JP2006113077A - リガンドの迅速な同定のための拡張されたテザー化アプローチ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
プロセスであって、
(i)目的の第1の部位および第2の部位を有する標的分子(TM)を、複数の第1の小さい有機リガンド候補と接触させる工程であって、このTMは目的の第1の部位または第1の部位付近で反応性の求核剤または求電子剤を含むかまたは含むように改変されており、この候補は、この求核剤または求電子剤と反応性の官能基を有する工程;
(ii)(i)の複合体由来の第1のリガンドを同定する工程;および
(iii)(ii)で同定された第1のリガンドの誘導体を設計して、TM上の求核剤または求電子剤と反応性の第1の官能基、および目的の第2の部位に対する親和性を有する第2のリガンドと反応性の第2の官能基を有する、SMEを提供する工程
を包含する、プロセス。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、一般に、標的分子に対する結合パートナーの迅速な同定および特徴付けのための、および改善された結合親和性を有する結合パートナーを提供するための方法に関する。より詳細には、本発明は、標的分子上で互いに近くで結合する低分子フラグメントの迅速な同定のための、改善されたテザー化(tethering)方法に関する。この方法は、より高い親和性の化合物を生成するために、標的生物学的分子(TBM)(例えば、ポリペプチドまたは他の高分子)上に予め形成されたリンカーを介して、目的の部位付近に弱く結合する低分子リガンドの迅速な同定に特に適切である。
薬物発見プロセスは、通常、適度な親和性のリード(Kd 約1〜10μM)を同定するための化合物ライブラリー(代表的には、数十万のメンバー)の大量のスクリーニングから開始する。いくつかの標的は、このスクリーニングプロセスに十分に適切であるが、ほとんどは、適度な親和性のリードが得るのが困難であることから、問題となる。より弱い結合化合物を同定およびその後に最適化することは、この成功率を改善するが、高い濃度でのスクリーニングは、一般に、化合物の不溶性およびアッセイの人為的結果に起因して、実用的でない。さらに、代表的なスクリーニングプロセスは、薬物設計のための特定の部位を標的とせず、高スループットアッセイが利用可能である部位のみを標的とする。最後に、多くの従来のスクリーニング方法は、阻害アッセイに依存し、これは、しばしば、反応性化学種または変性剤によって生じる人為的結果を受けやすい。
(i)標的生物学的分子(TBM)を提供する工程であって、該TBMは、該TBM上の目的の第1の部位付近に反応性の求核剤を含むかまたは含むように改変されている、工程;
(ii)(i)由来のTBMを、第1の官能基および第2の官能基を有する低分子エキステンダーと接触させる工程であって、該第1の官能基は、該TBM上の求核剤と反応性である、工程;
(iii)該TBM上の求核剤と該低分子エキステンダー上の第1の官能基との間で共有結合が形成されるように条件を調整する工程であって、それによって、該TBMと該低分子エキステンダーとを含む共有結合複合体を形成し、該複合体は、該TBM上の目的の第2の部位付近に第2の官能基を提示する、工程;
(iv)(iii)由来の該複合体に有機低分子のライブラリーを接触させる工程であって、各々の分子は、(iii)由来の該複合体中に存在する該低分子エキステンダー上の第2の官能基と反応し得る官能基を有し、該工程は、該TBM上の目的の第2の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、該複合体と化学結合を形成するような条件下で行われる、工程;および
(v)(iv)由来の該ライブラリーのメンバーを同定する工程
を包含する、プロセス。
(項目2) 項目1に記載のプロセスであって、前記低分子エキステンダー上の前記第2の官能基が、遊離チオールまたは保護化チオールである、プロセス。
(項目3) 項目2に記載のプロセスであって、前記工程(iv)において、工程(iii)由来の前記複合体を有機低分子のライブラリーと接触させ、該分子の各々が、遊離チオールまたは交換可能なジスルフィド連結基を有する、プロセス。
(項目4) 項目3に記載のプロセスであって、工程(iii)由来の前記複合体と前記有機低分子のライブラリーとを、チオール交換条件下で接触させ、ここで、前記TBM上の目的の第2の部位に対する最も高い親和性を有する該ライブラリーのメンバーが、該複合体とジスルフィド結合を形成する、プロセス。
(項目5) 項目4に記載のプロセスであって、前記チオール交換条件が、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスレイトール(DTE)、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびトリス(シアノエチル)ホスフィンからなる群より選択されるジスルフィド還元剤の添加から生じる、プロセス。
(項目6) 項目1に記載のプロセスであって、前記低分子エキステンダーから本質的になる分子を合成する工程をさらに包含し、ここで、前記第1の官能基が、もはや前記TBM上の求核剤と反応性でなく、前記第2の官能基と工程(i)で同定された前記ライブラリーのメンバーとの間のジスルフィド結合が、異なる基で置換される、プロセス。
(項目7) 前記ジスルフィド結合が、アルキル基で置換される、項目6に記載のプロセス。
(項目8) 前記分子の誘導体を合成する工程をさらに包含する、項目6に記載のプロセス。
(項目9) 前記反応性求核剤が、チオールである、項目1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目10) 前記第1の官能基が、前記チオールと不可逆的な共有結合を形成する、項目9に記載のプロセス。
(項目11) 項目9に記載のプロセスであって、工程(i)の後に、以下:
(a)チオール交換条件下で、前記TBMを有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の分子が、交換可能なジスルフィド連結基を有し、ここで、前記目的の第1の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、該TBMとジスルフィド結合を形成する、工程;
(b)(a)由来の該ライブラリーのメンバーを同定する工程;
(c)(b)における該ライブラリーのメンバーの誘導体を形成する工程であって、該誘導体は、第1の官能基および第2の官能基を有する低分子エキステンダーであり、該第1の官能基は、前記求核剤と反応性であり、そして該第2の官能基は、チオールまたは保護化チオールである、工程
をさらに包含する、プロセス。
(項目12) 項目11に記載のプロセスであって、工程(a)が、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスレイトール(DTE)、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびトリス(シアノエチル)ホスフィンからなる群より選択されるジスルフィド還元剤を添加することをさらに包含する、プロセス。
