JP2006008715A - Phospholipase a2 inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ホスホリパーゼＡ２阻害剤に関する。より詳細には、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、ホスホリパーゼＡ２阻害剤、および心血管病などのホスホリパーゼＡ２が関与する疾患の治療剤に関する。 The present invention relates to phospholipase A 2 inhibitor. More specifically, the present invention relates to a phospholipase A 2 inhibitor containing astaxanthin and / or an ester thereof as an active ingredient, and a therapeutic agent for diseases involving phospholipase A 2 such as cardiovascular disease.
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、生体膜構成成分の１，２−ジアシルホスホグリセリドのＣ２位のエステル結合を加水分解する酵素として知られている。ＰＬＡ２には、膵臓から消化酵素として外分泌されるＩ型、細胞内に存在しアラキドン酸代謝の初期過程に関与する内分泌性のＩＩ型など、種々のタイプが存在する。このＩＩ型は、アラキドン酸カスケードの律速酵素であり、その代謝産物であるプロスタグランジン、ロイコトリエンなどを介して通常の炎症に関連することが知られている。そのため、これらの炎症性物質の生合成を抑えることができるＰＬＡ２の阻害剤が、抗炎症剤として使用されている。 Phospholipase A 2 (PLA 2 ) is known as an enzyme that hydrolyzes the ester bond at the C2 position of 1,2-diacylphosphoglyceride, a biological membrane constituent. There are various types of PLA 2 , such as type I exocrine as a digestive enzyme from the pancreas and endocrine type II present in cells and involved in the initial process of arachidonic acid metabolism. This type II is the rate-determining enzyme of the arachidonic acid cascade and is known to be associated with normal inflammation through its metabolites, prostaglandins and leukotrienes. Therefore, PLA 2 inhibitors that can suppress the biosynthesis of these inflammatory substances are used as anti-inflammatory agents.
現在、抗炎症剤として実際に使用されているＰＬＡ２阻害剤としては、ステロイド系薬剤が挙げられる。ステロイド系薬剤は、以下のようなメカニズムによって、間接的にＰＬＡ２を阻害する：細胞質内のレセプターと結合して複合体を形成した後核内へ移行し、ＤＮＡの転写促進によりリポコルチンなどのタンパク質が発現し、これらの発現したタンパク質によってＰＬＡ２が阻害される（非特許文献１および２）。このように、ステロイド系薬剤は、転写に影響を及ぼすため、免疫抑制やその他の代謝への影響（例えば、タンパク質異化作用、カルシウム代謝異常）など、種々の副作用があることが問題となっている。 Currently, PLA 2 inhibitors that are actually used as anti-inflammatory agents include steroidal drugs. Steroidal drugs indirectly inhibit PLA 2 by the following mechanism: binding to cytoplasmic receptors to form a complex, then translocating into the nucleus, and promoting protein transcription such as lipocortin Is expressed, and PLA 2 is inhibited by these expressed proteins (Non-patent Documents 1 and 2). Thus, since steroidal drugs affect transcription, there are problems with various side effects such as immunosuppression and other effects on metabolism (for example, protein catabolism and calcium metabolism abnormality). .
間接的なＰＬＡ２阻害においては、上記のように種々の副作用の問題があるため、ＰＬＡ２活性を直接的に阻害する物質について、種々検討されている。例えば、安息香酸誘導体（特許文献１）、インドール化合物（特許文献２）などの種々の化学合成物質が、ＰＬＡ２阻害剤として報告されている。しかし、これらのＰＬＡ２阻害剤は、合成品であるため、強い毒性や副作用が考えられ、いずれも実用化には至っていない。あるいは、抗マウスＰＬＡ２抗体（特許文献３）などの抗体もあるが、やはり抗体医薬の実用化には困難が伴う。 Indirect PLA 2 inhibition involves various problems of side effects as described above, and various studies have been conducted on substances that directly inhibit PLA 2 activity. For example, various chemically synthesized substances such as benzoic acid derivatives (Patent Document 1) and indole compounds (Patent Document 2) have been reported as PLA 2 inhibitors. However, since these PLA 2 inhibitors are synthetic products, strong toxicity and side effects are considered, and none of them has been put into practical use. Alternatively, there are antibodies such as an anti-mouse PLA 2 antibody (Patent Document 3), but it is still difficult to put an antibody drug into practical use.
