JP2006180745A - フェノール類２量体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 充分な収率をもってフェノール類２量体を与えることができ、酵素の反応系からの除去がいらず、同じ酵素を用いて繰り返し反応が行なえる製造方法を提供する。
【解決手段】 オキシダーゼを固定化した酵素充填層を有するカラム中に、炭素数１〜４のアルキル基を有するジアルキルフェノール及び炭素数１〜４のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールからなる群から選ばれた少なくとも一種のジ置換フェノールを水性媒質中に含有させた溶液を流し、カラム中で酵素反応を行う第一工程と、還元剤を添加する第二工程を有することを特徴とするフェノール類２量体の製造方法
【選択図】 なし

Description

本発明は、酵素法によるフェノール類２量体の製造方法に関する。

置換基を有するフェノール（以下、置換フェノールあるいはフェノール類という）の２量体（以下、フェノール類２量体という。）は樹脂材料などとして広く用いられており、従来、各種フェノール類２量体を得るための方法が提案されている。
特許文献１では、水性媒体中において、ペルオキシダーゼ酵素、過酸化物及びラジカル伝達薬剤の存在下で、水酸基等の置換基を有する置換芳香族化合物を反応させる２量体化方法が記載されている。
特許文献２では、便利で安価な合成方法への要望に対応して、過酸化水素等の過酸化物が存在する水性媒質中で、炭素原子数１ないし６のアルキル基を持つ２，４−または２，６−ジアルキルフェノールを大豆ペルオキシダーゼ酵素等のペルオキシダーゼ酵素と反応させ、２，４−または２，６−ジアルキルフェノールの酸化的カップリングによりテトラアルキルビフェノールを生成する方法、あるいはテトラアルキルキノンを生成し、このテトラアルキルキノンを還元してテトラアルキルビフェノール（ジアルキルフェノール２量体に相当する）を生成する方法が記載されている。
特許文献３では、西洋ワサビに多く含まれている酵素であるペルオキシダーゼを固定化する方法が記載されている。
特表平１１−５０３０２１号公報 特表平１１−５０６９０３号公報 特開平８−７１５３４号公報

特許文献１、２に記載の方法のいずれにおいても、フェノール類２量体を得る反応を生起させるには、原料であるフェノール類、反応のためのペルオキシダーゼ酵素の他に、過酸化物を使用する必要があった。また、目的とするフェノール類２量体の他に重合体が同時に得られ、目的とするフェノール類２量体を効率的に製造することが難しかった。

本発明の目的は、上記事情に鑑みてなされたもので、充分な収率をもってフェノール類２量体を与えることができ、更に酵素を固定化することにより酵素の反応系からの除去がいらず、同じ酵素を用いて繰り返し反応が行なえる製造方法を提供するものである。

固定化酵素は特許文献３の記載のように既に知られている。しかしながら、本発明者らは、オキシダーゼを固定化させた固定化酵素を、水性媒質中に懸濁させて置換フェノールの反応を行なったが、酵素の固定化により反応性が低下し、フェノール類２量体の収率を著しく低下することを見出した。更にこの低下は、オキシダーゼを固定化した固定化酵素をカラムに充填し、水性媒質中に基質を含有させた反応溶液を流し酵素反応を行なった後、還元剤を添加することにより、フェノール類２量体の反応性を大きく向上させることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
オキシダーゼを固定化した酵素充填層を有するカラム中に、炭素数１〜４のアルキル基を有するジアルキルフェノール及び炭素数１〜４のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールからなる群から選ばれた少なくとも一種のジ置換フェノールを水性媒質中に含有させた溶液を流し、カラム中で酵素反応を行う第一工程と、還元剤を添加する第二工程を有することを特徴とするフェノール類２量体の製造方法を提供する。

本発明の製造方法によれば、充分な収率をもってフェノール類２量体を提供することができる。

本発明のフェノール類２量体の製造方法の第一工程は、水性媒質中に溶解又は懸濁させた、炭素数１〜４のアルキル基を有するジアルキルフェノール及び炭素数１〜４のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールからなる群から選ばれた少なくとも一種のジ置換フェノールを、カラム中に固定化されたオキシダーゼと反応させる。

