JP2006028075A - リン酸化フルクタン及びその調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】植物から調製したフルクタンを用いてリン酸化処理を行う場合に問題となるエンドトキシンを陰イオン交換クロマトグラフィーで除去することで、エンドトキシンフリーのフルクタンを用いてリン酸化フルクタンを調製した。リン酸化フルクタンは、免疫賦活化作用を有し、Bリンパ球マイトジェンとして機能し、Th1及びTh2系の樹状細胞を活性化することが明らかとなった。
【選択図】なし
Description
Kitazawa H.,Harada T.,Uemura J.,Saito T.,Kaneko T.,及びItoh T.著「Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus」International Journal of Food Microbiology,1998年,p.169-175
原末フルクタンからのエンドトキシンの除去は、陰イオン交換クロマトグラフィー(BioLogic Duoflow System, BIORAD)により行った。原末フルクタン5gを200mlのTris-HCl緩衝液(pH8.2)に溶解し、陰イオン交換カラム(HiTrapQ HP, φ1.6×2.5cm)に通し、素通り画分を回収した。回収画分は、蒸留水に対して2日間透析を行い、透析内液を凍結乾燥して、エンドトキシンを除去したフルクタン(エンドトキシンフリーフルクタン)を得た。実施した陰イオン交換クロマトグラフィーの条件をまとめて以下に示す。
カラム HiTrapQ HP(φ1.6×2.5cm, Amersham Pharamacia Biotech UK, Bukinghamshire, England)
移動相 20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)
流速 5.0ml/min
機器 BioLogic Duoflow System(BIORAD)
フルクタンのリン酸化は、文献(Edward T, and Susan F.W:Drying from Phosphate-Buffered Solutions Can Result in the Phosphorylation of Primary and Secondary Alcohol Groups of Saccharides, Hydroxylated Amino Acids, Proteins, and Glycoproteins. :Analytical Biochemistry, 222, 196-201(1994))に記載の方法を一部改良して行った。すなわち、ネジ付き試験管中で精製されたフルクタン50mgを0.1M KH2PO4-Na2HPO4緩衝液(pH5.5)2.5mlに懸濁し、70℃のウォーターバス中でフルクタンが完全に溶解するまで攪拌した後、溶液を凍結乾燥する乾燥工程を行う。そして、乾燥させた試料をヒーティングブロックにより開放系(キャップをせずに)で加熱してリン酸化する加熱工程を行い、加熱工程を経た試料を冷却した後蒸留水に溶解させる。こうして溶解させた溶液を10mM炭酸水素アンモニウム溶液に対して一晩透析後、さらに蒸留水に対して2日間透析し、透析内液を凍結乾燥して「粗リン酸化フルクタン」を得た。
温度 80℃ 100℃ 120℃ 140℃
時間 96時間 24時間 24時間 24時間
作製された粗リン酸フルクタンをBioLogic Duoflow System(BIORAD)におけるHiTrapQ HPによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、リン酸基の導入度による分画を行った。各分画画分(P-Fructan)は、蒸留水に対して2日間4℃下で透析後、透析内液を凍結乾燥して「精製リン酸化フルクタン」を得た。実施した陰イオン交換クロマトグラフィーの条件をまとめて以下に示す。
カラム HiTrapQ HP(φ1.6×2.5cm, Amersham Pharamacia Biotech UK, Bukinghamshire, England)
移動相 20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)
溶出 同緩衝液中の0-1.0M NaClによるリニアグラジエント溶出(ただし、140℃試料・160℃試料は0-2.0 NaClによるリニアグラジエント溶出)
流速 5.0ml/min
検出 フェノール硫酸法(490nm、中性糖)
機器 BioLogic Duoflow System(BIORAD)
リン酸フルクタン中に含まれるリンの定量は、文献(John C. D and Michael A. W:Quantitative and qualitive analysis of lipids and lipid components.:Methods in Enzymology 14,482-530(1969))に記載された方法により行った。すなわち、リン酸フルクタン試料1mgを10mlのミリQ水に溶解し、その溶液1mlを試験管にとり、凍結乾燥を行って水分を完全に除去した。乾燥させた試料に過塩素酸(70%)を0.4ml添加し、試料が透明になるまで開放系で電気コンロを用いて加熱分解した。分解終了後、2.4mlのモリブデン酸アンモニウム試薬(モリブデン酸アンモニウム4.4gを200〜300mlの蒸留水で溶解し、これに硫酸14mlを添加後1リットルにしたもの)及び2.4mlの還元剤(Fiske&SubbaRow還元試薬:亜硫酸水素ナトリウム3g、無水亜硫酸ナトリウム0.6g、1-アミノ-2-ナフトール-4-スルホン酸0.05gを乳鉢で充分に混合するまで磨砕し、25mlの蒸留水に溶解し3時間暗所に放置後、褐色瓶にろ過した。これを1:12(v/v)に希釈して用いた)を添加混合した。ついで、試料を100℃10分間加熱し、放冷後に830nmの吸光度を測定した。試料中に含まれるリン含量は、リン酸二水素カリウムを用いて作成した検量線により算出した。その結果を表1に示す。