(項目13) 前記反応性の求核剤が、ヒドロキシル(−OH)基である、項目1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目14) 項目13に記載のプロセスであって、前記求核剤と反応性の基が、活性化カルボニル、エポキシド、アジリジン、芳香族スルホネート、ヘミアセタール、ハロメチルケトン、アリールアシルオキシメチルケトン、ジスルフィド、チオスルホネート、およびチオスルフェートからなる群より選択される、プロセス。
(項目15) 項目14に記載のプロセスであって、該活性化カルボニルが、アルデヒド、ケトン、エステルまたはアシルハライドの形態である、プロセス。
(項目16) 項目15に記載のプロセスであって、前記活性化カルボニルが、ハロメチルケトン、アリールアシルオキソメチルケトンおよびチオエステルからなる群より選択される、プロセス。
(項目17) 前記反応性の求核剤が、アミンである、項目1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目18) 前記同定する工程が、質量分析を含む、項目1〜17のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目19) 項目3または11に記載のプロセスであって、交換可能なジスルフィド連結基を有する有機低分子の前記ライブラリーの各々の分子が、システアミン部分を含む、プロセス。
(項目20) 項目1〜19のいずれか1項に記載のプロセスであって、前記TBMが、リンパ球細胞表面レセプター、酵素、ステロイドレセプター、核タンパク質、アロステリック酵素インヒビター、凝固因子、セリン/トレオニンキナーゼおよびデホスホリラーゼ、トレオニンキナーゼおよびデホスホリラーゼ、細菌酵素、真菌酵素およびウイルス酵素、シグナル伝達分子、転写因子、DNAおよび/またはRNAの合成または分解に関連するタンパク質、免疫グロブリン、ホルモン、サイトカインレセプター、ケモカインおよびそれらのレセプター、チロシンキナーゼに対するリガンドおよびレセプター、ニューロトロフィンおよびそのリガンド、ならびに他のホルモンおよびレセプターからなる群より選択される、プロセス。
(項目21) 項目1〜19のいずれか1項に記載のプロセスであって、前記TBMが、エリスロポイエチン(EPO)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)レセプター、トロンボポイエチン(TPO)、インターロイキン、例えば、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−11、IL−12、成長ホルモン、プロラクチン、ヒト胎盤ラクトゲン(LPL)、CNTF、オンコスタチン、RANTES MTPβ、IL−8、インスリン、インスリン様増殖因子1(IGF−1)、上皮増殖因子(RGF)、ヘレグリン−αおよびヘレグリン−β、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、胎盤成長因子(PLGF)、組織増殖因子(TGF−αおよびTGF−β)、神経成長因子(NGF)、骨形成因子、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体化ホルモン(LH)、組織壊死因子(TNF)、アポトーシス因子−1およびアポトーシス因子−2(AP−1およびAP−2)、およびmdm2からなる群より選択される、プロセス。
(項目22) 項目1〜19のいずれか1項に記載のプロセスであって、前記TBMが、IgE/IgER、ZAP−70、lck、syk、ITK/BTK、TACE、カテプシンSおよびカテプシンF、CD11a、LFA/ICAM、VLA−4、CD28/B7、CTLA4、TNFαおよびTNFβ、(およびp55およびp75 TNFレセプター)、CD40L、p38マップキナーゼ、IL−2、IL−4、IL−13、IL−15、Rac 2、PKCθ、IL−8、TAK−1、jnk、IKK2、IL−18、カスパーゼ1、カスパーゼ3、カスパーゼ8およびカスパーゼ9、IL−1/IL−1レセプター、BACE、HIVインテグラーゼ、PDE IV、C型肝炎ヘリカーゼ、C型肝炎プロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、トリプターゼ、cPLA(サイトゾルホスホリパーゼA2)、CDK4、c−junキナーゼ、アダプタ、例えば、Grb2、GSK−3、AKT、MEKK−1、PAK−1、raf、TRAF1〜6、Tie2、ErB1およびErB2、FGF、PDGF、PARP、CD2、C5aレセプター、CD4、CD26、CD3、TGF−α、NF−κB、IKKβ、STAT6、ニューロキニン−1、PTP−1B、CD45、Cdc25A、SHIP−2、TC−PTP、PTP−α、LARおよびヒトp53、bax/bcl2およびmdm2からなる群より選択される、プロセス。
(項目23) 項目1に記載の工程(v)において同定されたライブラリーのメンバーを含む、分子。
(項目24) 項目1に記載の工程(ii)において使用される低分子エキステンダーの少なくとも一部をさらに含む、項目23に記載の分子。
(項目25) 共有結合によって連結された、前記ライブラリーのメンバーおよび前記低分子エキステンダーまたはその一部を含む、項目24に記載の分子。
(項目26) 前記共有結合が、ジスルフィド結合以外である、項目25に記載の分子。
(項目27) 共有結合によって連結された、前記ライブラリーのメンバーの機能的改変体および低分子エキステンダーまたはその一部を含む、項目24に記載の分子。
(項目28) 前記共有結合が、ジスルフィド結合以外である、項目27に記載の分子。
本発明は、拡張されたテザー化アプローチを使用することによる、標的分子上の異なる部位に対して固有の結合親和性を有するリガンドを迅速かつ確実に同定するためのストラテジーを記載する。このアプローチは、低分子エキステンダー(SME)の設計に基づき、このSMEは、可逆的または不可逆的な共有結合を介して、目的の第1の部位または第1の部位付近で標的分子(TM)にテザー化(繋がれ)され、そしてTM上の目的の第2の部位に対する親和性についてスクリーニングされる有機低分子と反応性である、化学反応基を有する。従って、SMEは、複数のリガンド候補をスクリーニングして、TM上の目的の第2の部位に対する固有の結合親和性を有するリガンドを同定するために使用される。所望の場合、さらなるSMEは、目的の第2の部位に対する結合親和性を有するリガンドの正体に基づいて設計され、そしてスクリーニングを繰り返して、同じTMまたは関連するTM上の目的の同じ部位または他の部位に対する固有の結合親和性を有するさらなるリガンドを同定し得る。
(i)目的の第1の部位および第2の部位を有する標的分子(TM)を、複数の第1の小さい有機リガンド候補と接触させる工程であって、このTMは、目的の第1の部位または第1の部位付近で反応性の求核剤または求電子剤を含むかまたは含むように改変されており、この候補は、この求核剤または求電子剤と反応性の官能基を有し、この工程は、この求核剤または求電子剤と目的の第1の部位に対する親和性を有する候補との間で、可逆的な共有結合が形成されて、TM−第1のリガンド複合体を形成するような条件下で行われる、工程;
