JP2006091025A - 神経変性の分別診断 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、個体の1またはそれ以上の体液中の少なくとも3つの神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを用いる、個体における神経変性の特異的検出、定量および/または分別診断のための新たな方法であって、神経変性のタイプおよび程度が対照試料と比較して該神経学的マーカーのすべてのレベルの量的変化により反映されるものである方法。
【選択図】なし
Description
Soji M, Matsubara E, Kanai M, Watanabe M, Nakamura T, Tomidokoro Y, Shizuka M, Wakabayashi K, Igeta Y, Ikeda Y, Mizushima K, Amari M, Ishiguro K, Kawarabayashi T, Harigaya Y, Okamotot K, Hirai S (1998) J Neurol Sci 158: 134-140.
本発明のもう1つの目的は、個体におけるアルツハイマー病の、より特異的な検出、定量および/または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、個体におけるレービー小体疾患の、より特異的な検出、定量および/または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、個体におけるパーキンソン病の、より特異的な検出、定量および/または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、個体における前頭側頭葉痴呆の、より特異的な検出、定量および/または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、パーキンソン病とアルツハイマー病との分別方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、レービー小体疾患とアルツハイマー病との分別方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のための方法、ならびに異なる形態のアルツハイマー病の分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、化学療法により、あるいは化合物または放射線照射に対する曝露により誘発された神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、白血病または脳腫瘍の治療を受けた個体における、化学療法により誘発された神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、周産期仮死により生じる神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、脳脊髄液中のシナプス蛋白Rab3aの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、個体における神経変性の、より特異的検出、定量および/または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のRab3aの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、アルツハイマー病の、より特異的検出、定量および/または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のRab3aの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、脳脊髄液中のシナプス蛋白α−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、個体におけるより特異的な検出、定量、および/または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のα−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、アルツハイマー病および/またはレービー小体疾患の、より特異的な検出または定量を可能にする、ならびに/あるいはレービー小体疾患とアルツハイマー病との分別診断を可能にする、脳脊髄液中のα−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、上記方法を行うための診断キットを提供することである。
本発明のもう1つの目的は、特定の治療の有効性の治療モニタリングおよび/または決定のための方法を提供することである。
(1)個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のための方法であって、下記工程:
神経学的マーカーを特異的に認識する抗体を用いることにより、個体から得た1またはそれ以上の体液試料中の少なくとも3種の神経学的マーカーのレベルを決定する
を特徴とし、さらに以下のことを特徴とする方法:
アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のために、
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のホスホ−タウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびホスホ−タウのレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウ、ホスホ−タウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;
(2)個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、
少なくとも3種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、かつ、各抗体が下記の神経学的マーカー:
タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド(1−42)
の組み合わせを認識するものであるか;あるいは
少なくとも2種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、該抗体のうち1つが2つの異なる体液中の神経学的マーカーを認識するものであり、各抗体が下記の神経学的マーカーの組み合わせ:
−タウ、β−アミロイド(1−42);または
−ホスホ−タウ、β−アミロイド(1−42)
のいずれかを認識するものである、キット;
(3)個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、下記のもの:
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも3種の抗体(一次抗体または捕捉抗体)を一緒にあるいは別個に含む支持体;
神経学的マーカー−一次抗体複合体の1つをそれぞれ認識する二次抗体(ディテクター抗体);
−可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付すかあるいはカップリングするマーカー;
−可能ならば、一次抗体と体液試料間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液
−可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド
を含む、(2)に記載のキット;
(4)(1)に記載の方法を行うために特別に設計された(2)または(3)に記載のキット
を提供するものである。
本明細書の表現「神経変性の定量」は、特定の神経変性的症状による神経の機能不全の程度が測定されることを意味する。
本明細書の表現「神経変性の分別診断」は、神経学的障害の特定の疾患または特定の原因が特定の神経変性的症状に関連している種々の神経変性的症状を識別することをいう。
該個体から1またはそれ以上の体液試料を得ること;および
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下において、体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも3種の抗体(一次抗体または捕捉抗体)に該体液試料を接触させること;および
該体液試料に対する該抗体の免疫学的結合を検出すること;
対照試料と比較して、該神経学的マーカーすべてのレベルの量的変化に反映される神経変性のタイプおよび程度を該体液中の該神経学的マーカーのレベルに基づいて推断すること。
a)二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体は、抗原−抗体複合体の特異的エピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*抗原−抗体複合体の特異的エピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であって、好ましくは固定化された神経学的マーカーまたは神経学的マーカー−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたポリクローナル抗体であってもよい