第一工程は、例えば、前記ジ置換フェノールを、水性媒質中に溶解あるいは分散させた反応液を調製し、反応液及びオキシダーゼが固定化されたカラムを所望の反応温度に制御することにより行うことができる。
なお、前記ジ置換フェノールの溶解度をあげるため、前記水性媒質中に有機溶媒を添加してもよい。この場合、後述の水性媒質における有機溶媒含有率が１０体積％以下となるようにすればよい。

（水性媒質）
水性媒質としては、水、ｐＨ緩衝液、または、水もしくはｐＨ緩衝液と有機溶媒との混合溶液が用いられる。
ｐＨ緩衝液としては、例えば、マロン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、等が挙げられる。
水性媒質が水と有機溶媒の混合溶液である場合、有機溶媒の割合は１０体積％以下、好ましくは５体積％以下である。ここで、利用しうる有機溶媒の代表的な例としては、ヘキサン、トリクロロメタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等が挙げられる。

（ジ置換フェノール）
本発明の製造方法において、基質たるジ置換フェノールは、炭素数１〜４のアルキル基を有するジアルキルフェノール及び炭素数１〜４のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールからなる群から選ばれた少なくとも一種のジ置換フェノールである。
前記ジ置換フェノールは、反応性および得られるフェノール類２量体の実用性の点から、２，６‐ジ置換フェノールが好ましい。
また、前記ジ置換フェノールにおいて、アルキル基、アルコキシ基の炭素数は１であることが好ましい。
前記ジ置換フェノールとしては、前記ジアルキルフェノール、前記ジアルコキシフェノールをそれぞれ単独で用いてもよいし、前記ジアルキルフェノール及び前記ジアルコキシフェノールを併用してもよい。得られるフェノール類２量体を各種用途に適用する際の利便性という観点からは、前記ジアルキルフェノール、前記ジアルコキシフェノールをそれぞれ単独で用いることが好ましい。

本発明において、ジ置換フェノールに用いられるジアルキルフェノールは、炭素数１〜４のアルキル基を有する。本発明に使用可能なジアルキルフェノールとしては、２，４‐ジアルキルフェノール、２，６‐ジアルキルフェノール、３，５‐ジアルキルフェノール、２，３‐ジアルキルフェノール、２，５‐ジアルキルフェノール等の、各種置換位置のジアルキルフェノールが挙げられる。これらの中でも、２，４‐ジ置換体、２，６‐ジ置換体が好ましく、特に、下記一般式（１）に示す２，６‐ジアルキルフェノールを用いることが、フェノール類２量体の収率の観点から好ましい。

（式中Ｒ^１及びＲ^２は独立して炭素数１〜４のアルキル基を示す。）
ジアルキルフェノールのアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。このような炭素数１〜４のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられるが、メチル基であることが好ましい。式（１）におけるＲ^１とＲ^２は、同じでも異なっていてもよい。
また、２，６−ジアルキルフェノールの中でも、下式（２）に示す２，６−ジメチルフェノールが特に好ましく用いられる。これは、得られるフェノール類２量体の実用性の点で有利なためである。

前記ジ置換フェノールにおいて、異なる２種以上のジアルキルフェノールを用いても構わない。

本発明において、ジ置換フェノールに用いられるジアルコキシフェノールは、炭素数１〜４のアルコキシ基を有する。本発明に使用可能なジアルコキシフェノールとしては、２，４‐ジアルコキシフェノール、２，６‐ジアルコキシフェノール、３，５‐ジアルコキシフェノール、２，３‐ジアルコキシフェノール、２，５‐ジアルコキシフェノール等の、各種置換位置のジアルコキシフェノールが挙げられる。これらの中でも、２，４‐ジ置換体、２，６‐ジ置換体が好ましく、特に、下記一般式（３）に示す２，６‐ジアルコキシフェノールを用いることが、フェノール類２量体の収率の観点から好ましい。

