JP2006076947A - ホスホリパーゼａ（２）の活性亢進を伴う疾患用薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の課題は、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患の治療用および／または予防用組成物を提供することである。
【解決手段】 式［Ｉ］
【化１】

で表される化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患の治療用および／または予防用医薬組成物。
本発明に係る化合物は、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）阻害活性において、人為的な活性型酵素活性を反映する評価系においては弱い阻害活性が認められたことに対して、生理的な活性型酵素活性を反映する評価系において選択的に高い阻害活性を有するため、その化合物を有効成分として含有する組成物は、ＰＬＡ（２）活性の亢進を伴う病態症状を軽減し、その関連する疾患に非常に効果的な作用を示し、治療薬または予防薬として有用である。

Description

本発明は、ホスホリパーゼＡ（２）（以下、ＰＬＡ（２）と略記する）の活性亢進を伴う疾患の治療用および／または予防用組成物に関する。

ホスホリパーゼＡ（２）は、生体膜の主要構成分であるグリセロリン脂質のグリセロール骨格のｓｎ−２位に結合した脂肪酸を優先的に加水分解する酵素の総称である。本酵素は生体膜脂質の新生代謝に関わると同時に、その生成物およびその代謝物が強力かつ多様な生理活性を示す脂質メディエーターであることも知られている。一方の生成物アラキドン酸は、それ自身もメディエーターとして働くが、各々の炎症担当細胞により更にプロスタグランジン（以下、ＰＧと略記する）類、トロンボキサン類、リポキシン類、ロイコトリエン（以下、ＬＴと略記する）類等に代謝されて特徴ある生理反応を引き起こす（例えば非特許文献１参照）。また、リゾホスファチジルコリンもそれ自身が作用する他に血小板活性化因子（以下、ＰＡＦと略記する）の前駆体としても利用される。これらの脂質メディエーターは、本来は生体の恒常性維持のために機能しているが、炎症の関与する病態においては過剰生産されて症状の増悪に関与している。事実、このアラキドン酸カスケードに作用する薬剤としてステロイド性抗炎症薬や種々の非ステロイド性抗炎症薬（以下、ＮＳＡＩＤｓと略記する）が広く臨床にて使用されているが、ＰＬＡ（２）はこのアラキドン酸カスケードの上流に位置し、これらの脂質メディエーター産生における律速段階の酵素であることから抗炎症薬開発の有望なターゲットとして期待されている（例えば非特許文献２参照）。

ＰＬＡ（２）は近年、次々に新しいアイソザイムが発見されて１５種類を超え、これらはその蛋白質構造や酵素活性面での特徴から４つのファミリーに分類されて全体としては大きなスーパーファミリーを形成している（例えば非特許文献３、非特許文献４参照）。各々のアイソザイムはその活性発現における特性も異なり、機能分担を行っていることが報告されているが、これらの中でIVＡ−ｃＰＬＡ（２）はグリセロールの２位にアラキドン酸を結合したリン脂質に高い特異性を示し、或いは、炎症性疾患において活性の上昇が認められ、その遺伝子欠損（所謂ノックアウト）マウスの知見（例えば非特許文献５、非特許文献６参照）からも炎症病態における脂質メディエーター産生を制御する主要なアイソザイムであり、高い安全性が期待できる有望な創薬ターゲットであると考えられている。即ち、このアイソザイムの活性を阻害することにより病態で亢進している脂質メディエーター産生を特異的かつ総合的に抑制することができ、炎症性疾患の治療および／または予防が可能であると考えられている。しかしながら、本酵素活性の阻害により臨床上有用な効果を示す物質は未だ開発されていないため、その開発が望まれている。

IVＡ−ｃＰＬＡ（２）は殆ど全ての細胞および臓器にて恒常的に発現し、非活性型として大過剰量存在して待機し、外部からの刺激に応じてその一部の酵素が正確に活性化され、活性化された分子の数が閾値を超えた場合にのみ細胞応答が引き起こされる。正確な活性化は構造変化が伴ったものであり、上記の細胞応答を阻止するためには生理的な活性型酵素の活性を阻害することが必要である。ところが、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）阻害剤探索を目的とした活性評価においても、炎症病態において阻害すべき生理的な活性型酵素の機能構造／活性に着目した検討はなされてこなかった。また、このような生理的な活性型酵素の機能構造との類似性が低い、人為的な活性型酵素を用いた評価系における酵素に対する阻害活性とｉｎ ｖｉｖｏ薬理活性との関連性は低いものであった。