b)該二次抗体に特異的にタグを付する、あるいは特異的にカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかのマーカー
c)抗体と体液試料との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応、を行うための適当な緩衝液;および
d)また可能ならば、標準化する目的で、神経学的マーカーの検出に使用する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
本明細書の表現「認識」、「〜と反応」、「免疫学的結合」または「抗原−抗体複合体」は、抗体および抗原の免疫学的特性を考慮したすべての条件下で抗原と抗体との間の結合が起こることと解釈すべきである。
用語「体液」は、血液、リンパ液、尿および脳脊髄液(CSF)(これらに限らない)を包含する人体に存在するすべての液体をいう。
タウ、β−アミロイド(1−42)、およびニューロモジュリン;あるいは
タウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリン;あるいは
タウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド(1−42)。
個体から脳脊髄液試料を得ること;次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、Rab3aを認識するモノクローナル抗体(一次抗体または捕捉抗体)に該脳脊髄液試料を接触させること;次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
a)二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体(またはディテクター抗体)は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体(またはディテクター抗体)は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、Rab3aまたはRab3a−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
b)該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
c)抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液;および
d)さらに可能ならば、標準化を目的として、Rab3aを認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
個体から脳脊髄液試料を得ること;次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、SNAP25を認識するモノクローナル抗体(一次抗体または捕捉抗体)に該脳脊髄液試料を接触させること;次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
a)二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体(またはディテクター抗体)は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体(またはディテクター抗体)は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、SNAP25またはSNAP25−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
b)該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
c)抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液;および
d)さらに可能ならば、標準化を目的として、SNAP25を認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
個体から脳脊髄液試料を得ること;次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、α−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体(一次抗体または捕捉抗体)に該脳脊髄液試料を接触させること;次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
a)二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体(またはディテクター抗体)は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体(またはディテクター抗体)は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、α−シヌクレインまたはα−シヌクレイン−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
b)該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
c)抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液;および
d)さらに可能ならば、標準化を目的として、α−シヌクレインを認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
タウ、ホスホタウ、NSE、β−アミロイド(1−42)、β−アミロイド(1−40)、ニューロモジュリンまたはRab3a;あるいは
タウ、ホスホタウ、NSE、β−アミロイド(1−42)、β−アミロイド(1−40)、ニューロモジュリンまたはSNAP25;あるいは
タウ、ホスホタウ、NSE、β−アミロイド(1−42)、β−アミロイド(1−40)、ニューロモジュリンまたはα−シヌクレイン。
脳脊髄液試料中の少なくともα−シヌクレインのレベルが決定され;および/または
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド(1−42)およびα−シヌクレインのレベルが決定される。
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド(1−42)およびRab3aのレベルが決定され;あるいは
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド(1−42)およびSNAP25のレベルが決定される。
脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルが定量的に決定され;あるいは
脳脊髄液試料中のホスホタウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルが定量的に決定され;あるいは
脳脊髄液試料中のタウおよびホスホタウのレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルが定量的に決定され;あるいは
脳脊髄液中のタウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルが定量的に決定される。
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する、一緒にされたあるいは別個のウェル中にある少なくとも3つの抗体(一次抗体または捕捉抗体)を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体、
神経学的マーカー−一次抗体複合体の1つをそれぞれ認識する二次抗体(ディテクター抗体)
*該二次抗体は神経学的マーカー−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体は神経学的マーカー−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化された神経学的マーカーまたは神経学的マーカー−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
α−シヌクレイン;あるいは
タウ、β−アミロイド(1−42)およびα−シヌクレイン;あるいは
タウ、β−アミロイド(1−42)およびRab3a;あるいは
タウ、β−アミロイド(1−42)およびSNAP25;あるいは
タウ、β−アミロイド(1−42)およびニューロモジュリン;あるいは
タウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリン;あるいは
タウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド(1−42);あるいは
タウおよびβ−アミロイド(1−42)。