（式中Ｒ^１及びＲ^２は独立して炭素数１〜４のアルキル基を示す。）
ジアルコキシフェノールのアルコキシ基を構成するアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。このような炭素数１〜４のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられるが、メチル基であることが好ましい。式（３）におけるＲ^１とＲ^２は、同じでも異なっていてもよい。
また、２，６−ジアルコキシフェノールの中でも、下式（４）に示す２，６−ジメトキシフェノールが特に好ましく用いられる。これは、得られるフェノール類２量体の実用性の点で有利なためである。

前記ジ置換フェノールにおいて、異なる２種以上のジアルコキシフェノールを用いても構わない。

（オキシダーゼ）
本発明で使用するオキシダーゼには、例えばカテコールオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ラッカーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ等があり、その中で、フェノール類２量体の収率の点でラッカーゼが好ましい。本発明において、オキシダーゼは１種で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
ラッカーゼは、植物、動物、微生物に広く存在することが知られており、植物由来、微生物由来のラッカーゼが好ましい。
植物由来では漆の木由来のラッカーゼが好ましい。また、微生物由来のラッカーゼとしては、例えば細菌、真菌（糸状菌及び酵母を含む）に由来するものが挙げられるが、真菌のうち白色腐朽菌などの担子菌類や子のう菌類に由来するラッカーゼが、特に好ましいものとして挙げられる。
このような、特に好ましいラッカーゼとしては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属；ピリキュラリア・オリザエ（Ｐ．ｐｒｙｚａｅ）などのピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属；トラメテス・ビローサ（Ｔ．ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・バーシカラー（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）等のホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属；リゾクトニア・ソラニ（Ｒ．ｓｏｌａｎｉ）等のリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属；コプリヌス・シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）等のコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属；コリオルス・ヒルスツス（Ｃ．ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、コリオルス・バーシカラー（Ｃ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）等のコリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属に由来するものが例示できる。
また、市販されているラッカーゼとして、「ラッカーゼダイワ ＥＣ−Ｙ１２０」（商品名；大和化成（株）製）等が例示される。
オキシダーゼとしてラッカーゼを用いる場合、使用されるラッカーゼは特に制限されないが、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属由来のラッカーゼ、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属由来のラッカーゼから選ばれる少なくとも１種を用いることが、フェノール類２量体合成のために好ましい。
これらのラッカーゼは、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。

（固定化酵素）
酵素の固定化方法等は、市販の物や公知の方法を使えばよく、特に限定はない。
化学的又は物理的に酵素を固定化したものを挙げることができる。
担体としては、カオリナイトやガラスなどの無機物やポリアクリルアミドやポリスチレンなどの有機物を使用することができる。担体の形状としては、単位体積当りの酵素量が増えることによって反応性を高めることができることから、多孔質体であることが望ましい。
これら担体への第一の結合方法としては、担体表面の静電特性や表面形状と酵素との親和性を利用した物理的結合方式である非共有結合方法が挙げられる。この方式により酵素を担体へ結合させることが困難である場合には、第二の結合方法として、官能基どうしの化学反応を利用した共有結合方法が挙げられる。共有結合方法を利用する上では、酵素の持つＮＨ２基やＣＯＯＨ基と結合することが可能な官能基を、担体の表面に導入する必要がある。例えばガラス由来の担体に対しては、各種のシランカップリング剤を用いることにより、担体表面に様々な官能基を導入することが可能である。また、有機物由来の担体であれば、表面の官能基を修飾する方法や、担体を合成する際に官能基を持った化合物との共重合により、担体表面に様々な官能基を導入することが可能となる。