本発明者らは、Ｕ９３７細胞を用いて蛍光標識リン脂質である１，２−ｂｉｓ−（４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄｅｃｅｎｅ−３−ｕｎｄｅｃａｎｏｙｌ）−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（以下、ＦＬ−ＰＣと略記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の加水分解活性を指標としてＰＬＡ（２）阻害剤のＣｅｌｌ−ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙスクリーニングを行い、抗炎症活性を示すヘテロ環化合物を見出している（特許文献１乃至３参照）。細胞系に加えられたＦＬ−ＰＣは細胞膜に取り込まれて蛍光プローブがｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇされた状態で存在するが、ＰＬＡ（１）或いはＰＬＡ（２）により蛍光性脂肪酸鎖が加水分解されて遊離すると強い蛍光を発する（例えば、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９参照）。この基質は、起炎刺激により活性化された細胞においては阻害剤に対する感受性を含む活性動態から、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）により主に切断されることが示唆されていたが、これらのｉｎ ｖｉｖｏ薬理活性を示す化合物によるIVＡ−ｃＰＬＡ（２）活性阻害作用が、生理的な活性型／人為的な活性型酵素を反映した評価方法の各試験間で感受性の差が認められることを見出した（特許文献４参照）。

すなわち、アラキドン酸選択性を示すアイソザイムであるIVＡ−ｃＰＬＡ（２）への選択的な阻害以上に、生理的な活性型酵素の活性を反映する評価試験系における阻害が抗炎症薬創製のターゲット戦略として重要であり、更に、非活性型酵素に類似した構造を有するような人為的な活性型酵素に対して活性が弱いことは、多くの細胞に大過剰量存在する非活性型の酵素に対する親和性が低いことが類推されるために、ｉｎ ｖｉｖｏ薬理活性の発現に有利であることが示された。そこで、前記のヘテロ環化合物とは異なる構造の、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）阻害が見出されていない抗炎症化合物について、その生理的な活性型酵素の活性を反映する評価試験系における阻害活性、更には人為的な活性型酵素に対する選択性を評価した。

置換キノリルグアニジン化合物が抗炎症、鎮痛および解熱作用を示し、リウマチ関節炎や骨関節炎に有用であることは既に知られており、特許文献５等に記載されている。当該発明においては、置換キノリルグアニジン構造を有する代表化合物Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅ（ＳＲ１３６８）が、消炎・鎮痛・解熱活性を示し、急性毒性が低くかつ胃潰瘍活性が低いこと、作用機作としてプロスタグランジンの合成阻害活性が示されている。更に、Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅは、細胞においてＣａ刺激などによりＰＧ類、トロンボキサン類、ＬＴ類等の産生を阻害することが見出されているが、Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（以下、ＬＯＸと略記する）の代謝産物の産生に対する阻害活性に比較してＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（以下、ＣＯＸと略記する）の代謝産物の産生に対する阻害活性が強く、ＣＯＸ酵素阻害活性についても報告されている。ＴｉｍｅｇａｄｉｎｅはこのＣＯＸ阻害活性の約１，０００倍の濃度においてアラキドン酸の遊離を阻害している報告もあるが、ＰＬＡ（２）活性に対する阻害活性については報告がないため、ＣＯＸ／ＬＯＸ阻害剤とされている。また、薬効分野についても関節炎用途に集中して検討されたために、抗アレルギー作用を示すことは知られていない（例えば非特許文献１０、非特許文献１１参照）。
国際公開第０１／０７２７２３号パンフレット 国際公開第０３／０００６６８号パンフレット 国際公開第０３／０３１４１４号パンフレット 特願２００３− ６７５７７号公報 ドイツ国特許発明２８４７７９２号明細書 Ｉｒｖｉｎｅ，Ｒ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０４： ３−１６ （１９８２）． Ｇｌａｓｅｒ，Ｋ．Ｂ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３２： ３１−６６ （１９９５）． Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Ａ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２： １−２ （１９９７）． Ｂａｌｓｉｎｄｅ，Ｊ．ら， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３９： １７５−８９ （１９９９）． Ｕｏｚｕｍｉ，Ｎ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３９０： ６１９−２２ （１９９７）． Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ，Ｊ．Ｖ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３９０： ６２２−２５ （１９９７）． Ｍｅｓｈｕｌａｍ，Ｔ．ら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（３０）： ２１４６５−７０ （１９９２）． Ｓｏｌｉｔｏ，Ｅ．ら， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １２４： １６７５‐８３ （１９９８）． Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｓ．ら， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６： ２７−３５ （１９９９）． Ａｈｎｆｅｌｔ−Ｒｏｎｎｅ Ｉ ＆ Ａｒｒｉｇｏｎｉ−Ｍａｒｔｅｌｌｉ Ｅ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３１： ２６１９−２４ （１９８２）． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｋ． ら， Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ４１（２）： ３０１−９ （１９９３）．

