JP2006166907A5 - - Google Patents

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  1. (1)生物試料をジチオスレイトールの存在下、逆転写反応に供し、RNA-DNA複合体を調製し、
    (2)得られたRNA-DNA複合体のDNA鎖の3'端にポリN(NはGまたはCを示す)を形成するテーリング反応を、RNA-DNA複合体を希釈すること無しにマグネシウムイオンを含有するTris-HClバッファー中で行い、
    (3)ポリNを形成したRNA-DNA複合体のDNA鎖を鋳型とし、かつオリゴ-dNアダプター(dNのNはGまたはCを示し、オリゴ-dNアダプターは、オリゴ-dN部と(4)におけるPCRのプライマーの少なくとも一部と同一の配列を有するアダプター部とを含む)を一方のプライマーとして2本鎖DNA合成を行い、
    (4)得られた2本鎖DNA 中のオリゴ-dNアダプターを含んでいる1本鎖DNAを鋳型とし、かつ上記アダプターに含まれる配列を一方のプライマーとしてさらにPCRを行う
    ことを含む、生物試料に含まれる目的遺伝子を増幅する方法であって、
    生物試料が、1つの細胞であること、
    (1)において調製したRNA-DNA複合体を、逆転写反応の基質と分離することを含む精製をすることなしに(2)においてテーリング反応を行い、かつ
    (2)におけるテーリング反応は、
    ポリ鎖がポリGであり、反応液中のdGTP濃度をdATP、dCTP及びdTTPの濃度より２倍以上高くする、または
    ポリ鎖がポリCであり、反応液中のdCTP濃度をdATP、dGTP、及びdTTPの濃度より２倍以上高くする、
    ことを特徴とする前記方法。
  2. (1)〜(3)の反応は、1つの容器で、反応用試薬及び酵素を前記容器に順次追加することで行う、請求項1に記載の方法。
  3. (3)における2本鎖DNA合成は、ポリ鎖を形成したdNTPの濃度を、それ以外のdNTPの濃度の10倍以下にして行う請求項1または2に記載の方法。
  4. (4)におけるPCRは、ポリ鎖を形成したdNTPの濃度を、それ以外のdNTPの濃度の5倍以下にして行う請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
  5. (4)のPCRの後に、(5)ネステッドPCRを行う請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
  6. (1)〜(4)または(1)〜(5)の反応をマグネシウムイオンの存在下で行う請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
  7. (1)における逆転写反応の反応溶液の容量を1〜5μｌの範囲とし、
    (3)における2本鎖DNA合成の反応溶液の容量を25〜100μｌの範囲とする請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
  8. 生物試料がB細胞であり、目的遺伝子が抗体遺伝子である請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
  9. 生物試料がT細胞であり、目的遺伝子が抗原受容体遺伝子である請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
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