(ii)(i)の複合体由来の第1のリガンドを同定する工程;および
(iii)(ii)で同定された第1のリガンドの誘導体を設計して、TM上の求核剤または求電子剤と反応性の第1の官能基、および目的の第2の部位に対する親和性を有する第2のリガンドと反応性の第2の官能基を有する、SMEを提供する工程。
(i)チオール交換条件下で、TBMを有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、このTBMは、このTBM上の目的の第1の部位または第1の部位付近でチオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基を含むかまたは含むように改変されており、各々の有機低分子は、遊離チオールまたは可逆的ジスルフィド基(ジスルフィドモノフォア(monophore))を有し、ここで、目的の第1の部位に対して親和性を有するライブラリーのメンバーは、このTBMとジスルフィド結合を形成する、工程;
(ii)(i)由来のライブラリーのメンバー(選択されたジスルフィドモノフォア)を同定する工程;
(iii)(ii)由来のライブラリーのメンバーの誘導体を設計する工程であって、この誘導体は、第1の官能基および第2の官能基を有するSMEであり、第1の官能基は、TBM上のチオールと反応性であり、そして第2の官能基は、チオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基である、工程。
(i)標的生物学的分子(TBM)を、低分子エキステンダーと接触させる工程であって、このTBMは、そのTBM上の目的の第1の部位または第1の部位付近で求核剤を含むかまたは含むように改変されており、この低分子エキステンダーは、この求核剤と反応性の第1の官能基、およびチオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基である第2の官能基を有し、それによって、TBM−低分子エキステンダー(TBM−SME)複合体を形成する、工程;
(ii)チオール交換条件下で、このTBM−SME複合体を、有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の有機低分子(リガンド)は、遊離チオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基を有し、ここで、目的の部位に対する親和性を有するライブラリーのメンバーは、TBM−SME複合体とジスルフィド結合を形成し、それによって、TBM−SME−リガンド複合体を形成する、工程;および
(iii)(ii)由来のリガンドを同定する工程。
(i)標的生物学的分子(TBM)を提供する工程であって、このTBMは、このTBM上の目的の第1の部位付近に反応性の求核剤を含むかまたは含むように改変されている、工程;
(ii)(i)由来のTBMを、低分子エキステンダーと接触させる工程であって、この低分子エキステンダーは、TBM上の求核剤と反応性である基を有し、そして遊離チオールまたは保護化チオールを有する、工程;
(iii)TBM上の求核剤と低分子エキステンダー上の基との間で共有結合が形成されるように条件を調整する工程であって、それによって、TBMと低分子エキステンダーとを含む共有結合複合体を形成し、この複合体は、TBM上の目的の第2の部位付近に遊離チオールまたは保護化チオールを提示する、工程;
(iv)チオール交換条件下で、(iii)由来の複合体を、有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の分子は、遊離チオールまたは交換可能なジスルフィド連結基を有し、ここで、TBM上の目的の第2の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、この複合体とジスルフィド結合を形成する、工程;および
(v)(iv)由来のライブラリーのメンバーを同定する工程。
(1.定義)
他に規定されない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。Singletonら,Dictionary of Microbiology
and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)、およびMarch,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure,第4版,John Wiley&Sons(New York,NY 1992)は、本出願において用いられる用語の多くに対する一般的ガイドを当業者に提供する。
本発明における使用が見出される標的(例えば、標的生物学的分子(TBM))としては、リガンド候補が結合し得る、分子、分子の一部、および分子の凝集体、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質(例えば、酵素、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分、アロステリック酵素調節因子など)、ポリヌクレオチド、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、および他の高分子(例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチン、またはリボソーム)、脂質二重層を含む構造(例えば、膜)、または膜に由来する構造(例えば、小胞)が挙げられるが、これらに限定されない。この標的は、種々の様式で入手され得、この様式としては、天然供給源からの単離および精製、化学合成、組換え生成、ならびにこれらの方法および類似する方法の任意の組み合わせが挙げられる。
1およびErbB 2、FGF、PDGF、PARP、CD2、C5aレセプター、CD4、CD26、CD3、TGF−α、NF−κB、IKKβ、STAT 6、ニューロキニン−1、PTP−1B、CD45、Cdc25A、SHIP−2、TC−PTP、PTP−α、LARおよびヒトp53、bax/bcl2およびmdm2が、挙げられる。
229:1193(1985);Kunkelら,Methods Enzymol.154:367−82(1987),Adelmanら,DNA 2:183(1983);ならびにCarterら,Nucl.Acids Res., 13:4331(1986)。カセット変異誘発(Wellsら、Gene 34:315[1985])および制限選択変異誘発(Wellsら、Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415[1986])もまた、使用され得る。
広く、特定の標的(例えば、標的生物学的分子(TBM))上の「目的の部位」は、インビボまたはインビトロでその標的が自然な複合体を形成する分子にその標的が結合することに関与する残基によって、規定される。その標的が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、目的の部位は、その標的のリガンドへの結合(通常は、非共有結合による結合)に関与するアミノ酸残基によって、規定される。