本発明の課題は、ＰＬＡ（２）の活性亢進を伴う疾患の治療用および／または予防用組成物を提供することである。

本発明者は上記課題を解決する目的で鋭意研究を重ねてきた結果、公知の抗炎症化合物Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅが、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）阻害活性において、人為的な活性型酵素活性を反映する評価系においては弱い阻害活性が認められたことに対して、生理的な活性型酵素活性を反映する評価系において選択的に高い阻害活性を有することを見出し、また、アレルギーＩ型皮膚炎モデルにおいて抗アレルギー作用を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、下記（１）及至（１０）に示すものである。
（１）式［Ｉ］

で表される化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患の治療用および／または予防用医薬組成物。
（２）式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、脂質炎症メディエーターであるアラキドン酸およびその代謝物、および／またはリゾリン脂質、および／または血小板活性化因子（ＰＡＦ）により媒介される疾患の治療用および／または予防用医薬組成物。
（３）対象となる疾患がアナフィラキシー、アレルギー性炎症、喘息、鼻炎、気管支炎、肺炎、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸管疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、虚血―再灌流における傷害、血管炎、動脈硬化、肝炎、腎炎、神経変性疾患、関節炎、皮膚炎、紫外線角化症、乾癬、敗血症性ショック、または熱病である（１）または（２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（４）アレルギー疾患治療剤である（１）または（２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）免疫調節剤である（１）または（２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）急性炎症治療剤である（１）または（２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）哺乳動物に対して、式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を投与することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患または障害の治療方法。
（８）哺乳動物に対して、式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を投与することを特徴とする、脂質炎症メディエーターであるアラキドン酸およびその代謝物、および／またはリゾリン脂質、および／または血小板活性化因子（ＰＡＦ）により媒介される疾患または障害の治療方法。
（９）式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患哺乳動物に投与する治療用および／または予防用組成物。
（１０）式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、脂質炎症メディエーターであるアラキドン酸およびその代謝物、および／またはリゾリン脂質、および／または血小板活性化因子（ＰＡＦ）により媒介される疾患哺乳動物に投与する治療用および／または予防用組成物。

本発明に係る化合物は、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）阻害活性において、人為的な活性型酵素活性を反映する評価系においては弱い阻害活性が認められたことに対して、生理的な活性型酵素活性を反映する評価系において選択的に高い阻害活性を有するため、その化合物を有効成分として含有する組成物は、ＰＬＡ（２）活性の亢進を伴う病態症状を軽減し、その関連する疾患に非常に効果的な作用を示し、治療薬または予防薬として有用である。

次に、本発明について更に詳細に説明する。

本明細書に用いる「構造機能」なる用語は、機能因子の関わる生理反応を意味し、触媒反応、結合等の相互作用、移動等を含む。

本明細書に用いる「生理的な活性化」なる用語は、生物の生理現象において種々の刺激に応じて引き起こされている機能因子の機能の亢進を意味し、必然的に機能構造の変化を伴うものである。

本明細書に用いる「医薬上許容される複合体」とは、当該化合物と一定の比率でイオン結合、水素結合、或いは配位結合で相互作用する無毒性の低分子化合物とからなる複合体を意味し、水溶液中では当該化合物を遊離せしめるもので、具体的には塩酸塩、有機酸塩、およびアミノ酸塩等の塩、水和物等の溶媒和物等である。また、本発明化合物は場合によってはそのプロドラッグ化合物、およびその代謝物についても包含されるものである。

式［Ｉ］で表される化合物またはその医薬上許容される複合体はそのままであるいは慣用の製剤担体と共に人および動物に投与することができる。投与単位形態としては特に限定がなく必要に応じ全身性投与および局所適用、即ち非全身性投与のいずれからも適宜選択して使用される。斯かる投与単位形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、経口用液剤、トローチ剤等の経口投与製剤、或いは静脈注射、筋肉注射、皮下注射等の注射用溶液または懸濁液等を例示できる。また、坐剤等の直腸投与やエアゾール剤や吸入用粉剤等の経気道（経鼻または口内吸入）投与の形態を利用することもできる。局所投与に適した処方物としては炎症部位に皮膚や粘膜等を通して浸透するのに適した形態で、例えば液剤、リニメント剤、クリーム、乳剤、軟膏剤またはペースト、並びに眼、耳または鼻への適用に適した滴剤をも包含する。投与されるべき有効成分の量としては特に限定がなく、投与の形態、選択された個々の化合物、投与される人または動物により広い範囲から適宜選択されるが、所期の効果を発揮するためには１日当り体重１ｋｇ当り０．０１〜１００ｍｇの用量にて１〜数回に分けて投与するのがよい。また、投与単位形態中に有効成分を０．１〜１０００ｍｇ含有せしめるのがよい。