実験動物として、BALB/c(Specificpathoge free[SPF]、5週齢、雄、日本 SLC(株)、静岡)マウスに、MRブリーダー(日本農産工業、神奈川)及び蒸留水を自由摂取させ、予備飼育後実験に供した。このマウスの脾臓を摘出し、ストレプトマイシン・ペニシリンを含むPBS(pH7.3)で洗浄後縦割し、細胞浮遊液を調製した。脾臓細胞は遠心分離(1,200rpm、4℃、5分)により回収し、混在する赤血球を0.2%のNaCl溶液1mlに懸濁し、さらに1.5%のNaCl溶液を加えて懸濁することで溶血させた。ついで、細胞をRPMI-1640培地(SIGMA USA)に懸濁し、スチールメッシュに通して凝集細胞を取り除いた。細胞は、RPMI-1640培地で3回遠心洗浄(1,200rpm、4℃、5分)後、2%牛胎児血清(FCS、Biocell Laboratories, Inc. USA)を含むRPMI-1640培地に再懸濁して、トリパンブルー染色法によって細胞数を計数することにより算出した。
調製した細胞懸濁液を、96wellマイクロプレート(住友ベークライト(株)製)に各well中に2×105cell/wellとなるように撒布し、試料が各wellに最終濃度で200μg/mlとなるようにRPMI-1640培地を添加し、5%CO2存在下、37℃で48時間培養した。陽性対照試料として、Bリンパ球幼若化物質であるLipopolysaccharide(LPS、E.Coli 0111:B4由来、No L-2630:SIGMA)と、Tリンパ球幼若化物質であるConcanavalin A(Con A、canavalia ensiformis由来、No L6397:SIGMA)を、それぞれ20μg/ml又は2μg/mlとなるように添加した。培養終了16時間前に、9.25kBqのMethyl-[3H]-thymidine(Amersham Pharmacia Biotech, USA)を各wellに添加して、パルスラベルとした。48時間の培養終了後、セルハーベスターを用いて、細胞をグラスファイバーフィルター上に回収した。ドライヤーで乾燥させた後、グラスフィルターを専用バイアル内に設置し、液体シンチレーター用カクテル{POPOP:1.4-Bis-〔2-(5-phenyloxazoly)〕benzen(同仁化学研究所、熊本)0.1gと、DPO:2.5-Diphenyloxazole(同仁化学研究所)4.0gをそれぞれ、1リットルのトルエンに溶解させた}を2ml添加し、液体シンチレーションカウンターLS1801型(BechmanCoulter,Inc. USA)でMethyl-[3H]-thymidineの取り込み量を測定した。リンパ球幼若活性は、Methyl-[3H]-thymidineの取り込み量を用いて以下の式より刺激指数(Stimulation Index:S.I.)を算出し、算出された刺激指数に基づいて評価を行うことができる。リン酸化されていないフルクタン(120℃に加熱処理したもの)に関する試料、100℃及び120℃でリン酸化処理を行ったリン酸化フルクタンに関する試料について刺激指数の算出結果を図4に示す。
上述の方法で調製したマウス脾臓細胞をRPMI-1640培地(2%FCSを含む)に懸濁し、トリパンブルー法で計数した。48wellマイクロプレートに対して1wellに全量300μlの系で3×106cell/wellになるように分注し、サンプルを200μg/mlとなるように添加した。5%CO2存在下、37℃で任意の時間(6時間、12時間、24時間)培養後、サンプルを1.5mlエッペンドルフチューブに回収し、FACS washing buffer(2%FCS、0.01%NaN3を含むPBS)1mlで48wellマイクロプレートを洗浄し、細胞を回収した。遠心分離(2,800rpm、4℃、5分)後にピペットで上清を除去し、細胞をFACS washing buffer200μlに懸濁し、100μlずつ96wellマイクロプレートに分注した(各wellに細胞が1.5×106cellsとなっている)。遠心洗浄(2,000rpm、4℃、5分)後、ピペットで上清を除去した。FITC-抗体(CD69:BD Pharmingen or CD8:Serotec Inc.)、PE-抗体(CD45R or CD86 いずれもCALTAG Laboratories)及びBiotinラベルされたPE-cy5-抗体(Thy1.2:CALTAG Laboratories or CD33D1:eBioscience)を各10μl加え、よくピペッティングしてから、4℃、遮光下で30分間静置した。FACS washing bufferを合計100μlになるように加えてピペッティングし、細胞を洗浄した。さらに、遠心洗浄(2,000rpm、4℃、5分)後、上清を除去する。Streptavidin Phycoerythrin-Cy5(SA-PE-Cy5:eBioscience)を10μl加えて、4℃、30分間静置した。FACS washing buffer100μlを添加して、遠心洗浄(2,000rpm、4℃、5分)後上清を除去し、FACS washing buffer50μlと1%パラホルムアルデヒドPBS(固定液)を加えて、15分間室温で放置した。各wellごとに400μlのFACSflow(Becton Dickinson)が入った試験管にナイロンメッシュを通して挿入して、FACScaliburTM Model 3A(Becton Dickinson)によって解析した。
Claims (8)
- 植物から調製されたフルクタンからエンドトキシンを除去する精製工程と、精製されたフルクタンをリン酸緩衝液に溶解させて凍結乾燥する乾燥工程と、乾燥させて生成された試料を100℃以上140℃未満の温度で24時間加熱する加熱工程とを含むリン酸化フルクタンの調製方法。
- 前記精製工程は、陰イオン交換クロマトグラフィにより行う請求項1に記載のリン酸化フルクタンの調製方法。
- エンドトキシンを除去したフルクタンにより調製されたリン酸化フルクタンを有効成分として含む、免疫賦活化作用を有する薬剤。
- 免疫賦活化作用が細胞に対する幼若化作用である請求項3に記載の薬剤。
- Bリンパ球特異的マイトジェンである請求項3に記載の薬剤。
- エンドトキシンを除去したフルクタンにより調製されたリン酸化フルクタンと細胞とを接触させることを特徴とする細胞の免疫賦活化方法。
- 免疫賦活化作用が細胞に対する幼若化作用である請求項6に記載の免疫賦活化方法。
- 細胞が脾臓細胞由来又は樹状細胞由来である請求項6又は7に記載の免疫賦活化方法。
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