ＰＬＡ２は、上記のような炎症作用だけでなく、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなどの脂質性ケミカルメディエーターを介して、動脈硬化の発生・進展にも深く関わっている（非特許文献３）。そのため、ＰＬＡ２阻害剤は、動脈硬化性疾患である心筋梗塞などの心血管病の治療への応用も期待されている。 PLA 2 is deeply involved not only in the above-mentioned inflammatory action but also in the generation and development of arteriosclerosis via lipid chemical mediators such as prostaglandins, thromboxanes, and leukotrienes (Non-patent Document 3). . Therefore, PLA 2 inhibitors are expected to be applied to the treatment of cardiovascular diseases such as myocardial infarction, which is an arteriosclerotic disease.
カロテノイド（カロチノイド）は、動物、植物、および微生物に広く分布し、その数約６００種におよぶ黄〜橙〜赤色を呈する脂溶性生体色素である。その一種であるアスタキサンチンは、オキアミ、エビ、カニなどの甲殻類、サケ・マスの筋肉・卵（イクラなど）、タイ・コイ・金魚などの体表などに含有されている。アスタキサンチンは、プロビタミンＡとなり得ることや顕著な抗酸化作用を有することだけでなく、抗炎症作用を有することも知られている（例えば、特許文献４および５）。その作用機作については、炎症性サイトカインおよびケモカインの発現の阻害（特許文献６）、ヒスタミンの放出抑制（特許文献７）などによることが報告されている。しかし、上記のようなＰＬＡ２の活性に対する影響に関しては、全く報告がない。
本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を阻害する新たな安全性の高い薬剤を提供することを目的とする。本発明はさらに、ＰＬＡ２が関与すると考えられる炎症性疾患および心血管病などの疾患の治療剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a new highly safe drug that inhibits phospholipase A 2 (PLA 2 ). The present invention further aims to PLA 2 provides a therapeutic agent for diseases such as inflammatory diseases and cardiovascular diseases thought to be involved.
抗炎症剤として知られているアスタキサンチンについて種々の検討を行ったところ、アスタキサンチンがＰＬＡ２阻害作用を有することを見出し、本発明を完成した。 As a result of various studies on astaxanthin known as an anti-inflammatory agent, it was found that astaxanthin has a PLA 2 inhibitory action, and the present invention was completed.
本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、ホスホリパーゼＡ２阻害剤を提供する。 The present invention provides a phospholipase A 2 inhibitor containing astaxanthin and / or an ester thereof as an active ingredient.
１つの実施態様では、上記ホスホリパーゼＡ２阻害剤は、ホスホリパーゼＡ２の活性を直接的に阻害する。 In one embodiment, the phospholipase A 2 inhibitors, directly inhibit the activity of phospholipase A 2.
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、ホスホリパーゼＡ２が関与する疾患の治療剤を提供する。 The present invention also contains astaxanthin and / or its ester as an active ingredient, phospholipase A 2 to provide a therapeutic agent for a disease associated.
好適な実施態様では、上記疾患は、炎症性疾患および心血管病である。 In a preferred embodiment, the diseases are inflammatory diseases and cardiovascular diseases.
１つの実施態様では、上記治療剤は、ホスホリパーゼＡ２の活性を直接的に阻害する。 In one embodiment, the therapeutic agent is directly inhibit the activity of phospholipase A 2.