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、経口用液剤等の経口剤は常法にしたがって製造される。即ち錠剤は式［Ｉ］で表される化合物またはその医薬上許容される複合体を澱粉、乳糖、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、滑石、アラビアゴム等の製剤学的賦形剤と混合し、賦形することにより製造される。カプセル剤は式［Ｉ］で表される化合物またはその医薬上許容される複合体を不活性の製剤充填剤もしくは希釈剤と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填することにより製造される。経口溶液剤のシロップ剤もしくはエリキシル剤は式［Ｉ］で表される化合物またはその医薬上許容される複合体を蔗糖等の甘味剤、メチル−およびプロピル−パラベン類等の防腐剤、着色剤、調味剤等と混合して製造される。また非経口剤は常法に従って製造され、例えば、式［Ｉ］で表される化合物またはその医薬上許容される複合体を滅菌した液状担体に溶解して製造される。好ましい担体は水または食塩水である。所望の透明度、安定性および非経口使用の適応性を有する液剤は約０．１〜１０００ｍｇの有効成分を、水および有機溶剤に溶解し且つ分子量が２００〜５０００であるポリエチレングリコールに溶解して製造される。斯かる液剤には、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ナトリウムカルボキシメチルセルローズ、メチルセルローズ等の潤滑剤が含有されているのが好ましい。さらには上記液剤中にベンジルアルコール、フェノール、チメロサール等の殺菌剤および防カビ剤、さらに必要に応じ蔗糖、塩化ナトリウム等の等張剤、局所麻酔剤、安定剤、緩衝剤等が含まれてもよい。さらに安定性を高めるために非経口投与用薬剤は充填後冷凍され、この分野で公知の凍結乾燥技術により水を除去することができる。而して使用直前に凍結乾燥粉末から液剤を再調整することもできる。

次に本発明の医薬組成物の製剤例を示す。
製剤例１ 錠剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 ５
乳糖（日本薬局方品） ５０
コーンスターチ（日本薬局方品） ２５
結晶セルローズ（日本薬局方品） ２５
メチルセルローズ（日本薬局方品） １．５
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） １
上記本発明化合物、乳糖、コーンスターチおよび結晶セルローズを充分混合し、メチルセルローズの５％水溶液で顆粒化し２００メッシュの篩に通して注意深く乾燥する。乾燥した顆粒はステアリン酸マグネシウムと混合して常法により打錠して錠剤１０００錠が調製される。

製剤例２ カプセル剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 １０
乳糖（日本薬局方品） ８０
澱粉（日本薬局方品） ３０
滑石（日本薬局方品） ５
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） １
上記成分を細かく粉末にし、均一な混合物となるように充分に撹拌した後、所望の寸法を有する経口投与用のゼラチンカプセルに充填することにより、１０００個の２片ゼラチンカプセルが調製される。

製剤例３ 注射剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 １
ポリエチレングリコール４０００（日本薬局方品） ０．３
塩化ナトリウム（日本薬局方品） ０．９
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（日本薬局方品） ０．４
メタ重亜硫酸ナトリウム（日本薬局方品） ０．１
メチルーパラベン（日本薬局方品） ０．１８
プロピルーパラベン（日本薬局方品） ０．０２
注射用蒸留水 適宜
（最終容量） １００（ｍＬ）
上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを撹拌しながら８０℃で上記の約半量の注射用蒸留水に溶解する。得られた溶液を４０℃まで冷却し、上記本発明化合物、次にポリエチレングリコールおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを添加してその溶液中に溶解する。次にその溶液に残余の蒸留水を加えて最終の容量に調製し、適当なフィルターを用いて滅菌濾過することにより滅菌し、非経口投与に適する水溶液製剤を得る。

製剤例４ 軟膏剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 ０．１
白色軟パラフィン １０
本発明化合物を基材中に均一になるまで混和する。