（カラム充填）
また、固定化酵素カラムは、得られた固定化酵素を緩衝液等で洗浄し、カラムに充填液とともに充填して製造することができる。

（固定化酵素カラムによる二量化反応）
固定化酵素カラムを用いてフェノール類２量体を合成する方法としては、基質を溶解させた展開液をカラムに通す方法が挙げられる。酵素が担体に固定されていること以外は、一般的な酵素反応と同様である。そのため展開液としては、一般的な酵素反応において用いられる緩衝液等に基質を溶解させた溶液を用いることが好ましい。反応時間は、カラム体積と展開液流速によって制御することが可能である。基質濃度と酵素濃度については、フェノール類２量体を効率よく合成する上では、基質濃度／酵素濃度比は小さい方が一般的には好ましく、これは、固定化酵素カラムを用いる上でも同様である。このため、２量体を優先的に得るためには、基質濃度を小さくする必要があり、多くの２量体生成物を得ることが難しい。

通常の酵素反応では、基質濃度を上げていくと、高分子体が得られやすくなるため２量化の比率が低くなる。フェノール類２量体を効率よく合成する上では、基質濃度／酵素濃度比は小さい方が望ましい。固定化酵素をバッチ式で使用する場合、展開液中に固定化酵素が分散しなくてはならい。しかしながら担体の分散性は非常に低くなりがちであり、その結果、酵素の拡散効率が低くなり見かけの酵素量は大きく減少する。すなわち、基質濃度／酵素濃度比が大きくなる。

一方、固定化酵素をカラム式で使用する場合には、展開液がカラム中を通過することになる。そのため先ず、固定化酵素を分散させる必要がない。さらに、分散している酵素をカラム部分に集めて使用するため、局所的にみれば酵素が非常に高濃度で存在することとなる。この二つの優位性のために、バッチ式で行うよりも見かけの酵素量が大きくなり、その結果、基質濃度／酵素濃度比が小さくなっていると考えられる。
以上のことから、本発明の方法では高い基質濃度に対しても２量体を多く得ることができる。

基質としてジアルキルフェノールを用いる場合、酵素濃度は好ましくは２μＭ以上、さらに好ましくは４μＭ以上である。また、ジアルコキシフェノールを用いる場合、酵素濃度は、好ましくは１μＭ以上、さらに好ましくは２μＭ以上である。

本発明においては、前記第一工程の後、還元剤を添加する第二工程を行う。
この第二工程を行うことで、フェノール類２量体を主として含む生成物が得られる。

（還元剤）
還元剤は特に限定されず、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム等があげられる。
還元剤の添加量は、後述の第一生成物中に含まれるキノン類２量体、具体的にはジアルコキシキノン２量体及び／又はジアルキルキノン２量体の濃度の当量とすることが好ましい。

本発明の製造方法においては、第一工程として、例えば上記反応液を調製し、所望の反応温度で保持することにより、ジ置換フェノールからジ置換キノンの二量体（キノン類２量体）及びジ置換フェノールの２量体（フェノール類２量体）が生成する反応が進行すると推定される。したがって、第一工程による反応生成物（第一生成物）は、キノン類２量体及びフェノール類２量体を含み、また、反応時間に応じて未反応のジ置換フェノールを含むと推定される。

例えば、ジ置換フェノールとして２，６−ジアルキルフェノールを用いた場合、第一工程によって、下式（Ｉ）に示すように、２，６−ジアルキルフェノール（Ａ）から２，６‐ジアルキルフェノール２量体（Ｂ）及び２，６−ジアルキルキノン２量体（２，２’，６，６’−テトラアルキルキノン）（Ｃ）が生成する反応が起こると推定される。

（式中Ｒ^１及びＲ^２は独立して炭素数１〜４のアルキル基を示す。）
さらに第二工程として還元剤を添加することで、キノン類２量体が還元されてフェノール類２量体が生成する反応が進行するものと推定される。例えば、下式（ＩＩ）に示すように、２，６‐ジアルキルキノン２量体（Ｃ）が還元されて、２，６‐ジアルキルフェノール２量体（Ｂ）が生成すると推定される。

（式中Ｒ^１及びＲ^２は独立して炭素数１〜４のアルキル基を示す。）

第一工程の反応温度は、前記ジ置換フェノールの種類、基質濃度、オキシダーゼの種類、酵素濃度等に応じて調整されうるが、比較的低温に設定することができ、５〜６０℃とすることが好ましく、１０〜４０℃とすることがさらに好ましい。また、反応温度は室温であってもよい。