少なくとも、Rab3aを認識するモノクローナル抗体(一次抗体または捕捉抗体)を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体はRab3a−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体はRab3a−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたRab3aまたはRab3a−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、ニ次抗体とRab3a−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、Rab3aの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
少なくとも、SNAP25を認識するモノクローナル抗体(一次抗体または捕捉抗体)を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体はSNAP25−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体はSNAP25−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたSNAP25またはSNAP25−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、ニ次抗体とSNAP25−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、SNAP25の検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
少なくとも、α−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体(一次抗体または捕捉抗体)を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体(またはディテクター抗体)
*該二次抗体はα−シヌクレイン−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
*該二次抗体はα−シヌクレイン−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたα−シヌクレインまたはα−シヌクレイン−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、二次抗体とα−シヌクレイン−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、α−シヌクレインの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
1.1 Rab3aおよびSNAP25のクローニング
製造者の増幅プロトコルに従ってQuick-ScreenTMヒトcDNAライブラリー(Clontech, Palo Alto, CA, USA;カタログ番号K1003-1)からRab3aおよびSNAP25コーディング配列を増幅するために特別なプライマーを使用した。簡単に説明すると、94℃で45秒、60℃で45秒アニーリング、次いでTaqポリメラーゼ(Stratagene, Amsterdam, The Netherlands;カタログ番号600131)を用いて72℃で2分伸長からなるサイクルを35サイクル行った。72℃で7分間のポリメラーゼ伸長反応にてプログラムを終了した。Perkin-Elmer(Ueberlingen, Germany)DNAサーマルサイクラー(480型)にて反応を行った。Rab3aを増幅するためのプライマーの配列はヒトRab3a配列(Zahraoui et al., 1989)に基づくものであった:ATGプライマーとしてATG GCA TCG GCC ACA GAC TCG CGC TAT GGG (Tm=76℃)および逆プライマーとしてCGCG TCTAG AGG CTC TCA GCA GGC GCA GTC CTG GTG CGG (Tm=77℃)。SNAP25を増幅するためのプライマーの配列はヒトSNAP25配列(Zhao et al., 1994)に基づくものであった:ATGプライマーとしてATG GCC GAA GAC GCA GAC ATG CGC AAT GAG (Tm=75℃)および逆プライマーとしてCGCG CTAG ACA CTT AAC CAC TTC CCA GCA TCT TTG TTG (Tm=59℃)。
PCR生成物を再増幅して十分な量のPCR生成物を得て、T4 DNAポリメラーゼで仕上げを行い、XbaIで切断し、NcoIで平滑末端化され、XbaIで切断されたpIGRHISA(Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号2075)中に連結した。これにより、Rab3aに関してpIGRHISARab3a(Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号3008)を、SNAP25に関してpIGRH6SNAP25a(Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号2941)を得た。連結生成物をDH1(λ)(Bachmann, 1987)中に形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーをインサートの存在について分析した。インサートを配列決定し、正しい配列(Zahraoui et al., 1989; Zhao et al., 1994)を含むプラスミドをさらに使用した。Rab3aに関しては、PCRによるいくつかの人工的要因が存在した。2つのクローンから正しい配列を組み立てた。
PLに基づく発現系pIGRHISARab3aおよびpIGRH6SNAP25aを用いてRab3aおよびSNAP25をそれぞれイー・コリにおいて発現させた。温度感受性cIリプレッサーを有するMC1061 pACI(Wertman et al., 1986)中に正しいプラスミドを形質転換した。約25kDaのクーマシー染色可能なバンドが12.5%アクリルアミドゲル上に可視化され、合理的な発現レベルが示された。組み換え蛋白は、NiIMACカラムでの精製を迅速ならしめる6個の付加ヒスチジン残基を含む融合蛋白として得られた。3リットルの熱誘導イー・コリ(Houchi, 1988; Van Gelder et al., 1993)を用いて、10mgよりも多い組み換えRab3aおよびSNAP25を精製し、少なくとも95%の均質性であった。
Rab3aおよびSNAP25に対する抗体をウサギにおいて生成させた。50μgの精製蛋白を2匹のウサギに腹腔内注射した(100μg/ウサギ1匹)。4週間ごとに注射を行い、ELISAで力価を測定した。抗体は脳抽出物により特徴づけられた。Rab3a免疫反応性に関する結果を図1に示す。アルツハイマー病患者および対照患者からの組織試料を、5倍体積の1% SDS、1% バナジン酸ナトリウム、10mM Tris pH7.4中で迅速にホモジナイズし、次いで、水浴にて5分間煮沸することにより調製した。ホモジネートを5分間遠心分離(12000g、室温)して不溶性物質を除去した。少量の上清を用いてBCA法(Pierce, Rockford, Illinois, USA)により蛋白濃度を測定した。上清を水で希釈して蛋白濃度を2mg/mlとし、同体積の2x試料緩衝液(250mM Tris pH6.8、3% SDS、10%グリセロール、0.006%ブロモフェノールブルーおよび2% β−メルカプトエタノール)を添加した。10〜12.5%ゲルのLaemmli系によりゲル電気泳動を行った。半乾燥ブロッティング法により蛋白をニトロセルロース(Schleicher and Schull, Dassel, Germany;カタログ番号401196)に移行させた。10mM Tris pH7.5,150mM NaCl中の1% BSAでニトロセルロースフィルターをブロックした。1% BSA中適当濃度(±1μg/ml)の一次抗体およびニ次抗体を添加した。
0.3M NaHCO3,pH8.6中で精製組み換え抗原を透析した。透析前後においてOD280値を測定して蛋白量を評価した。Mini-Leak-Medium(KEM-EN-TEC Biozyme, Vancouver, BC, Canada;カタログ番号10127、ロット番号60232-5)を用い、製造者の指示に従って免疫精製を行った。抗体の一部をビオチン化させた(Amersham, Place Little Chalfont ]Buckinghamshire, UK;カタログ番号RPN 2202)。銀染色およびウエスタンブロットにより精製および標識化をモニターした(データ示さず)。
特異的モノクローナル抗体(Transduction Labs, Lexington, KY, USA; R35520およびS35020)を捕捉抗体として用い、免疫精製されたポリクローナルウサギ抗血清をディテクター抗体として用いて、CSF中に添加したシナプス蛋白Rab3aおよびSNAP25の安定性を、37℃で一晩インキュベーションした後に評価した。濃度500pg/mlにおいて、SNAP25およびRab3aに対する組み換え体の免疫反応性は試験したCSF中で一晩置いても変化しなかった(図2)。