製剤例５ エアゾール剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 ０．２５
エタノール ２９．７５
プロペラント２２（クロロジフルオロメタン） ７０
本発明化合物をエタノールと混合し、さらにプロペラント２２の１部を添加して混和後に−３０℃まで冷却し、充填装置に入れる。次いで投与に必用な量をステンレス容器に移し入れ、残りのプロペラント２２で希釈することにより調製される。このステンレス容器にバルブユニットを装着して投与する。

製剤例６ ドライパウダー吸入製剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 ５
ラクトース ９５
本発明化合物をラクトースと均一に混合した後に、この混和物をドライパウダー吸入器に加える。

製剤例７ 坐剤
配 合 量（ｇ）
本発明化合物 ０．２２５
飽和脂肪酸グリセリド ２．０００
本発明化合物をＮｏ.６０メッシュＵ．Ｓ．篩に通し、必用最小限の加熱により予め溶解させた飽和脂肪酸グリセリド中に懸濁する。次いでこの混和物を表示容量２ｇの坐剤型に注入した後冷却する。

以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これらは単なる例示であり、本発明はこれらに限定されるものではない。

Ｕ９３７細胞培養および分化誘導
細胞は、３７℃、５％ＣＯ₂条件下にて培養した。各試験は、凍結融解後３〜１４週目の間の、細胞が安定した増殖並びに分化反応性を示す期間に行った。
［Ｉ］ 継代培養、非分化細胞：Ｕ ９３７細胞は、１０％非働化牛胎仔血清（以下、ｉＦＢＳと略記する、Ｓｉｇｍａ社Ｆ４１３５）を添加したＲＰＭＩ １６４０培養液中、Ｎｏｎ−ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄフラスコを用いて３〜４日毎に継代培養を行った。
［ＩＩ］ ＤＭＳＯ分化細胞−１：［Ｉ］の非分化細胞を［Ｉ］と同様の培養条件において、培養液中最終濃度０．１６Ｍ ＤＭＳＯ条件下で４８時間培養を継続すると、明確な形態変化は認められず、顕著な接着性も示さないが増殖速度は低下し、Ｃａ²⁺−ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ Ａ２３１８７（以下、Ａ２３１８７と略記する）刺激に応じてリン脂質よりアラキドン酸を加水分解する活性が亢進する細胞に分化した。
［ＩＩＩ］ ＤＭＳＯ分化細胞−２：［Ｉ］の非分化細胞を１０％牛胎仔血清（以下、ＦＢＳと略記する、Ｓｉｇｍａ社製 Ｆ２４４２）を添加したＲＰＭＩ １６４０培養液中、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｅｄフラスコを用いて１日以上前培養を行った後に、この培養液中最終濃度０．１６Ｍ ＤＭＳＯ条件下で細胞密度が２〜８ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように制御しつつ、９６〜１４４時間培養を継続すると増殖速度が低下し、接着性を示すマクロファージ系の細胞に分化した。

蛍光法による細胞系におけるＰＬＡ（２）活性
実施例１記載の［Ｉ］〜 ［ＩＩＩ］の各細胞を遠心分離により集め、反応緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと略記する）−２．２ｍＭグルコース−２．５μＭ牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する））に洗浄して置換した。活性化を行う場合には、最終濃度が１０ｎＭとなるようにＴＰＡをその反応緩衝液に添加後更に１時間培養を継続した（Ｒｚｉｇａｌｉｎｓｋｉ， Ｂ．Ａ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｍ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２２３： ２１９−２２５ （１９９４）．およびＧｏｎｃｈａｒ， Ｍ．Ｖ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ， ２４９： ８２９−８３２ （１９９８）．）。基質リポソーム懸濁液は、ＦＬ−ＰＣとホスファチジルセリンを分子数比 １：９となるようにクロロホルム溶液として混和後、窒素気流下で有機溶媒を留去乾固し、この混合物に対して１００μｇ／ｍＬとなるように反応緩衝液を添加して遮光氷冷下で１時間超音波処理することにより調製した。

試験は９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製３６０３）に前記の細胞の６ｘ１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ懸濁液を５０μＬ／穴に対して基質リポソーム懸濁液を添加して計１５０μＬ／穴の反応液に混和調製した後、遮光して３７℃にて３０分間培養を行った。必要に応じて１．５μＭ Ａ２３１８７を上記反応液に添加した。反応は０．０１％Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｂｉｓ（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ− ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（以下、ＥＧＴＡと略記する）メタノール溶液を５０μＬ／穴ずつ分注して混和することにより停止させた。酵素による加水分解生成物に基づく蛍光をＳＰＥＣＴＲＡ ＦＬＵＯＲ ＰＬＵＳ（ＴＥＣＡＮ社製）を使用し、４８５ｎｍの励起光による５３５ｎｍの蛍光強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ、以下、ＲＦＵと略記する）を上方測光にて測定した。各試験においては細胞を含まない反応区をブランク区として設定し、それらの蛍光強度の平均値をもってブランク値とし、各々の試験区のＰＬＡ（２）活性は、各々の穴の蛍光強度よりブランク値を減じて求めた。