Hot Spot of Binding Energy in a Hormone−Receptor InterfaceならびにCunninghamおよびWells,J.Mol.Biol.234:554−563(1993)を参照のこと。タンパク質A中にて同定された重大な接触残基の約4Å内にあるタンパク質Bのアミノ酸残基もまた、目的の部位の定義に含まれる。
Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.150:1(1976))。アラニン置換が十分な量の改変体を生じない場合、等比体積(isteric)アミノ酸が、使用され得る。
55:379−400(1971);Shrake,A.およびRupley,J.A. J.Mol.Biol.79:351−371(1973))または標準的分析法(Connolly,M.L. Science 221:709−713(1983);Richmond,T.J. J.Mol.Biol.178:63−89(1984))を使用する構造モデルより算出され得る。例えば、潜在的システイン改変体は、LeeおよびRichardsの方法(Lee,B.およびRichards,F.M. J.Mol.Biol 55:379−400(1971))によって計算される場合に炭素−β(CB)または硫黄−γ(SG)の結合した表面面積が21Å2より大きい場合、溶媒接近可能であるとみなされる。この値は、Creamerら(Creamer,T.P.ら、Biochemistry 34:16245−16250(1995))によって記載されるようなシステイン側鎖に接近可能な理論的表面面積の約33%に相当する。
Acids Research 28:235−242(2000))中の独特な構造(Hobohm,U.ら、Protein Science 1:409−417(1992))から構成される。ここで、フラグメントの残基j−1、jおよびj+1の骨格原子は、0.75A2未満のRMSDを有する標的分子の残基j−1、jおよびj+1の骨格原子上に重ねあわされ得る。残基iのCB原子よりも目的の部位の任意の原子に近接する位置jのシステイン(システインに変異された場合)にジスルフィド結合した残基のCB原子を配置するフラグメントが同定された場合、位置iは、好ましいとみなされる。代替の手順では、位置iの残基は、コンピュータ上でシステインに「変異され」、そしてジスルフィド結合を介してS−メチル基でキャップされる。
(A)静的SME
本発明の1つの実施形態において、SMEは、TBM上の求核剤または求電子体(好ましくは、求核剤)を介して「静的」共有結合または不可逆的共有結合を形成し、これにより、不可逆的TBM−SME複合体を形成する。この方法は、図2に例示される。必要に応じて、SMEはまた、TBM上の目的の第1の部位と非共有結合を形成する。さらに、SMEは、有機低分子のライブラリーのライブラリーメンバーと可逆的結合を形成し得る第2の官能基を含み、このライブラリーの各分子は、SMEの第2の官能基と可逆的結合を形成し得る官能基を有する。TBM−SME複合体およびライブラリーは、TBM上の目的の第2の部位に対して親和性(好ましくは、最高の親和性)を有するライブラリーメンバーが、TBM−SME複合体と可逆的結合を形成する条件に供される。
本発明の別の実施形態において、SMEは、二重の可逆的共有結合SME(「二重ジスルフィド」エキステンダー)であり、すなわち、このSMEは、二官能性であり、そして可逆的供給結合を形成し得る2つの官能基(通常は、ジスルフィド)を含む。このSMEは、SME上の第1の官能基を介してTBM上の求核剤と「動的」共有結合または第1の可逆的共有結合を形成する。これにより、可逆的TBM−SME複合体(以下の7)を形成する。必要に応じて、SMEはまた、TBM上の目的の第1の部位と非共有結合を形成する(TBMと非共有結合を形成するSME上の部分は、本明細書中でSMEといわれる)。さらに、SMEは、有機低分子の第2のライブラリーのライブラリーメンバーと第2の可逆的結合を形成し得る第2の官能基を含むか、または含むように改変され、各分子は、SMEの第1の官能基または第2の官能基と可逆的結合を形成し得る官能基を有する。TBM−SME複合体および第2のライブラリーは、TBM上の目的の第2の部位に対して最高の親和性を有するライブラリーメンバーがTBM−SME複合体(以下の8)と可逆的結合を形成する条件に、供される。好ましくは、共有結合は、ジスルフィドであり、これは、還元剤の存在下で可逆的であり得る。
R2は、−(CH2)n−SR’および−C(=O)−(CH2)n−SR’であり;
R3、R4およびR5は、−O−(CH2)n−SR’および−(CH2)n−SR’であり;
R6は、−(CH2)n−SR’であり;ここで、nは、1、2または3であり、そして
R’は、H、ジスルフィドまたはチオール保護基である。
Sons,New York,第4版,1992)に記載されている。アルデヒドとケトンとアミンとの間での還元的アミノ化は、例えば、Marchら,前出,898−900頁に;アミンを調製するための代替方法は1276頁に;ヒドラゾンおよびヒドラゾン誘導体(例えば、セミカルバゾン)を得るためのアルデヒドとケトンとヒドラジド誘導体との間の反応は904−906頁に;アミド結合形成は1275頁に;尿素の形成は1299頁に;チオカルバメートの形成は892頁に;カルバメートの形成は1280頁に;スルホンアミドの形成は1296頁に;チオエーテルの形成は1297頁に;ジスルフィドの形成は1284頁に;エーテルの形成は1285頁に;エステルの形成は1281頁に;エポキシドへの付加は368頁に;アジリジンへの付加は368頁に;アセタールおよびケタールの形成は1269頁に;カルボネートの形成は392頁に;デアミンの形成は1264頁に;アルケンの転移は1146−1148頁に(Grubbsら,Acc,Chem.Res.28:446−453[1995]もまた参照のこと);ハロゲン化アリールおよびアリールスルホネートと、アルカンおよびアセチレンとの遷移金属触媒カップリング(例えば、Heck反応)は717−178頁に;ハロゲン化アリールおよびアリールスルホネートと、有機金属試薬(例えば、有機ホウ素試薬)との反応は662頁に(Miyauraら,Chem.Rev.95:2457[1995]もまた参照のこと);有機錫試薬および有機亜鉛試薬、オキサゾリジンの形成(Edeら,Tetrahedron Letts.28:7119−7122[1997]);チアゾリジンの形成(Patekら,Tetrahedron Letts.36:2227−2230[1995]);イミドエステルを介してアミンをカップリングすることによって、アミジン基を介して連結されたアミン(Daviesら,Canadian J.Biochem.c50:416−422[1972])などに記載されている。特に、ジスルフィド含有低分子ライブラリーは、Parlowら,Mol.Diversity 1:266−269(1995)の方法を適用することによって、市販のカルボン酸および保護されたシステアミン(例えば、mono−BOC−cysteamine)から作製され得、そして反応性システインを含むかまたは含むように改変されている、ポリペプチドへの結合についてスクリーニングされ得る。この節において引用された全ての文献は、本明細書中に明らかに参考として援用される。