第一工程において、その他ｐＨ等の反応条件は、オキシダーゼの種類等に応じて適宜調整されうるが、好ましくはｐＨ ３．５〜５．５、特に好ましくはｐＨ ４．０〜５．０とすることが好ましい。

本発明において、第一工程の反応時間は、オキシダーゼと前記ジ置換フェノールとを水性媒質中で共存させた時点から、還元剤が添加される時点までとなる。ここで、第一工程の反応時間は、前記ジ置換フェノールが充分に消費される時間とすることが好ましい。ジ置換フェノールの消費は、例えば、還元剤が未添加の生成物を分取して高速液体クロマトグラフィーに供し、検出波長を前記ジ置換フェノールの特異吸収波長（２７０ｎｍ付近）としてジ置換フェノールの残存量を測定することによって確認可能である。

第一工程において、上記反応液を調製した後、固定化酵素を反応系で懸濁して使用したり、反応を長時間行わせすぎると、下式（III）に例示するような、ジ置換フェノール（例では２，６−ジアルキルフェノール）（Ａ）からのポリフェニレンアルコキシド（Ｄ）の生成が進行する場合がある。ここで、ポリフェニレンアルコキシドが生成する機構は、ジ置換フェノールからいったんキノン類２量体が生成し、このキノン類２量体が重合してポリフェニレンアルコキシドが生成するものと推定される。

（式中Ｒ^１及びＲ^２は独立して炭素数１〜４のアルキル基を示す。）

第一工程の好適な反応時間は、酵素濃度、ジ置換フェノール（基質）の種類、基質濃度等により異なり得るが、例えばジ置換フェノールとしてジアルキルフェノールを用い、基質濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ、酵素濃度を１ｍｇ／ｍｌ（１ｍｇ−酵素／ｇ−担体質量かつ、１ｇ−担体質量／ｍｌ−担体体積）とする場合、反応時間は好ましくは０．１〜２４時間、さらに好ましくは０．５〜２０時間である。

また、例えばジ置換フェノールとしてジアルコキシフェノールを用い、基質濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ、酵素濃度を１ｍｇ／ｍｌ（１ｍｇ−酵素／ｇ−担体質量かつ、１ｇ−担体質量／ｍｌ−担体体積）とする場合、反応時間は好ましくは０．０５〜２４時間、さらに好ましくは０．１〜２０時間である。

第二工程の反応温度は、フェノール類２量体を安定に得るためには０℃以上とすることが好ましい。製造効率、副生物の生成抑制の面では反応温度が低い方が好ましく、２５℃以下とすることが好ましい。本発明では、第二工程の反応温度を室温としつつ充分な収率をあげることができるため、室温とすることが、収率と製造効率とのバランス面で好ましい。

本発明において、第二工程の反応時間は、還元剤の添加時点を起点とする。
第二工程の反応時間は、好ましくは３０秒以下、さらに好ましくは５〜１０秒である。本発明の製造方法では、第二工程の反応時間が上記の通り非常に短くとも、充分な収率のフェノール類２量体を得ることができる。

第二工程において、ｐＨ等のその他反応条件は、オキシダーゼの種類等に応じて適宜調整されうるが、ｐＨ ２．５〜６．５、特に好ましくはｐＨ ４．０〜５．０とすることが好ましい。

本発明の製造方法によれば、前記ジアルキルフェノール及び前記ジアルコキシフェノールからなる群から選ばれる少なくとも一種のジ置換フェノールと、オキシダーゼとを用い、さらに還元剤を添加することにより、基質および固定化した酵素以外の試薬等を用いることなく、十分な収率をもってフェノール類２量体を得ることができる。したがって、製造効率を損なうことなく、かつ簡便に、フェノール類２量体を提供することができる。

しかも、製造工程全体を通して、反応温度等の反応条件を緩やかに設定しつつ、充分な収率を達成することができる。また、固定化酵素をカラムに充填して使用するため、反応後に酵素を分離する必要もない。