細胞培養液中のＰＧＥ₂およびＬＴＣ₄の定量
実施例１記載の［Ｉ］〜［ＩＩＩ］の各細胞を遠心分離することにより集め、反応緩衝液として用いるＨａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＨＢＳＳと略記する）−０．１％ＢＳＡを用いて３回洗浄した。洗浄された細胞を２ｘ１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように反応緩衝液に懸濁して最終反応溶液量が０．２ｍＬ／穴となるように９６穴プレートに分注して調製した。必要に応じて最終濃度が１０ｎＭとなるようにＴＰＡをその反応液に添加後３７℃にて１時間培養して活性化した。ＰＧＥ₂およびＬＴＣ₄の生成反応は、５０μＭアラキドン酸または適切な濃度のＡ２３１８７等のＳｔｉｍｕｌａｔｏｒを添加することにより開始させ、３７℃にて培養を継続し、氷冷により終了させた。４℃において遠心分離することにより細胞を沈殿させ、上清のＰＧＥ₂およびＬＴＣ₄の濃度は、各々直接に、或いは適宜希釈した後にｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を使用して定量した。

上記の実施例１記載の［Ｉ］〜［ＩＩＩ］の非分化および分化細胞を、各々遠心分離により集め、実施例２および実施例３の方法に従ってＰＬＡ（２）活性および上清のＰＧＥ₂およびＬＴＣ₄の濃度を測定した。例えば、各種分化活性化条件の細胞は第１表に示すような加水分解活性を示した。

［Ｉ］の非分化細胞はＴＰＡ活性化処理に対しては緩やかに反応して分化が進行するがＬＴＣ₄産生およびＣＯＸ−２によるＰＧＥ₂の産生も極めて低いものであった。［ＩＩ］の分化細胞はＴＰＡ活性化処理に対する反応性の亢進はなく、ＬＴＣ₄産生の亢進およびＣＯＸ−２によるＰＧＥ₂の産生も極めて低いものであった。［ＩＩＩ］の分化細胞はＴＰＡ活性化処理に対して良好に反応して速やかに接着性の極めて強い細胞に形態変化を引き起こし、ＬＴＣ₄産生およびＣＯＸ−２によるＰＧＥ₂産生の亢進が極めて高い等、炎症細胞モデルとして好ましい特性を示した。実施例１記載の［ＩＩＩ］の分化細胞を１０ｎＭ ＴＰＡにて１時間活性化処理した後の細胞の示す加水分解活性は、生理的な活性型ＰＬＡ（２）活性を反映していることが示された。

化合物による生理的な活性型ＰＬＡ（２）阻害活性
実施例１記載の［ＩＩＩ］の分化細胞を１０ｎＭ ＴＰＡにて１時間活性化処理した後の細胞を用いて化合物による生理的な活性型ＰＬＡ（２）阻害活性を測定した。被験化合物はＤＭＳＯにて溶解し、各試験における反応液中のＤＭＳＯの最終濃度が０．１％以下となるようにＤＭＳＯ或いは各反応緩衝液にて希釈した。培養細胞を用いた各試験の反応を開始する１０〜１５分前に化合物溶液を添加し、３７℃にて培養した。陽性対照としてはＡｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ Ｋｅｔｏｎｅ（以下、ＡＡＣＯＣＦ₃と略記する）およびＭｅｔｈｙｌ Ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ＭＡＦＰと略記する）を用いた。試験は三連で行い、ブランクとしては細胞を含まない反応混合物区を、各試験区のＰＬＡ（２）活性は、各々の穴の蛍光強度よりブランク区の蛍光強度の平均値を減じて求めた。また、実施例１記載の［Ｉ］の非分化細胞を用いてＡ２３１８７を含まない条件下における加水分解活性を基礎代謝活性とし、各々の酵素活性からこの基礎代謝活性を減じたものを炎症活性化ＰＬＡ（２）活性とした。この炎症活性化ＰＬＡ（２）活性についてＤＭＳＯ添加区に対する阻害度をもって各化合物の活性を評価した。抗炎症化合物Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅは例えば第２表に示されるような阻害活性が測定された。