本発明によれば、新たなＰＬＡ２阻害剤が提供される。このＰＬＡ２阻害剤は、ＰＬＡ２が関与すると考えられる心血管病などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明のＰＬＡ２阻害剤は、ＰＬＡ２の活性を直接的に阻害するため副作用が少ない。さらに、本発明のＰＬＡ２阻害剤の有効成分であるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、食経験が長くて非常に毒性が低いため、安全性が高い。 According to the present invention, a new PLA 2 inhibitor is provided. This PLA 2 inhibitor can be used as a therapeutic agent for various diseases such as cardiovascular diseases that are thought to involve PLA 2 . Since the PLA 2 inhibitor of the present invention directly inhibits the activity of PLA 2 , there are few side effects. Furthermore, astaxanthin and / or its ester, which is an active ingredient of the PLA 2 inhibitor of the present invention, is highly safe because it has a long diet and very low toxicity.
本発明のＰＬＡ２阻害剤の有効成分であるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式： Astaxanthin and / or its ester, which is an active ingredient of the PLA 2 inhibitor of the present invention, has the following formula:
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。 (Here, R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or a fatty acid residue). The ester of astaxanthin is not particularly limited. For example, saturated fatty acids such as palmitic acid and stearic acid, or oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, bishomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid, Examples thereof include monoesters or diesters of unsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid. These can be used alone or in appropriate combination. Astaxanthin has a structure having extra oxo groups and hydroxy groups at both ends of the skeleton of β-carotene, and therefore has low molecular stability unlike β-carotene. On the other hand, the ester body (for example, krill extract) in which the hydroxyl groups at both ends are esterified with unsaturated fatty acid or the like is more stable.
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。 Astaxanthin and / or its ester used in the present invention may be either chemically synthesized or derived from natural products. Examples of the latter natural products include red yeast containing astaxanthin and / or an ester thereof; shellfish shells such as tigliopath (red daphnia) and krill; and microalgae such as green algae. In the present invention, an extract containing astaxanthin and / or its ester produced by any method can be used as long as the characteristics of astaxanthin and / or its ester can be utilized. In general, extracts from these natural products are used, and the extract may be in the form of an extract or may be appropriately purified as necessary. In the present invention, such a crude extract or crushed powder containing astaxanthin and / or an ester thereof, or an appropriately purified or chemically synthesized product containing astaxanthin and / or its ester may be used alone or in appropriate combination. Can do. Considering the stability in the body, an ester form is preferably used.
本発明のＰＬＡ２阻害剤は、ＰＬＡ２が関与する疾患または症状を治療または予防するのに有用であり得る。このような疾患または症状としては、膵炎、膵癌、慢性肝炎、肝硬変、胆嚢炎、リウマチ、アレルギー、気管支喘息、関節炎、皮膚炎、痛風、多発性硬化症、外傷誘発性炎症などの炎症性疾患；動脈硬化、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞などの心血管病；微生物感染などによる潰瘍；乾癬；糖尿病およびその合併症；腎不全などが挙げられる。 The PLA 2 inhibitors of the present invention may be useful for treating or preventing diseases or conditions involving PLA 2 . Such diseases or symptoms include pancreatitis, pancreatic cancer, chronic hepatitis, cirrhosis, cholecystitis, rheumatism, allergy, bronchial asthma, arthritis, dermatitis, gout, multiple sclerosis, trauma-induced inflammation, etc .; Cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, myocardial infarction, angina pectoris, cerebral infarction; ulcer caused by microbial infection, etc .; psoriasis; diabetes and its complications;
本発明のＰＬＡ２が関与する疾患の治療剤は、上記の本発明のＰＬＡ２阻害剤と同様に、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する。特に、炎症性疾患および心血管病の治療に有用である。 The therapeutic agent for a disease involving PLA 2 of the present invention contains astaxanthin and / or an ester thereof as an active ingredient, similarly to the PLA 2 inhibitor of the present invention. It is particularly useful for the treatment of inflammatory diseases and cardiovascular diseases.
