JP2006008719A - Blood peroxidized-lipid inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血中過酸化脂質抑制剤に関する。より詳細には、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中過酸化脂質抑制剤、および血中過酸化脂質が関与する疾患の治療剤に関する。 The present invention relates to a blood lipid peroxide inhibitor. More specifically, the present invention relates to a blood lipid peroxide inhibitor containing astaxanthin and / or an ester thereof, and a therapeutic agent for diseases involving blood lipid peroxide.
近年、生体内で生成される活性酸素などが、不飽和脂肪酸と反応して過酸化脂質を生じ、これが人体に悪影響を及ぼすことが明らかとなってきている。例えば、皮膚においては、紫外線などの環境因子の刺激を直接受けるため、活性酸素の生成による過酸化脂質の異常産生が、シミ・ソバカスなどの色素沈着、炎症、浮腫、壊死、老化などの原因となっている。また、生体内で生成した過酸化脂質やその酸化分解物は、核酸やタンパクに作用し、動脈硬化、高血圧症、それらにより発症する血管障害、肝機能障害、網膜症、白内障などを引き起こす。 In recent years, it has been clarified that active oxygen generated in vivo reacts with an unsaturated fatty acid to produce lipid peroxide, which adversely affects the human body. For example, the skin is directly stimulated by environmental factors such as ultraviolet rays, so abnormal production of lipid peroxides due to the generation of active oxygen is the cause of pigmentation such as spots and freckles, inflammation, edema, necrosis, and aging. It has become. In addition, lipid peroxides and their oxidative degradation products generated in vivo act on nucleic acids and proteins, causing arteriosclerosis, hypertension, vascular disorders caused by them, liver dysfunction, retinopathy, cataracts and the like.
特に、過酸化脂質の血中濃度が増加すると、動脈硬化の原因となる血管内皮細胞の障害、血小板の凝集亢進、泡沫細胞の形成などが引き起こされることが知られている。そのため、血中過酸化脂質を低下させる物質についての検討が種々行われている（例えば、特許文献１〜３）。 In particular, it is known that when the blood concentration of lipid peroxide increases, vascular endothelial cells causing arteriosclerosis, platelet aggregation, foam cell formation, and the like are caused. For this reason, various studies have been conducted on substances that lower blood lipid peroxide (for example, Patent Documents 1 to 3).
特許文献１では、抗酸化作用を有するカロチノイドとレシチンとの均質混合物の経口投与によって、血中過酸化脂質量が低下することが記載されている。ここでは、レシチンとの併用に使用可能なカロチノイドが列挙され、その中にアスタキサンチンが記載されている。この特許文献１に開示される組成物中に含まれるカロチノイドは、レシチン９０部に対して多くても１０部にすぎない。アスタキサンチンは、プロビタミンＡとなり得ることや顕著な抗酸化作用を有することだけでなく、抗炎症作用を有することも知られている（例えば、特許文献４および５）。特許文献４には、アスタキサンチンジエステルが、経口投与によって小腸の過酸化脂質濃度の抑制作用を示すことが記載されている。しかし、アスタキサンチン単独による血中過酸化脂質に対する影響については全く知られていない。
本発明は、血中過酸化脂質を抑制する新たな安全性の高い薬剤を提供することを目的とする。本発明はさらに、血中の過酸化脂質が関与する疾患の治療剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a new highly safe drug that suppresses blood lipid peroxide. Another object of the present invention is to provide a therapeutic agent for a disease involving lipid peroxide in blood.
抗酸化剤として知られているアスタキサンチンについて種々の検討を行ったところ、アスタキサンチンが血中の過酸化脂質抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。 As a result of various studies on astaxanthin, which is known as an antioxidant, it was found that astaxanthin has an inhibitory action on lipid peroxide in blood, and the present invention was completed.
本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中過酸化脂質抑制剤を提供する。 The present invention provides a blood lipid peroxide inhibitor containing astaxanthin and / or an ester thereof.