標的に結合したリガンドは、質量分析法(MS)によって容易に検出および同定され得る。MSは、質量対電荷比(m/z)に基づいて分子を検出し、従って、それらのサイズに基づいて分子を分離し得る(Yates,Trends Genet.16:5−8[2000]に概説される)。質量分析計(mass spectrometer)は最初に、分子を気相イオンに変換し、次いで個々のイオンがm/z比に基づいて分離され、そして最終的に検出される。質量分析器(mass analyzer)は、質量分析計の不可欠の部分であり、物理的特性(例えば、電場もしくは磁場、または飛行時間型[TOF])を使用して、特定のm/z値のイオンを分離し、次いでこのイオン検出器に衝突する。質量分析計は、データを迅速に作製し得、従って高処理能力の分析についての大きな可能性を有する。MSは、薬物の発見に用いられ得る、非常に汎用性の高いツールを提供する。質量分析法は、単独で、または標的に結合した有機化合物リガンドの検出もしくは同定のための他の手段との組み合わせのいずれかで用いられ得る。質量分析法を用いる技術は、当該分野で周知であり、そして種々の適用のために用いられている(例えば、FitzgeraldおよびSiuzdak,Chemistry & Biology 3:707−715[1996];Chuら,J.Am.Chem.Soc.118:7827−7835[1996];Siudzak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11290−11297[1994];Burlingameら,Anal.Chem.68:599R−651R[1996];Wuら,Chemistry
& Biology 4:653−657[1997];ならびにLooら,Am.Reports Med.Chem.31:319−325[1996]を参照のこと)。
2以上の有機分子リガンドを連結して結合体分子を生成するための用途が見出されるリンカーエレメントは、少なくとも2つの有機分子を、これらの分子によって保有される反応性官能基を介して一緒に共有結合するように機能し得る、多官能性(好ましくは二官能性)架橋分子である。リンカーエレメントは、少なくとも2つの有機分子を結合するために利用可能である少なくとも2つ(好ましくは2つのみ)の反応性官能基を有し、ここで、これらの官能基は、このリンカー上のどこにでも(好ましくはリンカーの各末端に)出現し得、そしてこれらの官能基は、連結されるべき有機分子が同じ反応性官能基を有するかまたは異なる反応性官能基を有するかに依存して、同じであっても異なっていてもよい。本明細書中で用途が見出されるリンカーエレメントは、直鎖、分岐鎖、芳香族など(好ましくは直鎖)であり得、そして一般に少なくとも約2原子長であり、より一般的には約4原子長よりも長く、そしてしばしば、約12原子長以上もの長さである。リンカーエレメントは一般的に、水素飽和または水素不飽和のいずれかの炭素原子を含み、それゆえアルカン、アルケンもしくはアルキンおよび/または他のヘテロ原子(窒素、硫黄、酸素などを含む)を含み得、これらは(好ましくはアルキル基、アルコキシル基、ヒドロキシアルキル基またはヒドロキシアルキル基で)置換されていなくても置換されていてもよい。用途が見出されるリンカーエレメントは、種々の長さであり得、それによって、それらから調製される結合体リガンド化合物の結合特性を最適化するための手段を提供する。標的生体分子に共有結合する第一の有機化合物は、それ自体、第二の有機化合物に対する結合部位を提供する化学反応性基を保有し得る。あるいは、第一の有機分子は、(化学的に、それに対する化学的反応基を含む化合物を結合することによって、または他の方法でのいずれかで)改変された後、有機化合物の第二のライブラリーに対してスクリーニングされ得る。
本発明の化合物は、少なくとも1つ(好ましくは少なくとも2つ)のリガンド(このうちの少なくとも1つは、本明細書中に開示される拡張テザリングアプローチによって同定されている)およびこのような化合物のアナログを包含することによって特徴付けられる。従って、本発明の化合物は、有機低分子、ペプチド、(ポリ)ヌクレオチド、(オリゴ)糖などを含むがこれらに限定されない、多数の化学的クラスを包含する。本発明の方法によって同定されるリガンドは代表的に、以下の周知の技術によって設計されるさらなる改変体および誘導体の開発のためのリード化合物として役立つ。特に、同定されるリガンド(モノフォア、ダイアフォア、およびより複雑な構造体を含む)は、医薬品化学および親和性成熟に従い、そして構造補助設計を用いて容易に最適化され得る。本発明の拡張テザリングアプローチは、標的(例えば、TBM)上の異なる部位に結合することがすでに示されたリガンドに焦点を当てたさらなる化学的改変を可能にするという点で、他の公知の技術(コンビナトリアル化学を含む)よりも優れている。
本発明の方法は、薬物リードを作製するための強力な技術であり、互いに近い部位で標的に弱くまたは中程度の結合性で結合する2以上のフラグメントの同定を可能にし、そしてより高い親和性の化合物を生成する、互いに共有結合的に連結された、同定されたフラグメント(モノフォア)を含むダイアフォアまたはより大きな分子の合成を可能にする。さらなるリガンド化合物を含む、ダイアフォアまたは同様のマルチマー化合物は、合理的薬物設計における貴重なツールであり、これらは、医薬品化学アプローチおよび構造補助設計を用いてさらに改変および最適化され得る。
本発明に従って同定されたリガンド、およびこのようなリガンドを含む化合物、ならびにこのような化合物の類似体は、標的の疾患または状態を予防および/または処置するために、薬学的組成物において使用され得る。標的の疾患または状態は、リガンドまたは化合物がそのリガンドの結合に基づいて設計される標的(例えば、TBM)の生物学的/生理学的な機能に依存する。このような疾患および状態の例を、上記のTBMの表において列挙する。
好ましい実施形態において、本発明の方法を用いて、第1リガンドとタンパク質との間で形成される中間のジスルフィドのテザー化を介して標的タンパク質上の少なくとも2つの異なる目的の部位に結合する低分子量リガンド、ならびに第1リガンドおよび第2リガンドの各々の反応基を、同定する。
Co.,Milwaukee,WIおよびSigma Chemical Co.,Sr.Louis,MO)から容易に取得可能であり、または化学合成によって取得され得る。好ましくは本発明の方法を用いて、適切な反応基(好ましくは、チオール基または保護チオール基)を有する低分子有機化合物のライブラリーを、スクリーニングする。
本発明を、引続いての非制限的な実施例によってさらに例示する。他に記載しない限り、標準的分子生体学的手順の全てを、以下において記載されるプロトコルに従って実施する:Molecular Cloning:A Laboratory Manual 1巻〜3巻、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989;Current Protocols in Molecular Biology、1巻〜2巻、Ausbubel,F.、Brent,R.、Kingston,R.、Moore,D.、Seidman,J.G.、Smith,J.およびStruhl,K.編、Wiley Interscience、1987。
