JP2006075152A - 細胞移動阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の移動阻害方法および移動阻害剤;該遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞移動能を阻害する化合物の同定方法;該遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止剤および/または治療剤並びに防止方法および/または治療方法を提供する。
【選択図】なし
Description
1.Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法、
2.Lib遺伝子の発現阻害剤および/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能阻害剤を用いることを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法、
3.配列表の配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列または該相補的な塩基配列の一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを用いることを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法、
4.Lib遺伝子によりコードされる蛋白質のアストログリア細胞の細胞移動能を阻害する化合物の同定方法であって、Lib遺伝子を発現している細胞とある化合物との相互作用を可能にする条件下で該細胞と化合物とを接触させ、次いで、該細胞の移動を測定することのできる条件下で細胞の移動を測定し、該細胞の移動の変化を検出することにより、該化合物がLib遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞移動能を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法、
5.Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害剤、
6.配列表の配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列または該相補的な塩基配列の一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを有効量含んでなるアストログリア細胞の移動阻害剤、
7.Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することによりアストログリア細胞の移動を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止剤および/または治療剤、
8.前記5.または6.のアストログリア細胞の移動阻害剤を含有してなる、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止剤および/または治療剤、
9.アストログリア細胞の集積に起因する疾患が、アルツハイマー病である前記7.または8.の疾患の防止剤および/または治療剤、
10.Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することによりアストログリア細胞の移動を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止方法および/または治療方法、
11.前記5.または6.のアストログリア細胞の移動阻害剤を用いることを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止方法および/または治療方法、
12.アストログリア細胞の集積に起因する疾患が、アルツハイマー病である前記10.または11.の疾患の防止方法および/または治療方法、
からなる。
(Lib遺伝子の脳内発現の解析)
本発明においては、Lib遺伝子がAβを含む老人斑に隣接するアストログリア細胞で特異的に発現していることを見出した。Lib遺伝子の脳内発現の解析は、脳切片を用いて、in situハイブリダイゼーション法により実施できる。in situハイブリダイゼーション法は、プローブを用いて、自体公知の方法により実施できる。プローブは、Lib mRNAとのハイブリダイゼーションに適当な塩基配列をLib cDNAの塩基配列に基づいてその部分配列から設計し、該配列を有するDNAを自体公知の方法で製造することにより取得できる。
本発明においてはまた、Lib遺伝子の発現によりアストログリア細胞の細胞外マトリックス間の移動が引き起こされることを見出した。Lib遺伝子の発現によるアストログリア細胞の移動は、Lib遺伝子を発現しているアストログリア細胞の細胞移動を測定することにより検出できる。
上述のように、ラットアストログリア細胞においてAβ添加により発現誘導される遺伝子として見出したLib遺伝子は、実際にヒトAD脳の老人斑に隣接するアストログリアで発現していることが明らかになった。また、Lib遺伝子は、培養グリア細胞を用いた解析においてECM間の該細胞の移動を引き起こす機能を有する蛋白質をコードすることが明らかになった。さらに、ラット胎児脳においてLib遺伝子の高い発現が認められた。これらから発明者らは、脳発生時に、神経細胞やグリア細胞は所定の配置へダイナミックな移動を行いながら、それぞれの細胞種への分化とネットワークの形成を実現すると考えている。発生が完了し成体となった後には、定常状態では脳内での細胞移動は認められない。しかし、脳疾患に伴う損傷を受けた神経細胞に対する修復・防御作用を示すアストログリア細胞の脳内移動は広く知られる。
Lib遺伝子が発現することによりアストログリア細胞の細胞移動が著しく促進されるので、Lib遺伝子の発現を阻害することにより、該細胞の細胞移動を阻害することができる。また、Lib遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することにより、該細胞の細胞移動を阻害することができる。すなわち、本発明において、Lib遺伝子が発現することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法および該細胞の移動阻害剤を提供できる。
Lib遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞移動能を阻害する化合物の同定は、細胞の移動を測定することのできる実験系において、Lib遺伝子を発現している細胞と調べようとする化合物(被検化合物)の相互作用を可能にする条件下で、該細胞と化合物とを接触させ、次いで該細胞の移動を測定することのできる条件下で該細胞の移動を測定し、その後、被検化合物の存在下における該細胞の移動と、被検化合物の非存在下における該細胞の移動とを比較し、細胞の移動の変化を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における細胞移動と比較して、被検化合物の存在下における細胞移動が低減または消失する場合、該被検化合物はLib遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞移動能を阻害すると判定できる。本同定方法に用いる細胞として、好ましくはアストログリア細胞が挙げられる。また、アストログリア細胞由来細胞株を用いることができる。アストログリア細胞由来細胞株として、ヒトアストログリオーマ由来U87MG細胞を例示できる。細胞移動の測定は、例えば、市販の細胞移動測定システムまたは細胞浸潤測定システムを用いて実施できる。このようなシステムとして、上述したBD Falcon社製のバイオコートTMマトリゲルTM インベージョンチャンバーを例示できる。