50mlのCSFからのアルブミンおよびIgGの抽出ならびにカラムでの分画により、両蛋白がCSF中に存在するという直接的証拠を得た。フラクションを乾燥させ、試料緩衝液に溶解し、12%アクリルアミドゲルで泳動し、ブロッテイングした。Rab3aおよびSNAP25モノクローナル抗体を用いてPVDF膜をプローブした。予想分子量およびpIの免疫反応性バンドが検出された。
モノクローナルRab3aまたはSNAP25抗体を捕捉抗体とし、免疫アフィニティー精製されたビオチン化ポリクローナル抗体をディテクター抗体とするサンドイッチELISAを開発した。MaxisporpマイクロタイタープレートをAffini Pureヤギ抗マウスIgG(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号115-035-144)で被覆した。PBS中1% BSA(臨床用グレード 98% 脂肪酸不含; ICN, Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, USA; カタログ番号 105033, ロット番号 6p384)をブロッキング緩衝液として使用した。ブロッキング緩衝液で1/1000に希釈したマウス抗Rab3a(Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 R35520, IgG2a, クローン 9, ロット番号 606-259-1550 ロット 2)または抗SNAP25(Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S35020, IgG1, クローン 20)を添加した。インキュベーション後、組み換え抗原を異なる濃度で添加した(濃度範囲40000〜2.56pg/ml)。同時に、アフィニティー精製されたウサギ抗Rab3aまたは抗SNAP25抗血清を最適バックグラウンドシグナル比となるように選択した濃度で添加した。次いで、1/2000に希釈したセイヨウワサビ標識ストレプトアビジン(Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 016-030-084)によりビオチン化ウサギ抗体を検出した。カップリングしたペルオキシダーゼを、TMB H2O2基質溶液により検出した。30分後に2N H2SO4で反応を停止し、吸光度を450nmで測定した。このELISAに基づいて10pg/ml程度のRab3aを検出することができた。SNAP25のアッセイは同じ原理に基づくものであった。
2.1 α−シヌクレインに対する特異性に関する市販抗体の評価
異なるシヌクレインのイソ形態(isoform)に対する市販モノクローナル抗体(Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S63320, IgG1)の特異性を評価した。公表された配列のデータ(α-synuclein: accession number L08850; β-synuclein: accession number S69965; γ-synuclein: accession number AF010126)に基づくプライマーを用いて、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン、γ−シヌクレインのオープンリーディングフレーム(ATGから停止コドンまで)をヒト脳cDNAライブラリー(HL5018; Clontech, Palo Alto, CA, USA)から増幅した。報告されたように、いくつかの重要なアミノ酸変化がγ−シヌクレインのオリジナル配列に存在した:このクローンにはK12EおよびK68Eがあり、このクローンのアミノ酸109の多型性はE109Vであった。アミノ末端に6個のさらなるヒスチジンを付加するPLベースの発現系(ICCG 3307; Innogenetics, Gent, Belgium)中にインサートをサブクローンした。Hisタグを付したシヌクレイン融合蛋白をイー・コリにおいて発現させた。次いで、イー・コリ蛋白をSDS−PAGEで泳動し、Transduction Labs (Lexington, KY, USA)から市販されているモノクローナル抗体を用いてイムノブロッテイングした。このモノクローナル抗体はα−シヌクレインに対して特異性を示し、シヌクレイン蛋白のカルボキシ末端半分をマッピングしている(図3)。
数人の患者からのCSFをプールした。Rotophorを用いて200mlのプールしたCSFを等電点により分離した。次いで、得られたフラクションをSDS−PAGEで泳動し、Transduction Labs (Lexington, KY, USA)から市販されているモノクローナル抗体を用いてイムノブロッテイングした。2つの免疫反応性バンドが19kDaの範囲に検出され、pIは4ないし6の範囲であった(図4)。いくつかの負に荷電したアミノ酸(最後の20個のアミノ酸中に6つのE)はpIをより塩基性のほうへシフトさせるので、低い方のバンドはC末端切断形態である可能性があった。この免疫反応性に基づいて、α−シヌクレインの濃度範囲をpg/mlの範囲で評価した。
3リットルの誘導イー・コリ培養からα−シヌクレインを精製したところ、10mgよりも多いα−シヌクレインが精製された(クーマシーおよび銀染色ゲルから評価すると純度は90%より高い)。いくつかの免疫スキーム(表3)に従って蛋白をマウスに注射した。4回注射後、コーティングELISAにおいてα−シヌクレインに対する力価を評価した。6匹のマウスは100000以上の力価を有していた(バックグラウンドの2倍のODが得られる血清の希釈率として力価を定義)。
最後の注射から3日後、動物312(m3)から脾臓細胞を取り、Koehler and Milstein (1975)により記載された方法に大まかに準じて細胞融合に使用した。最初のスクリーニングラウンドでは、直接コーティングアッセイにおいて特異的抗体の存在についてハイブリドーマを試験した。次いで、α−、β−、γ−シヌクレインおよびα−シヌクレイン由来の欠失変異体を含有するイー・コリ溶解物のドットブロットによりそれらを再試験して、シヌクレイン蛋白上の異なるエピトープを認識する抗体を生成するハイブリドーマを選択した。
ドットブロットにおいてα−シヌクレインに特異的であった2つのハイブリドーマ3B5(IgG2a)および9B6(IgG1)を単離した。その正確なエピトープを決定するために、カルボキシ末端部分(位置64から140まで)を、10個の重複するペプチドとして合成した(図5)。それらのペプチドはアミノ酸14個の長さで、7個のアミノ酸が重複していた。ビオチン化ペプチドを、1μg/mlの濃度でストレプトアビジン被覆プレート上に捕捉した。これらのペプチド上でα−シヌクレイン特異的抗体をインキュベーションし、次いで、抗マウス酵素結合抗体を用いて検出した。トリメチルベンジジンを基質として用いて酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼを定量した。3B5および9B6は両方とも、配列LEDMPVDPDNEAYE(位置113〜126)を含むペプチドを認識し、このモノクローナル抗体に対する直鎖状エピトープが示唆された(図6)。同じセットの実験において、α−シヌクレインを認識することがすでに示されている市販抗体(Clone 42, IgG1, Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S63320)もまた、直鎖状エピトープ(配列AGSIAAATGFVKKD)(図6)にマップできた。
第2および第3ラウンドのサブクローニング後、10〜20mgの抗体を精製するために抗体の生成を1〜2リットルまでスケールアップする。Mini-Leak-Medium(KEM-EN-TEC Biozyme, Vancouver, BC, Canada; カタログ番号 10127, ロット番号 60232-5)を用いて、製造者により提供される説明に従って抗体を免疫精製する。
十分に確立された方法(Bonhard et al., 1984)に従って、D−ビオチニル−エタ−アミノカプロン酸N−ヒドロキシサクシンイミドエステル(Boehringer-Mannheim, Brussels, Belgium; カタログ番号 1008960)を用いてビオチン化を行う。
α−シヌクレイン抗体を捕捉抗体とし、ビオチン化モノクローナル抗体の1つをディテクター抗体とするサンドイッチELISAを開発する。MaxisporpマイクロタイタープレートをAffini Pureヤギ抗マウスIgG(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号115-035-144)で被覆する。PBS中1% BSA(臨床用グレード 98% 脂肪酸不含; ICN, Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, USA; カタログ番号 105033, ロット番号 6p384)+1%マウス血清をブロッキング緩衝液として使用する。ブロッキング緩衝液で1/1000に希釈した抗α−シヌクレイン(Transduction Labs, Lexington, KY, USA)を添加する。インキュベーション後、組み換え抗原を異なる濃度で添加する(濃度範囲1000〜2pg/ml)。同時に、1%マウス抗体の存在下においてビオチン化抗α−シヌクレインモノクローナル抗体を最適バックグラウンドシグナル比となるように選択した濃度で添加する。次いで、1/2000に希釈したセイヨウワサビ標識ストレプトアビジン(Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 016-030-084)によりビオチン化ウサギ抗体を検出する。カップリングしたペルオキシダーゼを、TMB H2O2基質溶液により検出する。30分後に2N H2SO4で反応を停止し、吸光度を450nmで測定する。