1:191〜210(1995))、エキステンダーを合成した:2,6−ジクロロ−安息香酸 3−(2−アセチルスルファニル−アセチルアミノ)−4−カルボキシル−2−オキソ−ブチルエステル(図4中の化合物5として示す)、この合成を、以下の実施例2に記載する。エキステンダーの遺伝子構造を、図4に示す。カスパーゼをエキステンダーと反応させることで改変し(実施例3)、続いて、拡張テザー化アプローチを使用して、実施例1中に記載されるように調製したジスルフィドライブラリーのスクリーニングのための生体学的標的分子として、使用した。
(ジスルフィドライブラリー)
ジスルフィドライブラリーを、以下の化合物クラスからの標準的な化学を使用して、合成した:アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミン、塩化スルホニル、イソシアネート、およびイソチオシアネート。例えば、ジスルフィド含有ライブラリーメンバーを、Parlowおよび共同研究者らの方法(ParlowおよびNormansell、Mol.Diversity 1:266〜269(1995))を適用することによって、市販のカルボン酸およびモノ−N−(tert−ブトキシカルボニル)保護システイン(モノ−BOC−システイン)から、作製した。簡単に述べると、260μmolの各カルボン酸を、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中で1,3−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して、ポリスチレン樹脂上の130μmol当量の4−ヒドロキシ−3−ニトロベンゾフェノンに、固定化した。室温で4時間後、DMF(×2)、ジクロロメタン(DCM、×3)、およびテトラヒドロフラン(THF、×1)を用いて樹脂をリンスし、カップリングしていない酸およびDICを除去した。酸を、THF中の66μmolのモノ−BOC保護システインを用いるアミド形成を介して、樹脂から切断した。外界温度にて12時間反応後、溶媒をエバポレートし、そして、BOC基を、DCM中で80%トリフルオロ酢酸(TFA)を使用することによって、各ジスルフィドのカップリングしていない半分から、除去した。生成物をHPLC−MSによって特徴付け、そして、実質的に純粋であるこれらの生成物を、さらなる精製なしで使用した。総計530の化合物を、この方法論を使用することによって、作製した。
ピリジン)存在下で、THF(2%ジイソプロピルエチルアミンを用いて)中で、10.5μmolのモノ−BOC−保護システインと結合させた。48時間後、ポリ(4−ビニルピリジン)を、ろ過を介して除去し、そして、溶媒をエバポレートした。BOC基を、DCM中で50%TFAを使用することで除去した。イソチオシアネートの場合、10μmolの各イソシアネートまたはイソチオシアネートを、THF中で10.5μmolのモノ−BOC−保護システインとカップリングさせた。外界温度にて12時間反応させた後、溶媒をエバポレートし、そして、BOC基を、DCM中で50%TFAを使用することによって、除去した。総計212の化合物を、この方法論を使用することによって、作製した。
(エキステンダー(SME)合成)
拡張テザー化アプローチのために、エキステンダー(2,6−ジクロロ−安息香酸3−(2−アセチルスルファニル−アセチルアミノ)−4−カルボキシル−2−オキソ−ブチルエステル、図4中の化合物5として示す)を、図4中に示すような一連の化学反応を使用して合成し、そして、以下に記載する。
アセチルスルファニル酢酸ペンタフルオロフェニルエステル(1.6g、5.3mmol)およびH−Asp(OtBu)−OH(1g、5.3mmol)を、乾燥ジクロロメタン(DCM)(20ml)中で混合した。次いで、1.6mlのトリエチルアミン(11.5mmol)を添加し、そして、反応を、外界温度にて3.5時間進行させた。次いで、有機層を15mlの1Mカルボン酸ナトリウムを用いて抽出し(×3)、合わせた水性画分を、100mlの1M硫酸水素ナトリウムを用いて酸性化し、そして30mlのエチルアセテートを用いて抽出した(×3)。次いで、結合した有機性画分を、30mlの1Mヒドロゲンスルホン酸ナトリウム、30mlの5M NaClを用いてリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、そして減圧下でエバポレートして、1.97gのほぼ無色のシロップを得、さらなる精製なしに使用した。分子量=305(実測値306、M+1)。
遊離酸(化合物2)を10mlの乾燥テトラヒドロフラン(THF)中に溶解し、0℃に冷却し、そして、0.58ml N−メチルモルフォリン(5.3mmol)および0.69イソブチルクロロギ酸を用いて処理した。濃密な白色沈澱を、直ちに形成し、そして30分後、反応物をガラスフリットを介してろ過し、そして、更なる10mlのTHFを有する新しいフラスコに移した。一方、ジアゾメタンを、1−メチル−3−ニトロ−1−ニトロソグアニジン(2.3g、15.6mmol)と7.4mlの40%水性KOHおよび25mlジエチルエーテルとを、0℃にて45分間反応させることによって、調製した。次いで、黄色エーテル層を、混合アルデヒドを含有する反応物へデカントし、そしてこの反応を165分間にわたりゆっくり外界温度まで暖める間、進行させた。この反応物を、8℃に冷却し、そしてジオキサン中の1.5mlの4N HCl(総計6mmol)を滴下した。これは、多くの気泡を生じ、そして黄色溶液は無色となった。この反応を、徐々に外界温度まで暖める間、2時間進行させ、次いで、1mlの氷酢酸を用いてクエンチした。溶媒を減圧下で除去し、そして、残渣を75mlのエチルアセテート中に再溶解し、50mlの飽和ジカルボン酸ナトリウム、50mlの5M NaClでリンスし(×2)、硫酸酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして、90:10のクロロホルム:エチルアセテートを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製する前にエバポレートして乾燥させて、0.747gの淡黄色油(2.2mmol、(1)から42%)を得た。推定分子量=337.7、実測値338(M+1)。
クロロメチルケトン(化合物3)(0.25g、0.74mmol)を、5mlの乾燥N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(これは、0.17gの2,6−ジクロロ安息香酸(0.89mmol)および0.107gのKF(1.84mmol)を添加されている)中に溶解した。反応を、19時間、外界温度にて進行させた。19時間の時点で、75mlのエチルアセテートで希釈し、50mlの飽和炭酸水素酸ナトリウム、50mlの1M硫酸水素ナトリウム、50mlの5M NaClを用いてリンスし(×2)、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、そして、減圧下で乾燥させて、黄色シロップを得た。HPLC−MSは約75%生成物および25%未反応物(3)であることを示した。これを、さらなる精製なしに使用した。推定分子量492.37、実測値493(M+1)。