上述のように、本来生体防御機構であるはずのアストログリア細胞の移動・集積が、アルツハイマー病の進行に伴ってむしろ、脆弱化している神経細胞の傷害をさらに悪化させる方向に働いてしまう可能性を示唆するデータが集積されてきている。また、アストログリア細胞の病変部位への集積はアルツハイマー病に限らず、脳梗塞、パーキンソン病その他、多くの神経変性疾患に共通して認められる。これらから、Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することにより、アストログリア細胞の移動・集積を伴う疾患の防止および/または治療が可能になると考える。すなわち、本発明において、Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することによりアストログリア細胞の移動を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の移動・集積を伴う疾患の防止剤および/または治療剤を提供できる。また、該防止剤および/または治療剤を用いて、アストログリア細胞の移動・集積を伴う疾患の防止方法および/または治療方法を実施できる。アストログリア細胞の移動・集積を伴う疾患の防止剤および/または治療剤は、アストログリア細胞の移動・集積に起因する疾患や、アストログリア細胞の移動・集積により症状の増悪が認められる疾患に適用されることが好ましい。このような疾患として、アルツハイマー病、脳梗塞、パーキンソン病を、より好ましくはアルツハイマー病を例示できる。
Lib遺伝子の発現解析を、ヒト脳切片およびラット脳切片を用いて、in situハイブリダイゼーション法で実施した。
解析は、アルツハイマー病患者の脳切片(以下、AD脳と称することがある)およびアルツハイマー病に罹患していない患者由来の脳切片(以下、Non−AD脳と称することがある)について行なった。
成体脳切片および胎児(胎生17日目)切片は、それぞれジェノスタッフ(Genostaff)社およびノバジェン(Novagen)社より購入した。プローブは、ラットLib cDNAの3´−UTR領域に存在する配列番号4に示す361bpのDNA断片を用いた。該DNA断片は、次に示すプライマーを用いてPCRにより作製した。アンチセンスプローブ用にはフォワードプライマー 5´−AAACAGTTCTGGTAAGACGA−3´(配列番号7)とリバースプライマー 5´−TAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTGGACATTGTGTAGG−3´(配列番号8)、センスプローブ用にはフォワードプライマー 5´−TAATACGACTCACTATAGGGAAACAGTTCTGGTAAGACGA−3´(配列番号9)とリバースプライマー 5´−AAGTCTGGACATTGTGTAGG−3´(配列番号10)を用いた。上記プライマーにはT7プロモーター配列が含まれるので、PCRで得られたそれぞれのヌクレオチド断片中のT7プロモーター配列を利用し、T7RNAポリメラーゼにより、ジゴキシゲニンラベルRNAプローブを作製した。
hLib遺伝子を発現する細胞の作製は、ヒトLib蛋白質(以下、hLib蛋白質と称することもある)をそのC末端にFlag−tagが付加された状態で発現させるプラスミドを、ヒトアストログリオーマ由来U87MG細胞(ATCC(American Type Culture Collection)より購入)にFugene6(Roche社製)を用いてトランスフェクションすることにより実施した。該プラスミドは、G418耐性遺伝子を保持している。ネガティブコントロールとして、G418耐性遺伝子を保持しているが、hLib蛋白質をコードする遺伝子を保持していない空ベクター(mockプラスミド)を、上記同様の方法でU87MG細胞にトランスフェクションして用いた。
ブロットオーバーレイバインディングアナリシスにより、マトリゲルおよびECM巨大分子へのhLib蛋白質の結合能を評価した。本評価において、hLib蛋白質として、hLib蛋白質の細胞外領域、すなわち該蛋白質のアミノ酸配列のうち第1番目から第529番目までのアミノ酸配列からなる蛋白質(以下、hLib(1−529)と称する)、のC末端にHis×6−tagが付加された蛋白質を用いた。
配列番号3:hLib遺伝子に対するプローブとして用いることができるhLib遺伝子の部分配列。
配列番号4:rLib cDNAの3´末端側非翻訳領域に存在するDNA断片。
配列番号5:hLib遺伝子に対するプローブ作製用プライマーとして設計されたDNA。
配列番号6:hLib遺伝子に対するプローブ作製用プライマーとして設計されたDNA。
配列番号7:rLib遺伝子に対するアンチセンスプローブ作製用プライマーとして設計されたDNA。
配列番号8:rLib遺伝子に対するアンチセンスプローブ作製用プライマーとして設計されたDNA。
配列番号9:rLib遺伝子に対するセンスプローブ作製用プライマーとして設計されたDNA。
配列番号10:rLib遺伝子に対するセンスプローブ作製用プライマーとして設計されたDNA。
配列番号11:hLib蛋白質に対する抗体作製用の抗原として有用なhLib蛋白質の部分ペプチド。
Claims (12)
- Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法。
- Lib遺伝子の発現阻害剤および/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能阻害剤を用いることを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法。
- 配列表の配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列または該相補的な塩基配列の一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを用いることを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害方法。
- Lib遺伝子によりコードされる蛋白質のアストログリア細胞の細胞移動能を阻害する化合物の同定方法であって、Lib遺伝子を発現している細胞とある化合物との相互作用を可能にする条件下で該細胞と化合物とを接触させ、次いで、該細胞の移動を測定することのできる条件下で細胞の移動を測定し、該細胞の移動の変化を検出することにより、該化合物がLib遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞移動能を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
- Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することを特徴とするアストログリア細胞の移動阻害剤。
- 配列表の配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列または該相補的な塩基配列の一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを有効量含んでなるアストログリア細胞の移動阻害剤。
- Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することによりアストログリア細胞の移動を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止剤および/または治療剤。
- 請求項5または6に記載のアストログリア細胞の移動阻害剤を含有してなる、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止剤および/または治療剤。
- アストログリア細胞の集積に起因する疾患が、アルツハイマー病である請求項7または8に記載の疾患の防止剤および/または治療剤。
- Lib遺伝子の発現を阻害することおよび/または該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を阻害することによりアストログリア細胞の移動を阻害することを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。
- 請求項5または6に記載のアストログリア細胞の移動阻害剤を用いることを特徴とする、アストログリア細胞の集積に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。
- アストログリア細胞の集積に起因する疾患が、アルツハイマー病である請求項10または11に記載の疾患の防止方法および/または治療方法。
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