3.1 タウおよびホスホタウ
AT120を捕捉抗体とし、ビオチン化HT7−BT2をディテクター抗体として用いて、タウ抗原試験(INNOTEST hTau antigen, Innogenetics, Gent, Belgium)により全タウを測定した。モノクローナル抗体AT120は、正常ヒトタウ蛋白および過剰にリン酸化されたヒトタウ蛋白の両方と等しく十分に反応し(Vandermeeren et al., 1993)、モノクローナル抗体HT7もまた、正常ヒトタウ蛋白および過剰にリン酸化されたヒトタウ蛋白の両方と等しく十分に反応するが、モノクローナル抗体BT2は優先的に正常タウを認識する(Goedert et al., 1994)。すでに記載されたようにして(Mercken et al., 1992b)調製された、アフィニティー精製されたタウ蛋白を標準物質として使用した。
HT7を捕捉抗体とし、ビオチン化AT270をディテクター抗体として用いるサンドイッチELISA(INNOTEST phospho-tau(181), Innogenetics, Gent, Belgium)を用いてホスホタウを測定した。AT270はホスホタウを特異的に認識する(国際公開 WO 95/17429)。
Innotest β-amyloid(1-42)(Innogenetics, Gent, Belgium)を用いてβ−アミロイド(1−42)濃度を測定した。アッセイはサンドイッチ型ELISAであり、該アッセイにおいて第1のモノクローナル抗体21F12(アミロイドのカルボキシ末端に特異的)を捕捉抗体として使用し、ビオチン化抗体3D6(アミノ末端に特異的)をディテクター抗体として使用する。21F12/3D6の組み合わせはアミロイド(1−42)ペプチドの特異的検出を可能にする。いくぶんかの交差反応性がアミロイド(1−42)に関して観察されるが、短いペプチドに関しては観察されない(Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997)。簡単に説明すると、21F12抗体を10mM Tris−10mM NaClに懸濁し、4℃で一晩かけてNunc Maxisorbsマイクロタイタープレートを被覆した。1回洗浄工程を行った後、25℃で2時間、PBS−0.1%カゼインでプレートをブロックした。75μlのビオチン化3D6および25μlのCSFまたは標準物質を同時インキュベーション(25℃で1時間)することにより試験を行った。数回洗浄工程を行った後、100μlのHRP−ストレプトアビジン(RDI, Flanders, New York, NY, USA)を添加することにより結合抗体量を調べた。インキュベーションを25℃で30分継続した。次いで、100μlの0.42mM 3,5,3’,5’−テトラメチルベンジジンをペルオキシダーゼ基質として添加した。30分後に50μlの0.9N H2SO4で反応を停止した。
Quality Controlled Biochemicals (QCB, Hopkinton, MA, USA)から得た、C末端に特異的な、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、3D6(Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997)をディテクター抗体として用いて、β−アミロイド(1−40)濃度を測定した。10mM Tris−10mM NaCl緩衝液中で25℃で2時間かけてNunc Maxisorbsマイクロタイタープレートを5μg/mlのアフィニティー精製されたヤギ抗ウサギIgG(H+L)(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 111-005-144)で被覆した。その後、4℃で一晩、プレートをPBS−0.1%カゼインでブロックした。ウサギポリクローナル抗体(QCB, Hopkinton, MA, USA; カタログ番号 44-348-20)を0.5μg/mlの濃度で添加し、25℃で1時間置いた。数回洗浄工程を行った後、100μlのCSFまたは標準物質を25℃で2時間インキュベーションした。100μlのビオチン化3D6抗体を添加(抱合体希釈物中0.1μg/mlの濃度で添加)して25℃で1時間置くことにより結合アミロイド量を調べた。プレートをさらに5回洗浄した。100μlのSV−AP(Gibco, Rockville, MD, USA; カタログ番号 JK-4410)を添加することにより結合抗体量を調べた。インキュベーションを25℃で1時間継続した。最後の洗浄工程(5回)の後、基質緩衝液に溶解した100μlのTMBをペルオキシダーゼ基質として添加した。30分後に50μlの0.9N H2SO4で反応を停止した。
2種のエピトープ特異的モノクローナル抗体(NM2、NM4;Oestreicher et al., 1994)を用いてニューロモジュリンについても測定した。捕捉抗体としてNM2を選択し、ディテクター抗体としてビオチン化NM4を選択した。組み換えニューロモジュリンを標準物質として使用した。
NSEの測定は、抗NSEモノクローナル抗体2E7を捕捉抗体として用い、ペルオキシダーゼ標識抗NSEモノクローナル抗体10C1をディテクター抗体として用いるサンドイッチELISAの測定は、抗NSEモノクローナル抗体2E7を捕捉抗体として用い、ペルオキシダーゼ標識抗NSEモノクローナル抗体10C1をディテクター抗体として用いるサンドイッチELISAに基づくものであった。ヒト脳から精製したNSEを標準物質として使用した(Vanmechelen et al., 1997)。
BCA蛋白試薬(Pierce, Rockford, Illinois, USA)を用いて蛋白濃度を決定した。
4.1 患者および対照患者
アルツハイマー病(AD)群は32人の患者からなり、男性15人、女性17人で、平均年齢±SDは75.0±6.6歳であった。血管性痴呆(VAD)群は20人の患者からなり、男性10人、女性10人で、平均年齢±SDは81.0±7.0歳であった。対照群は18個体を含み、男性7人、女性11人で、平均年齢±SDは67.5±5.5歳であった。NINCDS−ADRDA判断基準(McKhann et al., 1984)に従って排除を行うことにより可能性のあるADの診断を行った。痴呆の進展、および/または大規模な梗塞および/または多発性裂口のCT所見、および/または重症の血管性疾患の臨床的所見、例えば、合併症を伴う動脈高血圧または糖尿病に関連した一時的な虚血発作および/または卒中エピソードを有する患者においてVADを診断した。対照群は精神病または神経学的疾患、悪性疾患、または全身性疾患(例えば、リューマチ性関節炎、感染性疾患)の病歴、症状または徴候のない個体からなっていた。60歳以上の個体において、Multi-Mental state examination (Folstein et al., 1975)を用いて認識状態を試験した。28点以下のスコアを有する患者は参加させなかった。University of Goeteberg(Goeteberg, Swedec)のEthic Committeeにより当該研究は承認された。患者(または彼らに最も近い親類)および対照群の個体は研究に参加するためのインフォームドコンセントを受けた。
手順はDavidsson et al., 1996に詳述されている。簡単に説明すると、5〜10mlのCSFをBlue Sepharoseカラム(Pharmacia, Uppsala, Sweden)に供してアルブミンを選択的に除去した。次いで、アルブミン不含フラクションを、Sepharose 4B(Pharmacia, Uppsala, Sweden)に共有結合したスタフィロコッカス蛋白Gのカラムに供してIgGを吸着させた。mRPC C2/C18カラム(内径2.1x100mm、ゲル体積0.35ml、粒子サイズ3mm)を装備したSMARTシステム(Pharmacia LKB technology)を用いるmR−HPLCにより未吸着蛋白を分離した。2回のトリフルオロ酢酸のグラジエントにより蛋白を溶離した。全部で40個のフラクションをSavant Speed Vac Concentratorで乾燥させた。フラクションをSDS−PAGE試料緩衝液に溶解し、超音波処理し、15分煮沸して、12%ポリアクリルアミドゲルで分離した。
サンドイッチELISAを用いることにより、CSF−Rab3a、CSF−SNAP25、CSF−タウおよびCSF−β−アミロイド(1−42)を32人のAD患者、20人のVAD患者および11人の対照のCSF試料中で測定した。すべてのマーカーの平均レベルを表4にまとめる。個体のタウおよびRab3a値を図7に示す。