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中過酸化脂質が関与する疾患の治療剤を提供する。 The present invention also provides a therapeutic agent for a disease involving blood lipid peroxide, comprising astaxanthin and / or an ester thereof.
１つの実施態様では、上記疾患は、心血管病、脳疾患、肝障害、または炎症性疾患である。 In one embodiment, the disease is a cardiovascular disease, a brain disease, a liver disorder, or an inflammatory disease.
本発明によれば、新たな血中過酸化脂質抑制剤が提供される。この血中過酸化脂質抑制剤は、血中の過酸化脂質が関与すると考えられる心血管病、脳疾患、肝障害、炎症性疾患などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明の血中過酸化脂質抑制剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高い。 According to the present invention, a new blood lipid peroxide inhibitor is provided. This blood lipid peroxide inhibitor can be used as a therapeutic agent for various diseases such as cardiovascular diseases, brain diseases, liver disorders, and inflammatory diseases which are thought to involve blood lipid peroxides. Since the blood lipid peroxide inhibitor of the present invention has very low toxicity, it is highly safe.
本発明の血中過酸化脂質抑制剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式： Astaxanthin and / or its ester contained in the blood lipid peroxide inhibitor of the present invention has the following formula:
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。 (Here, R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or a fatty acid residue). The ester of astaxanthin is not particularly limited. For example, saturated fatty acids such as palmitic acid and stearic acid, or oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, bishomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid, Examples thereof include monoesters or diesters of unsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid. These can be used alone or in appropriate combination. Astaxanthin has a structure having extra oxo groups and hydroxy groups at both ends of the skeleton of β-carotene, and therefore has low molecular stability unlike β-carotene. On the other hand, the ester body (for example, krill extract) in which the hydroxyl groups at both ends are esterified with unsaturated fatty acid or the like is more stable.
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。 Astaxanthin and / or its ester used in the present invention may be either chemically synthesized or derived from natural products. Examples of the latter natural products include red yeast containing astaxanthin and / or an ester thereof; shellfish shells such as tigliopath (red daphnia) and krill; and microalgae such as green algae. In the present invention, an extract containing astaxanthin and / or its ester produced by any method can be used as long as the characteristics of astaxanthin and / or its ester can be utilized. In general, extracts from these natural products are used, and the extract may be in the form of an extract or may be appropriately purified as necessary. In the present invention, such a crude extract or crushed powder containing astaxanthin and / or an ester thereof, or an appropriately purified or chemically synthesized product containing astaxanthin and / or its ester may be used alone or in appropriate combination. Can do. Considering the stability in the body, an ester form is preferably used.
本発明の血中過酸化脂質抑制剤は、血中過酸化脂質が関与する疾患または症状を治療または予防するのに有用であり得る。このような疾患または症状としては、高血圧症、糖尿病、脳卒中、動脈硬化症、肝機能障害、網膜症、白内障、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、肝硬変、肝炎、アレルギー性疾患、癌、代謝異常、肌荒れなどが挙げられる。 The blood lipid peroxide inhibitor of the present invention may be useful for treating or preventing a disease or condition involving blood lipid peroxide. Such diseases or symptoms include hypertension, diabetes, stroke, arteriosclerosis, liver dysfunction, retinopathy, cataract, angina, myocardial infarction, cerebral infarction, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cirrhosis, hepatitis, allergy Sexual disorders, cancer, metabolic abnormalities, rough skin, etc.
本発明の血中過酸化脂質が関与する疾患の治療剤は、上記の本発明の血中過酸化脂質抑制剤と同様に、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する。特に、心血管病、脳疾患、肝障害、または炎症性疾患の治療に有用である。 The therapeutic agent for diseases involving blood lipid peroxide of the present invention contains astaxanthin and / or an ester thereof as an active ingredient in the same manner as the blood lipid peroxide inhibitor of the present invention. In particular, it is useful for the treatment of cardiovascular disease, brain disease, liver disorder, or inflammatory disease.
