturing method of the measurement chip | tip for localized surface plasmon resonance is shown in FIG.
図２に、実施例１で作製した局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップ表面のAFM画像の結果を示す。図２により、第３層の粒子層が単一粒子層を形成していた。 FIG. 2 shows the result of an AFM image on the surface of the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) produced in Example 1. According to FIG. 2, the particle layer of the third layer forms a single particle layer.
（DNA-peptide nucleic acid (PNA)相互作用のモニタリング）
PNAはDNAと構造が類似しており、化学的にも安定であるという長所から、医薬などへの応用が期待されている。そこで、実施例１で作製した局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップへPNAプローブを固定化し、PNA-DNA相互作用の検出および定量を行った。
(Monitoring of DNA-peptide nucleic acid (PNA) interaction)
PNA is similar in structure to DNA and is expected to be applied to medicines due to its chemical stability. Therefore, the PNA probe was immobilized on the measurement chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) prepared in Example 1, and the PNA-DNA interaction was detected and quantified.
実地例１で作製したチップへ、PNAプローブ（配列番号１：5'-Biotin- ACC ACC ACT TC -3'）の固定化を行った。PNAプローブの固定化には、チップ表面へ1mM DDAを用いてSAMを形成した後、400mM EDCにてDDA末端カルボキシル基を活性化させ、100mM NHSを結合させた。そして、ストレプトアビジンとNHS活性基を結合させた後、1μM のPNAプローブ溶液を添加し、PNAプローブ末端に修飾したビオチンとストレプトアビジンとのアビジン-ビオチン結合によってプローブの固定化を行った。そしてPNAプローブ固定化チップ表面へ、相補鎖となるDNA（配列番号２：5' - GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG -3'）あるいはミスマッチDNA（配列番号３：5'- GGT TTC GAA GCG GTG GTC TTG -3'）を添加し、特異的な結合である相互作用をさせた後、吸収スペクトル変化の観察を行った。 The PNA probe (SEQ ID NO: 1: 5′-Biotin-ACC ACC ACT TC-3 ′) was immobilized on the chip prepared in Example 1. To immobilize the PNA probe, SAM was formed on the chip surface using 1 mM DDA, and then the DDA terminal carboxyl group was activated with 400 mM EDC to bind 100 mM NHS. Then, after binding streptavidin and the NHS active group, 1 μM PNA probe solution was added, and the probe was immobilized by avidin-biotin bond between biotin modified at the PNA probe end and streptavidin. Then, on the PNA probe-immobilized chip surface, complementary DNA (SEQ ID NO: 5'-GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG -3 ') or mismatched DNA (SEQ ID NO: 5'-GGT TTC GAA GCG GTG GTC After addition of TTG-3 ′) and causing interaction, which is a specific binding, the change in absorption spectrum was observed.
図３に、PNA-DNA相互作用の検出および定量の結果を示す。相補鎖DNA（ターゲットDNA）の検出限界は10 pMであった。また、PNA固定化局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップでは1μMのミスマッチDNA溶液を添加した場合、吸収スペクトルの変化は検出されなかった。よって本発明のPNA固定化局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、生体分子相互作用の特異的検出および低濃度の定量を行うことができた。 FIG. 3 shows the results of detection and quantification of the PNA-DNA interaction. The detection limit of complementary strand DNA (target DNA) was 10 pM. In addition, when a 1 μM mismatch DNA solution was added to the PNA-immobilized localized surface plasmon resonance (LSPR) measurement chip, no change in the absorption spectrum was detected. Therefore, the measurement chip for PNA-immobilized localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention was able to perform specific detection of biomolecular interaction and quantification at a low concentration.
（抗原抗体反応の検出および定量・多検体検出）
実施例１で作製したチップへ、スポッター装置（Biodot社 Biojet quanti 3000）を用いて、100μg/ml抗Fibrinogen抗体（140スポット）および抗Dinitrophenyl(DNP)抗体（140スポット）を固定化し、チップ上へ計280スポットの抗体固定化部位を有するアレイ状の局在プラズモン共鳴マルチバイオセンサーとした。そのチップ表面の各スポットへ異なる濃度のFibrinogen抗原溶液を滴下し、吸収スペクトル変化の観察を行った。
(Detection and quantification of antigen-antibody reaction / multiple sample detection)
100 μg / ml anti-Fibrinogen antibody (140 spots) and anti-Dinitrophenyl (DNP) antibody (140 spots) were immobilized on the chip prepared in Example 1 using a spotter device (Biodot Biojet quanti 3000). An array-like localized plasmon resonance multibiosensor having a total of 280 spots of antibody immobilization sites was used. Fibrinogen antigen solutions with different concentrations were dropped onto each spot on the chip surface, and the change in absorption spectrum was observed.