AD患者に関する最高感度および対照患者に関する最高特異性により決定されたカットオフ値に基づいて、確度比を決定した(表5)。Rab3aレベルとSNAP25レベルとが相関関係を有しているので、Rab3aまたはSNAP25のいずれかをタウおよびβ−アミロイドと組み合わせるだけでよい(図8)。かくして、Rab3aとSNAP25の組み合わせに関する確度比を調べなかった。個々のマーカー1つだけあるいは2つだけの組み合わせに関する確度比と比較した場合の、3つの神経学的マーカーの組み合わせ、タウ−β−アミロイド(1−42)−Rab3aならびにタウ−β−アミロイド(1−42)−SNAP25の増加した確度比は、これらの3つのマーカーの組み合わせによりアルツハイマー病のより特異的かつ感度の良い検出が可能になることを示す。
依存的変数、因子としての性別、共分散としての年齢および最小精神的スコア(MMSE; Folstein et al., 1975)のようなすべてのマーカーを有する、十分に階乗的な変数の多数分析(ANOVA)は、異なる群において、これらのパラメーターが共分散しないことを示した。さらに、タウ、β−アミロイド(1−42)およびRab3a/SNAP25の間の有為な相関関係は、各群においても、全群を一緒にしても検出できなかった。
Rab3aおよびSNAP25に対するさらなる抗体を単離する。CSF−Rab3a、CSF−SNAP25、CSF−タウおよびCSF−β−アミロイド(1−42)のレベルを、許容される試料のサイズにより統計学的に有意な比較が可能な十分に定義された臨床診断群において研究する。
5.1 患者および対照患者
1996年8月から1998年9月までの間、the Pediatric Hemato-oncology Department of the Catholic University of Leuven, Belgiumにおいて癌の治療を受けた83人の小児から448のCSF試料を得た。すべての患者は診断時点において完全に臨床的評価を受けていた。親のインフォームドコンセントが得られた。
悪性疾患の分類および治療のために、計画された腰椎せん刺(LP)のコースに試料を供した。血液学的悪性疾患を有する患者の異なる群を本研究に参加させた(表6)。第1群は、United Kingdom Children Cancers group (UKCCSG 9602) NHL protocolに従って治療された9人のB細胞非ホジキンリンパ腫患者(B−NHL)からなっていた(表7a)。この群において、4人の患者がB細胞リンパ腫を有し、3人の患者がBurkittリンパ腫を、2人の患者が未分化ラージ細胞リンパ腫(ALCL)を有していた。これらの患者のうち8人は長期にわたり研究された。第2および最後の群は、European Organization for Research and Treatment of Cancer' (EORTC) protocol 58881に従って治療された非B細胞急性リンパ芽球白血病/非ホジキンリンパ腫(NB ALL/NHL)の42人の患者からなっていた(表7b)。この第2群において、18人の小児はCD10(+)ブラストまたは通常のNB ALLを有し、2人の患者はダウン症候群(DS)を有し、1人の患者はBrachmann-de Lange症候群を有し、3人の患者は通常のB細胞ブラストを有し、1人の患者はT細胞ブラストを有し、2人の患者はプロB細胞ブラストを有し、9人の患者はプレB細胞ブラストを有し、8人の患者はT細胞ブラストを有していた。38人の小児が白血病を有し、5人の患者が非ホジキンリンパ腫段階II(1人)、段階III(3人)または段階(IV)(1人)であり、それらのうち1人の患者は、CSF中の悪性細胞に関する研究プロトコル、眼底検査およびコントラストカプテーション(contrast captation)により定義された明らかなCNSの疾病(CNS+)を有していた。5人の患者は、治療プロトコルにおいて定義された判断基準によれば非常に危険性の高い(VHR)患者であった(2人の患者はT細胞ブラスト、3人の患者はコルチコイド耐性)。この群中の患者のうち27人は長期にわたり追跡できた。第3の患者群は急性骨髄性白血病(AML)の6人の小児からなってお、そのうち1人の患者はCNSの疾病を有し、2人の患者はダウン症候群であった。M0表現型を有する3人の患者、およびM1、M2またはM7表現型が1人ずついた。これらすべての患者はEORTC 58921プロトコルにより治療され、長期にわたり追跡された。他の患者は異種の小児群(n=18)からなり、治療前後の感染の診断および段階分けのために臨床的理由により腰椎せん刺を行った。この群は5人の髄芽細胞腫の小児(3人が段階分け中、1人が治療中、1人がフォローアップ中)、3人のホジキン病の小児(段階分け中)、3人の横紋筋肉腫(2人が段階分け中、1人が治療中)、2人の脊髄形成異常(MDS)の小児(段階分け中)、2人のランゲルハンス細胞組織球炎(LCH/HLH、段階分け中)、1人の若年性慢性骨髄性白血病(CML)の小児(治療中)、絨毛癌(フォローアップ中)の小児、または胚細胞腫(段階分け中)の小児であった。健康な新生児の大きな群は利用できなかった。なぜなら、これらの患者から脳脊髄液を採取することは倫理に反するからである。対照として、髄膜炎を有する疑いがあるが陰性である小児(n=4)、局所的網膜芽細胞腫(n=1)の小児および家族性ヘモファゴサイティックリンパ組織炎球増多症(n=1)の小児を参加させた。親のインフォームドコンセンサスが得られた。
見込のある、かつ長期の単一中心研究計画を用いた。研究に入る前に患者は治療を受けなかった。今回の調査研究において、58人の小児から得たCSF試料を治療前に利用した(診断的腰椎せん刺またはLP1)(さらなる詳細は表7参照)。大部分の患者に関してすべての時点において残りの試料が利用できなかった。失われた値は小児の疾病の状態によるのではなく、サンプリングまたは試料の保存の間の人為的要因によるものであった。
診断ワークアップのためのベースラインまたは化学療法のIT投与直前のいずれかにおいて、ルーチンな分析のために腰椎せん刺を行った。別々のポリプロピレンチューブに5mlのCSFを集めた。1の試料を即座に1500rpmで2分間遠心分離して細胞および他の不溶性物質を除去した。引き続いて行う分析のために上清を−70℃で保存した。凍結/融解サイクルの数を最小限とした。ルーチンなCSF測定は、細胞学的項目、蛋白濃度、グルコース等を包含した。
診断群にかかわらずすべての神経学的マーカーのデータに関する正規化が拒否されたので、非パラメトリック統計を分析に使用した。Kruskal-Wallis検定を用いて、エフェクト変数(タウ、ニューロモジュリン、蛋白等)に関する群の差異を調べた。Wilcoxonサインドランクス検定、マッチド−ペアー(Wilcoxon signed ranks test, matched-pairs)を用いて、最初の診断LPとその後のLPとの間の相違をチェックした。Prismソフトウェアv2.01(Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA)、Systatバージョン7(SPSS, Chicago, IL, USA)を用いて分析を行った。
治療前の神経学的マーカーのレベル
まず、感染性疾患(しかしながら、ウイルスおよび細菌培養陰性)(n=4)の小児から得たCSF試料に関してタウの正常な上限を調べた。1人の患者は非常に局部的な網膜芽細胞腫を有し、1人の小児は家族性HLHに関してスクリーニングされた者であった。対照小児における平均タウ値は106.2pg/ml(95% CI=34.3〜178.0)であった。任意のカットオフ正常値は312pg/ml(平均+3SD)であり、それは成人において観察される値の範囲内である。正常成人対照の80%が352pg/ml未満のタウ値を有するが、425pg/ml(p25−p75:274−713,n=150)がアルツハイマー病患者のメジアンタウレベルである(Hulstaert et al.,1999)。まず、患者数に関係なく試料を分析し、その後、1の患者から得たすべての試料を1のイムノプレート上でさらに分析した。104個の試料のセットに関する第1のアプローチと第2のアプローチとの間の相関係数は0.901(95% CI:0.856−0.933)であった。
診断時のタウレベルを患者の各サブグループに関して分析した(図9)。診断時のタウレベルは66から1500pg/mlの範囲であった。タウ、ニューロモジュリン、β−アミロイド(1−42)、β−アミロイド(1−40)、血清LDHおよびCSF白血球カウントに関するデータ(図10)は、ダウン症候群を有するまたは有しない患者群において、あるいは診断群間において、明らかな相違を示さない。さらに、タウレベルとWBCまたはLDHレベルとの間にも相関関係が見出されなかった。タウ濃度と小児の年齢との間にも有意な相関関係が見出されなかった。2人のMDS患者、明らかなCNS侵襲(CNS+)であるがAMLでない小児は、診断時においてタウレベルが著しく上昇していた。また、後方窩における髄芽細胞腫のために頭蓋内圧が上昇して入院した3人の患者から、段階分けのためにCSFを取ったところ、非常に高いCSF−タウ濃度であった(823、1397、1500)。しかしながら、非B ALL/NHLを有する21人中7人の小児、非常に高い危険性を有する非B ALL/NHL患者4人のうち1人、AMLの患者4人のうち2人、およびB細胞NHLの患者8人のうち2人が312pg/ml以上のタウレベルを有していたが、古典的な診断手順を用いるとCNS侵襲は検出されなかった。