本発明の血中過酸化脂質抑制剤または血中過酸化脂質が関与する疾患の治療剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。 The administration route of the blood lipid peroxide inhibitor or the therapeutic agent for diseases involving blood lipid peroxide of the present invention may be either oral administration or parenteral administration. The dosage form is appropriately selected depending on the administration route. For example, injections, infusions, powders, granules, tablets, capsules, pills, enteric solvents, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, liquids for external use, poultices, nasal drops, ear drops Agents, eye drops, inhalants, ointments, lotions, suppositories, enteral nutrients and the like. This can be used alone or in combination depending on the symptoms. In these preparations, auxiliary agents usually used in the pharmaceutical preparation technical field such as excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrants, lubricants, and corrigents are used as necessary. .
本発明の血中過酸化脂質抑制剤または血中過酸化脂質が関与する疾患の治療剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。 The dosage of the blood lipid peroxide inhibitor of the present invention or the therapeutic agent for a disease involving blood lipid peroxide varies depending on the purpose of administration and the situation (sex, age, weight, etc.) of the administration subject. Usually, for adults, 0.1 mg to 2 g per day, preferably 4 mg to 500 mg per day in the case of oral administration, in terms of astaxanthin free body, while 0.01 mg to 1 g per day for parenteral administration, Preferably it can be administered at 0.1 mg to 500 mg.
本発明の血中過酸化脂質抑制剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。 The blood lipid peroxide inhibitor of the present invention can be used not only as a pharmaceutical as described above, but also as a quasi-drug, cosmetic, functional food, nutritional supplement, food and drink, and the like. When used as a quasi-drug or cosmetic, it can be used together with various adjuvants commonly used in the technical field such as quasi-drug or cosmetic, if necessary. Or, when used as a functional food, nutritional supplement, or food and drink, it is usually used in foods such as sweeteners, spices, seasonings, preservatives, preservatives, bactericides, and antioxidants as necessary. You may use with the additive used. Further, it may be used in a desired shape such as solution, suspension, syrup, granule, cream, paste, jelly, etc., or as necessary. The ratio contained in these is not specifically limited, It can select suitably according to a use purpose, a usage form, and a usage-amount.
（調製例１：アスタキサンチンの調製）
アスタキサンチンを次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールでアスタキサンチンを含む油性画分を抽出した。抽出物を減圧濃縮してエタノールを留去し、アスタキサンチンをフリー体換算で９．９％含む抽出物を調製した。
(Preparation Example 1: Preparation of astaxanthin)
Astaxanthin was prepared as follows. The Haematococcus pulvialis strain K0084 was cultured at 25 ° C. under irradiating gas containing 3% CO 2 under light irradiation conditions, under nutrient stress (nitrogen source deficiency), and cysted. The cystized cells were disrupted by means usually used by those skilled in the art, and an oily fraction containing astaxanthin was extracted with ethanol. The extract was concentrated under reduced pressure to distill off ethanol, and an extract containing 9.9% of astaxanthin in free form was prepared.
（調製例２：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。次いで、抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
(Preparation Example 2: Preparation of astaxanthin monoester)
Astaxanthin monoester was prepared as follows. The Haematococcus pulvialis strain K0084 was cultured at 25 ° C. under irradiating gas containing 3% CO 2 under light irradiation conditions, under nutrient stress (nitrogen source deficiency), and cysted. The cysted cells were crushed by means commonly used by those skilled in the art, and the oily fraction was extracted with ethanol. The extract contained lipids such as triglycerides in addition to astaxanthins. Subsequently, the extract was subjected to column chromatography using a synthetic resin adsorbent to obtain a purified product containing astaxanthin monoester. This purified product was analyzed by HPLC, and it was confirmed that this purified astaxanthin monoester contained a monoester having a molecular weight of 858 as a main component, did not contain free and diester forms of astaxanthin, and contained a slight amount of diglyceride. .