本発明のＰＬＡ２阻害剤またはＰＬＡ２が関与する疾患の治療剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。 The administration route of the PLA 2 inhibitor of the present invention or the therapeutic agent for diseases involving PLA 2 may be either oral administration or parenteral administration. The dosage form is appropriately selected depending on the administration route. For example, injections, infusions, powders, granules, tablets, capsules, pills, intestinal solvents, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, liquids for external use, poultices, nasal drops, ear drops Agents, eye drops, inhalants, ointments, lotions, suppositories, enteral nutrients and the like. This can be used alone or in combination depending on the symptoms. In these preparations, auxiliary agents usually used in the pharmaceutical preparation technical field such as excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrants, lubricants, and corrigents are used as necessary. .
本発明のＰＬＡ２阻害剤またはＰＬＡ２が関与する疾患の治療剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。 The dosage of the PLA 2 inhibitor of the present invention or the therapeutic agent for a disease involving PLA 2 varies depending on the purpose of administration and the situation (sex, age, body weight, etc.) of the administration subject. Usually, for adults, 0.1 mg to 2 g per day, preferably 4 mg to 500 mg per day in the case of oral administration, in terms of astaxanthin free body, while 0.01 mg to 1 g per day for parenteral administration, Preferably it can be administered at 0.1 mg to 500 mg.
本発明のＰＬＡ２阻害剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。 The PLA 2 inhibitor of the present invention can be used not only as a pharmaceutical as described above, but also as a quasi-drug, cosmetic, functional food, nutritional supplement, food and drink, and the like. When used as a quasi-drug or cosmetic, it can be used together with various adjuvants commonly used in the technical field such as quasi-drug or cosmetic, if necessary. Or, when used as a functional food, nutritional supplement, or food and drink, it is usually used in foods such as sweeteners, spices, seasonings, preservatives, preservatives, bactericides, and antioxidants as necessary. You may use with the additive used. Further, it may be used in a desired shape such as solution, suspension, syrup, granule, cream, paste, jelly, etc., or as necessary. The ratio contained in these is not specifically limited, It can select suitably according to a use purpose, a usage form, and a usage-amount.
（調製例１：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
(Preparation Example 1: Preparation of astaxanthin monoester)
Astaxanthin monoester was prepared as follows. The Haematococcus pulvialis strain K0084 was cultured at 25 ° C. under irradiating gas containing 3% CO 2 under light irradiation conditions, under nutrient stress (nitrogen source deficiency), and cysted. The cysted cells were crushed by means commonly used by those skilled in the art, and the oily fraction was extracted with ethanol. The extract contained lipids such as triglycerides in addition to astaxanthins. The extract was subjected to column chromatography using a synthetic resin adsorbent to obtain a purified product containing an astaxanthin monoester. This purified product was analyzed by HPLC, and it was confirmed that this purified astaxanthin monoester contained a monoester having a molecular weight of 858 as a main component, did not contain free and diester forms of astaxanthin, and contained a slight amount of diglyceride. .
（実施例１：ＰＬＡ２の活性に及ぼす効果）
上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルについて、ＰＬＡ２の活性に及ぼす効果を検討した。ＰＬＡ２は、ブタ膵臓由来のＩ型（ＰＬＡ２−Ｉ）およびヘビ膵臓由来のＩＩ型（ＰＬＡ２−ＩＩ）の精製酵素を用いた。アスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、以下の表１に示すアッセイ系に２５０、２５、２．５、および０．２５μＭとなるように添加してインキュベートし、阻害率を測定した。
(Example 1: Effect on the activity of PLA 2 )
Regarding the astaxanthin monoester obtained in Preparation Example 1, the effect on the activity of PLA 2 was examined. For PLA 2 , purified porcine pancreas type I (PLA 2 -I) and snake pancreas type II (PLA 2 -II) were used. Astaxanthin monoester was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), added to the assay system shown in Table 1 below, and incubated at 250, 25, 2.5, and 0.25 μM, and the inhibition rate was measured. .