チップ上の抗体が固定化された任意のスポット（図４の左図：Antibody immobilized region）は、抗体が固定されていない任意のスポット（図４の左図：Bare gold region）と比較して吸収スペクトルの変化が観察された（図４の左図）。また、チップ上の抗Fibrinogen抗体が固定化された各スポットにおいては、抗原濃度（Fibrinogen）に応じた吸収スペクトルの変化が観察された（図４の右図：●:Anti-fibrinogen antibody）。なお、抗原濃度の検出限界は、1 pg/mlであった。また、抗Dinitrophenyl(DNP)抗体が固定化された各スポットにおいては、各濃度のFibrinogenを添加しても、吸収スペクトル変化が観察されなかった（図４の右図：×:Anti-DNP antibody）。よって、本発明のPNA固定化局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、多検体検出および低濃度の目的物質の検出を行うことができ、さらにはスクリーニング用途としても利用できる。 An arbitrary spot where the antibody is immobilized on the chip (left figure: Antibody immobilized region) is absorbed in comparison with an arbitrary spot where the antibody is not immobilized (left figure: Bare gold region). A change in the spectrum was observed (left figure in FIG. 4). Further, in each spot where the anti-Fibrinogen antibody was immobilized on the chip, a change in absorption spectrum according to the antigen concentration (Fibrinogen) was observed (right figure in FIG. 4: ●: Anti-fibrinogen antibody). The detection limit of the antigen concentration was 1 pg / ml. In each spot where the anti-Dinitrophenyl (DNP) antibody was immobilized, no change in the absorption spectrum was observed even when each concentration of fibrinogen was added (right figure in FIG. 4: x: Anti-DNP antibody). . Therefore, the PNA-immobilized localized surface plasmon resonance (LSPR) measurement chip of the present invention can detect multiple analytes and low-concentration target substances, and can also be used for screening applications.
（細胞刺激による代謝物の検出）
実地例１より作製したチップ表面へ一定濃度（107個/ｍｌ）の摘出したマウス脾臓細胞を添加し、IgMを用いて脾臓細胞中に存在するB細胞を刺激し、時間変化に伴う、細胞代謝物の検出を行った。
(Detection of metabolites by cell stimulation)
A certain concentration (10 7 cells / ml) of mouse spleen cells added to the surface of the chip prepared in Example 1 was added, and B cells existing in the spleen cells were stimulated with IgM. Metabolites were detected.
細胞刺激後の細胞代謝物の検出を行った結果、時間を追うごとに吸収スペクトル変化が観察され、細胞代謝物の検出を行うことが可能であった（図５：Cell＋IgM）。また、細胞＋IgM（Cell＋IgM）は、コントロール実験の細胞のみ（Only cells）、IgMのみ（Only IgM）での吸収スペクトルと比較した結果、これらのコントロール実験よりも大きい吸収スペクトル変化が観察された（図５）。よって、本発明のPNA固定化局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップは、分子量の大きい細胞を分子認識素子として使用ができ、さらに目的物質である細胞代謝物の継時的検出及び定量が可能である。 As a result of detecting cell metabolites after cell stimulation, changes in absorption spectrum were observed over time, and cell metabolites could be detected (FIG. 5: Cell + IgM). In addition, as for cell + IgM (Cell + IgM), as compared with the absorption spectrum of only the cells of the control experiment (Only cells) and only of IgM (Only IgM), a larger change in absorption spectrum was observed than these control experiments (Fig. 5). Therefore, the measurement chip for PNA-immobilized localized surface plasmon resonance (LSPR) of the present invention can use cells having a large molecular weight as a molecular recognition element, and can detect and quantify cell metabolites as target substances over time. Is possible.
本発明によれば、分子量が大きい分子認識素子が固定化可能な局在表面プラズモン共鳴（LSPR）用測定チップチップを提供することができる。また本発明のチップは、抗原・抗体反応のみならずDNAや細胞を用いて、相互作用解析や、細胞代謝物の検出も可能であり、センサーの役割を果たすだけでなく、スクリーニング用途にも適用可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a measurement chip chip for localized surface plasmon resonance (LSPR) in which a molecular recognition element having a large molecular weight can be immobilized. The chip of the present invention can be used not only for antigen / antibody reactions but also for DNA and cells to perform interaction analysis and detection of cell metabolites. Is possible.