［³Ｈ］アラキドン酸の培養細胞系からの遊離
実施例１記載の［Ｉ］〜［ＩＩＩ］の各細胞の入ったフラスコにＡｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ，［５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−３Ｈ（Ｎ）］−（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、７８４４ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、３．７ＭＢｑ／ｍＬ）を１０⁶細胞あたり３．７ｋＢｑとなるように、培養最終日の夕方に添加して一晩培養を継続し、放射性脂肪酸を平衡状態に取り込ませた。この［³Ｈ］アラキドン酸を取り込んだ細胞の培養液を遠心分離することにより除去し、反応緩衝液として用いるＨＢＳＳ−０．１％ＢＳＡを用いて３回洗浄した。洗浄された細胞を５Ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ、最終反応溶液量が０．５ｍＬ／ｔｕｂｅとなるように分注した。必要に応じて最終濃度が１０ｎＭとなるようにＴＰＡを各反応液に添加後３７℃にて１時間培養して活性化した。［³Ｈ］アラキドン酸の遊離反応は適切な濃度のＡ２３１８７を添加することにより開始させ、氷冷することによりその反応を停止させた。４℃において遠心分離して細胞を沈殿させ、上清５００μＬより２００μＬを採取して液体シンチレーションカウンター（以下、ＬＳＣと略記する）にて放射能を測定した。細胞を含む残液３００μＬに２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液３００μＬを加え混合して得た溶解液６００μＬより２００μＬを採取してＬＳＣにて放射能を測定した。これらの測定された放射能の値から、各処理の「遊離放射能」および「取込まれていた総放射能」を算出し、遊離活性としては「取込まれていた総放射能」に対する「遊離放射能」の割合（％）として算出した。

各種の分化培養を行っている細胞を各々遠心分離により集め、実施例５の方法に従って最終濃度３μＭ Ａ２３１８７添加後１５分間に遊離される［³Ｈ］アラキドン酸の放射能を指標としてＰＬＡ（２）活性を測定した。例えば各種分化活性化条件の細胞は第３表に示すような加水分解活性を示した。

この方法による加水分解活性は、条件Ｆ．の分化活性化条件の細胞を用いる場合には酵素のリン酸化やＣａ²⁺等の活性化の条件が揃った「生理的な活性型酵素の寄与するＰＬＡ（２）活性」を、条件Ｃ．の分化・活性化条件の細胞を用いる場合にはＣａ²⁺による活性化に依存した条件であるため、生理的な活性型と類似性の低い、「人為的な活性型酵素の寄与するＰＬＡ（２）活性」を、各々反映していることが示された。

化合物によるＰＬＡ（２）阻害活性の選択性
上記の実施例５の条件Ｆ．および条件Ｃ．の分化・活性化条件の細胞を用いて化合物によるＰＬＡ（２）阻害活性を測定した。被験化合物はＤＭＳＯにて溶解し、各試験における反応液中のＤＭＳＯの最終濃度が０．１％以下となるようにＤＭＳＯ或いは各反応緩衝液にて希釈した。培養細胞を用いた各試験の反応を開始する１０〜１５分前に化合物溶液を添加し、３７℃にて培養した。陽性対照としてはＡＡＣＯＣＦ₃およびＭＡＦＰを用いた。また、比較の目的で別のアイソザイムＶＩ−ｉＰＬＡ（２）の阻害剤であるＢｒｏｍｏｅｎｏｌ ｌａｃｔｏｎｅ（以下、ＢＥＬと略記する）を用いた。

阻害剤の活性は、阻害剤が加えられていない対照区（以下、対照区と略記する）のデータとの対比として、以下の計算式により算出した。

各阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）値は複数の濃度処理の試験を行い、対数濃度を使用して各濃度における阻害率をグラフ上にプロットして求めた。

例えば第４表に示すように、抗炎症活性化合物Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅは、使用する細胞の状態および試験法によりＰＬＡ（２）阻害活性が異なり、生理的な活性型酵素の寄与するＰＬＡ(２)に対して選択的に強く阻害することが示された。この阻害活性は、従来報告されているＣＯＸ阻害活性よりも強いものであった。