（調製例３：アスタキサンチンカプセルの調製）
上記調製例１で得たアスタキサンチンを用いて、１カプセル当たり以下の表１に示す成分を内包するソフトカプセルを調製した。
(Preparation Example 3: Preparation of astaxanthin capsule)
Using the astaxanthin obtained in Preparation Example 1, soft capsules containing the components shown in Table 1 below per capsule were prepared.
得られたソフトカプセル１個当たりには、アスタキサンチンをフリー体換算で４ｍｇ含有する。 Each soft capsule obtained contains 4 mg of astaxanthin in terms of free form.
（実施例１：血中過酸化脂質濃度に及ぼす効果）
上記調製例２で得たアスタキサンチンカプセルを、２０歳代〜７０歳代の男女１８名の被験者に、１日１回１カプセルずつ４週間にわたり摂取させた。摂取開始日の朝食前および摂取終了日の翌日の朝食前に、各被験者から採血し、血中の過酸化脂質濃度を測定した。過酸化脂質濃度は、ＴＢＡ法によって測定した。
(Example 1: Effect on blood lipid peroxide concentration)
The astaxanthin capsules obtained in Preparation Example 2 were ingested once a day for 4 weeks by 18 subjects in their 20s and 70s who were male and female. Before breakfast on the day of ingestion and before breakfast on the day after the end of ingestion, blood was collected from each subject, and the lipid peroxide concentration in the blood was measured. Lipid peroxide concentration was measured by the TBA method.
ＴＢＡ法は、脂質内の過酸化物を熱分解してマロンジアルデヒドを生成させ、これを酸性下でＴＢＡと縮合させることによって、過酸化物を定量する方法である。具体的には、以下のように行う。まず、試料を、０．０５Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＡＤＰ、および０．１２ｍＭのＦｅ（ＮＯ３）３を含む１ｍＬの反応液に加える。最終濃度が０．１ｍＭになるようにＮＡＤＰＨを添加することによって反応を開始し、３７℃にて５分間インキュベートした。次に、２ｍＬのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）−チオバルビツール酸（ＴＢＡ）−ＨＣｌ試液（１５w/v％ＴＣＡ、０．３７５w/v％ＴＢＡ、および０．２５Ｎ ＨＣｌからなる）および９０ｍＬの２％ブチルヒドロキシトルエン液を加え、沸騰水中で１５分間加熱する。冷却後、１，０００×Ｇで１０分間遠心分離して沈殿を除去し、上清中のＴＢＡ−マロンジアルデヒド縮合物を、５３５ｎｍの吸光度によって測定する。 The TBA method is a method in which a peroxide in a lipid is thermally decomposed to produce malondialdehyde, which is condensed with TBA under an acidic condition, thereby quantifying the peroxide. Specifically, this is performed as follows. First, a sample is added to 1 mL of a reaction solution containing 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 mM ADP, and 0.12 mM Fe (NO 3 ) 3 . The reaction was started by adding NADPH to a final concentration of 0.1 mM and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 2 mL of trichloroacetic acid (TCA) -thiobarbituric acid (TBA) -HCl reagent solution (consisting of 15 w / v% TCA, 0.375 w / v% TBA, and 0.25 N HCl) and 90 mL of 2% butyl Add hydroxytoluene solution and heat in boiling water for 15 minutes. After cooling, the precipitate is removed by centrifugation at 1,000 × G for 10 minutes, and the TBA-malondialdehyde condensate in the supernatant is measured by absorbance at 535 nm.