１ 第１層
２ 第２層
３ 第３層
４ 第４層
1 1st layer 2 2nd layer 3 3rd layer 4 4th layer
Claims (11)
（１）抗体、（２）抗原、（３）ＤＮＡ、（４）ＰＮＡ、（５）細胞 The localized plasmon resonance (LSPR) biosensor according to claim 4 or 5, wherein the molecular recognition element is selected from any one or more of the following.
(1) antibody, (2) antigen, (3) DNA, (4) PNA, (5) cell
A measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) according to any one of claims 1-3 and a reagent used for the production of a localized plasmon resonance (LSPR) biosensor according to any one of claims 4-6. A measurement chip for localized plasmon resonance (LSPR) biosensor or a localized plasmon resonance (LSPR) biosensor manufacturing kit, comprising at least one of the following.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005066653A JP2006250668A (en) | 2005-03-10 | 2005-03-10 | Non-labelled biochip |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005066653A JP2006250668A (en) | 2005-03-10 | 2005-03-10 | Non-labelled biochip |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006250668A true JP2006250668A (en) | 2006-09-21 |
Family
ID=37091340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005066653A Pending JP2006250668A (en) | 2005-03-10 | 2005-03-10 | Non-labelled biochip |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006250668A (en) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008180702A (en) * | 2006-12-27 | 2008-08-07 | Canon Inc | Optical element, sensor device, and sensing method |
| JP2008216055A (en) * | 2007-03-05 | 2008-09-18 | Omron Corp | Surface plasmon resonance sensor and chip therefor |
| WO2008146569A1 (en) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K. | Biosensor |
| JP2009210569A (en) * | 2008-02-05 | 2009-09-17 | Rohm Co Ltd | Surface plasmon resonance sensor chip |
| WO2010107136A1 (en) * | 2009-03-17 | 2010-09-23 | 国立大学法人東京工業大学 | Production method for microparticle monolayer |
| WO2011021846A2 (en) | 2009-08-18 | 2011-02-24 | 한국과학기술원 | Multi-spot metal-deposited nucleic acid chip with nanostructure arrays for diagnosing corneal dystrophy, and method for producing same |
| US8048385B2 (en) | 2008-01-04 | 2011-11-01 | Rohm Co., Ltd. | Sensing chip |
| WO2011135922A1 (en) * | 2010-04-27 | 2011-11-03 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | Near-field light-source two-dimensional array and process for producing same, two-dimensional array type surface plasmon resonator, solar cell, light sensor, and biosensor |
| KR101093203B1 (en) | 2009-10-20 | 2011-12-12 | 한국과학기술원 | Copper-Capped Nanoparticle Array Biochip Based on LSPR Optical Properties and Use Thereof |
| WO2012124377A1 (en) * | 2011-03-15 | 2012-09-20 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer |
| US20130095005A1 (en) * | 2010-04-27 | 2013-04-18 | National Institute For Materials Science | Near-field light microchannel structure and near-field light microreactor |
| US9856516B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-01-02 | Avellino Labs Usa, Inc. | Methods for improved isolation of genomic DNA templates for allele detection |
| US9938581B2 (en) | 2009-04-17 | 2018-04-10 | Avellino Co., Ltd. | Primers for diagnosing Avellino corneal dystrophy |
| US9970051B2 (en) | 2010-10-01 | 2018-05-15 | Avellino Co., Ltd. | System for diagnosing Avellino corneal dystrophy |
| US10889850B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-01-12 | Avellino Lab Usa, Inc. | Methods for improved isolation of genomic DNA templates for allele detection |
| US11525160B2 (en) | 2013-11-15 | 2022-12-13 | Avellino Lab Usa, Inc. | Methods for multiplex detection of alleles associated with ophthalmic conditions |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10267841A (en) * | 1997-03-24 | 1998-10-09 | Kokuritsu Shintai Shogaisha Rehabilitation Center Souchiyou | Surface plasmon resonance-sensing device |
| JPH10339808A (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-22 | Hitachi Ltd | Reflection mirror |
| JPH111703A (en) * | 1997-06-06 | 1999-01-06 | Hitachi Ltd | Reparation of superfine particles |
| JPH11326193A (en) * | 1998-05-19 | 1999-11-26 | Hitachi Ltd | Sensor and measuring device using it |
| JP2002365210A (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-18 | Hitachi Ltd | Method of detecting living-body molecule |
| WO2003056336A2 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-10 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Improved structured-functional bonding matrices for biomolecules |