マウス アレルギーＩ型皮膚炎試験
Ｎａｇａｉ，Ｈ．らの方法（Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １００（６ Ｐｔ ２）：Ｓ３９−４４．（１９９７））を参考にして行った。即ち、ＢＡＬＢ／ｃ系雄性マウス（５週齢）の耳介の表裏にアセトン：オリーブ油（３：１）に溶解した２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（以下、ＤＮＦＢと略記する）２５μｇを１週間毎に左右交互に７回塗布することにより反復感作し、アレルギーＩ型皮膚炎モデルを作成した。抗アレルギー活性は、感作物質ＤＮＦＢ ２５μｇを感作時と同様に右耳に塗布して惹起された耳介浮腫を測定することにより評価した。非惹起区としては、感作物質ＤＮＦＢを含まないアセトン：オリーブ油（３：１）溶液２５μＬを代わりに同様に塗布した。惹起前および惹起の２、６、および２４時間後に両耳介一定部位の厚さを、デジタルノギス（ＪＡＰＡＮ ＭＩＣＲＯＭＥＴＥＲ ＭＦＧ．Ｃｏ．Ｌｔｄ．製）を用いて３回測定して各々の平均値を算出した。ＤＮＦＢを塗布した右耳介の厚さより無処置の左耳介の厚さを減じて耳介浮腫とした。

被験化合物は塗布投与の場合には、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０／アセトン溶液に溶解し、ＤＮＦＢ塗布惹起の３０分前および３０分後に、２０μＬの被験化合物溶液を同じく右耳介の表裏に塗布することによりその抗炎症活性を評価した。陽性対照としてはＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−２１−ａｃｅｔａｔｅ（以下、ＤＥＸ−Ａｃと略記する、Ｓｉｇｍａ社製）０．１％Ｔｗｅｅｎ８０／アセトン溶液を被験化合物と同様に投与した。また、経口投与の場合にはＴｗｅｅｎ８０：エタノール：水（２：２：９６）溶液に乳化・懸濁し、１０ｍＬ／ｋｇの薬剤溶液をＤＮＦＢ塗布惹起の１時間前に経口投与した。経口投与前の動物は１時間絶食した。抗アレルギー活性は、ＤＮＦＢ塗布惹起６時間後の耳介浮腫について、溶媒対照区の耳介浮腫に対する阻害度（％）として算出した。

例えば図1および第５表に示すように、抗炎症活性化合物Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅは抗アレルギー活性を示すことが見出された。

以上の試験結果より本発明の抗炎症化合物Ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅは、IVＡ−ｃＰＬＡ（２）阻害活性において、人為的な活性型酵素活性を反映する評価系においては弱い阻害活性が認められたことに対して、生理的な活性型酵素活性を反映する評価系において選択的に高い阻害活性を有することは明らかである。また、本化合物は抗アレルギー作用も示すことが見出された。

従って、本発明化合物を有効成分として含有する組成物は、抗アレルギー作用も含め、ＰＬＡ（２）活性の亢進を伴う病態症状を軽減し、その関連する疾患に非常に効果的な作用を示し、治療薬または予防薬として有用である。

実施例７の図である。

Claims (10)

1. 式［Ｉ］
   

   

   で表される化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患の治療用および／または予防用医薬組成物。
2. 式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、脂質炎症メディエーターであるアラキドン酸およびその代謝物、および／またはリゾリン脂質、および／または血小板活性化因子（ＰＡＦ）により媒介される疾患の治療用および／または予防用医薬組成物。
3. 対象となる疾患がアナフィラキシー、アレルギー性炎症、喘息、鼻炎、気管支炎、肺炎、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸管疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、虚血―再灌流における傷害、血管炎、動脈硬化、肝炎、腎炎、神経変性疾患、関節炎、皮膚炎、紫外線角化症、乾癬、敗血症性ショック、または熱病である請求項１または請求項２のいずれかに記載の医薬組成物。
4. アレルギー疾患治療剤である請求項１または請求項２のいずれかに記載の医薬組成物。
5. 免疫調節剤である請求項１または請求項２のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 急性炎症治療剤である請求項１または請求項２のいずれかに記載の医薬組成物。
7. 哺乳動物に対して、式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を投与することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患または障害の治療方法。
8. 哺乳動物に対して、式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を投与することを特徴とする、脂質炎症メディエーターであるアラキドン酸およびその代謝物、および／またはリゾリン脂質、および／または血小板活性化因子（ＰＡＦ）により媒介される疾患または障害の治療方法。
9. 式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ（２）の活性亢進を伴う疾患哺乳動物に投与する治療用および／または予防用組成物。
10. 式［Ｉ］で表される複素環化合物またはその医薬上許容される複合体からなる群より選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする、脂質炎症メディエーターであるアラキドン酸およびその代謝物、および／またはリゾリン脂質、および／または血小板活性化因子（ＰＡＦ）により媒介される疾患哺乳動物に投与する治療用および／または予防用組成物。
    
    

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