アスタキサンチンモノエステルによる５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＰＬＡ２−Ｉでは５３．１μＭであり、ＰＬＡ２−ＩＩでは６７．３μＭであった。２５０μＭにおける酵素活性の阻害率は、それぞれ７９％および７７％であった。このように、アスタキサンチンモノエステルは、いずれのＰＬＡ２に対しても、比較的低い阻害濃度かつ高い阻害率を示した。 The 50% inhibitory concentration (IC 50 ) by astaxanthin monoester was 53.1 μM for PLA 2 -I and 67.3 μM for PLA 2 -II. The inhibition rate of enzyme activity at 250 μM was 79% and 77%, respectively. Thus, astaxanthin monoester showed a relatively low inhibitory concentration and a high inhibition rate for any PLA 2 .
（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
(Reference Example 1: Measurement of 50% lethal concentration against HUVEC)
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (ATCC CRL-1730) were obtained from American Type Culture Collection and endothelial cell growth containing 10% fetal bovine serum supplemented with 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO BRL, USA) Medium (CELL APPLICATIONS, USA)) was pre-cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。 Matrigel matrix (BD Biosciences, USA) was thawed and kept on ice at 4 ° C., and 50 μL of matrix was transferred to each well of a 96-well tissue culture plate. The plate was incubated at 37 ° C. for at least 1 hour to solidify the matrix solution.
一方、上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。 On the other hand, the astaxanthin monoester obtained in Preparation Example 1 above was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and then diluted with distilled water to obtain 25000, 2500, 250, 25, and 40% in 40 (v / v)% DMSO. A stock test solution containing 2.5 μM astaxanthin monoester was prepared.
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。 100 μL of HUVEC suspension (approximately 2.5 × 10 3 cells / well) was placed in a 96-well Matrigel plate at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. After 24 hours, 100 μL of growth medium and 2 μL of each of the above stock test solutions or vehicles (40 (v / v)% DMSO) were added to each of the two wells and incubated for a further 72 hours. The final concentrations of DMSO and astaxanthin monoester were 250, 25, 2.5, 0.25, and 0.025 μM.
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。 At the end of the incubation, 20 μL of 90% alamarBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 6 hours. Next, the fluorescence intensity of each well was measured at an excitation wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 590 nm using a Spectrafluor Plus plate reader, and the number of viable cells was counted. This is based on the ability of viable cells to change alamarBlue from a non-fluorescent oxidized form (blue) to a fluorescent reduced form (red). The 50% lethal concentration was calculated as the concentration at which 50% of the number of cells at the start of the experiment.
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。 As a result, the 50% lethal concentration (LC 50 ) of astaxanthin monoester with respect to HUVEC was 250 μM (maximum dissolution concentration in DMSO), indicating that the toxicity was low.
本発明によれば、新たなＰＬＡ２阻害剤が提供される。このＰＬＡ２阻害剤は、ＰＬＡ２が関与すると考えられる炎症性疾患および心血管病などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明のＰＬＡ２阻害剤は、ＰＬＡ２の活性を直接的に阻害するため副作用が少ない。さらに、本発明のＰＬＡ２阻害剤の有効成分であるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは食経験が長く、非常に毒性が低いため、安全性が極めて高い。したがって、医薬品として使用されるだけでなく、健康食品などとして日常的に予防的に用いられ得る。 According to the present invention, a new PLA 2 inhibitor is provided. This PLA 2 inhibitor can be used as a therapeutic agent for various diseases such as inflammatory diseases and cardiovascular diseases that are thought to involve PLA 2 . Since the PLA 2 inhibitor of the present invention directly inhibits the activity of PLA 2 , there are few side effects. Furthermore, astaxanthin and / or an ester thereof, which is an active ingredient of the PLA 2 inhibitor of the present invention, has a long diet and very low toxicity, so it is extremely safe. Therefore, it can be used not only as a medicine but also on a daily basis as a health food.
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