| JP2003240710A (en) * | 2001-12-21 | 2003-08-27 | Interuniv Micro Electronica Centrum Vzw | Method for analyzing and determing analyte |
| JP2003533691A (en) * | 2000-05-17 | 2003-11-11 | ジ アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティ オブ アリゾナ | Surface plasmon resonance spectrometer and surface plasmon resonance spectroscopy method |
-
2005
- 2005-03-10 JP JP2005066653A patent/JP2006250668A/en active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10267841A (en) * | 1997-03-24 | 1998-10-09 | Kokuritsu Shintai Shogaisha Rehabilitation Center Souchiyou | Surface plasmon resonance-sensing device |
| JPH10339808A (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-22 | Hitachi Ltd | Reflection mirror |
| JPH111703A (en) * | 1997-06-06 | 1999-01-06 | Hitachi Ltd | Reparation of superfine particles |
| JPH11326193A (en) * | 1998-05-19 | 1999-11-26 | Hitachi Ltd | Sensor and measuring device using it |
| JP2003533691A (en) * | 2000-05-17 | 2003-11-11 | ジ アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティ オブ アリゾナ | Surface plasmon resonance spectrometer and surface plasmon resonance spectroscopy method |
| JP2002365210A (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-18 | Hitachi Ltd | Method of detecting living-body molecule |
| JP2003240710A (en) * | 2001-12-21 | 2003-08-27 | Interuniv Micro Electronica Centrum Vzw | Method for analyzing and determing analyte |
| WO2003056336A2 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-10 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Improved structured-functional bonding matrices for biomolecules |
Cited By (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008180702A (en) * | 2006-12-27 | 2008-08-07 | Canon Inc | Optical element, sensor device, and sensing method |
| JP2008216055A (en) * | 2007-03-05 | 2008-09-18 | Omron Corp | Surface plasmon resonance sensor and chip therefor |
| WO2008146569A1 (en) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K. | Biosensor |
| US8048385B2 (en) | 2008-01-04 | 2011-11-01 | Rohm Co., Ltd. | Sensing chip |
| JP2009210569A (en) * | 2008-02-05 | 2009-09-17 | Rohm Co Ltd | Surface plasmon resonance sensor chip |
| US8035810B2 (en) | 2008-02-05 | 2011-10-11 | Rohm Co., Ltd. | Surface plasmon resonance sensor chip |
| JPWO2010107136A1 (en) * | 2009-03-17 | 2012-09-20 | 国立大学法人東京工業大学 | Method for producing fine particle monolayer |
| WO2010107136A1 (en) * | 2009-03-17 | 2010-09-23 | 国立大学法人東京工業大学 | Production method for microparticle monolayer |
| US11268146B2 (en) | 2009-04-17 | 2022-03-08 | Avellino Co., Ltd. | Primers for diagnosing Avellino corneal dystrophy |
| US9938581B2 (en) | 2009-04-17 | 2018-04-10 | Avellino Co., Ltd. | Primers for diagnosing Avellino corneal dystrophy |
| US9145583B2 (en) | 2009-08-18 | 2015-09-29 | Avellino Co., Ltd. | Multi-spot metal-capped nanostructure array nucleic acid chip for diagnosis of corneal dystrophy and preparation method thereof |
| JP2014113152A (en) * | 2009-08-18 | 2014-06-26 | Korea Advanced Inst Of Science & Technology | Multi-spot metal-deposited nucleic acid chip with nanostructure arrays for diagnosing corneal dystrophy, and method for producing same |
| WO2011021846A2 (en) | 2009-08-18 | 2011-02-24 | 한국과학기술원 | Multi-spot metal-deposited nucleic acid chip with nanostructure arrays for diagnosing corneal dystrophy, and method for producing same |
| JP2013502215A (en) * | 2009-08-18 | 2013-01-24 | コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ | Nucleic acid chip for diagnosing multi-spot metal deposited nanostructured array corneal dystrophy and method for producing the same |
| EP2468884A4 (en) * | 2009-08-18 | 2016-02-17 | Korea Advanced Inst Sci & Tech | Multi-spot metal-deposited nucleic acid chip with nanostructure arrays for diagnosing corneal dystrophy, and method for producing same |
| KR101093203B1 (en) | 2009-10-20 | 2011-12-12 | 한국과학기술원 | Copper-Capped Nanoparticle Array Biochip Based on LSPR Optical Properties and Use Thereof |
| JP5408576B2 (en) * | 2010-04-27 | 2014-02-05 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | Near-field light source two-dimensional array and manufacturing method thereof, two-dimensional array type surface plasmon resonator, solar cell, optical sensor, and biosensor |
| US8889080B2 (en) * | 2010-04-27 | 2014-11-18 | National Institute For Materials Science | Near-field light microchannel structure and near-field light microreactor |