なお、特許文献２に記載されている、大豆ペルオキシダーゼを用いたフェノール類２量体の合成では、得られるフェノール類２量体の収率が安定しない。また、フェノール類２量体を得るまでの製造工程において、絶えず加熱等の温度制御が必要であり、効率よく生産を行うには問題となる。

これに対し、本発明の製造方法では、収率の安定性を維持しつつ、室温で反応を行うことが可能であり、達成される収率（ジ置換フェノールに対するフェノール類２量体の収率）も、大豆ぺルオキシダーゼを用いる場合より高い水準となる。

本発明の方法により得られるフェノール類２量体は、種々の分野、例えば、エポキシ樹脂、難燃剤、酸化防止剤、ポリエステル、ポリカーボネート等の製造、および芳香族ジオールが使用される他の用途に広く使用することができる。
本発明の製造方法により得られるフェノール類２量体は、上記の第二工程の生成物中に高含有率で含まれる形態で得られる。したがって、本発明の方法により得られるフェノール類２量体を各種用途に使用する場合、当該生成物をそのまま用いてもよいし、あるいは公知の方法でフェノール類２量体を精製して使用してもよい。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を示す。
以下実施例、比較例においては、酵素としてラッカーゼ（「ラッカーゼダイワ ＥＣ−Ｙ１２０」（商品名；大和化成（株）製））を使用し、固定化担体には多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト（「Ｔｏｙｏｎｉｔｅ−２００」（商品名；東洋電化工業（株）製））を使用した。基質としては、ジアルキルフェノールとして２，６‐ジメチルフェノール（以下、２，６−ＤＭＰと言う。）（和光純薬社製「２，６‐ジメチルフェノール」）を用いた。また、以下、還元剤として亜ジチオン酸ナトリウム（和光純薬社製「ハイドロサルファイトナトリウム」）を用いた。

（固定化担体の調製）
ラッカーゼ１０ｇをＭｃｌｌｖａｉｎ氏緩衝液（ｐＨ４．６）に溶解させ２００ｍｇ／ｍｌの固定用酵素溶液を５０ｍｌ調製した。この固定用酵素溶液にトヨナイト５ｇを加え、振とう機（「ダブルシェーカーＮＲ−３０」（商品名；タイテック（株）製））を用いて１２０〜１４０ｍｉｎ^−１の速さで一昼夜、振とうを行った。振とう後の溶液を、１５００ｒｐｍにて５分間遠心し、固定用酵素溶液をピペットにて分取した。分取した溶液を固定化後酵素溶液とする。

溶液を分取し得られたトヨナイトに、１０ｍｌのＭｃｌｌｖａｉｎ氏緩衝液（ｐＨ４．６）を加え懸濁した後、１５００ｒｐｍにて５分間遠心し、遠心後の上清を固定化後酵素溶液に加えた。この作業を計３回行い、ラッカーゼがトヨナイト上に固定化されている固定化酵素（Ａ）を得た。

（固定化担体の評価）
固定用酵素溶液ならびに固定化後酵素溶液中の酵素量をタンパク定量キット（「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ」（商品名；日本バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製））にて測定し、その差分がトヨナイトに結合したものとした。前述の方法により得られた各試料についてこの測定を行った結果、固定化酵素（Ａ）にはトヨナイト１ｇ当り２．７６ｍｇのラッカーゼが結合していることを確認した。

（固定化酵素カラムの作製）
調製した固定化酵素（Ａ）３．６２ｇをＭｃｌｌｖａｉｎ氏緩衝液（ｐＨ４．６）に懸濁し、懸濁液を低圧クロマトグラフィー用ガラスカラム（「エコノカラム」（底面積０．７９ｃｍ２）（商品名；日本バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製））に充填して固定化酵素カラム（Ｂ）を得た。充填後、固定化担体の占める高さは約２ｃｍとなり、体積にして約１．６ｃｍ^３であった。

（展開液の調整）
アセトン中に調製した１Ｍの２，６−ＤＭＰ溶液１００μｌをＭｃｌｌｖａｉｎ氏緩衝液（ｐＨ４．６）にて１００倍に希釈した溶液を、展開液として調整した。