以前の工程の生成物(化合物4)を、10mlの乾燥DCM中に溶解し、0℃に冷却し、そして、9mlのトリフロロ酢酸(TFA)を用いて処理した。次いで、この反応物を氷浴から取り出し、そして、1時間にわたり外界温度まで暖めた。溶媒を減圧下で除去し、そして、残渣をDCM中に2回溶解し、そして、残存するTFAを除去するためにエバポレートした。粗生成物を、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、101.9mg(0.234mmol、(3)から32%)の白色吸湿性粉末を得た。推定分子量=436.37、実測値437(M+1)。これをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、50mMのストック溶液を得た。
(エキステンダーを用いたカスパーゼ3の改変)
カスパーゼ3を、標準的な技術(Rotondaら、Nature Structural Biology 3(7):619〜625(1996))を使用してクローニングし、大量発現し、そして精製した。2mlの0.2mg/mlカスパーゼ3溶液に、実施例2において記載されたように合成した10mlの50mM 2,6−ジクロロ−安息香酸3−(2−アセチルスルファニル−アセチルアミノ)−4−カルボキシ−2−オキソ−ブチルエステル(化合物5、図3)を添加し、そして、反応を3.5時間、外界温度にて進行させた。3.5時間の時点で、質量分析は、カスパーゼ3大型サブユニットの完全な改変(分子量16861Da、計算分子量16860Da)を示した。チオエステルを、PBS緩衝液中で緩衝化された0.2mlの0.5Mヒドロキシルアミンを加えることによって脱保護し、反応を18時間進行させた。18時間の時点で、この巨大なサブユニットは、16819Da(計算16818Da)の質量を有した。このタンパク質を、Ultrafree 5 MWCOユニット(Millipore)中で濃縮し、そして、緩衝液を、Nap−5カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、0.1M TES(pH7.5)に交換した。得られた「拡張された」カスパーゼ−3の構造を、図6に示す。
(ジスルフィドライブラリーのスクリーニング)
典型的な実験において、8個〜15個のジスルフィド含有化合物のライブラリーを含む1μlのDMSO溶液を、49μlのエキステンダー改変タンパク質含有緩衝液に添加した。質量分析を結合リガンドの同定に用いた場合、化合物を各々が固有の分子量を有するように選択した。例えば、これらの分子量は、少なくとも10の原子質量単位まで異なり、その結果、デコンヴォル−ションは明白である。デコンヴォル−ションの簡便さに起因して、8個〜15個のジスルフィド含有化合物のプールを、スクリーニングのために典型的に選んだが、より巨大なプールもまた、使用され得る。タンパクは約15μMの濃度で存在し、ジスルフィドライブラリーのメンバー各々は約0.2mMで存在し、従って、全ジスルフィドライブラリーメンバーの総濃度は、約2mMであった。反応を、25mMリン酸カルシウム(pH7.5)および1mM 2−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で行ったが、他の緩衝液および還元剤も使用し得る。この反応を少なくとも30分間、外界温度にて、平衡化した。これらの条件は、タンパク質が質量分析においてイオン化する容易さ、特定のシステイン(単数または複数)の反応性などに依存して、かなり変化し得る。
Claims (28)
- プロセスであって、以下:
(i)標的生物学的分子(TBM)を提供する工程であって、該TBMは、該TBM上の目的の第1の部位付近に反応性の求核剤を含むかまたは含むように改変されている、工程;
(ii)(i)由来のTBMを、第1の官能基および第2の官能基を有する低分子エキステンダーと接触させる工程であって、該第1の官能基は、該TBM上の求核剤と反応性である、工程;
(iii)該TBM上の求核剤と該低分子エキステンダー上の第1の官能基との間で共有結合が形成されるように条件を調整する工程であって、それによって、該TBMと該低分子エキステンダーとを含む共有結合複合体を形成し、該複合体は、該TBM上の目的の第2の部位付近に第2の官能基を提示する、工程;
(iv)(iii)由来の該複合体に有機低分子のライブラリーを接触させる工程であって、各々の分子は、(iii)由来の該複合体中に存在する該低分子エキステンダー上の第2の官能基と反応し得る官能基を有し、該工程は、該TBM上の目的の第2の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、該複合体と化学結合を形成するような条件下で行われる、工程;および
(v)(iv)由来の該ライブラリーのメンバーを同定する工程
を包含する、プロセス。 - 請求項1に記載のプロセスであって、前記低分子エキステンダー上の前記第2の官能基が、遊離チオールまたは保護化チオールである、プロセス。
- 請求項2に記載のプロセスであって、前記工程(iv)において、工程(iii)由来の前記複合体を有機低分子のライブラリーと接触させ、該分子の各々が、遊離チオールまたは交換可能なジスルフィド連結基を有する、プロセス。
- 請求項3に記載のプロセスであって、工程(iii)由来の前記複合体と前記有機低分子のライブラリーとを、チオール交換条件下で接触させ、ここで、前記TBM上の目的の第2の部位に対する最も高い親和性を有する該ライブラリーのメンバーが、該複合体とジスルフィド結合を形成する、プロセス。
- 請求項4に記載のプロセスであって、前記チオール交換条件が、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスレイトール(DTE)、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびトリス(シアノエチル)ホスフィンからなる群より選択されるジスルフィド還元剤の添加から生じる、プロセス。
- 請求項1に記載のプロセスであって、前記低分子エキステンダーから本質的になる分子を合成する工程をさらに包含し、ここで、前記第1の官能基が、もはや前記TBM上の求核剤と反応性でなく、前記第2の官能基と工程(i)で同定された前記ライブラリーのメンバーとの間のジスルフィド結合が、異なる基で置換される、プロセス。
- 前記ジスルフィド結合が、アルキル基で置換される、請求項6に記載のプロセス。
- 前記分子の誘導体を合成する工程をさらに包含する、請求項6に記載のプロセス。
- 前記反応性求核剤が、チオールである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記第1の官能基が、前記チオールと不可逆的な共有結合を形成する、請求項9に記載のプロセス。
- 請求項9に記載のプロセスであって、工程(i)の後に、以下:
(a)チオール交換条件下で、前記TBMを有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の分子が、交換可能なジスルフィド連結基を有し、ここで、前記目的の第1の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、該TBMとジスルフィド結合を形成する、工程;
(b)(a)由来の該ライブラリーのメンバーを同定する工程;
(c)(b)における該ライブラリーのメンバーの誘導体を形成する工程であって、該誘導体は、第1の官能基および第2の官能基を有する低分子エキステンダーであり、該第1の官能基は、前記求核剤と反応性であり、そして該第2の官能基は、チオールまたは保護化チオールである、工程
をさらに包含する、プロセス。 - 請求項11に記載のプロセスであって、工程(a)が、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスレイトール(DTE)、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびトリス(シアノエチル)ホスフィンからなる群より選択されるジスルフィド還元剤を添加することをさらに包含する、プロセス。
- 前記反応性の求核剤が、ヒドロキシル(−OH)基である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- 請求項13に記載のプロセスであって、前記求核剤と反応性の基が、活性化カルボニル、エポキシド、アジリジン、芳香族スルホネート、ヘミアセタール、ハロメチルケトン、アリールアシルオキシメチルケトン、ジスルフィド、チオスルホネート、およびチオスルフェートからなる群より選択される、プロセス。
- 請求項14に記載のプロセスであって、該活性化カルボニルが、アルデヒド、ケトン、エステルまたはアシルハライドの形態である、プロセス。
- 請求項15に記載のプロセスであって、前記活性化カルボニルが、ハロメチルケトン、アリールアシルオキソメチルケトンおよびチオエステルからなる群より選択される、プロセス。
- 前記反応性の求核剤が、アミンである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記同定する工程が、質量分析を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載のプロセス。
- 請求項3または11に記載のプロセスであって、交換可能なジスルフィド連結基を有する有機低分子の前記ライブラリーの各々の分子が、システアミン部分を含む、プロセス。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のプロセスであって、前記TBMが、リンパ球細胞表面レセプター、酵素、ステロイドレセプター、核タンパク質、アロステリック酵素インヒビター、凝固因子、セリン/トレオニンキナーゼおよびデホスホリラーゼ、トレオニンキナーゼおよびデホスホリラーゼ、細菌酵素、真菌酵素およびウイルス酵素、シグナル伝達分子、転写因子、DNAおよび/またはRNAの合成または分解に関連するタンパク質、免疫グロブリン、ホルモン、サイトカインレセプター、ケモカインおよびそれらのレセプター、チロシンキナーゼに対するリガンドおよびレセプター、ニューロトロフィンおよびそのリガンド、ならびに他のホルモンおよびレセプターからなる群より選択される、プロセス。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のプロセスであって、前記TBMが、エリスロポイエチン(EPO)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)レセプター、トロンボポイエチン(TPO)、インターロイキン、例えば、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−11、IL−12、成長ホルモン、プロラクチン、ヒト胎盤ラクトゲン(LPL)、CNTF、オンコスタチン、RANTES MTPβ、IL−8、インスリン、インスリン様増殖因子1(IGF−1)、上皮増殖因子(RGF)、ヘレグリン−αおよびヘレグリン−β、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、胎盤成長因子(PLGF)、組織増殖因子(TGF−αおよびTGF−β)、神経成長因子(NGF)、骨形成因子、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体化ホルモン(LH)、組織壊死因子(TNF)、アポトーシス因子−1およびアポトーシス因子−2(AP−1およびAP−2)、およびmdm2からなる群より選択される、プロセス。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のプロセスであって、前記TBMが、IgE/IgER、ZAP−70、lck、syk、ITK/BTK、TACE、カテプシンSおよびカテプシンF、CD11a、LFA/ICAM、VLA−4、CD28/B7、CTLA4、TNFαおよびTNFβ、(およびp55およびp75 TNFレセプター)、CD40L、p38マップキナーゼ、IL−2、IL−4、IL−13、IL−15、Rac 2、PKCθ、IL−8、TAK−1、jnk、IKK2、IL−18、カスパーゼ1、カスパーゼ3、カスパーゼ8およびカスパーゼ9、IL−1/IL−1レセプター、BACE、HIVインテグラーゼ、PDE IV、C型肝炎ヘリカーゼ、C型肝炎プロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、トリプターゼ、cPLA(サイトゾルホスホリパーゼA2)、CDK4、c−junキナーゼ、アダプタ、例えば、Grb2、GSK−3、AKT、MEKK−1、PAK−1、raf、TRAF1〜6、Tie2、ErB1およびErB2、FGF、PDGF、PARP、CD2、C5aレセプター、CD4、CD26、CD3、TGF−α、NF−κB、IKKβ、STAT6、ニューロキニン−1、PTP−1B、CD45、Cdc25A、SHIP−2、TC−PTP、PTP−α、LARおよびヒトp53、bax/bcl2およびmdm2からなる群より選択される、プロセス。
- 請求項1に記載の工程(v)において同定されたライブラリーのメンバーを含む、分子。
- 請求項1に記載の工程(ii)において使用される低分子エキステンダーの少なくとも一部をさらに含む、請求項23に記載の分子。
- 共有結合によって連結された、前記ライブラリーのメンバーおよび前記低分子エキステンダーまたはその一部を含む、請求項24に記載の分子。
- 前記共有結合が、ジスルフィド結合以外である、請求項25に記載の分子。
- 共有結合によって連結された、前記ライブラリーのメンバーの機能的改変体および低分子エキステンダーまたはその一部を含む、請求項24に記載の分子。
- 前記共有結合が、ジスルフィド結合以外である、請求項27に記載の分子。
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