| US20130095005A1 (en) * | 2010-04-27 | 2013-04-18 | National Institute For Materials Science | Near-field light microchannel structure and near-field light microreactor |
| WO2011135922A1 (en) * | 2010-04-27 | 2011-11-03 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | Near-field light-source two-dimensional array and process for producing same, two-dimensional array type surface plasmon resonator, solar cell, light sensor, and biosensor |
| US9970051B2 (en) | 2010-10-01 | 2018-05-15 | Avellino Co., Ltd. | System for diagnosing Avellino corneal dystrophy |
| WO2012124377A1 (en) * | 2011-03-15 | 2012-09-20 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer |
| US9957562B2 (en) | 2011-03-15 | 2018-05-01 | Hitachi High-Technologies Corporation | Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer |
| JP2012191874A (en) * | 2011-03-15 | 2012-10-11 | Hitachi High-Technologies Corp | Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer |
| US9856516B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-01-02 | Avellino Labs Usa, Inc. | Methods for improved isolation of genomic DNA templates for allele detection |
| US10889850B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-01-12 | Avellino Lab Usa, Inc. | Methods for improved isolation of genomic DNA templates for allele detection |
| US11525160B2 (en) | 2013-11-15 | 2022-12-13 | Avellino Lab Usa, Inc. | Methods for multiplex detection of alleles associated with ophthalmic conditions |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2006250668A (en) | Non-labelled biochip | |
| Marquette et al. | State of the art and recent advances in immunoanalytical systems | |
| Wu et al. | Biomedical and clinical applications of immunoassays and immunosensors for tumor markers | |
| US8043868B2 (en) | Method and apparatus for detecting an analyte | |
| Gruhl et al. | Biosensors for diagnostic applications | |
| Kim et al. | Development of indirect-competitive quartz crystal microbalance immunosensor for C-reactive protein | |
| Tang et al. | Amplification of the antigen–antibody interaction from quartz crystal microbalance immunosensors via back-filling immobilization of nanogold on biorecognition surface | |
| JP2010145408A (en) | Biochip and biological material detector | |
| JP2011519422A (en) | Surface plasmon resonance sensing device and method integrated with shear vertical surface acoustic wave | |
| Liao et al. | Enhanced sensitivity of quartz crystal microbalance immunosensor via back-conjugation of biofunctionalized magnetic beads with an external magnetic field | |
| Hiep et al. | RNA aptamer-based optical nanostructured sensor for highly sensitive and label-free detection of antigen–antibody reactions | |
| US20070166703A1 (en) | Method of detecting pathogenic microorganism in real-time, using modified flow-type surface plasmon resonance biosensor | |
| US20070122308A1 (en) | Biosensor | |
| Ramanaviciene et al. | Design of immunosensors for rapid and sensitive detection of biomarkers | |
| WO2008036465A2 (en) | A method to assess cancer susceptibility and differential diagnosis of metastases of unknown primary tumors | |
| US9851350B2 (en) | Nanohole sensor chip with reference sections | |
| US8158440B2 (en) | Method for quantitative measurement of thyroid related antibodies or antigens in a serum sample | |
| KR20060124450A (en) | An electrochemical immunosensor and fabrication method thereof | |
| Morozova et al. | Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads | |
| US20080311679A1 (en) | Biosensor Device | |
| Viguier et al. | Trends and perspectives in immunosensors | |
| Wang et al. | Aspects of recent development of immunosensors | |
| JP2010181155A (en) | Method of manufacturing substance fixing substrate | |
| KR101515155B1 (en) | Electrochemical immunoassay system utilizing gold doped silica nanoparticles, electrochemical immunoassay method and electrochemical immunoassay device using the same. | |
| Hadžić et al. | Immunosensors: Recent Advances and Applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080307 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080403 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080403 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20100204 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101111 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110106 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110126 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111024 |