（高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと言う。）評価サンプルの調製）
第一工程を終了した展開液１０ｍｌに対して、１ｇの還元剤を加え室温にて５分間放置した。これにより、第二工程の反応を行った。反応終了後の展開液にアセトニトリルを１０ｍｌ加えて激しく撹拌した後、１０分間静置した。静置後の上澄み液を分取した。
分取した溶液５００μｌと内部標準としてアセトニトリルに溶解した１ｍＭの２，６−ジメトキシフェノール（以下２，６−ＤＭＯＰと言う。）（和光純薬社製「２，６‐ジメトキシフェノール」）５００μｌとを混合し、０．４５μｍのフィルター（「ＰＴＦＥ０．４５μｍ」（商品名；アドバンテック東洋(株)製））を通過させたものを、ＨＰＬＣに供した。

（評価方法）
本実施例においては、生成物について、下記条件でＨＰＬＣによる測定を行った。
検出装置：ＨＰＬＣ
カラム：ＳＴＲ ＯＤＳ−ＩＩ（島津ジーエルシー）
溶出条件：０．５９ ｇ／Ｌ リン酸水溶液（２０％ アセトニトリル）／１００％ アセトニトリル
０−５分：２０ ％（アセトニトリル％）
５−２１分：２０−１００ ％ グラジェント
２１−３１分：１００ ％
送液速度：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２７０ ｎｍ

フェノール類２量体の収率：上記条件によるＨＰＬＣ測定において検出される吸収ピークを内部標準により換算した強度から、生成物に含まれるフェノール類２量体の生成量を比較した。

（実施例１）
（固定化酵素カラムによる二量化反応）
１０ｍｌの展開液を、ペリスタルティックポンプを用いて、流速１．０ｍｌ／分にて固定化酵素カラム（Ｂ）中を通過させた。さらに通過後の展開液に還元剤を１ｇ加えて、２量化反応を行った。

（比較例１）
（固定化酵素を用いたバッチ懸濁による二量化反応）
１０ｍｌの展開液中に、固定化酵素（Ａ）３．６２ｇを加えて、２分間振とうさせた。さらに反応後の展開液に還元剤を１ｇ加えて、２量化反応を行った。

（比較例２）
（固定化しない酵素を用いたバッチ懸濁による二量化反応）
１０ｍｌの展開液中に、固定化に供したラッカーゼ１０．００ｍｇを加えて、２分間振とうさせた。さらに反応後の展開液に還元剤を１ｇ加えて、２量化反応を行った。

実施例１及び比較例１で得られた結果を上記に従いＨＰＬＣにより評価した結果を表１にまとめた。

比較例１と比較例２の比較により、酵素を固定化することのより、２量体生成比が低下していることがわかる。この固定化酵素をカラム充填してカラム中で反応を行なうことにより、２量体生成比が大きく向上していることがわかる。

本発明で用いるカラム酵素反応では、固定化酵素を用いたバッチ合成に比べ、目的とするフェノール２量体を優位に得ることができた。

本発明の製造方法で得られるフェノール類２量体は、塗料などに用いられる樹脂材料として好適に用いられる。

Claims (4)

1. オキシダーゼを固定化した酵素充填層を有するカラム中に、炭素数１〜４のアルキル基を有するジアルキルフェノール及び炭素数１〜４のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールからなる群から選ばれた少なくとも一種のジ置換フェノールを水性媒質中に含有させた溶液を流し、カラム中で酵素反応を行う第一工程と、還元剤を添加する第二工程を有することを特徴とするフェノール類２量体の製造方法。
2. 前記オキシダーゼが、ラッカーゼである請求項１に記載のフェノール類２量体の製造方法。
3. 前記ジ置換フェノールが、２，６−ジ置換フェノールである請求項１に記載のフェノール類２量体の製造方法。
4. 前記酵素充填層が、オキシダーゼを多孔質体に固定化した固定化酵素を充填したものである請求項１に記載のフェノール類２量体の製造方法。