非B ALL/NHLを有する27人の患者あるいはB細胞 NHLを有する9人の患者に関しては(データ示さず)、白血球カウント(p=0.935,n=40)または血清LDH(p=0.855,n=39)によって反映されるように、診断時のタウレベルは腫瘍負荷と相関関係がなかった。LP1において、タウとニューロモジュリンとの間の非常に有意な相関関係が存在し[r=0.793;95% CI:0.658−0.928,n=50]、両方の蛋白の分泌がある程度相互関係があることが示された。タウとβ−アミロイド(1−42)との間には相関関係が見られなかった(p=0.1032,n=52)。
化学療法により誘導されたCSF中のタウの増加に関する最も明確な相違がB細胞NHL患者において検出された。ベースライン試料および9日目のLP(=LP2)におけるフォローアップ試料の両方が利用可能であった3人の患者に関する結果を図11aに示す。9日目、すなわちIV MTXおよびビンクリスチンとともにMTXおよびヒドロコルチゾンをIT投与した後には、すでに最大タウ増加が測定可能であった。タウのさらなる増加はその後測定されなかった。ニューロモジュリン(図11b)およびニューロン特異的エノラーゼ(図11c)に関する同様の知見によっても、化学療法により誘導された神経代謝活性に対する効果が確認された。さらに、タウとニューロモジュリンとの間(r=0.722, 95% CI: 0.553-0.834, n=49)あるいはニューロモジュリンとニューロン特異的エノラーゼとの間(r=0.622, 95% CI: 0.247-0.835, n=20)に明確な相関関係があった。
全治療期間にわたるデータ(前後試料)が、EORTCプロトコル58881により治療を受けた13人の非B細胞ALL患者に関して利用可能であった。個々の患者について、異なるフェーズまたは治療に関するメジアンタウ値を図12aに示す。治療前(LP1)と比較して(p=0.048)、あるいはメンテナンス期間と比較して(p=0.040)、誘導期間中にタウレベルが有意に増加した。1人の患者は治療開始前からすでにタウレベルが上昇しており(893pg/ml)、おそらく神経学的機能不全がすでに開始していたことを反映するものであろう。また、治療前と誘導期間との間のニューロモジュリンレベルの増加傾向もあった(図12b)。治療開始時に高いタウレベルが存在した患者もまた、化学療法開始時において高いニューロモジュリンレベルを示した。LP1およびLP2に関するNSEのデータが利用可能であった2人の患者において[LP1 (4.0 ng/ml, 3.4 ng/ml); LP2 (11.7 ng/ml, 9.6 ng/ml)]、NSEの明確な増加が観察された。
非B細胞ALL患者からのすべてのデータの分析により、誘導期間において最高タウ濃度が見られることが明らかとなった。誘導期間中、分析した試料の41%(28/68)が500pg/mlよりも高かった。その後、インターバル期間においてこのパーセンテージは18.9%(14/74)まで低下し、再誘導期間中に16.7%(3/18)となり、最後に、メンテナンス期間中に9.7%(7/72)となった(図13a)。治療開始前にすでに上昇したタウ(>500pg/ml)を有していた3人の患者におけるタウ値は化学療法後に正常化した。β−アミロイド(1−42)、非B ALL患者におけるニューロモジュリンおよびNSEレベルに関するデータを図13b、図13cおよび図13dにそれぞれ示す。ここでもやはりタウとニューロモジュリン(r=0.658, 95% CI = 0.580-0.725,n=251)またはNSE(r=0.589, 95% CI = 0.363-0.749, n=47)との間に明確な相関関係があった。
非常に高い危険性を有する5人の非B ALL小児を、本研究において長期にわたり試験した。最初の治療フェーズはEORTC 58881と同様であった。同様の化学療法により誘導されたタウレベルの変化が5人中4人の患者において観察され、タウとニューロモジュリンとの間の高く有意な相関関係も観察された(n=55; r=0.880, 95% CI: 0.802-0.929)。
1人のダウン症候群−非B ALL患者は診断時に70pg/mlのタウ濃度を有していた。すべての非B ALL患者における平均タウ増加は、長期研究の8日目で250%(95% CI = 130% 370%, n=13)、21日目で200%(95% CI = 150%-260%, n=8)であったが、ダウン症候群患者のタウ増加パーセンテージは8日目および21日目においてそれぞれ820%および1200%であった。
高い白血球負荷(610000WBC/mm3)のため、1人の特別な患者を、1日目にIT MTXを使用せずにプレドニソロンで8日間治療した。治療8日後にタウレベルは低いまま、すなわち155pg/mlであった。その後、この患者は他の非B ALL患者と同様にEORTCプロトコル(次の週からMTXをIT注射することを含む)に入った。タウレベルは急激に増加し、12、15、18、22および44日目にはそれぞれ744、948、1120、861および1023pg/mlとなった。別のセンターで治療を受け、MTXでの治療後に明らかな神経毒性に苦しんでおり、しかも両側麻痺であった小児から1のCSF試料が利用可能であった。この小児のタウおよびミューロモジュリンのレベルは使用した最高標準値(タウについて1500pg/ml、ニューロモジュリンについて8000pg/ml)を超え、大規模な神経変性を反映していた。
図14aは、AMLを有する個々の患者におけるタウの消長を示す。患者11、12および23は治療期間中有意なタウの増加を示さなかった(表7c)。1日目および8日目にLPを取った患者12は激しい疾病を有しており、骨髄移植後間もなく死亡した。ダウン症候群の2人の患者のうち1人から、長期にわたるデータが利用可能であり、この患者は300pg/mlをわずかに上回るタウレベルを有しており、患者11および23のCSF中のタウレベルの消長とは対照的であった。診断時にCNS侵襲の証拠があった患者69はCSF中のタウおよびニューロモジュリンの劇的な増加を示した(図14b)。この小児はまだ治療中であり、現在完全に軽快している。
我々は、長期の研究において、体液中のタウ、ニューロモジュリンおよびNSEレベルの有意な増加を見出し、それは化学療法に関連した神経のダメージを反映している可能性が最も高く、主にIV コルチコステロイドおよび化学療法剤と組み合わせてIT MTXを投与した場合に誘導されたが、インターバル治療期間中の高用量のIVおよびIT MTX投与期間中には誘導されなかった。
周産期仮死は神経損傷に関連している可能性がある。電脳図および神経放射線学的データに加えて、CSF神経学的マーカーは低酸素−虚血イベントを評価する際の臨床データを補完しうるものである(Garcia-Alix, 1994)。変化した脳の代謝活性はCSF中の成分の変化を反映するものであるという証拠が増えつつある。CSFマーカーの周産期レベルおよび仮死による変化の分布を評価する。
7.1 患者および対照患者
109の個体からCSFを得た。個体を4群に分けた:(i)痴呆に関する神経学的対照と定義される群(n=70)。この群は、多発性硬化症、Guillan-Barre症候群、多発性ニューロパシーおよびてんかんの患者を含んでいた。他の群は、(ii)記憶障害の老人患者(n=7)、(iii)アルツハイマー病(AD)患者(n=27)、および(iv)血管性痴呆(VAD)の患者(n=5)からなっていた。International Classification of Diseases, version 9 (Manual of the international statistical classification of diseases, injuries, and causes of death: based on recommendations of the Ninth Revision Conference; 1975, and adopted by the Twenty-Ninth World Health Assembly. Geneva: World Health Organization, 1977)により決定された判断基準に従ってすべての患者を診断した。AD群において、2人の患者は1の家族からの者であり、プレセニリン変異により疾病の早期発症がわかっている。これらの患者のうち1人は徴候前であった。
神経学的試験の一環としてCSFをルーチンに採取した。CSFの残りについてすべての試験を行った。ポリプロピレンチューブ中に正しく保存され、1回だけ凍結されたCSF試料においてのみβ−アミロイド(1−42)を測定した。
これらの患者のCSF中のタウ、β−アミロイド(1−42)およびニューロモジュリン(GAP−43)を調べた。各群の平均CSFレベルを表8に示す。β−アミロイド(1−42)、タウおよびニューロモジュリンの個人レベルを図15a、15bおよび15cにそれぞれ示す。