結果を図１および２に示す。図１は、各被験者についてのアスタキサンチンカプセル摂取前後の血中過酸化脂質濃度の変化を示し、そして図２は、平均値を示す。いずれの図においても、縦軸の数値の単位はμＭである。 The results are shown in FIGS. FIG. 1 shows the change in blood lipid peroxide concentration before and after ingestion of astaxanthin capsules for each subject, and FIG. 2 shows the average value. In any of the figures, the unit of numerical values on the vertical axis is μM.
図１からわかるように、被験者全員において血中の過酸化脂質濃度が低下していた。また、図２に示すように、過酸化脂質濃度の平均値は、アスタキサンチンカプセル摂取前と比較して、４７．８％も減少していた。このように、アスタキサンチンにより、血中の過酸化脂質濃度が非常に低下することが明らかになった。 As can be seen from FIG. 1, the lipid peroxide concentration in the blood was decreased in all the subjects. Moreover, as shown in FIG. 2, the average value of the lipid peroxide concentration was reduced by 47.8% as compared to before intake of the astaxanthin capsule. Thus, astaxanthin was found to greatly reduce the lipid peroxide concentration in the blood.
（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
(Reference Example 1: Measurement of 50% lethal concentration against HUVEC)
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (ATCC CRL-1730) were obtained from American Type Culture Collection and endothelial cell growth containing 10% fetal bovine serum supplemented with 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO BRL, USA) Medium (CELL APPLICATIONS, USA)) was pre-cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。 Matrigel matrix (BD Biosciences, USA) was thawed and kept on ice at 4 ° C., and 50 μL of matrix was transferred to each well of a 96-well tissue culture plate. The plate was incubated at 37 ° C. for at least 1 hour to solidify the matrix solution.
一方、上記調製例２で得たアスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。 On the other hand, the astaxanthin monoester obtained in Preparation Example 2 was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and then diluted with distilled water to obtain 25000, 2500, 250, 25, and 40% in 40 (v / v)% DMSO. A stock test solution containing 2.5 μM astaxanthin monoester was prepared.
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。 100 μL of HUVEC suspension (approximately 2.5 × 10 3 cells / well) was placed in a 96-well Matrigel plate at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. After 24 hours, 100 μL of growth medium and 2 μL of each of the above stock test solutions or vehicles (40 (v / v)% DMSO) were added to each of the two wells and incubated for a further 72 hours. The final concentrations of DMSO and astaxanthin monoester were 250, 25, 2.5, 0.25, and 0.025 μM.
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。 At the end of the incubation, 20 μL of 90% alamarBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 6 hours. Next, the fluorescence intensity of each well was measured at an excitation wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 590 nm using a Spectrafluor Plus plate reader, and the number of viable cells was counted. This is based on the ability of viable cells to change alamarBlue from a non-fluorescent oxidized form (blue) to a fluorescent reduced form (red). The 50% lethal concentration was calculated as the concentration at which 50% of the number of cells at the start of the experiment.
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。 As a result, the 50% lethal concentration (LC 50 ) of astaxanthin monoester with respect to HUVEC was 250 μM (maximum dissolution concentration in DMSO), indicating that the toxicity was low.
本発明によれば、新たな血中過酸化脂質抑制剤が提供される。この血中過酸化脂質抑制剤は、血中過酸化脂質が関与すると考えられる心血管病、脳疾患、肝障害、炎症性疾患などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明の血中過酸化脂質抑制剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは食経験が長く、非常に毒性が低いため、安全性が極めて高い。したがって、医薬品として使用されるだけでなく、健康食品などとして日常的に予防的に用いられ得る。 According to the present invention, a new blood lipid peroxide inhibitor is provided. This blood lipid peroxide inhibitor can be used as a therapeutic agent for various diseases such as cardiovascular diseases, brain diseases, liver disorders and inflammatory diseases which are thought to involve blood lipid peroxides. Astaxanthin and / or an ester thereof contained in the blood lipid peroxide inhibitor of the present invention has a long diet and very low toxicity, so it is extremely safe. Therefore, it can be used not only as a medicine but also on a daily basis as a health food.
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