AD患者においてCSF−タウおよびCSF−β−アミロイド(1−42)が有意に変化していた。また、ADにおいてCSF−ニューロモジュリンが有意に増加していた。対照的に、老人性記憶障害患者においてはCSF−ニューロモジュリンにおける有意な影響は観察されなかったが、対照患者と比較してCSF−タウレベルが有意に増加していた。7人の記憶障害患者のうち3人が対照群により決定された最大レベル(280pg/ml)よりも高いCSF−タウレベルを有していた。正しくない保存のため、CSF−β−アミロイド(1−42)レベルは3人の記憶障害の患者においてしか調べることができなかった。3人の患者のうち2人において、300pg/ml未満のレベルがみられた。これらの患者のうち1人は上昇したCSF−タウレベルも有していた。他の患者は278pg/mlのCSF−タウレベルを有しており、すなわち、対照群により決定された最大レベルよりもわずかに低かった。徴候前の家族性AD患者において、327pg/mlのCSF−タウレベルにまで増加しており、β−アミロイド(1−42)レベルは300pg/ml未満であった。少ない記憶障害個体の試料についてのこの分析は、タウ、β−アミロイド(1−42)およびニューロモジュリンの組み合わせ使用はアルツハイマー病の存在に関するより良いインジケーターであることを示す。統計学的に有意であるように、1群あたりより多数の試料を分析中である(1の診断群あたり少なくとも50の試料)。
8.1 患者および対照患者
60人のアルツハーマー病患者、23人のパーキンソン病患者および年齢の合った32人の対照患者からCSFを得た。これらの患者のCSF中のタウ、β−アミロイド(1−42)およびニューロモジュリン(GAP−43)を調べた。各群の平均CSFレベルを表9に示す。
対照と比較すると、AD患者においてタウが有意に増加していたが、β−アミロイド(1−42)レベルが減少していた。NMレベルは両群間で有意には異ならなかった。しかしながら、NMとタウのレベルは有意に相関関係があった(図16)。図16は、AD患者に関する値が対照患者に関する値とは異なる可能性を示す。後退判別分析(backward discriminant analysis)(Marrisonら,1976年)を用いて、タウ、β−アミロイド(1−42)、ニューロモジュリンまたはタウ/ニューロモジュリンのいすれの変数が最も良くアルツハイマー病患者を対照患者から識別するものであるかを調べた。変数タウ/ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド(1−42)を選択し、アルツハイマー患者58人中55人(感度94.8%、CI 85.6%〜98.9%)および対照患者31人中30人(特異性96.8%、CI 83.3%〜99.9%)を正しく分類した(図17)。より多くの試料をさらに分析すれば、これら3つのマーカーを用いることによるアルツハイマー病の診断の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
後退判別分析(Morrison, 1976)を用いて、いずれの変数がパーキンソン病患者と対照患者とを最適に識別するものであるかを調べた。変数タウ/ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド(1−42)を選択した。パーキンソン病患者23人中14人が正しく分類され(感度60.9%、CI 38.6%〜80.3%)、対照患者31人中27人が正しく分類された(特異性87.1%、CI 70.2%〜96.4%)(図17)。より多くの試料をさらに分析すれば、これら3つのマーカーを用いることによるパーキンソン病の診断の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
β−アミロイド(1−42)およびニューロモジュリンを選択して、アルツハイマー病患者をパーキンソン病患者から分別し、アルツハイマー病患者について感度94.8%(CI 85.6〜98.9%)、パーキンソン病患者について特異性78.3%(CI 56.3%〜92.5%)であった。より多くの試料をさらに分析すれば、これら3つのマーカーを用いることによるアルツハイマー病とパーキンソン病の分別の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
9.1 患者および対照患者
30〜40人のアルツハイマー患者、10〜20人のレービー小体痴呆患者および10〜20人の年齢の合った対照からCSFを得る。
患者群および対照群からのCSF中のα−シヌクレイン濃度を定量する。レービー小体痴呆群のα−シヌクレインレベルに関する値の平均値とアルツハイマー病群のα−シヌクレインレベルに関する値の平均値との有意な相違により、両方のタイプの痴呆を分別することが可能である。α−シヌクレインの定量と少なくとも2種の他の神経学的マーカー(タウおよびβ−アミロイド(1−42)のごとき)の定量を組み合わせることにより、アルツハイマー病とレービー小体痴呆との分別がさらに改善される。
10.1 患者および対照患者
30〜40人の前頭側頭葉痴呆患者および10〜20人の年齢の合った対照からCSFを得る。
前頭側頭葉痴呆患者および対照患者のCSF中のβ−アミロイド(1−42)、タウおよびホスホ−タウのレベルを定量する。対照患者のタウおよびホスホ−タウのレベルの平均値と比較した場合、前頭側頭葉痴呆患者のタウおよびホスホ−タウのレベルの平均値が有意に増加している。前頭側頭葉痴呆患者は、対照患者と比較すると、β−アミロイド(1−42)のレベル低下を示す。
11.1 患者および対照患者
アルツハイマー病の血管性疾患の患者30〜40人、他の形態のアルツハイマー病患者30〜40人および年齢の合った対照10〜20人からCSFおよび血漿を得る。
血管性疾患の患者、他の形態のアルツハイマー病の患者、ならびに対照患者のCSF中のタウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルならびに血漿中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量する。血漿−β−アミロイド(1−42)、CSF−タウおよびCSF−β−アミロイド(1−42)の定量的に異なったレベルは、血管性疾患の患者と他の形態のアルツハイマー病の患者との分別を可能にする。
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Claims (4)
- 個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のための方法であって、下記工程:
神経学的マーカーを特異的に認識する抗体を用いることにより、個体から得た1またはそれ以上の体液試料中の少なくとも3種の神経学的マーカーのレベルを決定する
を特徴とし、さらに以下のことを特徴とする方法:
アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のために、
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のホスホ−タウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびホスホ−タウのレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する;あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウ、ホスホ−タウおよびβ−アミロイド(1−42)のレベルを定量的に測定する。 - 個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、
少なくとも3種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、かつ、各抗体が下記の神経学的マーカー:
タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド(1−42)
の組み合わせを認識するものであるか;あるいは
少なくとも2種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、該抗体のうち1つが2つの異なる体液中の神経学的マーカーを認識するものであり、各抗体が下記の神経学的マーカーの組み合わせ:
−タウ、β−アミロイド(1−42);または
−ホスホ−タウ、β−アミロイド(1−42)
のいずれかを認識するものである、キット。 - 個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに/あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、下記のもの:
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも3種の抗体(一次抗体または捕捉抗体)を一緒にあるいは別個に含む支持体;
神経学的マーカー−一次抗体複合体の1つをそれぞれ認識する二次抗体(ディテクター抗体);
−可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付すかあるいはカップリングするマーカー;
−可能ならば、一次抗体と体液試料間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および/または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液
−可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド
を含む、請求項2記載のキット。 - 請求項1記載の方法を行うために特別に設計された請求項2または3に記載のキット。
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